JPWO2009005124A1 - 乳酸菌由来の２本鎖ｒｎａ - Google Patents
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Abstract
安全で、かつ、細胞に効率的に取り込まれる免疫調節剤及びその製造法を提供すること。乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡ、乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡを有効成分とする免疫調節剤及び乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡの製造法を提供する。乳酸菌の一種であるテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属などの菌体が、免疫調節作用を有する２本鎖ＲＮＡを菌体中に生産することができる。
Description
本発明は、乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡとその製造方法に関する。
生体内の免疫系は、細菌、酵母、カビ、ウイルスなどの微生物による感染や、腫瘍に対する防御、アレルギーの発症に重要な役割を果たしている。この免疫系は、加齢やストレス、がんなどの病気で機能が低下することが知られており、微生物感染予防、抗腫瘍、アレルギー予防などのため、安全、かつ、安価で効果の高い免疫調節剤が求められている。
乳酸菌は、食経験が豊富で安全な微生物として知られ、また、整腸作用、血清コレステロール低下作用、免疫賦活作用や抗アレルギー作用などの免疫調節作用等、様々な機能性が報告されている（例えば、非特許文献１参照）。免疫調節作用を有するプロバイオティクス乳酸菌として市販されている乳酸菌として、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌などが挙げられる。これらの乳酸菌は、乳製品（ヨーグルト、ヨーグルト飲料等）の発酵に用いられている。
従来、乳酸菌を有効成分とする免疫賦活剤や抗アレルギー剤などの免疫調節剤が知られている（例えば、特許文献１〜１２参照）。これらの乳酸菌を有効成分とする免疫調節剤の関与成分として報告があるのは、細胞壁成分のペプチドグリカン（例えば、非特許文献２参照）、リポテイコ酸（例えば、非特許文献３参照）、リポタンパク（例えば、非特許文献４参照）、核酸（例えば、非特許文献５、６参照）、ヒートショックタンパク（例えば、非特許文献７参照）などである。
これらの関与成分の中で、核酸成分として報告があるのは、ＤＮＡのＣｐＧモチーフ（例えば、非特許文献５参照）、ＡＴモチーフ（例えば、非特許文献６参照）である。
これらの関与成分の中で、核酸成分として報告があるのは、ＤＮＡのＣｐＧモチーフ（例えば、非特許文献５参照）、ＡＴモチーフ（例えば、非特許文献６参照）である。
現在、トル様（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ）受容体（以下「ＴＬＲ」という）として、ヒトでは、１０種類のＴＬＲの存在が知られている。ＴＬＲは、細胞膜に存在するタンパク質の一種で、細胞外の病原体等を認識し、細胞内にその情報を伝えることにより、インターフェロンやサイトカインを産生する。
その中でもＴＬＲ３は、ウイルスの２本鎖ＲＮＡを認識し、ＭｙＤ８８非依存的にインターフェロンβプロモーターの活性化及びインターフェロンβの産生を誘導することが知られている。そして、インターフェロンβは、樹状細胞を活性化させて、インターロイキン１２、ＴＮＦなどの炎症性サイトカインを産生させる。さらに、インターロイキン１２は、ナイーブＴ細胞を１型ヘルパーＴ（Ｔｈ１）細胞へと分化誘導し、細胞性免疫を確立させる。
その中でもＴＬＲ３は、ウイルスの２本鎖ＲＮＡを認識し、ＭｙＤ８８非依存的にインターフェロンβプロモーターの活性化及びインターフェロンβの産生を誘導することが知られている。そして、インターフェロンβは、樹状細胞を活性化させて、インターロイキン１２、ＴＮＦなどの炎症性サイトカインを産生させる。さらに、インターロイキン１２は、ナイーブＴ細胞を１型ヘルパーＴ（Ｔｈ１）細胞へと分化誘導し、細胞性免疫を確立させる。
２本鎖ＲＮＡとは、一般にはＲＮＡウイルスに特有に見られる構造である。ウイルスは、宿主細胞内に感染し宿主のシステムを利用してウイルスゲノムの複製を行うが、この際、２本鎖ＲＮＡが形成される。また、２本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムとしても、２本鎖ＲＮＡは存在する。
また、非常に報告は少ないながら、細菌があるストレス条件下で２本鎖ＲＮＡを形成することは知られている。例えば、大腸菌において、鉄イオン枯渇ストレスによりＲｙｈＢという低分子ＲＮＡが合成される。この低分子ＲＮＡは、ｓｏｄＢ ｍＲＮＡを含む鉄結合タンパク質をコードするｍＲＮＡと部分的な塩基対を形成し、２本鎖ＲＮＡが生じることが知られている（例えば、非特許文献８参照）。しかし、これらの２本鎖ＲＮＡが免疫調節作用を有するか否かは知られていない。また、これまでのところ、乳酸菌において２本鎖ＲＮＡが存在するという報告はない。
また、非常に報告は少ないながら、細菌があるストレス条件下で２本鎖ＲＮＡを形成することは知られている。例えば、大腸菌において、鉄イオン枯渇ストレスによりＲｙｈＢという低分子ＲＮＡが合成される。この低分子ＲＮＡは、ｓｏｄＢ ｍＲＮＡを含む鉄結合タンパク質をコードするｍＲＮＡと部分的な塩基対を形成し、２本鎖ＲＮＡが生じることが知られている（例えば、非特許文献８参照）。しかし、これらの２本鎖ＲＮＡが免疫調節作用を有するか否かは知られていない。また、これまでのところ、乳酸菌において２本鎖ＲＮＡが存在するという報告はない。
上述のように、ウイルスの２本鎖ＲＮＡは、ＴＬＲ３を介して細胞性免疫を誘導するため、免疫賦活剤としては好適と考えられるが、ウイルスそのものを免疫賦活剤として利用することは、安全性の面で現実的でなく、安全性の確保のための工夫が必要となる。
１つの解決策は、安全性が確保された人工的な２本鎖ＲＮＡ分子を利用することである。実際、人工的な２本鎖ＲＮＡ分子であるＰｏｌｙＩ：ＰｏｌｙＣは、インターフェロン誘導効果があることから、古くから抗がん剤や抗ウイルス薬として検討が行われている。しかし、一般に生体に使用する上では、必要な薬物を細胞に効果的に取り込ませるためのシステムが必要である。例えば、ＰｏｌｙＩ：ＰｏｌｙＣを人体で有効に作用させるためには、リポソーム製剤化することが必要である（例えば、非特許文献９参照）。
このような背景から、免疫賦活剤として利用でき、安全で、かつ、細胞に効率的に取り込まれる２本鎖ＲＮＡが求められている。
１つの解決策は、安全性が確保された人工的な２本鎖ＲＮＡ分子を利用することである。実際、人工的な２本鎖ＲＮＡ分子であるＰｏｌｙＩ：ＰｏｌｙＣは、インターフェロン誘導効果があることから、古くから抗がん剤や抗ウイルス薬として検討が行われている。しかし、一般に生体に使用する上では、必要な薬物を細胞に効果的に取り込ませるためのシステムが必要である。例えば、ＰｏｌｙＩ：ＰｏｌｙＣを人体で有効に作用させるためには、リポソーム製剤化することが必要である（例えば、非特許文献９参照）。
このような背景から、免疫賦活剤として利用でき、安全で、かつ、細胞に効率的に取り込まれる２本鎖ＲＮＡが求められている。
本発明の課題は、免疫調節作用を有し、安全で、かつ、細胞に効率的に取り込まれる免疫調節剤及びその製造法を提供することにある。
本発明者らは、前記課題を解決するため、免疫調節作用を有する乳酸菌及びその菌体成分に関する研究を重ねたところ、乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡに免疫調節作用を有することを見出した。
また、乳酸菌の一種であるテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属などの菌体が、免疫調節作用を有する２本鎖ＲＮＡを菌体中に生産することを明らかにした。醤油醸造において代表的な乳酸菌の一種であるテトラジェノコッカス属においては、ストレス存在下で培養することにより、免疫調節作用を有する２本鎖ＲＮＡの含有量を大幅に増加させることができることを見出した。
すなわち本発明により、安全で安価な免疫賦活剤、抗アレルギー剤などの免疫調節剤を提供することができる。
また、乳酸菌の一種であるテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属などの菌体が、免疫調節作用を有する２本鎖ＲＮＡを菌体中に生産することを明らかにした。醤油醸造において代表的な乳酸菌の一種であるテトラジェノコッカス属においては、ストレス存在下で培養することにより、免疫調節作用を有する２本鎖ＲＮＡの含有量を大幅に増加させることができることを見出した。
すなわち本発明により、安全で安価な免疫賦活剤、抗アレルギー剤などの免疫調節剤を提供することができる。
すなわち本発明は、以下に関する。
（１）乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡ。
（２）乳酸菌がテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする、上記（１）記載の乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡ。
（３）免疫調節作用がＴＲＩＦ依存性シグナル変換経路又はＭｙＤ８８依存性シグナル変換経路の賦活化であることを特徴とする、上記（１）〜（２）記載の乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡ。
（４）ＴＲＩＦ依存性シグナル変換経路又はＭｙＤ８８依存性シグナル変換経路の賦活化がトル様（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ）受容体３（ＴＬＲ３）の活性化であることを特徴とする、上記（３）記載の乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡ。
（５）乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡを有効成分とする免疫調節剤。
（６）乳酸菌がテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする、上記（５）記載の免疫調節剤。
（７）ストレス条件下で乳酸菌を培養することによって菌体内に２本鎖ＲＮＡを生産させることを特徴とする、乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡの製造法。
（８）乳酸菌がテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする、上記（７）記載の乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡの製造法。
（９）テトラジェノコッカス属に属する乳酸菌を塩分０．５〜２５％の乳酸菌用培地で培養することによって菌体内に２本鎖ＲＮＡを生産させることを特徴とする、乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡの製造法。
（１）乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡ。
（２）乳酸菌がテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする、上記（１）記載の乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡ。
（３）免疫調節作用がＴＲＩＦ依存性シグナル変換経路又はＭｙＤ８８依存性シグナル変換経路の賦活化であることを特徴とする、上記（１）〜（２）記載の乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡ。
（４）ＴＲＩＦ依存性シグナル変換経路又はＭｙＤ８８依存性シグナル変換経路の賦活化がトル様（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ）受容体３（ＴＬＲ３）の活性化であることを特徴とする、上記（３）記載の乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡ。
（５）乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡを有効成分とする免疫調節剤。
（６）乳酸菌がテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする、上記（５）記載の免疫調節剤。
（７）ストレス条件下で乳酸菌を培養することによって菌体内に２本鎖ＲＮＡを生産させることを特徴とする、乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡの製造法。
（８）乳酸菌がテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする、上記（７）記載の乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡの製造法。
（９）テトラジェノコッカス属に属する乳酸菌を塩分０．５〜２５％の乳酸菌用培地で培養することによって菌体内に２本鎖ＲＮＡを生産させることを特徴とする、乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡの製造法。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡ
生体内の免疫系は、細菌、酵母、カビ、ウイルスなどの微生物による感染や、腫瘍に対する防御、アレルギーの発症に重要な役割を果たしており、その防御機構の中心はリンパ球と抗原提示細胞である。リンパ球と抗原提示細胞は抗原特異的、また、抗原非特異的に活性化され、異物を排除する能力を高める。
リンパ球や抗原提示細胞の活性化において、インターロイキン１２は、ＮＫ細胞やＴ細胞に作用してインターフェロンγや腫瘍壊死因子αの産生を誘導し、抗原提示細胞を活性化すること、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞障害活性を増強すること、インターロイキン２と相乗的に作用して細胞障害性リンパ球を活性化するとともにリンホカイン活性化キラー細胞を誘導すること、細胞性免疫を補助するヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０）のＴｈ１タイプへの分化や、そのバランス（Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス）の制御にも関与していることが知られている。
このようにインターロイキン１２は、自然免疫及び細胞性免疫の強化による感染防御、抗腫瘍活性など免疫賦活活性増強、また、アレルギー予防において重要な役割を担っている。
（１）乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡ
生体内の免疫系は、細菌、酵母、カビ、ウイルスなどの微生物による感染や、腫瘍に対する防御、アレルギーの発症に重要な役割を果たしており、その防御機構の中心はリンパ球と抗原提示細胞である。リンパ球と抗原提示細胞は抗原特異的、また、抗原非特異的に活性化され、異物を排除する能力を高める。
リンパ球や抗原提示細胞の活性化において、インターロイキン１２は、ＮＫ細胞やＴ細胞に作用してインターフェロンγや腫瘍壊死因子αの産生を誘導し、抗原提示細胞を活性化すること、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞障害活性を増強すること、インターロイキン２と相乗的に作用して細胞障害性リンパ球を活性化するとともにリンホカイン活性化キラー細胞を誘導すること、細胞性免疫を補助するヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０）のＴｈ１タイプへの分化や、そのバランス（Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス）の制御にも関与していることが知られている。
このようにインターロイキン１２は、自然免疫及び細胞性免疫の強化による感染防御、抗腫瘍活性など免疫賦活活性増強、また、アレルギー予防において重要な役割を担っている。
本発明において、免疫調節作用とは、免疫細胞を賦活化する活性又は抗アレルギー活性を意味する。この免疫調節作用は、抗原提示細胞からのインターロイキン１２産生促進活性を指標に評価できる。
インターロイキン１２産生促進活性は、抗原提示細胞を含有する細胞、例えば、マウス腹腔滲出マクロファージ、マウス脾臓懸濁細胞又は骨髄由来樹状細胞を組織培養プレートで培養し、乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡ含有物を添加して一定期間培養し、培地中のインターロイキン１２濃度をエンザイムイムノアッセイで測定することにより容易に判定することができる。
インターロイキン１２産生促進活性は、抗原提示細胞を含有する細胞、例えば、マウス腹腔滲出マクロファージ、マウス脾臓懸濁細胞又は骨髄由来樹状細胞を組織培養プレートで培養し、乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡ含有物を添加して一定期間培養し、培地中のインターロイキン１２濃度をエンザイムイムノアッセイで測定することにより容易に判定することができる。
乳酸菌とは、細胞形態が桿菌又は球菌のグラム陽性菌である。カタラーゼは、陰性であり、消費したブドウ糖に対し、５０％以上の乳酸を産生し、内性胞子は形成しないものをいう。まれに運動性を示す場合もある。具体的には、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属などの乳酸菌が含まれる。
２本鎖ＲＮＡとは、リボヌクレオチドとそれに相補的なリボヌクレオチドとが塩基対を形成しているものをいう。免疫調節作用を有する２本鎖ＲＮＡの存在は、以下の（ａ）と（ｂ）を確認することで証明できる。
まず、（ａ）牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡを作用させることにより乳酸菌菌体の免疫調節作用が低下することを確認する。これにより、ＲＮＡ画分（１本鎖ＲＮＡ及び２本鎖ＲＮＡ）の存在と、この画分に免疫調節作用があることが証明できる。
その上で、（ｂ）免疫調節作用には、１本鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲ７ではなく、２本鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲ３が必要であることを確認する。
その方法としては、ＴＬＲ７を欠損した細胞及びＴＬＲ３を欠損した細胞を使用して免疫調節作用を評価し、ＴＬＲ３を欠損した細胞においては正常な細胞を使用した場合と比較して活性が低下することを確認すればよい。
ここで、（ｂ）の代わりに、牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡに対する感受性の違いを利用して、（ｃ）０．３Ｍ以上のＮａＣｌ存在下で牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡを作用させた場合にはＮａＣｌ非存在下で作用させた場合と比較して免疫活性が高いことを確認しても良い。なぜなら、牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡは、０．３Ｍ以上のＮａＣｌ存在下では１本鎖ＲＮＡのみを分解し、２本鎖ＲＮＡは分解しないからである。
まず、（ａ）牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡを作用させることにより乳酸菌菌体の免疫調節作用が低下することを確認する。これにより、ＲＮＡ画分（１本鎖ＲＮＡ及び２本鎖ＲＮＡ）の存在と、この画分に免疫調節作用があることが証明できる。
その上で、（ｂ）免疫調節作用には、１本鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲ７ではなく、２本鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲ３が必要であることを確認する。
その方法としては、ＴＬＲ７を欠損した細胞及びＴＬＲ３を欠損した細胞を使用して免疫調節作用を評価し、ＴＬＲ３を欠損した細胞においては正常な細胞を使用した場合と比較して活性が低下することを確認すればよい。
ここで、（ｂ）の代わりに、牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡに対する感受性の違いを利用して、（ｃ）０．３Ｍ以上のＮａＣｌ存在下で牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡを作用させた場合にはＮａＣｌ非存在下で作用させた場合と比較して免疫活性が高いことを確認しても良い。なぜなら、牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡは、０．３Ｍ以上のＮａＣｌ存在下では１本鎖ＲＮＡのみを分解し、２本鎖ＲＮＡは分解しないからである。
本発明の乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡは、乳酸菌を培養することによってその菌体内に生産される。
乳酸菌とは、例えば、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属等に属する菌株であり、より具体的には、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＮＢＲＣ１２１７２株、ペディオコッカス・ペントサセウスＯＳ株（ＮＩＴＥ Ｐ−３５４）、ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ１９１５株、ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ００９９株、ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ０１２２株、ラクトバチルス・プランタラムＮＲＩＣ１９３０株、ラクトバチルス・プランタラムＮＲＩＣ１０６７株、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＮＲＩＣ１６８８株、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＮＲＩＣ１６８３株、ラクトバチルス・ブレビスＮＲＩＣ１７１３株、ラクトバチルス・ペントーサスＮＲＩＣ０３９１株、ラクトバチルス・ペントーサスＮＲＩＣ０３９６株、ラクトバチルス・ペントーサスＮＲＩＣ１８３６株、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・カゼイＮＲＩＣ０６４４株、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイＮＲＩＣ１９３６、ストレプトコッカス・サーモフィラスＮＲＩＣ０２５６株、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・メセンテロイデスＮＲＩＣ１９８２株、ロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１株、ロイコノストック・ラクティスＮＲＩＣ１５８２株、などである。
なお、本発明の一例であるテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００７年６月２５日付けで寄託され、受託番号 ＦＥＲＭ ＡＰ−２１３１０が付与されている。
上記の乳酸菌は、醤油諸味、漬物、市販の乳酸菌飲料等から分離し利用することが可能である。乳酸菌の培養は、菌体が２本鎖ＲＮＡを生産する限り、どのように培養してもよい。
乳酸菌とは、例えば、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属等に属する菌株であり、より具体的には、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＮＢＲＣ１２１７２株、ペディオコッカス・ペントサセウスＯＳ株（ＮＩＴＥ Ｐ−３５４）、ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ１９１５株、ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ００９９株、ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ０１２２株、ラクトバチルス・プランタラムＮＲＩＣ１９３０株、ラクトバチルス・プランタラムＮＲＩＣ１０６７株、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＮＲＩＣ１６８８株、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＮＲＩＣ１６８３株、ラクトバチルス・ブレビスＮＲＩＣ１７１３株、ラクトバチルス・ペントーサスＮＲＩＣ０３９１株、ラクトバチルス・ペントーサスＮＲＩＣ０３９６株、ラクトバチルス・ペントーサスＮＲＩＣ１８３６株、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・カゼイＮＲＩＣ０６４４株、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイＮＲＩＣ１９３６、ストレプトコッカス・サーモフィラスＮＲＩＣ０２５６株、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・メセンテロイデスＮＲＩＣ１９８２株、ロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１株、ロイコノストック・ラクティスＮＲＩＣ１５８２株、などである。
なお、本発明の一例であるテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００７年６月２５日付けで寄託され、受託番号 ＦＥＲＭ ＡＰ−２１３１０が付与されている。
上記の乳酸菌は、醤油諸味、漬物、市販の乳酸菌飲料等から分離し利用することが可能である。乳酸菌の培養は、菌体が２本鎖ＲＮＡを生産する限り、どのように培養してもよい。
免疫調節作用にかかわるシグナル変換経路には、多くの因子が関わっていることが知られている。
ＴＬＲが細菌等の構成成分を認識して生じたシグナルは、細胞内において、アダプター分子であるＭｙＤ８８、ＴＲＩＦ、ＴＩＲＡＰ等を介して変換され、下流のＮＦ−ｋＢやＭＡＰＫを活性化する。
したがって、ＴＬＲ３を欠損した細胞において免疫調節作用が低下する場合、そのアダプター分子であるＴＲＩＦに依存したシグナル変換経路が、免疫調節作用にかかわっていることになる。また、シグナル変換経路がＭｙＤ８８に依存していることを証明するには、ＭｙＤ８８を欠損する細胞を用いて評価を行った場合に免疫調節作用が低下することを示せばよい。
ＴＬＲが細菌等の構成成分を認識して生じたシグナルは、細胞内において、アダプター分子であるＭｙＤ８８、ＴＲＩＦ、ＴＩＲＡＰ等を介して変換され、下流のＮＦ−ｋＢやＭＡＰＫを活性化する。
したがって、ＴＬＲ３を欠損した細胞において免疫調節作用が低下する場合、そのアダプター分子であるＴＲＩＦに依存したシグナル変換経路が、免疫調節作用にかかわっていることになる。また、シグナル変換経路がＭｙＤ８８に依存していることを証明するには、ＭｙＤ８８を欠損する細胞を用いて評価を行った場合に免疫調節作用が低下することを示せばよい。
免疫調節を目的として本発明の乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡを摂取する場合、その摂取量は、摂取者の症状や体格に合わせて適宜設定すればよい。乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡを乳酸菌菌体としてそのまま、又は精製した乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡをリポソーム化して生体に投与することができる。
テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属などに属する乳酸菌の菌体に含まれる２本鎖ＲＮＡを摂取する場合、その摂取する乳酸菌の菌体量は、例えば、１〜１０００ｍｇ／体重６０ｋｇ／日である。
免疫細胞を賦活化する活性を有する乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡは、単独で使用してもよいし、飲食品、医薬品に添加して使用することもできる。
テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属などに属する乳酸菌の菌体に含まれる２本鎖ＲＮＡを摂取する場合、その摂取する乳酸菌の菌体量は、例えば、１〜１０００ｍｇ／体重６０ｋｇ／日である。
免疫細胞を賦活化する活性を有する乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡは、単独で使用してもよいし、飲食品、医薬品に添加して使用することもできる。
（２）乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡの製造法
本発明の乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡは、乳酸菌を培養することによって菌体内に生産させることができる。例えば、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属などから選択される１種又は２種以上の乳酸菌を培養し、２本鎖ＲＮＡを含有する培養物、菌体又は菌体成分を採取することにより得られる。
菌体が２本鎖ＲＮＡを生産する限り、乳酸菌の培地及び培養条件は特に限定されないが、ストレス条件下で乳酸菌を培養することによって菌体内に２本鎖ＲＮＡをより多く生産させることができる。ここでストレス条件下とは、高塩濃度、高温、貧栄養、低ｐＨストレスなどを意味する。
特にテトラジェノコッカス属に属する乳酸菌の場合、塩分０．５〜２５％、好ましくは５〜１０％を含む培地を使用して培養することが望ましい。塩分濃度が０．５％以下、あるいは２５％以上の培地では、テトラジェノコッカス属に属する乳酸菌は増殖が極端に遅くなるため、実用的とはいえない。
本発明の乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡは、乳酸菌を培養することによって菌体内に生産させることができる。例えば、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属などから選択される１種又は２種以上の乳酸菌を培養し、２本鎖ＲＮＡを含有する培養物、菌体又は菌体成分を採取することにより得られる。
菌体が２本鎖ＲＮＡを生産する限り、乳酸菌の培地及び培養条件は特に限定されないが、ストレス条件下で乳酸菌を培養することによって菌体内に２本鎖ＲＮＡをより多く生産させることができる。ここでストレス条件下とは、高塩濃度、高温、貧栄養、低ｐＨストレスなどを意味する。
特にテトラジェノコッカス属に属する乳酸菌の場合、塩分０．５〜２５％、好ましくは５〜１０％を含む培地を使用して培養することが望ましい。塩分濃度が０．５％以下、あるいは２５％以上の培地では、テトラジェノコッカス属に属する乳酸菌は増殖が極端に遅くなるため、実用的とはいえない。
乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡを含有する乳酸菌培養物、乳酸菌菌体又は乳酸菌菌体成分は、そのまま使用することもできるが、乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡを濃縮・精製してもよい。乳酸菌菌体から２本鎖ＲＮＡを濃縮・精製する場合、例えば、以下のように実施することができる。
まず、加熱処理した乳酸菌菌体から公知の方法に従って核酸画分を抽出する。例えば、ガラスビーズなどを用いて菌体を物理的に破砕したり、乳酸菌菌体に溶菌酵素などを用いて溶菌させたりした後に、フェノール−クロロホルム処理を行えばよい。その後は、セルロースカラムクロマトグラフィーと牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡに対する感受性の違いなどを利用して精製することができる。
例えば、抽出した核酸をエタノール存在下でセルロースへ吸着させ、洗浄後、エタノール不含有の緩衝液により乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡが濃縮された画分を溶出させる。この画分に対し、ＤＮａｓｅ処理及び１本鎖ＲＮＡのみを切断する条件（例えば、０．３Ｍ ＮａＣｌ）下で牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ処理を行うことで、乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡを精製できる。
例えば、抽出した核酸をエタノール存在下でセルロースへ吸着させ、洗浄後、エタノール不含有の緩衝液により乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡが濃縮された画分を溶出させる。この画分に対し、ＤＮａｓｅ処理及び１本鎖ＲＮＡのみを切断する条件（例えば、０．３Ｍ ＮａＣｌ）下で牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ処理を行うことで、乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡを精製できる。
以下に、テトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属に属する乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡの製造法を例示する。
テトラジェノコッカス属は、例えば、食塩０．５〜２５％、望ましくは５〜１０％を含有するＭＲＳ培地（ＢＤ社製）に、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属及びロイコノストック属に属する乳酸菌は、通常のＭＲＳ培地に植菌し、２５〜３７℃で２４〜７２時間培養する。このようにして得られた乳酸菌培養物や乳酸菌菌体は、２本鎖ＲＮＡを含有し、また、リポソーム製剤化などの特別な処理を行わなくとも細胞に効率的に取り込ませることができる。
テトラジェノコッカス属は、例えば、食塩０．５〜２５％、望ましくは５〜１０％を含有するＭＲＳ培地（ＢＤ社製）に、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属及びロイコノストック属に属する乳酸菌は、通常のＭＲＳ培地に植菌し、２５〜３７℃で２４〜７２時間培養する。このようにして得られた乳酸菌培養物や乳酸菌菌体は、２本鎖ＲＮＡを含有し、また、リポソーム製剤化などの特別な処理を行わなくとも細胞に効率的に取り込ませることができる。
乳酸菌培養物や乳酸菌菌体から２本鎖ＲＮＡを精製する場合は、例えば、以下のように行う。乳酸菌培養物や乳酸菌菌体を加熱殺菌後、乳酸菌菌体を洗浄して緩衝液に懸濁し、リゾチームを添加して３７℃で加温する。その後、ＳＤＳとＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加して、３７℃で加温する。その後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理を行い、上清を得る。ここで得られる粗核酸抽出液は、ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＲＮＡを含む混合物である。
次いで、セルロースカラムクロマトグラフィーによって乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡの精製を行う。粗核酸抽出液に対し、最終濃度が１５％となるようにエタノールを加える。この溶液にセルロース粉末を最終濃度５％になるよう加え、２本鎖ＲＮＡを該セルロース粉末へ吸着させる。
セルロース粉末としては、好ましくはＣＦ１１セルロース粉末（ワットマン社製）を用いる。２本鎖ＲＮＡは、１５％エタノール存在下でＤＮＡ及び１本鎖ＲＮＡよりも強くセルロース粉末に吸着する。２本鎖ＲＮＡを吸着したセルロース粉末は、遠心分離によって沈殿物として回収することができる。
回収されたセルロースは、例えば、１５％エタノールを含む緩衝液に再懸濁し、該懸濁液をカラムに注ぎ入れる。このカラムに１５％エタノールを含む緩衝液を通過させ、乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡ以外の吸着成分を洗い流す。
セルロースカラムに吸着された乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡは、エタノールを含まない緩衝液をカラムに通過させることによって回収することができる。以上の処理によって得られる液体試料をアルコール沈殿処理を行うことによって、乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡを得ることができる。
次いで、セルロースカラムクロマトグラフィーによって乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡの精製を行う。粗核酸抽出液に対し、最終濃度が１５％となるようにエタノールを加える。この溶液にセルロース粉末を最終濃度５％になるよう加え、２本鎖ＲＮＡを該セルロース粉末へ吸着させる。
セルロース粉末としては、好ましくはＣＦ１１セルロース粉末（ワットマン社製）を用いる。２本鎖ＲＮＡは、１５％エタノール存在下でＤＮＡ及び１本鎖ＲＮＡよりも強くセルロース粉末に吸着する。２本鎖ＲＮＡを吸着したセルロース粉末は、遠心分離によって沈殿物として回収することができる。
回収されたセルロースは、例えば、１５％エタノールを含む緩衝液に再懸濁し、該懸濁液をカラムに注ぎ入れる。このカラムに１５％エタノールを含む緩衝液を通過させ、乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡ以外の吸着成分を洗い流す。
セルロースカラムに吸着された乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡは、エタノールを含まない緩衝液をカラムに通過させることによって回収することができる。以上の処理によって得られる液体試料をアルコール沈殿処理を行うことによって、乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡを得ることができる。
上記のセルロースカラムクロマトグラフィーでは粗核酸抽出液に混入するＤＮＡや１本鎖ＲＮＡを完全には除去できないため、さらに高度な精製を行うことが好ましい。残存するＤＮＡは、例えば、ＤＮＡ分解酵素であるＤＮａｓｅＩ（宝酒造社製）を用いて分解除去することができる。また、残存する１本鎖ＲＮＡは、濃度０．３Ｍ以上のＮａＣｌ存在下でＲＮＡ分解酵素、例えば、牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて分解除去することができる。その後、フェノール／クロロホルム抽出とアルコール沈殿を行うことにより、精製した乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡを得ることができる。
精製した乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡは、リポソーム化して生体に投与することができる。
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらによって限定されるものではない。
精製した乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡは、リポソーム化して生体に投与することができる。
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらによって限定されるものではない。
＜牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ処理を行ったテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体のインターロイキン１２産生促進試験＞
加熱殺菌処理したテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体に牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ処理を施し、菌体懸濁液のインターロイキン１２産生促進活性を、マウス腹腔滲出マクロファージ細胞及び脾臓懸濁細胞を用いて評価した。
加熱殺菌処理したテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体に牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ処理を施し、菌体懸濁液のインターロイキン１２産生促進活性を、マウス腹腔滲出マクロファージ細胞及び脾臓懸濁細胞を用いて評価した。
（１）乳酸菌懸濁液の調製
食塩を０．５％、５％、１０％を含有したＭＲＳ培地（ＢＤ社製）に乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株を１×１０７個／ｍｌとなるように接種した。４８〜７２時間静置培養した後、９５℃で１０分間の加熱殺菌を行った。その後、遠心によって培地を除去して集菌した。生理食塩水にて菌体を洗浄後、生理食塩水に１×１０９個／ｍｌとなるように懸濁し、乳酸菌懸濁液を調製した。
食塩を０．５％、５％、１０％を含有したＭＲＳ培地（ＢＤ社製）に乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株を１×１０７個／ｍｌとなるように接種した。４８〜７２時間静置培養した後、９５℃で１０分間の加熱殺菌を行った。その後、遠心によって培地を除去して集菌した。生理食塩水にて菌体を洗浄後、生理食塩水に１×１０９個／ｍｌとなるように懸濁し、乳酸菌懸濁液を調製した。
（２）牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ処理
上記乳酸菌懸濁液に１０μｇ／ｍｌとなるように牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、３７℃で１時間インキュベートを行った。その後、生理食塩水にて菌体を洗浄し、再び生理食塩水に１×１０９個／ｍｌとなるように懸濁し、乳酸菌懸濁液を調製した。
上記乳酸菌懸濁液に１０μｇ／ｍｌとなるように牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、３７℃で１時間インキュベートを行った。その後、生理食塩水にて菌体を洗浄し、再び生理食塩水に１×１０９個／ｍｌとなるように懸濁し、乳酸菌懸濁液を調製した。
（３）腹腔滲出マクロファージ細胞の採取、調製
チオグリコレート（ＢＤ社製）２ｍｌを腹腔内に投与し、刺激したマウス（８週齢ＢＡＬＢ／ｃ、雄、チャールスリバー社より購入）から、投与３日後に無菌的に腹腔滲出マクロファージを採取した。腹腔滲出マクロファージ細胞浮遊液の細胞数を測定した後、細胞数を２×１０６／ｍｌの濃度となるようＲＰＭＩ完全培地で調製した。ＲＰＭＩ完全培地の組成は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に非働化（５６℃、３０分）した１％ウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１０％添加したものである。この調製済みの腹腔滲出マクロファージ細胞液を９６穴組織培養プレートに１穴当たり１００μｌを播種した。
チオグリコレート（ＢＤ社製）２ｍｌを腹腔内に投与し、刺激したマウス（８週齢ＢＡＬＢ／ｃ、雄、チャールスリバー社より購入）から、投与３日後に無菌的に腹腔滲出マクロファージを採取した。腹腔滲出マクロファージ細胞浮遊液の細胞数を測定した後、細胞数を２×１０６／ｍｌの濃度となるようＲＰＭＩ完全培地で調製した。ＲＰＭＩ完全培地の組成は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に非働化（５６℃、３０分）した１％ウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１０％添加したものである。この調製済みの腹腔滲出マクロファージ細胞液を９６穴組織培養プレートに１穴当たり１００μｌを播種した。
（４）脾臓胞懸濁液の調製
６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本エスエルシー社より購入）をイソフルラン吸入麻酔下で頸椎脱臼して安楽死させた後、開腹して脾臓を採取し、氷冷した１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社製）の入った細胞培養用６ｃｍ ディッシュに入れた。２つの脾臓をハサミで細片にし、４００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼ加基本培地（１０ｍｌ）とともに５０ｍｌプラスチックチューブ（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に入れ、インキュベーター（３７℃）内にて３０分間スターラーで緩やかに撹拌した。
基本培地は、ペニシリン（１００，０００ Ｕ／Ｌ、 明治製菓社製）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／Ｌ、 明治製菓社製）、２−メルカプトエタノール（５０μＭ、 Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｌ−グルタミン酸（２ｍＭ、 ナカライテスク社製）、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ、 同仁化学研究所社製）加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に５６℃、３０分非働化したＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を１０％添加したものを用いた。得られた細胞懸濁液を４４０×ｇで５分間遠心した後、１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した。
細胞を１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した後、セルストレイナーで濾過し、残った細胞塊もセルストレイナー上で１０ｍｌプラスチックシリンジ（テルモ社製）のプランジャー部分で押しつぶして濾過した。
得られた細胞懸濁液を遠心して上清を吸引除去し、溶血バッファー（０．１５５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５）を５ｍｌ加え、５分間氷上に置いた後、ＦＣＳ（５ｍｌ）を加えて、静かに懸濁し、１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地（１０ｍｌ）を加えて、４００×ｇで７分間遠心した。１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地でさらに３回洗浄した後、基本培地に懸濁した。細胞液は、血球計算板を用いて細胞数を計測した。調製した脾臓懸濁細胞は、９６穴プレートに５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／０．２ｍｌ／ｗｅｌｌとなるように播種した。
６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本エスエルシー社より購入）をイソフルラン吸入麻酔下で頸椎脱臼して安楽死させた後、開腹して脾臓を採取し、氷冷した１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社製）の入った細胞培養用６ｃｍ ディッシュに入れた。２つの脾臓をハサミで細片にし、４００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼ加基本培地（１０ｍｌ）とともに５０ｍｌプラスチックチューブ（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に入れ、インキュベーター（３７℃）内にて３０分間スターラーで緩やかに撹拌した。
基本培地は、ペニシリン（１００，０００ Ｕ／Ｌ、 明治製菓社製）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／Ｌ、 明治製菓社製）、２−メルカプトエタノール（５０μＭ、 Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｌ−グルタミン酸（２ｍＭ、 ナカライテスク社製）、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ、 同仁化学研究所社製）加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に５６℃、３０分非働化したＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を１０％添加したものを用いた。得られた細胞懸濁液を４４０×ｇで５分間遠心した後、１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した。
細胞を１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した後、セルストレイナーで濾過し、残った細胞塊もセルストレイナー上で１０ｍｌプラスチックシリンジ（テルモ社製）のプランジャー部分で押しつぶして濾過した。
得られた細胞懸濁液を遠心して上清を吸引除去し、溶血バッファー（０．１５５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５）を５ｍｌ加え、５分間氷上に置いた後、ＦＣＳ（５ｍｌ）を加えて、静かに懸濁し、１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地（１０ｍｌ）を加えて、４００×ｇで７分間遠心した。１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地でさらに３回洗浄した後、基本培地に懸濁した。細胞液は、血球計算板を用いて細胞数を計測した。調製した脾臓懸濁細胞は、９６穴プレートに５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／０．２ｍｌ／ｗｅｌｌとなるように播種した。
（５）インターロイキン１２産生促進活性の測定
上記のようにして得た２種類の細胞懸濁液と、牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ処理前後の乳酸菌懸濁液とを細胞数：乳酸菌数が１：５０になるように混合し、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間共培養を行った。上清を回収し、インターロイキン１２濃度をエンザイムイムノアッセイにより測定した。
エンザイムイムノアッセイは、ラット抗マウスインターロイキン１２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を０．２Ｍ、ｐＨ６．０のリン酸緩衝液で２μｇ／ｍｌに調製した溶液を、９６穴組織培養プレート１穴当たり１００μｌ加え、室温で一晩放置しラット抗マウスインターロイキン１２抗体を各穴に付着させたプレートを用いて行った。
培養上清を１穴当たり１００μl加え、室温で９０分間放置し、培養上清のマウスインターロイキン１２をプレートに付着したラット抗マウスインターロイキン１２抗体と結合させた。洗浄後、ラットビオチン化抗マウスインターロイキン１２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を加え、マウスインターロイキン１２に結合させた。
洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を加え、ビオチンと結合させた。
洗浄後、ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ社製）を１穴当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させ、反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４５０ｎｍを測定し、リコンビナントマウスインターロイキン１２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）で作成した標識曲線から、培養上清中のインターロイキン１２の濃度を求めた。
上記のようにして得た２種類の細胞懸濁液と、牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ処理前後の乳酸菌懸濁液とを細胞数：乳酸菌数が１：５０になるように混合し、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間共培養を行った。上清を回収し、インターロイキン１２濃度をエンザイムイムノアッセイにより測定した。
エンザイムイムノアッセイは、ラット抗マウスインターロイキン１２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を０．２Ｍ、ｐＨ６．０のリン酸緩衝液で２μｇ／ｍｌに調製した溶液を、９６穴組織培養プレート１穴当たり１００μｌ加え、室温で一晩放置しラット抗マウスインターロイキン１２抗体を各穴に付着させたプレートを用いて行った。
培養上清を１穴当たり１００μl加え、室温で９０分間放置し、培養上清のマウスインターロイキン１２をプレートに付着したラット抗マウスインターロイキン１２抗体と結合させた。洗浄後、ラットビオチン化抗マウスインターロイキン１２抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を加え、マウスインターロイキン１２に結合させた。
洗浄後、ストレプトアビジンで標識したペルオキシダーゼ酵素（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を加え、ビオチンと結合させた。
洗浄後、ＴＭＢ基質溶液（Ｍｏｓｓ／コスモバイオ社製）を１穴当たり１００μｌ加え、室温で２０分間反応させ、反応を０．５Ｎ塩酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４５０ｎｍを測定し、リコンビナントマウスインターロイキン１２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）で作成した標識曲線から、培養上清中のインターロイキン１２の濃度を求めた。
腹腔滲出マクロファージ細胞を用いた場合の結果を図１に、脾臓懸濁細胞を用いた場合の結果を図２に示す。いずれの場合も牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡを作用させると菌体の免疫調節作用が低下した。これにより、ＲＮＡ画分（１本鎖ＲＮＡ及び２本鎖ＲＮＡ）の存在と、この画分が免疫調節作用を有することが示された。
また、いずれの細胞を用いた場合も、培養時の培地食塩濃度が高い菌体において、免疫調節作用の低下が大きかった。このことから、培養時の培地食塩濃度が高いと、免疫調節作用を有する、ＲＮＡ画分の生産量が多いことが示された。
また、いずれの細胞を用いた場合も、培養時の培地食塩濃度が高い菌体において、免疫調節作用の低下が大きかった。このことから、培養時の培地食塩濃度が高いと、免疫調節作用を有する、ＲＮＡ画分の生産量が多いことが示された。
＜ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＭｙＤ８８をノックアウトしたマウスの骨髄由来樹状細胞におけるテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１菌体のインターロイキン１２産生促進試験＞
２本鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲ３、１本鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲ７、免疫調節作用にかかわるシグナル変換経路のアダプター分子であるＭｙＤ８８をノックアウトしたマウスから骨髄由来樹状細胞を調製し、インターロイキン１２産生促進活性を測定した。
２本鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲ３、１本鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲ７、免疫調節作用にかかわるシグナル変換経路のアダプター分子であるＭｙＤ８８をノックアウトしたマウスから骨髄由来樹状細胞を調製し、インターロイキン１２産生促進活性を測定した。
（１）乳酸菌懸濁液の調製
食塩を０％、５％、１０％を含有したＭＲＳ培地に乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株を１×１０７個／ｍｌ接種した。４８〜７２時間静置培養した後、９５℃で１０分間の煮沸殺菌を行った。その後、遠心濃縮機によって培地を除去して集菌した。生理食塩水にて菌体を洗浄後、生理食塩水に１×１０９個／ｍｌとなるように懸濁し、乳酸菌懸濁液を調製した。
食塩を０％、５％、１０％を含有したＭＲＳ培地に乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株を１×１０７個／ｍｌ接種した。４８〜７２時間静置培養した後、９５℃で１０分間の煮沸殺菌を行った。その後、遠心濃縮機によって培地を除去して集菌した。生理食塩水にて菌体を洗浄後、生理食塩水に１×１０９個／ｍｌとなるように懸濁し、乳酸菌懸濁液を調製した。
（２）骨髄由来樹状細胞の調製
野生型マウス及びＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＭｙＤ８８をノックアウトしたマウス（６〜１２週齢Ｃ５７ＢＬ／６、雌、兵庫医科大学より分与）を用いて試験を行った。イソフルラン吸入麻酔下に頸椎脱臼して、安楽死させた後、下肢から大腿骨、頸骨を取り出し、氷冷した１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、非動化したもの）加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社製）の入った細胞培養用６ｃｍディッシュ（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に入れた。１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０を注入して骨髄を押し出した後、懸濁した。
得られた細胞懸濁液をセルストレイナー（４０μｍ、 ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）で濾過した後、４４０×ｇで５分間遠心分離した。
野生型マウス及びＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＭｙＤ８８をノックアウトしたマウス（６〜１２週齢Ｃ５７ＢＬ／６、雌、兵庫医科大学より分与）を用いて試験を行った。イソフルラン吸入麻酔下に頸椎脱臼して、安楽死させた後、下肢から大腿骨、頸骨を取り出し、氷冷した１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、非動化したもの）加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社製）の入った細胞培養用６ｃｍディッシュ（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に入れた。１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０を注入して骨髄を押し出した後、懸濁した。
得られた細胞懸濁液をセルストレイナー（４０μｍ、 ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）で濾過した後、４４０×ｇで５分間遠心分離した。
溶血バッファー（５ｍＬ、０．１５５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５）を加え５分間氷上に置いた後、１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０（５ｍＬ）を加えて遠心分離し、１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０でさらに２回洗浄した。
ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（以下ＰＥという）標識抗Ｉ−Ａ抗体（Ｃｌｏｎｅ Ｍ５／１１４．１４．２、 ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、 ０．２ｍｇ／ｍＬ）、ＰＥ標識抗ＣＤ４抗体（Ｃｌｏｎｅ ＧＫ１．５、 ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、 ０．２ｍｇ／ｍＬ）及びＰＥ標識抗ＣＤ８抗体（Ｃｌｏｎｅ ５３−６．７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、０．２ｍｇ／ｍＬ）をＭＡＣＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒでそれぞれ１０００倍希釈した抗体カクテル（１００μＬ／１０７ ｃｅｌｌｓ）及びウサギＩｇＧ（５０μｇ／ｍＬ Ｚｙｍｅｄ社製）を加え、氷上で３０分間静置した。
ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（以下ＰＥという）標識抗Ｉ−Ａ抗体（Ｃｌｏｎｅ Ｍ５／１１４．１４．２、 ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、 ０．２ｍｇ／ｍＬ）、ＰＥ標識抗ＣＤ４抗体（Ｃｌｏｎｅ ＧＫ１．５、 ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、 ０．２ｍｇ／ｍＬ）及びＰＥ標識抗ＣＤ８抗体（Ｃｌｏｎｅ ５３−６．７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、０．２ｍｇ／ｍＬ）をＭＡＣＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒでそれぞれ１０００倍希釈した抗体カクテル（１００μＬ／１０７ ｃｅｌｌｓ）及びウサギＩｇＧ（５０μｇ／ｍＬ Ｚｙｍｅｄ社製）を加え、氷上で３０分間静置した。
ＭＡＣＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した後、抗ＰＥ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ （２０μＬ／１０７ ｃｅｌｌｓ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）とＭＡＣＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（８０μＬ／１０７ ｃｅｌｌｓ）を加え、４〜８℃で１５分間静置した。
反応液の２０倍量のＭＡＣＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した後、ＭＡＣＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．５ｍＬ／１０８ ｃｅｌｌｓ）に懸濁し、自動磁気分離システム（Ａｕｔｏ ＭＡＣＳ、 Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）を用いてネガティブフラクションを分離した。
分離した細胞を１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄した後、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）加基本培地に懸濁した。
反応液の２０倍量のＭＡＣＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した後、ＭＡＣＳ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．５ｍＬ／１０８ ｃｅｌｌｓ）に懸濁し、自動磁気分離システム（Ａｕｔｏ ＭＡＣＳ、 Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製）を用いてネガティブフラクションを分離した。
分離した細胞を１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄した後、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）加基本培地に懸濁した。
基本培地は、ペニシリン（１００，０００ Ｕ／Ｌ、 明治製菓社製）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／Ｌ、 明治製菓社製）、２−メルカプトエタノール（５０μＭ、 Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｌ−グルタミン酸（２ｍＭ、 ナカライテスク社製）、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ、 同仁化学社製）加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に５６℃、３０分非働化したＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を１０％添加したものを用いた。
ＧＭ−ＣＳＦは、マウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を導入したｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍａ Ｘ６３−Ａｇ８（Ｊ５５８Ｌ−ＧＭ−ＣＳＦ）の培養上清を基本培地に１０％添加した。細胞液をトリパンブルー（Ｇｉｂｃｏ社製）で懸濁し、血球計算板を用いて細胞数を計測した後、細胞培養用６ウェルプレート（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に１．２ｘ１０６／４ｍＬ／ウェルとなるように分注し、培養した。
培養開始後３日目及び６日目に培地を２ｍＬ吸引除去して新しいＧＭ−ＣＳＦ加基本培地を２ｍＬ加え、培養開始後８日目に浮遊細胞を未成熟樹状細胞として回収した（ＣＤ１１ｃ陽性細胞＞９５％）。細胞を１％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄した後、基本培地に懸濁し、骨髄由来樹状細胞懸濁液とした。
（３）インターロイキン１２産生促進活性の測定
実施例１と同様に行った。結果を図３に示す。
インターロイキン１２産生促進活性は、ＴＬＲ３ノックアウトマウスからの骨髄由来樹状細胞で減少したが、ＴＬＲ７ノックアウトマウスからの骨髄由来樹状細胞では変化がなかった。このことより、免疫調節作用を有するＲＮＡ画分は、ＴＬＲ７のリガンドである１本鎖ＲＮＡではなく、ＴＬＲ３のリガンドである２本鎖ＲＮＡであることが示された。
また、ＴＬＲ３ノックアウトマウスからの骨髄由来樹状細胞で減少することから、ＴＬＲ３のアダプター分子であるＴＲＩＦに依存したシグナル変換経路が、免疫調節作用に関係していることが示された。
ＭｙＤ８８ノックアウトマウスからの骨髄由来樹状細胞では、インターロイキン１２産生促進活性が消失した。
これらのことから、２本鎖ＲＮＡを含有するテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１菌体による免疫調節作用においては、ＴＲＩＦ依存性シグナル変換経路とＭｙＤ８８依存性シグナル変換経路が協調的に働いていることが示された。
実施例１と同様に行った。結果を図３に示す。
インターロイキン１２産生促進活性は、ＴＬＲ３ノックアウトマウスからの骨髄由来樹状細胞で減少したが、ＴＬＲ７ノックアウトマウスからの骨髄由来樹状細胞では変化がなかった。このことより、免疫調節作用を有するＲＮＡ画分は、ＴＬＲ７のリガンドである１本鎖ＲＮＡではなく、ＴＬＲ３のリガンドである２本鎖ＲＮＡであることが示された。
また、ＴＬＲ３ノックアウトマウスからの骨髄由来樹状細胞で減少することから、ＴＬＲ３のアダプター分子であるＴＲＩＦに依存したシグナル変換経路が、免疫調節作用に関係していることが示された。
ＭｙＤ８８ノックアウトマウスからの骨髄由来樹状細胞では、インターロイキン１２産生促進活性が消失した。
これらのことから、２本鎖ＲＮＡを含有するテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１菌体による免疫調節作用においては、ＴＲＩＦ依存性シグナル変換経路とＭｙＤ８８依存性シグナル変換経路が協調的に働いていることが示された。
＜１本鎖ＲＮＡのみを切断する条件（０．３Ｍ ＮａＣｌ）下で牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ処理を行ったテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１菌体のインターロイキン１２産生促進試験＞
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体において、免疫調節作用を有する２本鎖ＲＮＡが生産されることを、牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡに対する感受性の違いを利用して確認した。
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体において、免疫調節作用を有する２本鎖ＲＮＡが生産されることを、牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡに対する感受性の違いを利用して確認した。
（１）乳酸菌懸濁液の調製
１０％の塩を含むＭＲＳ培地にテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株を１×１０６個／ｍｌとなるように接種した。７２時間静置培養した後、９５℃で１０分間の加熱殺菌を行った。サンプルから２画分採取し、片方は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で、もう片方は０．３Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄後、それぞれの液に懸濁した。懸濁液は、ＯＤ６００ｎｍの値が１０になるように調製した。
１０％の塩を含むＭＲＳ培地にテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株を１×１０６個／ｍｌとなるように接種した。７２時間静置培養した後、９５℃で１０分間の加熱殺菌を行った。サンプルから２画分採取し、片方は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で、もう片方は０．３Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄後、それぞれの液に懸濁した。懸濁液は、ＯＤ６００ｎｍの値が１０になるように調製した。
（２）牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ処理
上記乳酸菌懸濁液に１０μｇ／ｍｌとなるように牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、３７℃で２時間インキュベートを行った。本酵素処理において、ＮａＣｌ非存在下では１本鎖ＲＮＡと２本鎖ＲＮＡの両方が分解され、０．３Ｍ ＮａＣｌ存在下では、１本鎖ＲＮＡのみが分解される。酵素処理後、それぞれ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び０．３Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で２回洗浄し、その後ＲＰＭＩ完全培地に懸濁した。懸濁液は、ＯＤ６００ｎｍの値が０．１２５になるように調製した。
上記乳酸菌懸濁液に１０μｇ／ｍｌとなるように牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、３７℃で２時間インキュベートを行った。本酵素処理において、ＮａＣｌ非存在下では１本鎖ＲＮＡと２本鎖ＲＮＡの両方が分解され、０．３Ｍ ＮａＣｌ存在下では、１本鎖ＲＮＡのみが分解される。酵素処理後、それぞれ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び０．３Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で２回洗浄し、その後ＲＰＭＩ完全培地に懸濁した。懸濁液は、ＯＤ６００ｎｍの値が０．１２５になるように調製した。
（３）腹腔滲出マクロファージ細胞の採取、調製
実施例１と同様に行った。
実施例１と同様に行った。
（４）インターロイキン１２産生促進活性の測定
実施例１と同様に行った。
結果を図４に示す。ＮａＣｌ非存在下で酵素処理を行ったサンプルでは、インターロイキン１２産生促進活性が大きく低下したが、０．３Ｍ ＮａＣｌ存在下酵素処理を行ったサンプルでは、インターロイキン１２産生促進活性の低下が少なかった。これにより、２本鎖ＲＮＡ画分にインターロイキン１２産生促進活性を有することが示された。
実施例１と同様に行った。
結果を図４に示す。ＮａＣｌ非存在下で酵素処理を行ったサンプルでは、インターロイキン１２産生促進活性が大きく低下したが、０．３Ｍ ＮａＣｌ存在下酵素処理を行ったサンプルでは、インターロイキン１２産生促進活性の低下が少なかった。これにより、２本鎖ＲＮＡ画分にインターロイキン１２産生促進活性を有することが示された。
（５）菌体中のＲＮＡが分解されることの確認
加熱殺菌した乳酸菌懸濁液をＲＮａｓｅＡ処理することにより、菌体内のＲＮＡが分解されうることを以下のようにして確認した。
加熱殺菌した乳酸菌懸濁液をＲＮａｓｅＡ処理することにより、菌体内のＲＮＡが分解されうることを以下のようにして確認した。
以下のサンプル<1>から<3>のサンプル、<1>加熱殺菌した乳酸菌、<2>加熱殺菌した後に１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）下でＲＮａｓｅＡ処理した乳酸菌、<3>加熱殺菌した後に０．３Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）下でＲＮａｓｅＡ処理した乳酸菌のそれぞれを、２．５ｍｌのＳＴＥ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に懸濁した。ここに、５０ｍｇ／ｍｌのリゾチームを０．２５ｍｌ添加し、３７℃で３０分インキュベートした。
その後、５０μｌのＳＴＥ緩衝液、０．１５ｍｌの１０％ＳＤＳ、１５μｌの２０ｍｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。そこに３ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコールを添加し、混和して遠心し、上清を回収した。
その後、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを添加して混和し、遠心して上清を回収した。この操作を２度行った。０．６等量のイソプロパノールを添加して沈殿させた後、５ｍｌのＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁した。１ｍｌのクロロホルムを添加し、混和して遠心し、上清を回収した。その後、２．５ｍｌのイソプロパノールを添加し、１０分放置後、遠心して沈殿を回収することによってＲＮＡ画分を得た。これらのＲＮＡ画分のアガロースゲル電気泳動を行った。
結果を図５に示す。ＲＮＡは主に低分子の状態で存在した（白三角印）。また、ＴＲＩｚｏｌ処理で除去しきれなかったＴｈ２２１株が保有するプラスミドＤＮＡも検出された（黒矢頭）。低分子ＲＮＡ画分をデンシトメーターで測定した結果、図５に示す数値が得られ、加熱殺菌した乳酸菌懸濁液をＲＮａｓｅＡ処理することにより、菌体内のＲＮＡが分解されていることが確認できた。
＜１本鎖核酸を切断するＳ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ酵素処理を行ったテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１菌体のインターロイキン１２産生促進試験＞
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体において、免疫調節作用を有する核酸の構造として２本鎖構造が重要であることを、実施例３の牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡに対する感受性の違いを用いた試験に加えて、１本鎖核酸を切断するＳ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ酵素処理試験を行って確認した。
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体において、免疫調節作用を有する核酸の構造として２本鎖構造が重要であることを、実施例３の牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡに対する感受性の違いを用いた試験に加えて、１本鎖核酸を切断するＳ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ酵素処理試験を行って確認した。
（１）乳酸菌懸濁液の調製
１０％の塩を含むＭＲＳ培地にテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株を１×１０６個／ｍｌとなるように接種した。７２時間静置培養した後、９５℃で１０分間の加熱殺菌を行った。サンプルは３つの画分に分割し、第１画分は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で、第２画分は０．３Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で、第３画分はＳ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ緩衝液（３０ｍＭ 酢酸ナトリウム ｐＨ４．６、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＳＯ４）で洗浄後、それぞれの液に懸濁した。懸濁液は、ＯＤ６００ｎｍの値が１０になるように調製した。
１０％の塩を含むＭＲＳ培地にテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株を１×１０６個／ｍｌとなるように接種した。７２時間静置培養した後、９５℃で１０分間の加熱殺菌を行った。サンプルは３つの画分に分割し、第１画分は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で、第２画分は０．３Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で、第３画分はＳ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ緩衝液（３０ｍＭ 酢酸ナトリウム ｐＨ４．６、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＳＯ４）で洗浄後、それぞれの液に懸濁した。懸濁液は、ＯＤ６００ｎｍの値が１０になるように調製した。
（２）牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ処理及びＳ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ酵素処理
第１画分及び第２画分には１０μｇ／ｍｌとなるように牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、３７℃で２時間インキュベートを行った。第３画分にはＳ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ（宝酒造社製）を２０００Ｕ／ｍｌになるように添加した。酵素処理後、それぞれの酵素処理緩衝液で２回洗浄し、その後ＲＰＭＩ完全培地に懸濁した。懸濁液は、ＯＤ６００ｎｍの値が０．１２５になるように調製した。
第１画分及び第２画分には１０μｇ／ｍｌとなるように牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、３７℃で２時間インキュベートを行った。第３画分にはＳ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ（宝酒造社製）を２０００Ｕ／ｍｌになるように添加した。酵素処理後、それぞれの酵素処理緩衝液で２回洗浄し、その後ＲＰＭＩ完全培地に懸濁した。懸濁液は、ＯＤ６００ｎｍの値が０．１２５になるように調製した。
（３）腹腔滲出マクロファージ細胞の採取、調製及び骨髄由来樹状細胞の調製
腹腔滲出マクロファージ細胞の採取、調製は実施例１と同様に行った。骨髄由来樹状細胞の調製は実施例２と同様に行った。
腹腔滲出マクロファージ細胞の採取、調製は実施例１と同様に行った。骨髄由来樹状細胞の調製は実施例２と同様に行った。
（４）インターロイキン１２産生促進活性の測定
腹腔滲出マクロファージ細胞からのインターロイキン１２産生促進活性の測定は実施例１と同様に行った。結果を図６に示す。ＮａＣｌ非存在下でＲＮａｓｅＡ処理を行ったサンプルでは、インターロイキン１２産生促進活性が大きく低下したが、０．３Ｍ ＮａＣｌ存在下でＲＮａｓｅＡ処理を行ったサンプル及びＳ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ酵素処理を行ったサンプルでは、インターロイキン１２産生促進活性の低下が見られなかった。
腹腔滲出マクロファージ細胞からのインターロイキン１２産生促進活性の測定は実施例１と同様に行った。結果を図６に示す。ＮａＣｌ非存在下でＲＮａｓｅＡ処理を行ったサンプルでは、インターロイキン１２産生促進活性が大きく低下したが、０．３Ｍ ＮａＣｌ存在下でＲＮａｓｅＡ処理を行ったサンプル及びＳ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ酵素処理を行ったサンプルでは、インターロイキン１２産生促進活性の低下が見られなかった。
骨髄由来樹状細胞からのインターロイキン１２産生促進活性の測定は実施例２と同様に行った。結果を図７に示す。ＮａＣｌ非存在下でＲＮａｓｅＡ処理を行ったサンプルでは、インターロイキン１２産生促進活性が大きく低下したが、０．３Ｍ ＮａＣｌ存在下でＲＮａｓｅＡ処理を行ったサンプル及びＳ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ酵素処理を行ったサンプルでは、インターロイキン１２産生促進活性の低下が見られなかった。
また、インターロイキン１２産生への関与が報告されているインターフェロンβも測定した。骨髄由来樹状細胞からのインターフェロンβ産生促進活性（培養６時間、ＰＢＬ社製インターフェロンβ測定キット使用）は図８に示すとおりであった。
これらの結果より、免疫調節作用を有する核酸の構造として２本鎖構造が重要であることが示された。
＜各種乳酸菌体における２本鎖ＲＮＡの生産＞
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＮＢＲＣ１２１７２株菌体、ペディオコッカス・ペントサセウスＯＳ株菌体、ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ１９１５株菌体、ラクトバチルス・プランタラムＮＲＩＣ１９３０株菌体、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＮＲＩＣ１６８８株菌体、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＮＲＩＣ１６８３株菌体、ラクトバチルス・ブレビスＮＲＩＣ１７１３株菌体、ストレプトコッカス・サーモフィラスＮＲＩＣ０２５６株菌体、ロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１株菌体、市販のヤクルト（ヤクルト社製）分離株菌体、植物性乳酸菌ラブレ（カゴメ社製）分離株菌体においても、免疫調節作用を有する２本鎖ＲＮＡが生産されることを牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡに対する感受性の違いを利用して確認した。
なお、乳酸菌同定キットＡＰＩ５０ＣＨ（日本ビオメリュー社製）により、ヤクルト分離株はラクトバチルス属・パラカゼイ種・パラカゼイ亜種、植物性乳酸菌ラブレ分離株は、ラクトバチルス属・ブレビス種あるいはラクトバチルス種コリノイデス種と同定された。
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＮＢＲＣ１２１７２株菌体、ペディオコッカス・ペントサセウスＯＳ株菌体、ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ１９１５株菌体、ラクトバチルス・プランタラムＮＲＩＣ１９３０株菌体、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＮＲＩＣ１６８８株菌体、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＮＲＩＣ１６８３株菌体、ラクトバチルス・ブレビスＮＲＩＣ１７１３株菌体、ストレプトコッカス・サーモフィラスＮＲＩＣ０２５６株菌体、ロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１株菌体、市販のヤクルト（ヤクルト社製）分離株菌体、植物性乳酸菌ラブレ（カゴメ社製）分離株菌体においても、免疫調節作用を有する２本鎖ＲＮＡが生産されることを牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡに対する感受性の違いを利用して確認した。
なお、乳酸菌同定キットＡＰＩ５０ＣＨ（日本ビオメリュー社製）により、ヤクルト分離株はラクトバチルス属・パラカゼイ種・パラカゼイ亜種、植物性乳酸菌ラブレ分離株は、ラクトバチルス属・ブレビス種あるいはラクトバチルス種コリノイデス種と同定された。
（１）乳酸菌懸濁液の調製
１０％の食塩を含むＭＲＳ培地にテトラジェノコッカス・ハロフィラスＮＢＲＣ１２１７２株を、通常のＭＲＳ培地にその他の株を１×１０６個／ｍｌとなるように接種した。テトラジェノコッカス・ハロフィラスＮＢＲＣ１２１７２株は、７２時間、その他の株は４８時間静置培養した後、９５℃で１０分間の加熱殺菌を行った。サンプルから２画分採取し、一方は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で、もう一方は０．３Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄後、それぞれの液に懸濁した。懸濁液は、ＯＤ６００ｎｍの値が約１０になるように調製した。
１０％の食塩を含むＭＲＳ培地にテトラジェノコッカス・ハロフィラスＮＢＲＣ１２１７２株を、通常のＭＲＳ培地にその他の株を１×１０６個／ｍｌとなるように接種した。テトラジェノコッカス・ハロフィラスＮＢＲＣ１２１７２株は、７２時間、その他の株は４８時間静置培養した後、９５℃で１０分間の加熱殺菌を行った。サンプルから２画分採取し、一方は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で、もう一方は０．３Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄後、それぞれの液に懸濁した。懸濁液は、ＯＤ６００ｎｍの値が約１０になるように調製した。
（２）牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ処理
上記乳酸菌懸濁液に１０μｇ／ｍｌの濃度となるように牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、３７℃で２時間インキュベートを行った。本酵素処理において、ＮａＣｌ非存在下では１本鎖ＲＮＡと２本鎖ＲＮＡの両方が分解され、０．３Ｍ ＮａＣｌ存在下では、１本鎖ＲＮＡのみが分解される。
酵素処理後、それぞれ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び０．３Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄し、その後ＲＰＭＩ完全培地に懸濁した。懸濁液は、ＯＤ６００ｎｍの値が０．１２５になるように調製した。
上記乳酸菌懸濁液に１０μｇ／ｍｌの濃度となるように牛膵臓由来ＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、３７℃で２時間インキュベートを行った。本酵素処理において、ＮａＣｌ非存在下では１本鎖ＲＮＡと２本鎖ＲＮＡの両方が分解され、０．３Ｍ ＮａＣｌ存在下では、１本鎖ＲＮＡのみが分解される。
酵素処理後、それぞれ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び０．３Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄し、その後ＲＰＭＩ完全培地に懸濁した。懸濁液は、ＯＤ６００ｎｍの値が０．１２５になるように調製した。
（３）腹腔滲出マクロファージ細胞の採取、調製
実施例１と同様に行った。
実施例１と同様に行った。
（４）インターロイキン１２産生促進活性の測定
実施例１と同様に行った。
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＮＢＲＣ１２１７２株菌体の結果を図９に、ペディオコッカス・ペントサセウスＯＳ株菌体の結果を図１０に、ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ１９１５株菌体の結果を図１１に、ラクトバチルス・プランタラムＮＲＩＣ１９３０株菌体の結果を図１２に、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＮＲＩＣ１６８８株菌体の結果を図１３に、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＮＲＩＣ１６８３株菌体の結果を図１４に、ラクトバチルス・ブレビスＮＲＩＣ１７１３株菌体の結果を図１５に、ストレプトコッカス・サーモフィラスＮＲＩＣ０２５６株菌体の結果を図１６に、ロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１株菌体の結果を図１７に、市販のヤクルト（ヤクルト社製）より分離した分離株菌体の結果を図１８に、植物性乳酸菌ラブレ（カゴメ社製）より分離した分離株菌体の結果を図１９に示す。
いずれの場合もＮａＣｌ非存在下で酵素処理を行ったサンプルでは、インターロイキン１２産生促進活性が大きく低下したが、０．３Ｍ ＮａＣｌ存在下酵素処理を行ったサンプルでは、インターロイキン１２産生促進活性の低下が少なかった。これにより、２本鎖ＲＮＡ画分にインターロイキン１２産生促進活性を有することが示された。
実施例１と同様に行った。
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＮＢＲＣ１２１７２株菌体の結果を図９に、ペディオコッカス・ペントサセウスＯＳ株菌体の結果を図１０に、ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ１９１５株菌体の結果を図１１に、ラクトバチルス・プランタラムＮＲＩＣ１９３０株菌体の結果を図１２に、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＮＲＩＣ１６８８株菌体の結果を図１３に、ラクトバチルス・デルブリュッキー・サブスピーシーズ・ラクティスＮＲＩＣ１６８３株菌体の結果を図１４に、ラクトバチルス・ブレビスＮＲＩＣ１７１３株菌体の結果を図１５に、ストレプトコッカス・サーモフィラスＮＲＩＣ０２５６株菌体の結果を図１６に、ロイコノストック・シュードメセンテロイデスＡＴＣＣ１２２９１株菌体の結果を図１７に、市販のヤクルト（ヤクルト社製）より分離した分離株菌体の結果を図１８に、植物性乳酸菌ラブレ（カゴメ社製）より分離した分離株菌体の結果を図１９に示す。
いずれの場合もＮａＣｌ非存在下で酵素処理を行ったサンプルでは、インターロイキン１２産生促進活性が大きく低下したが、０．３Ｍ ＮａＣｌ存在下酵素処理を行ったサンプルでは、インターロイキン１２産生促進活性の低下が少なかった。これにより、２本鎖ＲＮＡ画分にインターロイキン１２産生促進活性を有することが示された。
＜ＴＬＲ３をノックアウトしたマウスの骨髄由来樹状細胞における各種乳酸菌のインターロイキン１２産生促進試験＞
ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ００９９株菌体、ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ１９１５株菌体、ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ０１２２株菌体、ラクトバチルス・ペントーサスＮＲＩＣ０３９１株菌体、ラクトバチルス・ペントーサスＮＲＩＣ０３９６株菌体、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・カゼイＮＲＩＣ０６４４株菌体、ラクトバチルス・プランタラムＮＲＩＣ１０６７株菌体、ラクトバチルス・ペントーサスＮＲＩＣ１８３６株菌体、ラクトバチルス・プランタラムＮＲＩＣ１９３０株菌体、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイＮＲＩＣ１９３６、ロイコノストック・ラクティスＮＲＩＣ１５８２株菌体、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・メセンテロイデスＮＲＩＣ１９８２株菌体においても、免疫調節作用を有する２本鎖ＲＮＡが生産されることを、２本鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲ３をノックアウトしたマウスから骨髄由来樹状細胞を調製し、インターロイキン１２産生促進活性を測定することで確認した。
ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ００９９株菌体、ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ１９１５株菌体、ペディオコッカス・ペントサセウスＮＲＩＣ０１２２株菌体、ラクトバチルス・ペントーサスＮＲＩＣ０３９１株菌体、ラクトバチルス・ペントーサスＮＲＩＣ０３９６株菌体、ラクトバチルス・カゼイ・サブスピーシーズ・カゼイＮＲＩＣ０６４４株菌体、ラクトバチルス・プランタラムＮＲＩＣ１０６７株菌体、ラクトバチルス・ペントーサスＮＲＩＣ１８３６株菌体、ラクトバチルス・プランタラムＮＲＩＣ１９３０株菌体、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイＮＲＩＣ１９３６、ロイコノストック・ラクティスＮＲＩＣ１５８２株菌体、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・メセンテロイデスＮＲＩＣ１９８２株菌体においても、免疫調節作用を有する２本鎖ＲＮＡが生産されることを、２本鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲ３をノックアウトしたマウスから骨髄由来樹状細胞を調製し、インターロイキン１２産生促進活性を測定することで確認した。
（１）乳酸菌懸濁液の調製
ＭＲＳ培地に各種乳酸菌を１×１０７個／ｍｌとなるように接種した。３０℃で４８〜７２時間静置培養した後、９５℃で１０分間の煮沸殺菌を行った。その後、遠心濃縮機によって培地を除去して集菌した。生理食塩水にて菌体を洗浄後、基本培地で懸濁して調製した。
ＭＲＳ培地に各種乳酸菌を１×１０７個／ｍｌとなるように接種した。３０℃で４８〜７２時間静置培養した後、９５℃で１０分間の煮沸殺菌を行った。その後、遠心濃縮機によって培地を除去して集菌した。生理食塩水にて菌体を洗浄後、基本培地で懸濁して調製した。
（２）骨髄由来樹状細胞の調製
実施例２と同様に行った。
実施例２と同様に行った。
（３）インターロイキン１２産生促進活性の測定
実施例２と同様に行った。結果を図２０に示す。インターロイキン１２産生促進活性がＴＬＲ３ノックアウトマウスからの骨髄由来樹状細胞で減少したことから、ＴＬＲ３のリガンドである２本鎖ＲＮＡが免疫調節作用を有し、図２０に示す菌体内に２本鎖ＲＮＡが生産されていることが示された。
本試験では、インターロイキン１２産生への関与が報告されているインターフェロンβも測定した。骨髄由来樹状細胞からのインターフェロンβ産生促進活性（培養６時間、ＰＢＬ社製インターフェロンβ測定キット使用）は図２１に示すとおりであった。
実施例２と同様に行った。結果を図２０に示す。インターロイキン１２産生促進活性がＴＬＲ３ノックアウトマウスからの骨髄由来樹状細胞で減少したことから、ＴＬＲ３のリガンドである２本鎖ＲＮＡが免疫調節作用を有し、図２０に示す菌体内に２本鎖ＲＮＡが生産されていることが示された。
本試験では、インターロイキン１２産生への関与が報告されているインターフェロンβも測定した。骨髄由来樹状細胞からのインターフェロンβ産生促進活性（培養６時間、ＰＢＬ社製インターフェロンβ測定キット使用）は図２１に示すとおりであった。
＜ＴＲＩＦ経路阻害剤存在下でのテトラジェノコッカス・ハロフィラスのインターロイキン１２産生促進試験＞
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体及びテトラジェノコッカス・ハロフィラスＮＢＲＣ１２１７２株菌体について、ＴＲＩＦ経路阻害剤存在下でのインターロイキン１２産生促進活性を測定した。
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体及びテトラジェノコッカス・ハロフィラスＮＢＲＣ１２１７２株菌体について、ＴＲＩＦ経路阻害剤存在下でのインターロイキン１２産生促進活性を測定した。
（１）乳酸菌懸濁液の調製
食塩を１０％含有するＭＲＳ培地にテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体及びテトラジェノコッカス・ハロフィラスＮＢＲＣ１２１７２株菌体を１×１０６個／ｍｌとなるように接種した。７２時間静置培養した後、９５℃で１０分間の加熱殺菌を行った。菌体を生理食塩水で洗浄後、ＲＰＭＩ完全培地に懸濁した。懸濁液は、ＯＤ６００ｎｍの値が０．２５、０．１２５になるように調製した。
食塩を１０％含有するＭＲＳ培地にテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体及びテトラジェノコッカス・ハロフィラスＮＢＲＣ１２１７２株菌体を１×１０６個／ｍｌとなるように接種した。７２時間静置培養した後、９５℃で１０分間の加熱殺菌を行った。菌体を生理食塩水で洗浄後、ＲＰＭＩ完全培地に懸濁した。懸濁液は、ＯＤ６００ｎｍの値が０．２５、０．１２５になるように調製した。
（２）ＴＲＩＦ経路阻害剤の添加
ＴＢＫ１（キナーゼ）は、ＴＲＩＦと相互作用し、転写因子ＩＲＦ−３をリン酸化することが知られている。このＴＢＫ１活性を阻害することが知られているレスベラトロールを乳酸菌懸濁液に下記のとおりに添加した。レスベラトロール（Ｓｉｇｍａ社製）を２０ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、２．５ｍＭになるようにＤＭＳＯにて溶解した。また、コントロールとしてＤＭＳＯのみも用意した。これらのレスベラトロール溶解液を１％（ｖ／ｖ）になるように菌体懸濁液に添加した。
ＴＢＫ１（キナーゼ）は、ＴＲＩＦと相互作用し、転写因子ＩＲＦ−３をリン酸化することが知られている。このＴＢＫ１活性を阻害することが知られているレスベラトロールを乳酸菌懸濁液に下記のとおりに添加した。レスベラトロール（Ｓｉｇｍａ社製）を２０ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、２．５ｍＭになるようにＤＭＳＯにて溶解した。また、コントロールとしてＤＭＳＯのみも用意した。これらのレスベラトロール溶解液を１％（ｖ／ｖ）になるように菌体懸濁液に添加した。
（３）腹腔滲出マクロファージ細胞の採取、調製
実施例１と同様に行った。
実施例１と同様に行った。
（４）インターロイキン１２産生促進活性の測定
実施例１と同様に行った。菌体と細胞の共培養液中のレスベラトロール濃度は、終濃度１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１２．５μＭ、０μＭである。
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１菌体の結果を図２２に、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＮＢＲＣ１２１７２株菌体の結果を図２３に示す。いずれの場合も、レスベラトロールの濃度依存的にインターロイキン１２産生促進活性が低下した。このことから、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体及びテトラジェノコッカス・ハロフィラスＮＢＲＣ１２１７２株菌体によるインターロイキン１２産生促進がＴＲＩＦ依存性シグナル変換経路の賦活化によることが示された。
実施例１と同様に行った。菌体と細胞の共培養液中のレスベラトロール濃度は、終濃度１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１２．５μＭ、０μＭである。
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１菌体の結果を図２２に、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＮＢＲＣ１２１７２株菌体の結果を図２３に示す。いずれの場合も、レスベラトロールの濃度依存的にインターロイキン１２産生促進活性が低下した。このことから、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体及びテトラジェノコッカス・ハロフィラスＮＢＲＣ１２１７２株菌体によるインターロイキン１２産生促進がＴＲＩＦ依存性シグナル変換経路の賦活化によることが示された。
＜ＴＲＩＦをノックアウトしたマウスの骨髄由来樹状細胞におけるテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１菌体のインターロイキン１２産生促進試験＞
免疫調節作用にかかわるシグナル変換経路のアダプター分子であるＴＲＩＦをノックアウトしたマウスから骨髄由来樹状細胞を調製し、インターロイキン１２産生促進活性を測定した。
免疫調節作用にかかわるシグナル変換経路のアダプター分子であるＴＲＩＦをノックアウトしたマウスから骨髄由来樹状細胞を調製し、インターロイキン１２産生促進活性を測定した。
（１）乳酸菌懸濁液の調製
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株の培養は、食塩を１０％含有したＭＲＳ培地で行い、実施例１と同様にして乳酸菌懸濁液を調製した。
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株の培養は、食塩を１０％含有したＭＲＳ培地で行い、実施例１と同様にして乳酸菌懸濁液を調製した。
（２）骨髄由来樹状細胞の調製
実施例２と同様にして調製した。
実施例２と同様にして調製した。
（３）インターロイキン１２産生促進活性の測定
実施例１と同様に行った。結果を図２４に示す。
ＴＲＩＦノックアウトマウスからの骨髄由来樹状細胞では、インターロイキン１２産生促進活性は減少した。このことから、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体によるインターロイキン１２産生促進に、ＴＲＩＦ依存性シグナル変換経路の賦活化が関わっていることが示された。
実施例１と同様に行った。結果を図２４に示す。
ＴＲＩＦノックアウトマウスからの骨髄由来樹状細胞では、インターロイキン１２産生促進活性は減少した。このことから、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体によるインターロイキン１２産生促進に、ＴＲＩＦ依存性シグナル変換経路の賦活化が関わっていることが示された。
＜テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体のインターロイキン１２産生促進試験におけるＴＬＲ３ ｍＲＮＡの発現＞
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体のインターロイキン１２産生促進試験において、ＴＬＲ３ ｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にて測定した。
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体のインターロイキン１２産生促進試験において、ＴＬＲ３ ｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にて測定した。
（１）乳酸菌懸濁液の調製
乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株の培養は、食塩を１０％含有したＭＲＳ培地で行い、実施例１と同様にして乳酸菌懸濁液を調製した。
乳酸菌テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株の培養は、食塩を１０％含有したＭＲＳ培地で行い、実施例１と同様にして乳酸菌懸濁液を調製した。
（２）腹腔滲出マクロファージ細胞の採取、調製
実施例１と同様にして調製した。
実施例１と同様にして調製した。
（３）ＴＬＲ３ ｍＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
細胞懸濁液と乳酸菌懸濁液との共培養は、実施例１と同様に行った。２４時間の共培養後、上清を除去し、ＰＢＳにて洗浄を行った。そこに、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を２００μｌ添加し、エッペンドルフチューブにサンプルを回収した。クロロホルムを４０μｌ添加、攪拌・遠心後、水層を回収し、そこに等量のクロロホルムを添加した。攪拌・遠心後、水層を回収し、イソプロパノールを１．７倍量添加し、混和した。４℃、１２，０００ｒｐｍで遠心後、沈殿を回収し、７０％エタノールで洗浄後、ＤＥＰＣ水（Ａｍｂｉｏｎ社製）に溶解して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに用いるテンプレートとした。
細胞懸濁液と乳酸菌懸濁液との共培養は、実施例１と同様に行った。２４時間の共培養後、上清を除去し、ＰＢＳにて洗浄を行った。そこに、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を２００μｌ添加し、エッペンドルフチューブにサンプルを回収した。クロロホルムを４０μｌ添加、攪拌・遠心後、水層を回収し、そこに等量のクロロホルムを添加した。攪拌・遠心後、水層を回収し、イソプロパノールを１．７倍量添加し、混和した。４℃、１２，０００ｒｐｍで遠心後、沈殿を回収し、７０％エタノールで洗浄後、ＤＥＰＣ水（Ａｍｂｉｏｎ社製）に溶解して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに用いるテンプレートとした。
ＴＬＲ３のＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして、
５’−ＧＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＴＣＴＴＴＴ−３’（配列番号１）、
ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒとして、
５’−ＣＣＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡＡＣＴＧＧＣＣＡ−３’（配列番号２）、
を使用した。
内部標準としてはβアクチンを使用し、ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして、
５’−ＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＧ−３’（配列番号３）、
ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒとして、
５’−ＧＧＴＣＴＴＴＡＣＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＧＴＣ−３’（配列番号４）、
を使用した。
ＳＹＢＲ ＥｘＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ 宝酒造社製）を用い、添付のプロトコールにしたがってリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い、解析した。
５’−ＧＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＴＣＴＴＴＴ−３’（配列番号１）、
ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒとして、
５’−ＣＣＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＡＡＣＴＧＧＣＣＡ−３’（配列番号２）、
を使用した。
内部標準としてはβアクチンを使用し、ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして、
５’−ＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＧ−３’（配列番号３）、
ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒとして、
５’−ＧＧＴＣＴＴＴＡＣＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＧＴＣ−３’（配列番号４）、
を使用した。
ＳＹＢＲ ＥｘＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ 宝酒造社製）を用い、添付のプロトコールにしたがってリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い、解析した。
結果を図２５に示す。
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体との共培養によって、ＴＬＲ３ ｍＲＮＡの発現の発現が１０倍に増加した。すなわち、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体によるインターロイキン１２産生促進は、ＴＬＲ３の活性化によることであることが示された。
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体との共培養によって、ＴＬＲ３ ｍＲＮＡの発現の発現が１０倍に増加した。すなわち、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体によるインターロイキン１２産生促進は、ＴＬＲ３の活性化によることであることが示された。
＜テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体由来の２本鎖ＲＮＡの製造、２本鎖ＲＮＡを含有する菌体の製造＞
１０％の食塩を含むＭＲＳ培地（ＢＤ社製）４００ｍｌにテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株を１×１０６個／ｍｌとなるように接種した。７２時間静置培養した後、９５℃で１０分間の加熱殺菌を行った。その後、遠心によって培地を除去して集菌した。この菌体を５ｍｌのＳＴＥ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に懸濁した。
ここに、１ｍｌ ５０ｍｇ／ｍｌのリゾチームを添加し、３７℃で３０分インキュベートした。
その後、０．１ｍｌのＳＴＥ緩衝液、０．３ｍｌの１０％ＳＤＳ、３０μｌの２０ｍｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。そこに６ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコールを添加し、混和して遠心し、上清を回収した。
その後、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを添加して混和し、遠心して上清を回収した。この操作を２度行った。０．６等量のイソプロパノールを添加して沈殿させた後、１０ｍｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。
１０％の食塩を含むＭＲＳ培地（ＢＤ社製）４００ｍｌにテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株を１×１０６個／ｍｌとなるように接種した。７２時間静置培養した後、９５℃で１０分間の加熱殺菌を行った。その後、遠心によって培地を除去して集菌した。この菌体を５ｍｌのＳＴＥ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に懸濁した。
ここに、１ｍｌ ５０ｍｇ／ｍｌのリゾチームを添加し、３７℃で３０分インキュベートした。
その後、０．１ｍｌのＳＴＥ緩衝液、０．３ｍｌの１０％ＳＤＳ、３０μｌの２０ｍｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。そこに６ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコールを添加し、混和して遠心し、上清を回収した。
その後、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを添加して混和し、遠心して上清を回収した。この操作を２度行った。０．６等量のイソプロパノールを添加して沈殿させた後、１０ｍｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。
この該粗核酸抽出液に対し、エタノールの最終濃度が１５％となるようにエタノールを加え、十分混和する。この溶液に、ＣＦ１１セルロース粉末（ワットマン社製）を最終濃度が５％になるように加え、氷中で１０分間穏やかに振とうし、２本鎖ＲＮＡをセルロース粉末へ吸着させる。２本鎖ＲＮＡを吸着させたセルロース粉末は、遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、５分間）によって、沈殿として回収できる。回収されたセルロースは、１５％エタノール／ＳＴＥ緩衝液、ｐＨ８．０に再懸濁し、得られた懸濁液をエコノパックカラム（バイオラッド社製）に注ぎ入れる。このカラムに１００ｍｌの１５％エタノール／ＳＴＥ緩衝液ｐＨ８．０を通過させ、２本鎖ＲＮＡ以外の吸着成分を洗い流す。セルロースカラムに吸着された２本鎖ＲＮＡは、エタノールを含まないＳＴＥ緩衝液１０ｍｌをカラムに通過させ、得られた液体試料からエタノール沈殿によって、２本鎖ＲＮＡを得ることができる。
この試料中に残存するＤＮＡを除去するために、まず、ＤＮａｓｅI（宝酒造社製）処理を行う。ひきつづき、１本鎖ＲＮＡを除去するために、０．３ＭのＮａＣｌ存在下で牛脾臓ＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を行う。その後、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿を行い、精製２本鎖ＲＮＡを得ることができる。得られた精製２本鎖ＲＮＡは、リポソーム化して生体に投与できる。
＜骨髄由来樹状細胞の活性化測定試験＞
乳酸菌の培養塩濃度に依存して２本鎖ＲＮＡ含量が上昇するとき、乳酸菌の添加により、骨髄由来樹状細胞のＴＬＲ３経由でインターフェロンβが産生され、細胞の活性化状態に影響を与えることが考えられる。
異なる塩濃度で調製したテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体で骨髄由来樹状細胞を刺激し、そのときの樹状細胞の活性化状態を測定した。
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体の調製は、実施例１と同様の方法で行った。骨髄由来樹状細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスより骨髄細胞を採取後、実施例２と同様の方法で得た。
骨髄由来樹状細胞と乳酸菌の共培養は実施例１と同様の方法で行った。共培養２４時間後に骨髄由来樹状細胞を回収し、細胞表面の活性化マーカーを調べた。
具体的にはＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６の各活性化マーカーを、それぞれＰＥ標識抗ＣＤ４０抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、ＰＥ標識抗ＣＤ８０抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、ＰＥ標識抗ＣＤ８６抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）で検出した。細胞は、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）で測定を行い、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）によって解析を行った。
各活性化マーカーの発現量は、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株の培養塩濃度に依存して上昇した。このことから、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体内の２本鎖ＲＮＡ含量が塩濃度依存的に上昇していると考えられた。結果を図２６に示す。
乳酸菌の培養塩濃度に依存して２本鎖ＲＮＡ含量が上昇するとき、乳酸菌の添加により、骨髄由来樹状細胞のＴＬＲ３経由でインターフェロンβが産生され、細胞の活性化状態に影響を与えることが考えられる。
異なる塩濃度で調製したテトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体で骨髄由来樹状細胞を刺激し、そのときの樹状細胞の活性化状態を測定した。
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体の調製は、実施例１と同様の方法で行った。骨髄由来樹状細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウスより骨髄細胞を採取後、実施例２と同様の方法で得た。
骨髄由来樹状細胞と乳酸菌の共培養は実施例１と同様の方法で行った。共培養２４時間後に骨髄由来樹状細胞を回収し、細胞表面の活性化マーカーを調べた。
具体的にはＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６の各活性化マーカーを、それぞれＰＥ標識抗ＣＤ４０抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、ＰＥ標識抗ＣＤ８０抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、ＰＥ標識抗ＣＤ８６抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）で検出した。細胞は、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）で測定を行い、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）によって解析を行った。
各活性化マーカーの発現量は、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株の培養塩濃度に依存して上昇した。このことから、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体内の２本鎖ＲＮＡ含量が塩濃度依存的に上昇していると考えられた。結果を図２６に示す。
＜テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体内の２本鎖ＲＮＡ含量＞
実施例１１の結果から、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体内の２本鎖ＲＮＡ含量が培養時の塩濃度依存的に上昇していると考えられた。そこで、塩濃度の異なる条件で培養した菌体から２本鎖ＲＮＡ画分を精製し、含量を調べた。
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体の培養、加熱殺菌、集菌は、実施例１と同様の方法で行った。この菌体をＳＴＥ緩衝液に懸濁し、ＯＤ６００ｎｍの値が８０になるように調製した。以降、実験操作による回収率のばらつきをみるために、各サンプルを３分割して並行して進めた。実施例３の（５）と同様の方法で粗核酸抽出液を得、この該粗核酸抽出液に対し、ＴＲＩｚｏｌ処理（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、添付説明書に従って処理）を行うことでＲＮＡ画分を得、次いでＳ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ酵素処理（宝酒造社製、添付説明書に従って処理）で１本鎖核酸の分解を行うことにより２本鎖ＲＮＡ画分を得た。これらの２本鎖ＲＮＡ画分のアガロースゲル電気泳動を行い、含量を調べた。
結果を図２７に示す。テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体内の２本鎖ＲＮＡ含量は培養時の塩濃度依存的に上昇していることが確認できた。
実施例１１の結果から、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体内の２本鎖ＲＮＡ含量が培養時の塩濃度依存的に上昇していると考えられた。そこで、塩濃度の異なる条件で培養した菌体から２本鎖ＲＮＡ画分を精製し、含量を調べた。
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体の培養、加熱殺菌、集菌は、実施例１と同様の方法で行った。この菌体をＳＴＥ緩衝液に懸濁し、ＯＤ６００ｎｍの値が８０になるように調製した。以降、実験操作による回収率のばらつきをみるために、各サンプルを３分割して並行して進めた。実施例３の（５）と同様の方法で粗核酸抽出液を得、この該粗核酸抽出液に対し、ＴＲＩｚｏｌ処理（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、添付説明書に従って処理）を行うことでＲＮＡ画分を得、次いでＳ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ酵素処理（宝酒造社製、添付説明書に従って処理）で１本鎖核酸の分解を行うことにより２本鎖ＲＮＡ画分を得た。これらの２本鎖ＲＮＡ画分のアガロースゲル電気泳動を行い、含量を調べた。
結果を図２７に示す。テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体内の２本鎖ＲＮＡ含量は培養時の塩濃度依存的に上昇していることが確認できた。
＜テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株由来の２本鎖ＲＮＡの精製と免疫調節活性の測定＞
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株由来から２本鎖ＲＮＡ画分を精製し、そのいくつかについて配列を決定し、免疫調節活性を測定した。
免疫調節活性としては、骨髄由来樹状細胞からのインターロイキン１２産生促進活性を測定した。あるいは、インターロイキン１２産生に関与するサイトカインの１つとしてインターフェロンβが知られていることから、骨髄由来樹状細胞からのインターフェロンβ産生促進活性を測定した。
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株由来から２本鎖ＲＮＡ画分を精製し、そのいくつかについて配列を決定し、免疫調節活性を測定した。
免疫調節活性としては、骨髄由来樹状細胞からのインターロイキン１２産生促進活性を測定した。あるいは、インターロイキン１２産生に関与するサイトカインの１つとしてインターフェロンβが知られていることから、骨髄由来樹状細胞からのインターフェロンβ産生促進活性を測定した。
（１）テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株由来２本鎖ＲＮＡ画分の精製
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株の培養液１０Ｌから精製を開始した。培養、加熱殺菌、集菌、溶菌、クロロホルム／イソアミルアルコール処理、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理、イソプロパノール沈殿は実施例１０と同様に行い、粗核酸抽出液を得た。
この該粗核酸抽出液に対し、ＴＲＩｚｏｌ処理（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、添付説明書に従って処理）、ＤＮａｓｅ処理（寶酒造社製、添付説明書に従って処理）、０．３Ｍ ＮａＣｌ存在下でのＲＮａｓｅＡ処理（Ｓｉｇｍａ社製、実施例３と同様な方法で処理）、再度ＴＲＩｚｏｌ処理（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、添付説明書に従って処理）、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ−ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、添付説明書に従って処理）、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、添付説明書に従って処理）の処理を行い、２本鎖ＲＮＡ画分を得た。
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株の培養液１０Ｌから精製を開始した。培養、加熱殺菌、集菌、溶菌、クロロホルム／イソアミルアルコール処理、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理、イソプロパノール沈殿は実施例１０と同様に行い、粗核酸抽出液を得た。
この該粗核酸抽出液に対し、ＴＲＩｚｏｌ処理（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、添付説明書に従って処理）、ＤＮａｓｅ処理（寶酒造社製、添付説明書に従って処理）、０．３Ｍ ＮａＣｌ存在下でのＲＮａｓｅＡ処理（Ｓｉｇｍａ社製、実施例３と同様な方法で処理）、再度ＴＲＩｚｏｌ処理（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、添付説明書に従って処理）、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ−ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、添付説明書に従って処理）、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、添付説明書に従って処理）の処理を行い、２本鎖ＲＮＡ画分を得た。
（２）精製２本鎖ＲＮＡ画分のインターロイキン１２産生促進活性の測定
上記（１）で精製した２本鎖ＲＮＡ画分についてインターロイキン１２産生促進活性を測定した。骨髄由来樹状細胞は実施例２と同様にして調製した。
骨髄由来樹状細胞に精製２本鎖ＲＮＡ画分を添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間共培養を行った。インターロイキン１２産生促進活性は実施例１と同様にして測定した。
結果を図２８に示す。精製２本鎖ＲＮＡ画分の濃度依存的にインターロイキン１２産生促進活性は上昇した。
このとき、インターロイキン１２産生への関与が報告されているインターフェロンβも測定した。結果を図２９に示す。骨髄由来樹状細胞からのインターフェロンβ産生促進活性（培養６時間、ＰＢＬ社製インターフェロンβ測定キット使用）は精製２本鎖ＲＮＡ画分の濃度依存的に上昇した。
上記（１）で精製した２本鎖ＲＮＡ画分についてインターロイキン１２産生促進活性を測定した。骨髄由来樹状細胞は実施例２と同様にして調製した。
骨髄由来樹状細胞に精製２本鎖ＲＮＡ画分を添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間共培養を行った。インターロイキン１２産生促進活性は実施例１と同様にして測定した。
結果を図２８に示す。精製２本鎖ＲＮＡ画分の濃度依存的にインターロイキン１２産生促進活性は上昇した。
このとき、インターロイキン１２産生への関与が報告されているインターフェロンβも測定した。結果を図２９に示す。骨髄由来樹状細胞からのインターフェロンβ産生促進活性（培養６時間、ＰＢＬ社製インターフェロンβ測定キット使用）は精製２本鎖ＲＮＡ画分の濃度依存的に上昇した。
（３）ｃＤＮＡクローニング
精製２本鎖ＲＮＡ画分からｃＤＮＡの合成は、Ｌａｍｂｄｅｎらの方法（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ， １９９２， ６６， １８１７−１８２２）に従って行った。合成したｃＤＮＡはｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。約６０クローンが得られ、そのうち２クローンの塩基配列を決定したところ、以下のような配列であった。
ＤＳＲ１（４６ｍｅｒ）：
５’−ＡＡＡＴＴＴＴＣＡＡＡＡＡＣＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＡＡＡＡＴＣＣＡＡＴＴＧＡＡＡ−３’（配列番号５）、
ＤＳＲ２（１１９ｍｅｒ）：
５’−ＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＴＴＣＧＴＧＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＧＡＣＡＡＧＴＡＴＣＡＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＧＣＴＴＴＴＧＡＡＣＡＣＴＴＴＴＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＴＣＴＣＴＡＴＧＧＣＡＴＣＧＡＴＣＡＴＧＡＧＴＧＴＧＡＡＡＧ−３’（配列番号６）、
精製２本鎖ＲＮＡ画分からｃＤＮＡの合成は、Ｌａｍｂｄｅｎらの方法（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ， １９９２， ６６， １８１７−１８２２）に従って行った。合成したｃＤＮＡはｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。約６０クローンが得られ、そのうち２クローンの塩基配列を決定したところ、以下のような配列であった。
ＤＳＲ１（４６ｍｅｒ）：
５’−ＡＡＡＴＴＴＴＣＡＡＡＡＡＣＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＡＡＡＡＴＣＣＡＡＴＴＧＡＡＡ−３’（配列番号５）、
ＤＳＲ２（１１９ｍｅｒ）：
５’−ＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＴＴＣＧＴＧＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＧＡＣＡＡＧＴＡＴＣＡＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＧＣＴＴＴＴＧＡＡＣＡＣＴＴＴＴＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＴＣＴＣＴＡＴＧＧＣＡＴＣＧＡＴＣＡＴＧＡＧＴＧＴＧＡＡＡＧ−３’（配列番号６）、
（４）２本鎖ＲＮＡ ＤＳＲ１のインターフェロンβ産生促進活性
インターフェロンβはインターロイキン１２産生への関与が報告されているサイトカインである。そこで骨髄由来樹状細胞からのインターフェロンβ産生促進活性を測定した。
２本鎖ＲＮＡ ＤＳＲ１は株式会社ジーンデザインに合成を委託した。
骨髄由来樹状細胞は実施例２と同様にして調製した。骨髄由来樹状細胞に合成ＲＮＡを添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で６時間共培養を行った。インターフェロンβ産生促進活性はＰＢＬ社製インターフェロンβ測定キットを使用して測定した。
２本鎖合成ＲＮＡの濃度依存的な応答を調べた結果を図３０に示す。２本鎖合成ＲＮＡの濃度依存的に活性は上昇した。
また、野生型及びＴＬＲ３ノックアウトマウスからの骨髄由来樹状細胞を用いて調べた結果を図３１に示す。ＴＬＲ３ノックアウトマウスからの骨髄由来樹状細胞でインターフェロンβ産生促進活性が減少したことから、２本鎖合成ＲＮＡがＴＬＲ３を介してインターフェロンβを産生していることが示された。
インターフェロンβはインターロイキン１２産生への関与が報告されているサイトカインである。そこで骨髄由来樹状細胞からのインターフェロンβ産生促進活性を測定した。
２本鎖ＲＮＡ ＤＳＲ１は株式会社ジーンデザインに合成を委託した。
骨髄由来樹状細胞は実施例２と同様にして調製した。骨髄由来樹状細胞に合成ＲＮＡを添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で６時間共培養を行った。インターフェロンβ産生促進活性はＰＢＬ社製インターフェロンβ測定キットを使用して測定した。
２本鎖合成ＲＮＡの濃度依存的な応答を調べた結果を図３０に示す。２本鎖合成ＲＮＡの濃度依存的に活性は上昇した。
また、野生型及びＴＬＲ３ノックアウトマウスからの骨髄由来樹状細胞を用いて調べた結果を図３１に示す。ＴＬＲ３ノックアウトマウスからの骨髄由来樹状細胞でインターフェロンβ産生促進活性が減少したことから、２本鎖合成ＲＮＡがＴＬＲ３を介してインターフェロンβを産生していることが示された。
（５）ＤＳＲ１を３分割した短い２本鎖ＲＮＡのインターフェロンβ産生促進活性
２本鎖ＲＮＡ ＤＳＲ１に加え、ＤＳＲ１を３分割した短い２本鎖ＲＮＡ（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３）も株式会社ジーンデザインに合成を委託した。Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３はそれぞれ以下のような配列である。
Ｓ１（１８ｍｅｒ）：ＤＳＲ１の１塩基目から１８塩基目まで
５’−ＡＡＡＴＴＴＴＣＡＡＡＡＡＣＣＴＧＴ−３’（配列番号７）、
Ｓ２（１５ｍｅｒ）：ＤＳＲ１の１８塩基目から３２塩基目まで
５’−ＴＴＴＴＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＡ−３’（配列番号８）、
Ｓ３（１５ｍｅｒ）：ＤＳＲ１の３２塩基目から４６塩基目まで
５’−ＡＡＡＡＴＣＣＡＡＴＴＧＡＡＡ−３’（配列番号９）、
骨髄由来樹状細胞は実施例２と同様にして調製した。骨髄由来樹状細胞に合成ＲＮＡを添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で６時間共培養を行った。インターフェロンβ産生促進活性はＰＢＬ社製インターフェロンβ測定キットを使用して測定した。
結果を図３２に示す。配列及び長さによって、インターフェロンβ量に違いは見られるものの、２本鎖合成ＲＮＡによって骨髄由来樹状細胞からインターフェロンβが産生されることを確認できた。
２本鎖ＲＮＡ ＤＳＲ１に加え、ＤＳＲ１を３分割した短い２本鎖ＲＮＡ（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３）も株式会社ジーンデザインに合成を委託した。Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３はそれぞれ以下のような配列である。
Ｓ１（１８ｍｅｒ）：ＤＳＲ１の１塩基目から１８塩基目まで
５’−ＡＡＡＴＴＴＴＣＡＡＡＡＡＣＣＴＧＴ−３’（配列番号７）、
Ｓ２（１５ｍｅｒ）：ＤＳＲ１の１８塩基目から３２塩基目まで
５’−ＴＴＴＴＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＡ−３’（配列番号８）、
Ｓ３（１５ｍｅｒ）：ＤＳＲ１の３２塩基目から４６塩基目まで
５’−ＡＡＡＡＴＣＣＡＡＴＴＧＡＡＡ−３’（配列番号９）、
骨髄由来樹状細胞は実施例２と同様にして調製した。骨髄由来樹状細胞に合成ＲＮＡを添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で６時間共培養を行った。インターフェロンβ産生促進活性はＰＢＬ社製インターフェロンβ測定キットを使用して測定した。
結果を図３２に示す。配列及び長さによって、インターフェロンβ量に違いは見られるものの、２本鎖合成ＲＮＡによって骨髄由来樹状細胞からインターフェロンβが産生されることを確認できた。
（６）２本鎖ＲＮＡ ＤＳＲ２のインターフェロンβ産生促進活性
２本鎖ＲＮＡ ＤＳＲ２は以下のようにして合成した。まず、ＤＳＲ２ ＤＮＡの５’側あるいは３’側にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域を付加した２種類のＰＣＲ増幅反応物を作製した。
テンプレートとしては、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株ゲノムをショットガンクローニングしたプラスミドのうち、ＤＳＲ２領域を含むものを用いた。実際に用いたプライマーは以下のとおりである：
Ｔ７ＤＳＲ２Ｆ（５０ｍｅｒ）：
５’−ＧＡＴＣＡＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＴＴＣＧＴ−３’（配列番号１０）、
ＤＳＲ２Ｃ（２４ｍｅｒ）：
５’−ＣＴＴＴＣＡＣＡＣＴＣＡＴＧＡＴＣＧＡＴＧＣＣＡ−３’（配列番号１１）、
ＤＳＲ２Ｆ（２４ｍｅｒ）：
５’−ＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＴＴＣＧＴ−３’（配列番号１２）、
Ｔ７ＤＳＲ２Ｃ（５０ｍｅｒ）：
５’−ＧＡＴＣＡＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＴＴＣＡＣＡＣＴＣＡＴＧＡＴＣＧＡＴＧＣＣＡ−３’（配列番号１３）、
ＰＣＲ産物はＭＥＲｍａｉｄ Ｋｉｔ（ＭＰバイオメディカル社製）を用い、添付説明書に従って精製した。これをテンプレートとして、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロトランスクリプションを行った（寶酒造社製ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｔ７ Ｋｉｔ使用、添付説明書に従って実施）。
合成された転写物は、ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製し、モル数を合わせてアニーリング操作を行って２本鎖ＲＮＡを形成させた。これをエタノール沈殿で精製したものを以降の試験に用いた。
骨髄由来樹状細胞は実施例２と同様にして調製した。骨髄由来樹状細胞に合成ＲＮＡを添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間共培養を行った。インターフェロンβ産生促進活性はＰＢＬ社製インターフェロンβ測定キットを使用して測定した。
結果を図３３に示す。２本鎖合成ＲＮＡ ＤＳＲ２によって骨髄由来樹状細胞からインターフェロンβが産生されることが示された。
２本鎖ＲＮＡ ＤＳＲ２は以下のようにして合成した。まず、ＤＳＲ２ ＤＮＡの５’側あるいは３’側にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域を付加した２種類のＰＣＲ増幅反応物を作製した。
テンプレートとしては、テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株ゲノムをショットガンクローニングしたプラスミドのうち、ＤＳＲ２領域を含むものを用いた。実際に用いたプライマーは以下のとおりである：
Ｔ７ＤＳＲ２Ｆ（５０ｍｅｒ）：
５’−ＧＡＴＣＡＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＴＴＣＧＴ−３’（配列番号１０）、
ＤＳＲ２Ｃ（２４ｍｅｒ）：
５’−ＣＴＴＴＣＡＣＡＣＴＣＡＴＧＡＴＣＧＡＴＧＣＣＡ−３’（配列番号１１）、
ＤＳＲ２Ｆ（２４ｍｅｒ）：
５’−ＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＴＴＣＧＴ−３’（配列番号１２）、
Ｔ７ＤＳＲ２Ｃ（５０ｍｅｒ）：
５’−ＧＡＴＣＡＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＴＴＣＡＣＡＣＴＣＡＴＧＡＴＣＧＡＴＧＣＣＡ−３’（配列番号１３）、
ＰＣＲ産物はＭＥＲｍａｉｄ Ｋｉｔ（ＭＰバイオメディカル社製）を用い、添付説明書に従って精製した。これをテンプレートとして、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロトランスクリプションを行った（寶酒造社製ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｔ７ Ｋｉｔ使用、添付説明書に従って実施）。
合成された転写物は、ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製し、モル数を合わせてアニーリング操作を行って２本鎖ＲＮＡを形成させた。これをエタノール沈殿で精製したものを以降の試験に用いた。
骨髄由来樹状細胞は実施例２と同様にして調製した。骨髄由来樹状細胞に合成ＲＮＡを添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間共培養を行った。インターフェロンβ産生促進活性はＰＢＬ社製インターフェロンβ測定キットを使用して測定した。
結果を図３３に示す。２本鎖合成ＲＮＡ ＤＳＲ２によって骨髄由来樹状細胞からインターフェロンβが産生されることが示された。
＜乳酸菌のＲＮＡがインターフェロンγ産生細胞の誘導に及ぼす影響＞
骨髄由来樹状細胞とＣＤ４＋ Ｔ細胞の共培養を行う試験において乳酸菌を添加するとき、菌体のＲＮａｓｅＡ処理の有無によって、インターフェロンγ産生細胞の誘導にどのような影響が見られるかを確認した。
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体は食塩を１０％含有するＭＲＳ培地で培養した。ＲＮａｓｅＡ処理を行う菌体及び行わない菌体の調製は実施例１と同様に行った。骨髄由来樹状細胞の調製は実施例２と同様に行った。
また、ＣＤ４＋ Ｔ細胞はＤＯ１１．１０マウスの脾臓から調製した。ＤＯ１１．１０マウスの脾臓を採取後、メッシュによりすり潰し、脾臓細胞を得た。その後、抗マウスＣＤ４ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）と３０分間インキュベートし、Ａｕｔｏ ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）により、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を得た。
９６ウェルプレートにおいて１ウェル当たり１×１０６個の骨髄由来樹状細胞と５×１０５個のＣＤ４＋ Ｔ細胞を培養した。同時に、ＲＮａｓｅＡ処理を行った乳酸菌及び行っていない乳酸菌を５×１０７個添加した。
培養開始３日目に培地交換を行い、７日目にフローサイトメトリー ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ社製）を用いて、インターフェロンγ産生細胞、インターロイキン４産生細胞の割合を調べた。測定には抗マウスインターフェロンγ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と抗マウスインターロイキン４抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いた。
結果を図３４に示す。テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１の刺激によりインターフェロンγ産生細胞の割合が増加した。そして菌体のＲＮａｓｅＡ処理により、インターフェロンγ産生細胞の誘導は抑制された。このことから、乳酸菌のＲＮＡがインターフェロンγ産生細胞の誘導に関わっていることが確認された。
骨髄由来樹状細胞とＣＤ４＋ Ｔ細胞の共培養を行う試験において乳酸菌を添加するとき、菌体のＲＮａｓｅＡ処理の有無によって、インターフェロンγ産生細胞の誘導にどのような影響が見られるかを確認した。
テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１株菌体は食塩を１０％含有するＭＲＳ培地で培養した。ＲＮａｓｅＡ処理を行う菌体及び行わない菌体の調製は実施例１と同様に行った。骨髄由来樹状細胞の調製は実施例２と同様に行った。
また、ＣＤ４＋ Ｔ細胞はＤＯ１１．１０マウスの脾臓から調製した。ＤＯ１１．１０マウスの脾臓を採取後、メッシュによりすり潰し、脾臓細胞を得た。その後、抗マウスＣＤ４ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）と３０分間インキュベートし、Ａｕｔｏ ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）により、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を得た。
９６ウェルプレートにおいて１ウェル当たり１×１０６個の骨髄由来樹状細胞と５×１０５個のＣＤ４＋ Ｔ細胞を培養した。同時に、ＲＮａｓｅＡ処理を行った乳酸菌及び行っていない乳酸菌を５×１０７個添加した。
培養開始３日目に培地交換を行い、７日目にフローサイトメトリー ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ社製）を用いて、インターフェロンγ産生細胞、インターロイキン４産生細胞の割合を調べた。測定には抗マウスインターフェロンγ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と抗マウスインターロイキン４抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いた。
結果を図３４に示す。テトラジェノコッカス・ハロフィラスＴｈ２２１の刺激によりインターフェロンγ産生細胞の割合が増加した。そして菌体のＲＮａｓｅＡ処理により、インターフェロンγ産生細胞の誘導は抑制された。このことから、乳酸菌のＲＮＡがインターフェロンγ産生細胞の誘導に関わっていることが確認された。
Claims (9)
- 乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡ。
- 乳酸菌がテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする、請求項１記載の乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡ。
- 免疫調節作用がＴＲＩＦ依存性シグナル変換経路又はＭｙＤ８８依存性シグナル変換経路の賦活化であることを特徴とする、請求項１〜２記載の乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡ。
- ＴＲＩＦ依存性シグナル変換経路又はＭｙＤ８８依存性シグナル変換経路の賦活化がトル様（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ）受容体３（ＴＬＲ３）の活性化であることを特徴とする、請求項３記載の乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡ。
- 乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡを有効成分とする免疫調節剤。
- 乳酸菌がテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする、請求項５記載の免疫調節剤。
- ストレス条件下で乳酸菌を培養することによって菌体内に２本鎖ＲＮＡを生産させることを特徴とする、乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡの製造法。
- 乳酸菌がテトラジェノコッカス属、ペディオコッカス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属から選択される１種又は２種以上であることを特徴とする、請求項７記載の乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡの製造法。
- テトラジェノコッカス属に属する乳酸菌を塩分０．５〜２５％の乳酸菌用培地で培養することによって菌体内に２本鎖ＲＮＡを生産させることを特徴とする、乳酸菌由来の２本鎖ＲＮＡの製造法。
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