KR20210128551A - Treg 세포의 유도 및 병원성 사이토카인의 억제능을 갖는 효모 유래 다당체의 구조 및 기능 특성 및 이의 용도 - Google Patents

Treg 세포의 유도 및 병원성 사이토카인의 억제능을 갖는 효모 유래 다당체의 구조 및 기능 특성 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20210128551A
KR20210128551A KR1020200046142A KR20200046142A KR20210128551A KR 20210128551 A KR20210128551 A KR 20210128551A KR 1020200046142 A KR1020200046142 A KR 1020200046142A KR 20200046142 A KR20200046142 A KR 20200046142A KR 20210128551 A KR20210128551 A KR 20210128551A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
mgcp
polysaccharide
glucan
treg
Prior art date
Application number
KR1020200046142A
Other languages
English (en)
Inventor
임신혁
라비 비르마
이창헌
Original Assignee
기초과학연구원
포항공과대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 기초과학연구원, 포항공과대학교 산학협력단 filed Critical 기초과학연구원
Priority to KR1020200046142A priority Critical patent/KR20210128551A/ko
Publication of KR20210128551A publication Critical patent/KR20210128551A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0087—Glucomannans or galactomannans; Tara or tara gum, i.e. D-mannose and D-galactose units, e.g. from Cesalpinia spinosa; Tamarind gum, i.e. D-galactose, D-glucose and D-xylose units, e.g. from Tamarindus indica; Gum Arabic, i.e. L-arabinose, L-rhamnose, D-galactose and D-glucuronic acid units, e.g. from Acacia Senegal or Acacia Seyal; Derivatives thereof
    • C08B37/009—Konjac gum or konjac mannan, i.e. beta-D-glucose and beta-D-mannose units linked by 1,4 bonds, e.g. from Amorphophallus species; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/125—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols; containing starch hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1114—T cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1121—Dendritic cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Abstract

본 발명은 β-글루칸 및 만난(mannan)을 포함하는 효모 유래 다당체 및 이의 용도 에 관한 것으로, 상기 다당체는, 낮은 용량으로도 본 다당체가 가지는 β-글루칸 및 만난(mannan) 구조를 통해 면역관용성 항원 제시 세포(tolerogenic antigen presenting cell)를 생성하고 이에 의해 조절 T 세포(Treg 세포)의 분화 또는 생성을 유도하여 면역 체계를 조절할 수 있다. 따라서, MGCP 및 상기 유도된 Treg 세포는 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 및 치료에 유용하다.

Description

Treg 세포의 유도 및 병원성 사이토카인의 억제능을 갖는 효모 유래 다당체의 구조 및 기능 특성 및 이의 용도{Yeast-derived polysaccharides inducing Treg cells and inhibiting pathogenic cytokines and uses thereofStructure and functional characterization of yeast derived polysaccharides in inducing Treg cells}
본 발명은 β-글루칸 및 만난(mannan)을 포함하는 효모 유래 다당체 및 이의 용도 에 관한 것으로 보다 상세하게는 만난(mannan) 및 β-글루칸(β-glucan)을 포함하는 다당체, 상기 다당체를 유효성분으로 함유하는 면역 조절용 조성물, 상기 다당체를 유효성분으로 함유하는 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 식품, 상기 다당체를 이용한 조절 T 세포의 제조방법, 상기 제조방법으로 제조된 조절 T 세포를 유효성분으로 함유하는 세포치료제 및 치료방법에 관한 것이다.
포유류는 면역 시스템과 끊임없이 상호 작용하는 일련의 미생물을 보유하고 있다. 공생 미생물은 숙주와 공생관계를 맺으며, 소화, 행동, 면역 시스템의 성숙과 같은 다양한 과정에서 숙주와 상호 작용한다(Cerf-Bensussan N, Gaboriau-Routhiau V. The immune system and the gut microbiota: friends or foes? Nat Rev Immunol 2010;10(10):735-44.). 마찬가지로, 곰팡이는 인체에 존재하며, 숙주의 면역시스템에 영향을 준다(Wheeler ML, Limon JJ, Underhill DM. Immunity to Commensal Fungi: Detente and Disease. Annu Rev Pathol 2017;12:359-85.). 선천성 면역세포는 Toll-유사 수용체(Toll-like receptors, TLRs)와 같은 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptors, PRRs)를 통해 다당류를 포함한 곰팡이 세포 표면의 다양한 병원균 관련 분자 패턴(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)을 검출한다. 신호를 탐지하면 선천성 면역세포가 유전자 발현 profile을 변경하고 후천적 면역을 조율하기 위해 사이토카인과 같은 면역 신호 분자를 생산한다(Iliev ID, Leonardi I. Nat Rev Immunol 2017;17(10):635-46., Underhill DM, Iliev ID. Nat Rev Immunol 2014;14(6):405-16. 및 Brubaker SW, Bonham KS, Zanoni I, et al. Annu Rev Immunol 2015;33:257-90.).
이러한 공생 미생물들은 T 헬퍼 17 세포(Th17) 또는 조절 T 세포(Treg 세포)와 같은 CD4 세포의 특정 계통의 발달과 분화를 조절한다. Treg 세포는 면역억제기능을 가진 CD4+ 세포의 하위 집합이며 전사 인자 Foxp3의 발현을 특징으로 한다. Treg 세포는 크게 생성 위치에 따라 흉선 유래 세포 (nTreg 세포) 및 비흉선 세포로서, 2차 면역기관에서 CD4+ T naive로부터 유도 된 Treg 세포 (iTreg 또는 pTreg)로 나누어 진다. 생체 내 Treg 세포의 강화는 자가면역 및 알레르기 진환과 같은 다양한 과면역 질환을 조절할 수 있다. 이러한 Treg 세포 생성의 기본 분자 메커니즘은 명확히 밝혀진 바 없으며, 여러 연구에 따르면, 박테리아가 생산한 대사 산물 또는 특정 화학 구조를 갖는 세포벽 유래 다당체들이 Treg 세포의 분화를 촉진할 수 있다고 한다. 예를 들어 부티레이트는 클로스트리디아에 의해 대장 Treg 세포를 유도하는 주요 효과 분자로 보고되었다 (Furusawa et al., Nature 504:446-450, 2013). B. fragilis의 쌍성이온 다당류인 다당류 A (PSA)는 Treg 세포를 생산하는 IL-10 유도에 중요한 효과 면역조절제로 확인되었다 (Mazmanian et al., Cell 122:107-118, 2005; Ochoa-Reparaz et al., The Journal of Immunology 185:4101-4108, 2010).
이와 같은 미생물 또는 이의 대사산물 등을 환자의 치료에 이용하기 위해서, 일부 환자는 과다 활성화된 면역반응 (즉, 알레르기 또는 자가면역 질환)을 억제해야 하는 반면, 일부 환자는 면역계를 강화 (즉, 암 또는 바이러스 감염)시킬 필요가 있다. 예를 들어, Th17-유도 프로바이오틱스 균인 비피도박테리움을 류마티스성 관절염 동물모델에 투여했을 때 관절염 증상을 악화시켰다 (Tze Guan Tan, 113(50):E8141-E8150, 2016). 따라서, 유익한 미생물의 동정 및 그 작용인자의 메커니즘을 밝히는 것은 치료학적으로 매우 중요하다.
한편, 효모 유래 다당류는 면역 조절 기능을 가지고 있으며, 면역시스템을 활성화 하거나 억제하기 위한 치료제로 이용된다(Tzianabos AO. Clin Microbiol Rev 2000;13(4):523-33.) β-글루칸은 복잡하고 다양한 구조를 가진 곰팡이 세포벽의 가장 풍부한 다당류이다(Camilli G, Tabouret G, Quintin J. The Complexity of Fungal beta-Glucan in Health and Disease: Effects on the Mononuclear Phagocyte System.). 이들은 면역 반응에 영향을 미치는 생물학적 반응을 조절하는 것으로 알려져 있다(Silva VdO, de Moura NO, de Oliveira LJR, et al. Promising Effects of Beta-Glucans on Metabolism and on the Immune Responses: Review Article.).
일반적으로, 연구자들은 β-글루칸을 전염병 치료제 또는 암 치료제의 보조제로 사용해왔다(Sun B, Yu S, Zhao D, et al. Polysaccharides as vaccine adjuvants. Vaccine 2018;36(35):5226-34. 및 Novak M, Vetvicka V. Beta-glucans, history, and the present: immunomodulatory aspects and mechanisms of action. J Immunotoxicol 2008;5(1):47-57.). 반면에 몇몇의 연구에서는 β-글루칸이 항 염증성 기능을 가지는 것으로 보고하고 있다(Dalonso N, Goldman GH, Gern RM. Appl Microbiol Biotechnol 2015;99(19):7893-906. 및 Lee KH, Park M, Ji KY, et al. Bacterial beta-(1,3)-glucan prevents DSS-induced IBD by restoring the reduced population of regulatory T cells.). 곰팡이의 β-글루칸과 유사하게 곰팡이 만난 또한 면역조절 역할을 수행하는 것으로 보고 되었다(Saijo S, Ikeda S, Yamabe K, et al. Dectin-2 recognition of alpha-mannans and induction of Th17 cell differentiation is essential for host defense against Candida albicans.). 그러나 면역 조절자로서의 다당류의 역할이 보고됨에도 불구하고, 다당류가 면역계를 조절하는 정확한 요소 및 메커니즘은 아직 명확하게 밝혀진 바 없다. 특히 다당체의 구조와 분자량에 따라 서로 다르게 일어나는 면역 반응 (면역 증강 또는 과민면역억제 반응)에 대해서는 정확히 규정된 바 없다. 이를 규명하는 것은, 특정 질환에서 관찰되는, 잘못된 면역반응을 원하는 방향으로 재설계하는데 매우 중요하며, 질환 치료제 개발에도 적용될 수 있다.
자이모산(zymosan)은 효모의 유령 세포(ghost cell, Saccharomyces cerevisiae)로서, 대부분의 효모들은 유사한 세포벽 성분을 가지고 있다. 효모 (이스트) 세포벽은 만난으로 구성된 외막과 β-1,6-글루칸을 통해 연결된 여러 층의 β-1,3-linked 글루칸의 복잡한 구조를 가진 글루칸으로 구성된 내막으로 구분되는 두 개의 층 구조를 갖는다(Gow NAR, Latge JP, Munro CA. The Fungal Cell Wall: Structure, Biosynthesis, and Function. Microbiol Spectr 2017;5(3)). 자이모산의 다당류는 주로 구조적으로 이스트와 유사한 β-글루칸과 만난으로 구성된다. 이외 많은 연구에서 곰팡이 다당류의 면역 시스템에 대한 역할을 연구하기 위해 자이모산을 활용했으나, 이러한 연구결과는 논란의 여지가 있다. 일부 연구에 따르면, 자이모산이 면역 시스템을 활성화시켜 염증성 질환을 악화시키는 것으로 나타났으며(Sanguedolce MV, Capo C, Bongrand P, et al. Zymosan-stimulated tumor necrosis factor-alpha production by human monocytes 및 Gantner BN, Simmons RM, Canavera SJ, et al., J Exp Med 2003;197(9):1107-17), 자가 면역 질환을 완화시키기 위해 항원 특이적 T 세포 반응을 억제하는 IL-10 생성 면역 관용성 항원 제시 세포를 유도함으로써 면역학적으로 내성을 유도할 수 있음을 증명하는 다른 연구들도 있다(Karumuthil-Melethil S, et al. Diabetes 2015;64(4):1341-57 및 Dillon S, Agrawal S, Banerjee K, et al., J Clin Invest 2006;116(4):916-28).
동일한 균주 유래의 다당체에서도 상기 참조된 이전의 문헌들은 서로 상반된 효과를 보고하고 있기 때문에, 미생물 유래의 다당체의 성분, 분자량, 구조 등과 면역 조절효과에 미치는 영향에 대한 메커니즘을 보다 명확하게 규명하고, 목적하는 효과에 따라 다당체를 분류 및 동정할 필요가 있다.
이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 미생물 유래의 다당체의 성분, 구조, 분자량 등과 면역 조절 기능과의 명확한 상관관계 및 매커니즘을 밝히고자 예의 노력한 결과, 대한민국 특허출원 제10-2018-0067535호(출원 공개) 및 제10-2019-0086354호(등록 결정)에서, 신규한 비피도 박테리움 비피덤 균주 및 상기 균주 유래의 다당체(CSGG)가 iTreg 세포의 생성을 유도하여, 면역 억제효과를 나타내고, 동물 실험을 통해 염증질환인 염증성 대장질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인한 바 있다(Ravi Verma et al., Science immunology 3 (28), eaat6975).
나아가, 본 발명자들은 효모 유래의 다당체에서도 면역 억제능을 가지는 정확한 요소 및 메커니즘을 밝히고자 노력한 결과, 효모 세포벽에서부터 신규한 다당체를 정제하고, MGCP(mannan/beta-glucan containing polysaccharides)라 명명하였다. 또한. in vitro 및 in vivo에서 상기 MGCP에 의해 Treg 세포가 유도될 수 있고, MGCP에 의한 Treg 세포의 유도에 만난 및 β-1,6-글루칸을 골격으로 하는 다당체의 구조가 Treg 세포 유도 및 면역 억제능을 나타내는 유효성분임을 확인하였다. 나아가, 본 발명자들의 본 발명의 다당체가 IFN-γ 등의 염증성 사이토카인의 발현을 현저히 완화시킴으로써, 이전 연구에서 규명한 비피도 박테리움 유래의 다당체(CSGG) 또는 D(+)-mannose보다도 현저히 뛰어난 면역 억제능을 나타내고, 동물 실험에서 MGCP 또는 MGCP의 투여로 인해 대장염뿐만 아니라 뇌 척수염과 같은 소화기관 이외의 부분에서의 면역질환에도 현저한 증상 완화 및 치료효과가 있음을 확인하였으며, 나아가, CSGG와는 상이한 매커니즘을 통해 면역 억제효과를 나타내는 것을 확인하고본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 다양한 면역조절효과를 나타내는 것으로 보고되는 미생물 유래의 다당체에서, 각 성분 또는 구조가 면역 시스템에 미치는 효과를 명확히 규명하고, 이의 면역 조절 메커니즘을 확립함으로써, 기존의 다당체와 비교하여 현저히 향상된 면역억제능, 구체적으로는 Treg 유도능 및 염증성 사이토카인 억제능을 갖는 구조를 포함하는 다당체 및 이의 면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용도를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 만난(mannan) 및 β-글루칸(β-glucan)을 포함하는 다당체를 제공한다.
본 발명은 또한, 다당체를 유효성분으로 함유하는 면역 조절용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 다당체를 유효성분으로 함유하는 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방, 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 다당체를 유효성분으로 함유하는 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방, 개선용 식품을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 다당체를 유효성분으로 함유하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 다당체를 유효성분으로 함유하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 항원 제시 세포(antigen presenting cell)에 상기 다당체를 처리하여 면역관용성 항원 제시 세포(tolerogenic antigen presenting cell)를 수득하는 단계; 및 상기 면역관용성 항원 제시 세포(tolerogenic antigen presenting cell)를 CD4+ T 세포와 공배양(co-incubation)하여 조절 T 세포(Treg 세포)를 유도하는 단계를 포함하는 조절 T 세포(Treg 세포)의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 조절 T 세포(Treg 세포)를 유효성분으로 함유하는 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방, 치료 또는 개선용 세포치료제를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 세포치료제를 투여하는 것을 포함하는 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 세포치료제의 용도를 제공한다.
본 발명의 신규한 다당체는, 낮은 용량으로도 다당체가 가지는 β-글루칸 및 만난(mannan) 구조를 통해 면역관용성 항원 제시 세포(tolerogenic antigen presenting cell)를 생성하고 이에 의해 항원 특이적인 조절 T 세포(Treg 세포)의 분화 또는 생성을 유도하여 적은 부작용으로 목표하는 면역 체계를 조절할 수 있다. 따라서, MGCP 및 상기 유도된 Treg 세포는 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 및 치료에 유용하다.
도 1은 비장 CD11c+ DC를 표시된 자이모산으로 자극한 후, 비최적(suboptimal) Treg 또는 Th1 스큐잉(skewing) 조건에서 미접촉 CD4 T 세포와 함께 배양한 결과이다.
도 1A 및 1B는 iTreg 유도 조건(A) 또는 Th1 유도조건(B)에서, Treg 세포 및 Th1 세포의 유동세포 계측분석 플롯 및 빈도를 나타낸 것이다.
도 1C 및 1D는 β-1,3-글루칸이 제거된 자이모산에 의한 Treg 분화환경(C) 또는 Th1 분화환경(D)에서, Treg 세포 및 Th1 세포의 유동세포 계측분석 플롯 및 빈도를 나타낸 것이다.
도 1E 내지 1I는 마우스에 B16.F10 흑색종 세포 2x105 개를 피하에 이식한 뒤, 격일로 자이모산 또는 β-1,3-글루칸이 제거된 자이모산을 투여한 뒤 측정된 종양 성장(E), 대표적 종양 크기(F), 종양 무게(G), 종양 미세환경 및 종양 배출 림프절에서 분석된 IFN-γ+CD4+ T 세포의 빈도(H) 및 CD4+Foxp3+ T 세포의 빈도(I)를 나타낸 것이다
모든 그래프는 평균 ± SEM 값이며, *은 p < 0.05, **은 p < 0.01, ***은 p < 0.001, ****은 p < 0.0001 이다(Student's t test).
도 2는 자이모산으로부터 각각 만난, β-1,6-글루칸을 제거하고 비장 CD11c+ DC에 처리한 뒤, 자극된 DC를 Th1 또는 Treg 세포로의 비최적 스큐잉 조건에서 na
Figure pat00001
ve CD4 T 세포와 함께 배양하여 확인한 결과이다.
도 2A 및 2B는 Treg 유도 조건(A) 또는 Th1 유도 사이토카인의 존재 조건(B)에서 CD4+Foxp3+ T 세포(A) 및 IFN-γ+Foxp3+ T 세포(B)의 유동세포 계측분석 플롯 및 퍼센트를 나타낸 것이다. 데이터는 독립적인 세번의 실험 결과를 나타내고 모든 그래프는 평균 ± SEM 값이며, *은 p < 0.05, **은 p < 0.01, ***은 p < 0.001, ****은 p < 0.0001 이다(Student's t test).
도 3A는 온전한 효모 세포벽 또는 β-1,3-글루칸이 제거된 효모 세포벽으로부터 정제된 다당체를 비장 CD11c+ DC에 처리한 뒤, 최소량의 Treg 유도 사이토카인의 존재아래에서 미접촉 CD4 T 세포와 배양하여 Treg 세포의 빈도를 분석한 결과이다.
도 3B 및 3C는 핵 자기 공명(NMR)을 통한 MGCP의 구조를 분석한 것이다. MGCP는 만난(B) 및 β-1,6-글루칸(C)을 포함한다.
도 3D 및 3G는 도 1과 동일한 방법으로 MGCP를 처리한 결과이다. 비최적 Treg 스큐잉 조건(D) 및 비최적 Th1 스큐잉 조건(E)에서 분석된 Treg 세포의 유동세포 계측 분석 및 빈도를 나타낸다. β-1,6-글루칸이 제거된 MGCP로 유도된 Treg 세포 (F) 및 IFN-γ+CD4+ T 세포 (G)의 유동세포 계측분석 및 빈도이다.
도 3H 내지 3K는 유사유전자형(congenic) 미접촉 CD4 T 세포 (CD45.1+CD4+Foxp3EGFP-CD44loCD62Lhi)와 함께 mock 또는 MGCP 자극된 비장 DC를 배양하여 시험관내에서 iTreg세포를 생성하고, 상기 iTreg 세포 (CD45.1 + CD4 + Foxp3EGFP +)를 FAC로 분류하고 미접촉 CD4 T 세포 (CD45.2+ CD4+Foxp3Thy1.1CD44loCD62Lhi)와 함께, Rag1-/- 마우스로 입양전달하여 평가한 대장염의 증상 및 중증도 체중변화(H) 대장 길이(I), 대장 절편을 H&E로 염색하여 측정한 조직병리학점수(J) 및 대장 점막 고유층(colonic lamina propria)에서 측정된 공여자 미접촉 CD4 T 세포 유래의 IFN-γ의 생산을 나타낸다.
모든 그래프는 평균 ± SEM 값이며, *은 p < 0.05, **은 p < 0.01, ***은 p < 0.001, ****은 p < 0.0001 이다(Student's t test).
도 4A는 MGCP의 조성 분석 결과이다.
도 4B는 MGCP의 양성자 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 화살표는 MGCP에 존재하는 β-1,6-글루칸의 NMR 피크이다.
도 4C 및 4D는 일반적으로 시중에서 판매되는 만난, β-1,3-glucan 및 β-1,6-glucan으로 비장 DC를 프라이밍한 뒤, 미접촉 T 세포와 함께 배양하여 Treg 세포의 빈도를 확인한 결과이다.
도 4E 및 4F는 MGCP를 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분자량에 따라 분획한 결과이다. Eluent로 D2O를 사용하여 0.3 ml/mL의 유체 속도에서 분획을 수행하였다. 도 4E는 굴절률 검출기(refractive index detector)에 의해 분석된 MGCP의 크로마토그램 프로필 및 개별 분획이다. 도 4F는 MGCP 및 각 분획에서 만노스 및 글루코스의 풍부도를 확인한 결과이다.
도 4G는 미접촉 CD4 T 세포 및 MGCP 및 각 분획으로 프라이밍 된 비장 DC의 공동배양으로 유도된 Treg 세포의 유동세포 계측분석 플롯 및 빈도를 나타낸 것이다.
도 4H는 MGCP 및 CSGG의 β-1,6-glucan 구조를 비교한 것이다.
도 4I는 비장 DC를 MGCP 또는 CSGG로 자극한 후 최소량의 Th1 유도 사이토카인의 존재아래에서 미접촉 CD4 T 세포와 배양하여 생성된 IFN-γ 생성 CD4+ T 세포를 평가한 것이다.
데이터는 독립적인 세번의 실험 결과를 나타내고 모든 그래프는 평균 ± SEM 값이며, *은 p < 0.05, **은 p < 0.01, ***은 p < 0.001, ****은 p < 0.0001 이다(Student's t test).
도 5는 MGCP가 Treg의 de novo 생성을 촉진하고, IFN-γ를 감소시키는 것을 확인한 결과이다.
도 5A는 실험의 전반적인 개략도를 나타낸 것이다. 유사유전자형으로 표지된 미접촉 CD4 T 세포(CD45.1+CD4+Foxp3EGFP-CD44loCD62Lhi)를 전달받기 전 2주간 매일 mock(DW) 또는 MGCP를 마우스에 투여하였으며, MGCP는 세포 전달 후 1주일간 추가로 투여되었다. CD4 T 세포는 수용체 마우스의 장에서 분석되었다.
도 5B 및 5C는 마우스 대장(B) 및 소장(C) 점막 고유층에서 공여자 세포(CD45.1+CD4+) 유래 de novo 생성된 Treg 세포의 유동세포 계측 플롯을 나타낸 것이다.
도 5D 및 5E는 대장 점막 고유층(D) 및 소장(E) 에서 공여자 유래 Treg 세포의 빈도를 나타낸 것이다.
도 5F 및 5G는 대장(F) 및 소장(G)에서 IL-10 생산 Treg 세포 (CD4+Foxp3EGFP+)의 유동세포 계측 데이터 및 빈도를 나타낸 것이다.
도 5H 및 5I는 대장(F) 및 소장(G)에서 IFN-γ+ 이펙터 CD4 T 세포((CD4+Foxp3EGFP-)의 유동세포 계측 플롯 및 빈도를 나타낸 것이다.
모든 그래프는 평균 ± SEM 값이며, *은 p < 0.05, **은 p < 0.01, ***은 p < 0.001, ****은 p < 0.0001 이다(Student's t test).
도 6은 MGCP의 투여에 의한 장에서의 유도성 Treg 세포 분화의 증가를 나타낸 것이다. 마우스에 2주간 매일 mock(DW) 또는 MGCP를 투여한 후, 유사유전자형으로 표지된 미접촉 CD4 T 세포를 전달했다. 수용체 생쥐는 추가 1주일간 mock(DW) 또는 MGCP를 매일 투여하여 1주일후 장내 CD4 T 세포를 평가하였다.
도 6A 및 6B는 마우스 대장(B) 및 소장(C) 점막 고유층에서 수용체 유래 CD45.1-CD4+Foxp3+ T 세포의 빈도 및 절대 수를 나타낸 것이다.
도 6C 및 6D는 수용체 유래 대장 Treg 세포(c) 및 소장 Treg 세포(D) 중 유도성 Treg 세포의 비율을 나타낸 것이다.
각 점은 개별 마우스를 나타내고, 모든 그래프는 평균 ± SEM 값이며, *은 p < 0.05, **은 p < 0.01, ***은 p < 0.001 이다(Student's t test).
도 7은 MGCP 투여에 의한 염증질환의 개선을 나타낸 것이다.
도 7A는 염증성 대장염 모델을 대상으로하는 실험의 계략도이다. CBir 마우스로부터 단리된 나이브 CD4 T 세포(CD4 + Foxp3EGFP-CD44loCD62Lhi)를 Rag1 결핍 마우스로 입양전달하였다. 세포를 전달하기 전날부터 mock(DW) 또는 MGCP를 격일로 전체 시험기간동안 지속적으로 급여하였다.
도 7B는 마우스의 체중 변화를 나타낸 것이다.
도 7C는 대장이미지 및 초기 체중으로 정규화된 대장의 길이를 나타낸 것이다. 각 점은 개별 마우스를 나타낸다.
도 7D는 헤마톡실린 및 에오신(H&E)로 염색된 대표적인 대장 조직이미지를 나타낸 것이다.
도 7E는 대장염의 조직병리학점수를 나타낸 것이다.
도 7F는 체중이 감소하기 시작할 때 대장에서 CD4+Foxp3+T 세포를 분석한 결과이다.
도 7G는 실험의 종말점에서, 대장 이펙터 T 세포 (CD4+Foxp3EGFP-) 로부터 생성된 IFN-γ를 분석한 것이다.
도 7H는 EAE를 대상으로한 실험의 개략도를 나타낸 것이다.
도 7I는 상이한 방법으로 MGCP 처리된 마우스를 모니터링하여, EAE 질병 점수를 측정한 결과이다.
도 7J는 mock(DW) 또는 MGCP가 복강내투여된 EAE 임상 점수를 측정한 결과이다.
도 7K는 척수 섹션을 H&E로 염색한 결과이다. 배율은 각각 5배(상부), 20배(하부)이며, 화살표는 침윤된 림프구를 나타낸다.
도 7L은 척수에서 평가한 침윤 림프구의 절대 수이다.
도 7M은 척수에서 IFN-γ+IL-17A+ CD4 T 세포의 유동세포 계측 플롯 및 백분율을 나타낸 것이다.
도 7J 내지 7M의 데이터는 복강내 경로를 통해 mock 또는 MGCP 처리된 마우스에서 측정된 것이다.
각 점은 개별 마우스를 나타내고, 모든 그래프는 평균 ± SEM 값이며, *은 p < 0.05, **은 p < 0.01, ***은 p < 0.001, ****은 p < 0.0001 이다(Student's t test).
도 8은 염증질환에서 MGCP 투여가 면역에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 8A 및 8B에서 Rag1 결핍 마우스에 미접촉 CD4 T 세포를 입양 전달하였으며, mock 또는 MGCP로 격일 공급하였다.
도 8A는 대장의 CD4+Foxp3+ T 세포에서 평가된 CD103 및 CTLA-4의 발현을 나타낸 것이다.
도 8B는 대장에서 분석된 IL-17A+ 발현 이펙터 CD4 T 세포를 나타낸 것이다.
도 8C 내지 8G에서 마우스를 MOG35-55 및 CFA로 면역화하여 EAE를 유도하였다. 면역화된 마우스에 mock 또는 MGCP를 격일로 복강내 투여하였다.
도 8C는 척수에서 IFN-γ+ or IL-17A+ CD4 T 세포의 백분율을 나타낸 것이다.
도 8D 및 8E는 배출 림프절의 CD4 T 세포로부터의 유해 사이토카인의 발현을 비교한 것으로 배출 림프절의 CD4 T 세포로부터의 염증성 사이토카인 발현의 유동세포 계측 플롯(D) 및 빈도(E)를 나타낸 것이다.
도 8F 및 8G는 척수(F) 및 배출 림프절(G)에서 CD4+Foxp3+ T 세포를 평가한 것이다.
각 점은 개별 마우스를 나타내고, 유동세포 계측 플롯은 2번의 독립 실험을 나타낸다. 모든 그래프는 평균 ± SEM 값이며, *은 p < 0.05, **은 p < 0.01, ***은 p < 0.001, ****은 p < 0.0001 이다(Student's t test).
도 9는 MGCP에 의한 면역조절에서 Cox2의 역할을 나타낸 것이다.
도 9A는 플레이트 코팅된 항-CD3(1.5μg/ml), 가용성 항-CD28(1.5μg/ml), IL-2(100U/ml) 및 TGF-β1(2ng/ml)의 존재 아래, 미접촉 CD4 T 세포를 MGCP 또는 D-(+)-mannose와 함꼐 72시간 배양한 뒤 Treg 세포의 유도를 분석한 결과이다.
도 9B는 MGCP 또는 D-(+)-mannose 프라이밍된 비장 DC를 비최적 Treg 유도 환경에서 미접촉 CD4 T 세포와 함께 배양하여, Treg 세포의 생성을 분석한 결과이다.
도 9C 및 9D에서, DC 서브셋(MHCII+CD11c+)은 비장으로부터 CD8α 및 CD11b의 발현에 다라 FACs 분류되었으며, 도 1의 실험 절차를 통해 MGCP에 의한 Treg 세포 유도 능력을 시험하였다.
도 9C 및 9D는 MGCP에 의한 Treg 세포 유도의 유동세포 계측 플롯(C) 및 상대적 능력의 비교(D)를 나타낸 것이다. 데이터는 3번의 독립적인 실험 결과를 나타낸다.
도 9E는 mock 또는 MGCP 자극된 비장 CD8α-CD11b+ DC의 전사체 분석 결과이다. 풀링된 4개의 독립 실험의 비장 CD8α-CD11b+ DC에서 전사체를 분리하였다.
도 9F는 mock 또는 MGCP로 자극된 비장 CD8α-CD11b+ DC에서의 면역조절 관련 유전자의 발현을 나타낸 것이며, 데이터는 3번의 독립 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 9G 내지 9J에서, 도1에 도시된 바와 같이, 비장 DC를 MGCP로 자극한 후 비최적 Treg 또는 Th1 유도 사이토카인의 존재하에 미접촉 CD4 T 세포와 함께 배양하였다. Cox2 선택적 억제제인 Celecoxib을 DC 자극 및 T 세포 분화 절차 모두에 첨가하였다.
도 9G 및 9H는 비최적 Treg 분화 환경에서 MGCP에 의해 유도된 Treg 세포의 유동세포 계측 플롯(G) 및 백분율(H)을 나타낸 것이다.
도 9I 및 9J는 비최적 Th1 스큐잉 사이토카인 존재 아래에서 IFN-γ+CD4+ T 세포의 유동세포 계측 플롯(I) 및 빈도(J)를 나타낸 것이다.
데이터는 3번의 독립적인 실험의 결과를 나타낸 것이다. 모든 막대 그래프는 평균 ± SEM 값이며, *은 p < 0.05, **은 p < 0.01, ***은 p < 0.001, ****은 p < 0.0001 이다(Student's t test).
도 10은 MGCP에 의한 DC-매개 Treg 세포 분화 매커니즘을 나타낸 것이다.
도 10A및 10B에서, 무균 마우스(n=6)에 2주간 매일 mock 또는 MGCP를 공급하였다. 대장 DC를 마이크로비드로 분류하고 총 mRNA를 정제하였다.
도 10A는 조절 관련 마커의 발현을 비교하기 위한 전사체 분석 결과이다.
도 10B는 qRT-PCR로 확인한 면역관용성 DC 연관 마커의 발현을 나타낸 것이다.
데이터는 독립적인 두 번의 실험을 나타내는 것이다. 모든 막대 그래프는 평균 ± SEM 값이며, *은 p < 0.05, **은 p < 0.01, ***은 p < 0.001 이다(Student's t test).
도 11은 MGCP의 Dectin1-Cox2 축 매커니즘을 통한 면역조절을 나타내는 것이다.
도 11A는 각 마우스로부터 분리된 비장 DC를 mock 또는 MGCP로 처리한 후, 도 1과 같이, 비최적 Treg 유도 사이토카인의 존재하에 미접촉 CD4 T 세포와 함께 배양하여 Treg 세포 유도의 폴드 체인지(Fold Change)를 평가한 것이다.
도 11B는 MGCP 자극전, 지시된 길항적 항체를 자극전에 비장 DC에 처리한 뒤, 비최적 Treg 스큐잉 환경에서 CD4 T 세포와 함께 배양하여 CD4+Foxp3+ T 세포의 백분율을 분석한 결과이다.
도 11C는 Dectin1 충분 및 결핍 마우스에서 분리한 DC를 MGCP로 8시간 자극한 뒤 mRNA를 단리하여 Cox2를 코딩하는 Ptgs2의 발현을 qRT-PCR로 분석한 결과이다.
도 11D 및 11E에서, 유사유전자형 대립유전자를 가지는 OT-II 마우스 유래의 미접촉 CD4 T 세포(Thy1.1+V2+CD4+Foxp3EGFP-CD44loCD62Lhi)를 입양 전달하기 전, Dectin1 충분 및 결핍 마우스에 2주간 매일 mock 또는 MGCP를 공급하였다. 마우스는 추가 1주일간 매일 MGCP를 수용체 마우스에 투여하였고, 세포 입양전달 1일 전부터 격일로 오브알부민을 급여했다.
도 11D는 소장에서 평가된 공여자 세포 유래의 오브알부민 반응성 Treg 세포의 유동세포 계측 플롯 및 빈도를 나타낸 것이다.
도 11E는 수용체 유래 Treg 세포 중 유도성 세포 분획(Helios-CD4+Foxp3+)을 조사한 것으로 수용체 유래 Treg 세포의 유동세포 계측 플롯 및 Helios-의 백분율을 나타낸 것이다.
데이터는 3번의 독립 실험결과를 나타낸 것이다. 모든 그래프는 평균 ± SEM 값이며, *은 p < 0.05, **은 p < 0.01, ***은 p < 0.001 이다(Student's t test).
도 12는 MGCP에 의한 Treg 세포 유도에 있어서 Dectin1이 주요한 역할을 함을 나타내는 것이다.
도 12A는 MGCP가 Dectin1 이외에도 일부 다른 TLR과 그 신호 전달 체계를 통해 Treg 세포의 생성을 유도할 수 있는 것을 확인한 결과이다.
도 12B는 Dectin1 충분 및 결핍 마우스로부터의 CD11c+ DC를 mock 또는 MGCP로 8시간 자극하고 지시된 면역조절 유전자의 발현을 측정한 결과이다.
도 12C 내지 12E에서, Dectin1 충분 및 결핍 마우스에 OT-II 마우스 유래의 미접촉 CD4 T 세포를 수여하기 전, 2주간 매일 mock 또는 MGCP를 공급하였다. MGCP의 투여는 격일로 오브알부민의 급여와 함께 추가 1주일 더 지속하였다.
도 12C 및 12D는 소장에서 분석된 수용체 마우스 유래의 CD4+Foxp3+ T 세포의 빈도(C) 및 절대 세포 수(D)이다.
도 12E는 장간막 림프절에서 비교된 공여자 유래의 OVA-반응성 CD4+Foxp3+ T 세포의 백분율이다.
각 점은 개별 마우스를 나타내고, 데이터는 3번의 독립 실험을 나타낸다. 모든 그래프는 평균 ± SEM 값이며, *은 p < 0.05, **은 p < 0.01, ***은 p < 0.001, ****은 p < 0.0001 이다(Student's t test).
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, 자이모산의 실험 데이터는 특히 낮은 용량(50μg/mL)에서 오히려 RORγt의 발현을 촉진하여 Treg의 분화를 촉진시키지 못하는 것으로 나타났다. 또한, 온전한 자이모산이 Th1 분화 유도, CD4 T 세포 유래 IFN-γ의 증가 특성을 나타내는 것과 비교하여, β-1,3-glucanase를 처리하여 자이모산에서 β-1,3-glucan을 제거하면, Th1의 분화를 억제하고 Treg의 분화를 유도하며, CD4 T 세포 유래의 IFN-γ를 비롯한 염증성 사이토카인의 생산을 억제하는 것을 확인하여, 자이모산의 다당체의 각 구성의 상반되는 면역효과의 조합으로 면역조절능이 결정되고, 특히 β-1,3-glucan가 면역 증진능을 나타낸다는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 실시예에서, β-1,3-glucan 제거 시에 면역 억제능을 나타내는 상세한 구조를 파악하기 위해, 만난 및 β-글루칸을 함유하는 신규한 다당체를 정제하였고, 이를 Mannan/β-Glucan Containing Polysaccharides(MGCP)라 명명하였으며, β-1,6-결합 그루코스 골격을 갖는 β-glucan이 Treg 유도 및 사이토카인 억제등의 면역 억제능을 나타내는 구조임을 명확히 하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, in vitro 및 in vivo에서 상기 MGCP의 낮은 농도의 처리 또는 투여에 의해서도 효과적으로 Treg 세포가 유도될 수 있음을 확인하였으며, 이에 따라, 효모 세포벽 유래의 신규한 다당체의 구성 및 구조에 의한 Treg 세포 분화 메커니즘을 수용체, 유전자 전사체 형태 변화 및 사이토카인 발현 수준까지 확립하고, 상기 다당체 또는 이에 의해 유도된 Treg 세포의 투여는 in vivo 에서 효과적으로 대장염 및 뇌척수염과 같은 면역질환을 억제할 수 있음을 확인하였다.
특히, 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들의 이전에 출원한 바 있는 B.bifidum 유래의 β-1,6-glucan 함유 다당체와 면역억제능을 비교한 결과, 두 다당체 모두 Treg 세포의 생성을 극적으로 증가시키는 것은 동일하나, CSGG가 IFN-γ의 생성을 다소 증가시키는데 비해 MGCP는 IFN-γ의 생성을 현저히 감소시키는 것을 확인하였다. IFN-γ는 염증성 사이토카인으로, 염증부위에 IFN-γ가 과도하게 증가하는 경우 과도한 면역반응을 일으킬 수 있으며, 따라서, 본 발명의 다당체의 면역억제능이 CSGG에 비하여 현저히 뛰어남을 의미한다.
따라서 본 발명은 일 관점에서, 만난(mannan) 및 β-글루칸(β-glucan)을 포함하는 다당체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 β-글루칸(β-glucan)은 i) β-1,6-결합(β-1,6-linked)으로 결합된 글루코스 골격, 및 ii) β-1,3-결합(β-1,3-link)으로 연결된 단일 유닛 글루코스 사이드 체인을 포함하며; iii) β-1,3-글루칸 골격(backbone)을 포함하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 β-글루칸은 β-1,3-글루칸 골격(backbone)이 제거된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 다당체는 알파-1,6-결합 (α-1,6-linked mannose)으로 연결된 만노스 골격(back bone)을 가지는 만난(mannan)과 β-1,6-결합(β-1,6-linked)으로 결합된 글루코스 골격(back bone)을 가지는 β-글루칸(β-glucan)이 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 효모 유래의 신규한 다당체(MGCP)를 구조적/기능적으로 분석한 결과, 만난 및 β-글루칸의 구체적인 결합 구조를 확인 하고, β-1,6-글루칸 골격 및 만난이 Treg 세포의 분화를 촉진하며, β-1,3-글루칸은 Treg 세포의 분화를 억제함을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 다당체는 만노스(80.6%): 글루코스(14.9%) : 갈락토스 (4.5%)의 조성비를 가짐을 확인하였다. 만난 유닛의 상세한 구조는 알파-1,6-결합 만노스 골격을 가지고 있는 것으로 나타났으며, 알파-1,2-결합 또는 알파-1,3-결합으로 연결된 단일 유닛 만노스(30%), 2유닛 만노스(16.8%) 또는 3 유닛 만노스(28.4%)를 사이드 체인으로 하여 각각 연결되어 있는 것(사이드 체인이 없는 만노스(24.8%))을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 다당체는 만노스(mannose), 글루코스(glucose) 및 갈락토스(galactose)의 함량비가 만노스 (80.5%): 글루코스 (15.0%) : 갈락토스 (4.5%)의 조성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로 만노스 (80.6%): 글루코스(14.9%) : 갈락토스(4.5%), 더욱 구체적으로 만노스 (79.4%): 글루코스 (14.7%) : 갈락토스 (4.4%)의 조성을 가질 수 있으나 이에 한정 되는 것은 아니다.
따라서 본 발명에 있어서, 상기 다당체는 만노스 및 글루코스의 함량비가 만노스 70% 내지 90% : 글루코스 10% 내지 30%인 것을 특징으로 할 수 있으며, 경우에 따라서, 0%초과 10% 미만의 갈락토스를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 만난(mannan)은 i) 알파-1,6-결합 (α-1,6-linked mannose)으로 연결된 만노스 골격(back bone) 및 ii) 알파-1,2-결합 또는 알파-1,3- 결합으로 연결된 단일 만노스(single mannose), 2 유닛 만노스(two unit mannose) 및 3 유닛 만노스(three unit mannose)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 사이드 체인으로 포함하는 것 특징으로 할 수 있다. 구체적으로, 상기 만난은 i) 알파-1,6-결합 (α-1,6-linked mannose)으로 연결된 만노스 골격(back bone) 및 ii) 알파-1,2-결합 또는 알파-1,3- 결합으로 연결된 단일 만노스(single mannose), 2 유닛 만노스(two unit mannose) 및 3 유닛 만노스(three unit mannose)를 사이드 체인으로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 다당체는 단일 만노스 사이드 체인 20% 내지 40% : 2 유닛 만노스 사이드 체인 10% 내지 30% : 3 유닛 만노스 사이드 체인 20% 내지 40% : 사이드 체인이 없는 만노스 골격 20% 내지 40%의 함량비로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로, 상기 다당체의 만난은 단일 유닛 만노스 30% : 2 유닛 만노스 17.0% : 3 유닛 만노스 28.5%의일 수 있으며, 구체적으로 단일 유닛 만노스 30% : 2 유닛 만노스 16.8% : 3 유닛 만노스 28.4%, 더욱 구체적으로 단일 유닛 만노스 25.7% : 2 유닛 만노스 22.6% : 3 유닛 만노스 27.0% 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 만난은 단일 만노스(30%) : 2 유닛 만노스(16.8%) : 3 유닛 만노스(28.4%)의 조성으로 포함하고 있음을 확인하였다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 β-글루칸(β-glucan)은 β-1,6-결합으로 연결된(β-1,6-linked) 글루코스 골격 및 β-1,3-결합으로 연결된(β-1,3-linked) 단일 유닛 글루코스를 사이드 체인으로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 상기 β-1,6-결합으로 연결된 글루코스 골격의 글루코스 중 β-1,3-결합 글루코스 사이드 체인을 갖는 글루코스의 함량비는 20.0% 이하, 구체적으로 18.0% 일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, 18%의 골격 글루코스가 β-1,3-결합 글루코스 사이드 체인을 포함하는 것으로 확인되었다.
본 발명에 있어서, 다당체의 구성 중 β-1,6-글루칸 및 만난이 Treg 세포의 분화를 촉진하며, β-1,3-글루칸은 Treg 세포의 분화를 억제함을 확인하였다. 따라서, 상기 β-글루칸은 β-1,3-결합 글루코스가 제거되고, β-1,6-결합 글루코스만으로 구성된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 효모 유래의 신규한 다당체(MGCP)를 액체 크로마토그래피를 통해 분자량을 기준으로 분획한 결과, 높은 분자량(>50kDa) 및 낮은 분자량(<50kDa)을 갖는 2개의 피크를 확인하였다. 높은 분자량의 분획은 β-1,6-glucan을 포함하지 않는 것으로 확인 되었으며, 낮은 분자량 분획은 β-1,6-glucan과 만난을 모두 함유하고 있는 것으로 확인하고, 낮은 분자량 분획의 다당체만 Treg의 분화를 유도함을 확인하였다.
따라서 본 발명에 있어서, 상기 다당체는 분자량이 1kDa 이상 50kDa 이하인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 4kDa 내지 20kDa인 분자량을 지닌 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 다당체는 조절 T 세포(Treg)를 유도하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 조절 T 세포는 CD4+Foxp3+ 조절 T 세포인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 “조절 T 세포(Treg)”는 분화된 T 세포의 한 종류로서, 면역 작용을 억제하는 역할을 하여 자가항원에 대한 관용을 유지하고 자가면역 질병의 발병을 억제한다. 조절 T 세포는 일반적으로 IL-10 등의 면역 억제성 사이토카인을 발현하며, 이펙터 T 세포의 유도와 확산을 억제한다.
본 발명의 용어 “유도”는 목적하는 세포의 분화 또는 생성을 유도하는 것을 의미하며, 본 발명에서는 미접촉 T 세포 등으로부터 조절 T 세포로 분화시키는 것을 의미한다.
본 발명에서 “유도”는 “분화”, “생성” 또는 “생산”등과 호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 “미접촉 T 세포(naive T cell)”는 골수에서의 progenitor T cell이 흉선에서 성숙된 분화전의 T 세포를 의미한다. 미접촉 T 세포는 IL-2, IL-4, TGF-β 등의 자극을 받아 이펙터 T 세포, 헬퍼 T 세포(Th), 조절 T 세포(Treg) 등으로 분화할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, MGCP의 면역 억제 메커니즘을 구체적으로 확인하였다. D-(+)-mannose가 CD 4 T 세포에 직접적으로 영향을 미침으로써 Treg 세포 분화를 유도하는데 비해 MGCP 및 CSGG는 DC 매개 메커니즘에 의해 Treg을 유도하는 것을 확인하였으며, 나아가 CSGG가 TLR2 및 Myd88의 패턴 인식 수용체를 중심으로 DC에 면역관용성을 부여하는데 반해, MGCP는 Dectin1 수용체로 인식되어, DC의 Ptgs2(Cox2)의 발현을 극적으로 증가시키는 것을 확인하고 Dectin1-Cox2를 중심으로 DC에 면역관용성을 부여함을 입증하였다.
따라서, 본 발명에 있어서, 상기 조절 T세포의 유도는 DC(Dendritic Cell)에 의해 매개되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 DC 는 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptors, PRRs)를 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 패턴 인식 수용체는 바람직하게는, Dectin1, Dectin2, TLR2, TLR4 및 TLR6로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 가장 바람직하게는 Dectin1을 발현하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 DC는 예를 들어, 비장 유래의 DC일 수 있으며, CD8α와 CD11b의 발현에 따라 구분될 수 있고, 바람직하게는 CD8α-CD11b+DC인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 DC에 의해 매개는 상기 다당체의 처리로 자극되어 면역 관용성 DC로 전사체 지형이 변형되어 Treg 세포의 유도를 매개 하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 전사체 지형의 변형은 본 발명의 다당체를 처리하지 않은 DC의 전사체 지형과 비교하여, IL-10, Cd274, 인돌아민 2,3-디옥시게나아제(IDO), Tgfβ1 및 Cox2(사이클로옥시게나아제 코딩 유전자, Ptgs2)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상을 과발현 하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 다당체는 Treg으로부터 헬리오스(Helios), IL-10 및 CTLA-4의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있으며, 특히 Treg 중 헬리오스 Treg 세포의 빈도를 높이는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 다당체는 CD4 T 세포의 IFN-γ 생산을 감소시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
IFN-γ는 면역반응을 활성화 시키는 염증성 사이토카인으로서, Treg 세포 유도뿐만 아니라 IFN-γ의 생산 감소에 의한 면역억제 효과를 나타내어 본 발명자들이 발명한 CSGG보다도 더 뛰어난 면역억제능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 신규한 다당체는 효모 추출물에서 유래하였으며, 구체적으로는 효모의 세포벽에서 분리되었다. β-1,3-글루칸이 제거된 효모세포벽에서 유래된 만난/β-글루칸 함유 다당체(MGCP)의 경우 증가된 Treg 세포 유도능을 나타내었다.
본 발명에 있어서, 상기 다당체는 효모(yeast) 유래인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 효모 세포벽 유래일 수 있고, 더욱 바람직하게는 β-1,3-글루칸이 제거된 효모의 세포벽 유래인 것을 특징으로 할 수있다.
본 발명에 있어서, 상기 다당체는 항 염증 기능 또는 면역기능 조절 활성을 가지는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 면역억제 활성인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 장 출혈 등 장내 상처가 있는 사람의 경우 프로바이오틱스를 잘못 복용하면 부작용이 발생할 수 있는데, 이런 경우 다당체를 투여하여 치료효과를 볼 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 다당체를 유효성분으로 함유하는 면역조절용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 용어 “면역조절”이란, 혈액 내 면역 불균형을 해소하고 면역 항상성을 유지하는 것을 의미한다. 면역 항상성의 유지는 면역을 억제시키는 면역관용(tolerance)과 면역을 증진하는 면역반응(immunity)간의 균형을 이루는 상태를 일컫는 것으로 이러한 상태의 유지는 면역 질환 치료, 특히 자가면역 질환의 치료에 있어서 필수적인 요소이다. 본 발명에 있어서, 상기 조성물은 Treg세포 유도 및 IFN-γ 발현 감소를 통한 면역 억제 용도로 사용되는 것이 바람직하다.
상기 면역 조절용 조성물은 면역 활성의 조절 및 면역질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 목적으로 약학 조성물 또는 건강기능식품 등으로 사용될 수 있으며, 이때 사용량 및 사용 형태는 목적에 따라 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, MGCP의 경구투여는 대장 Treg 세포의 유도를 증가시키는 것으로 확인되었다. 뿐만 아니라 MGCP의 경구투여는 CTLA-4를 발현하는 Treg 세포를 효과적으로 유도하였으며, IL-10의 발현을 유의하게 증가시키고, 이펙터 T 세포의 IFN-γ 발현을 현저히 감소시켰다.
본 발명의 다른 실시예에서, MGCP를 급여한 미생물 플라젤린 반응성 CD4 T 세포를 보유한 마우스에서 체중 감소 및 대장 길이의 단축을 현저히 감소시켰으며, 상피세포의 증식 및 림프구의 대장 내 침투 또한 효과적으로 억제하였다. 조직 병리학 스코어링 결과도 mock 투여 마우스에 비해 현저히 완화된 결과를 나타내었다.
특히 본 발명의 일 실시예에서, 장 염증질환인 대장염 외에 자가면역질환인 실험성 자가면역 뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis; EAE) 마우스에 MGCP를 경구 투여한 결과, EAE의 발달을 방지하고 척수로 면역 세포의 침윤을 억제함을 확인하였다. 또한, 척수 및 배출 림프절 모두에서 IFN-γ+IL17A+ 유해 사이토카인 생산 CD4 T 세포의 활성을 현저히 감소시키고, 배출 림프절에서의 Treg 세포를 증가시키는 것을 확인하여, 소화기관 이외의 면역질환 또는 염증성 질환에도 현저한 증상 완화 및 치료효과를 나타내는 것을 증명하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 다당체를 유효성분으로 함유하는 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 용어 “면역 질환”이란 면역 체계의 이상이 직접적인 원인이 되어 발병할 수 있는 질환을 의미하며, 피부염, 알러지, 비염, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건주위염, 제1형 당뇨병, 피부경화증(scleroderma), 퇴행성 신경질환, 염증관련 신경질환, 제2형 당뇨병, 규폐증, 죽상동맥경화증, 백반증, 결막염 및 자가면역질환으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나에 해당할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 “자가면역 질환”이란, 생체 내의 면역 세포가 외부 침입 항원이 아닌 생체 스스로의 조직 또는 세포를 항원으로 인식하여 공격하여 발생하는 질환으로서, 류마티스성 관절염, 전신성 경피증(scleroderma), 아토피 피부염, 건선(乾癬), 천식, 길리안-바레 증후군(Guilian-Barre syndrome), 중증근무력증, 피부근염(dermatomyositis), 다발성근염(polymyositis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 자가면역성 뇌척수염, 결절성 다발성 동맥염(polyarteritis nodosa), 측두동맥염(temporal arteritis), 소아기 당뇨병, 원형탈모증, 청포창, 아프타구내염, 크론병 및 베체트병으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나에 해당할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 “염증성 질환”은 염증을 주 병변으로 하는 질병을 총칭하는 것으로서, 부종, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스성 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선 관절염, 골관절염, 류마티스성 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 중증근무력증 및 다발성 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 해당할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 면역 질환 또는 염증성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 면역 질환 또는 염증성 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 그 유효성분의 상술한 면역 증진 효과, 또는 면역 과잉 억제 효과를 통해 다양한 면역질환에 대한 예방 또는 치료 및 항염증 효과를 나타낸다.
상기 약학 조성물은 상기 다당체를 함유하는 것 이외에 통상적으로 약학 조성물에 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 적합한 제형으로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉, 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우 락토스, 수크로스, 전분 또는 그 유도체, 탈크, 칼슘 카보네이트, 젤라틴, 스테아르산 또는 그 염을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 연질 캡슐제인 경우에는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 용액 또는 시럽 형태인 경우, 물, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 상기의 담체 외에도 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 면역, 특히 자가면역 또는 알레르기 관련 단백질과 함께 투여될 수 있다. 구체적인 단백질로는, 자가면역 질환에 관여하는 자가 항원들, 예를 들면, 류마티스 관절염은 heat shock proteins (HSPs), citrullinated filaggrin, glucose-6-phosphate isomerase, p205, 콜라겐 등을 포함할 수 있고, 제1형 당뇨병은 insulin, Zinc transporter 8 protein (ZnT8), Pancreatic and duodenal homeobox 1 (PDX1), Chromogranin A (CHGA), Islet amyloid polypeptide (IAPP)을 포함할 수 있으며, 중증근무력증에 관련된 자가항원인 아세틸콜린 수용체를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 자가면역 질환에 알려진 모든 종류의 자가 항원뿐만 아니라, 식품 알러지를 일으키는 것으로 알려진 다양한 알러지 유도 물질들인 땅콩, 우유, 달걀, Tree nuts, 콩, 새우 등의 갑각류, 생선 유래 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 방식은, 예를 들면, 피하, 정맥, 근육 또는 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중, 병증의 정도, 투여경로에 따라 달라질 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 다당체 또는 상기 다당체를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 본 발명의 다당체 또는 상기 다당체를 유효성분으로 함유하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 본 발명의 다당체의 사용에 관한 것이다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 우수한 면역증강 및 면역 과잉 억제 효과를 제공할 뿐만 아니라 약물에 의한 독성 및 부작용도 거의 없어 면역질환의 치료 또는 예방의 목적으로 장기간 복용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 다당체를 유효성분으로 함유하는 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품에 관한 것이다.
상기 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품은 면역 활성을 증강시키거나 과잉면역을 억제 또는 개선하여 면역 기능의 항상성을 유지하는 활성을 갖는 건강기능식품인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 프리바이오틱스, 프로바이오틱스, 포스트 바이오틱스, 건강기능식품 및 건강식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 건강기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있으며, 본 발명에 따른 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태일 수 있다.
상기 건강식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강 유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용된다.
상기 식품조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 다당체와 함께 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 일 실시 예에서, in vivo 및 in vitro를 불문하고 MGCP가 대장 CTLA-4를 발현하는 Treg 세포를 유도하고, Treg세포에서의 IL-10 발현을 증가 시켰으며, 이펙터 T 세포에서 IFN-γ의 발현을 억제함으로써, 면역 작용을 억제하는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 다당체는 DC를 매개하여 Treg 세포를 유도하는 것임을 확인하였다. 구체적으로, DC의 Dectin1, Dectin2, TLR2, TLR4 및 TLR6가 결핍된 경우 Treg의 세포 분화가 감소 되는 것을 확인 하였으며, 특히 Dectin1 및 TLR4가 결핍된 경우 그 감소폭이 현저하였다. 또한, MyD88 신호 전달 체계가 결핍된 경우에도 Treg 세포의 유도가 감소하는 것을 확인 하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 이러한 PRR을 통한 다당체의 인식은 IL-10, Cd274, 인돌아민 2,3-디옥시게나아제(IDO), Tgfβ1 및 Cox2 등의 DC의 전사체 지형(transcriptome landscape)을 면역 관용성(tolerogenic) DC의 표현형으로 변형 시켰으며, 특히 celecoxib을 처리하여 실험한 결과 Cox2가 과발현 됨으로써, Treg세포를 유도하는 것으로 나타났다. 수지상 세포 외에도, Treg 세포는 항원을 인식하고 제시하는 모든 세포에 의해 유도 될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 항원 제시 세포(antigen presenting cell)에 제1항의 다당체를 처리하여 면역관용성 항원 제시 세포(tolerogenic antigen presenting cell)를 수득하는 단계; 및 상기 면역관용성 항원 제시 세포를 CD4+ T 세포와 공배양(co-incubation)하여 조절 T 세포(Treg 세포)를 유도하는 단계를 포함하는 조절 T 세포(Treg)의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 용어 “항원 제시 세포”란, 항원을 받아들여 처리한 후 항원 유래 조각을 MHC classⅡ분자와 같은 항원 제시 분자와 함께 T 세포에 제시하여 분화를 유도하는 세포를 의미한다. 예로써 상기 항원 제시 세포는 대식 세포, B 세포, 수지상 세포(dendritice cell; DC), 랑게르한스 세포 등이 있으나, 이에 한정 되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 “면역관용성 항원 제시 세포”란, 다양한 억제 항원에 대해 면역계를 면역 내성(tolerogenic) 상태로 만드는 면역 억제성을 갖는 항원 제시 세포의 한 종류이다. 면역 관용성 항원 제시 세포는 주로 T 세포의 아네르기화 및 사멸 유도, Treg의 유도 와 같은 T 세포 조절을 통해 면역환경에 영향을 미친다. 이러한 면역 억제적 특성 때문에 알레르기 질환, 자가면역 질환 등에 있어서 세포치료제의 후보 물질로 각광받고 있다. 면역관용성 항원 제시 세포는 예를 들어, 면역 관용성 대식 세포, 면역 관용성 수지상 세포(tolerogenic DC) 또는 면역 관용성 B 세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 항원 제시 세포 는 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptors, PRRs)를 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 패턴 인식 수용체는 바람직하게는, Dectin1, Dectin2, TLR2, TLR4 및 TLR6로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 면역 항원 제시 세포(tolerogenic antigen presenting cell)는 IL-10, Cd274, 인돌아민 2,3-디옥시게나아제(IDO), Tgfβ1 및 Cox2로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상을 과발현 하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 조절 T 세포는 CD4+Foxp3+ 조절 T 세포인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 다당체는 Treg 세포로부터 헬리오스(Helios) 및 IL-10의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있고 이펙터 T 세포의 IFN-γ를 감소시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, MGCP로 유도된 Treg 세포가 in vivo에서 기능적 활성을 가지고 대장염을 완화할 수 있는지 확인하기 위해, MGCP 처리된 DC에 의해 생성된 Treg 세포(CD45+)를 미접촉 CD4+ T 세포와 함께 마우스에게 입양전달 하였다. 수용체 마우스의 체중 감소 및 대장 길이의 단축은 MGCP-Treg 수용 마우스에서 유의하게 감소하였으며, 대장조직의 상피세포 구조 파괴를 예방하고, 조직 병리학 스코어로 나타난 것과 같이 대장 점막 고유층에 대한 림프구의 침윤을 억제했다. 또한 도너 미접촉 CD4+ T 세포의 IFN-γ 생산 수치를 현저히 감소시켰다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조된 조절 T 세포(Treg)를 유효성분으로 함유하는 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 세포치료제에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 상기 방법으로 제조된 조절 T 세포(Treg)를 유효성분으로 함유하는 세포치료제의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 조절 T 세포는 CD4+Foxp3+ 조절 T 세포인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 다당체 또는 세포 치료제의 사용에 관한 것이다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
재료 및 방법
1. 마우스
마우스는 포스텍 생명 공학 센터(POSTECH Biotech Center)의 동물 시설에서 사육되었다. 모든 실험 절차는 포스텍 연구소 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아 진행하였다. C57BL/6 마우스는 포스텍에서 동종번식으로 유지되었다. Foxp3-eGFP 마우스를 Jackson Labortory로부터 얻었다. Thy1.1+Rag1-/-TCR Vα2+ Foxp3EGFP OT-II (Rag1-/-OTII TCR 형질전환체) 및 Rag1-/- 마우스는 Taconic으로부터 얻었다. Dectin1-/- 및 Dectin2-/- 동물은 Yoichiro Iwakura박사(Tokyo University of Science, Japan)가 제공받았다. 무균(Germ-Free, GF) C57BL/6 마우스 콜로니가 Andrew Macpherson 박사(Bern Univ., Switzerland) 및 David Artis 박사(Then at Univ. Pennsylvania, currently at Cornell Univ., USA)의 도움을 받아 브리더에 의해 확립되었다. GF 마우스는 무균 연성 막 아이솔레이터(sterile flexible film isolators, Class Biological Clean Ltd., USA)에서 유지되었다. CBir 마우스는 버밍엄의 알라바마 대학교의 Charles O. Elson으로부터 제공받았다. 생후 6 내지 12 주령의 성별 및 연령에 맞는 마우스를 사용하였다.
2. 효모 세포벽으로부터 MGCP의 정제
효모 추출물(teast extract, BD Biosciences) 20g, 폴리솔베이트 80(Polysorbate 80, Sigma-Aldrich) 2g, 구연산 암모늄(Ammonium Citrate, Sigma-Aldrich) 4g, 아세트산 나트륨(Sodium Acetate, Sigma-Aldrich) 10g, 황산 마그네슘(Magnesium sulfate, Sigma-Aldrich), 0.1g의 망간 황산염(Manganese sulfate, Sigma-Aldrich) 및 4g의 디포타슘 포스페이트(Dipotassium phosphate, Sigma-Aldrich)를 2L의 증류수에 용해시켰다. 상기 용액을 오토 클레이브(auto clave)하고 실온에서 냉각하였다. 트리클로로 아세트산(TCA, Sigma Aldrich)을 최종 농도 0.4%가 되도록 상기 용액에 처리하고 밤새 자기 교반하면서 4℃에서 배양 하였다. TCA 처리 된 용액을 냉각 된 3 Volume의 에탄올과 함께 밤새 -20 ℃에서 배양 하였다. 배양된 용액을 원심 분리한 뒤 상층액 제거 및 펠렛을 건조하여 남아있는 에탄올을 제거하고, 20mM MgCl2, 20mM CaCl2(pH 7.5)을 포함한 10mM Tris 버퍼로 현탁시켰다. 현탁된 용액을 RNase(Sigma-Aldrich) 및 DNase (Roche)로 최종 농도 0.4mg/ml가 되도록 처리하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 그 후, 아지드 나트륨(sodium azid)으로 최종 농도 0.05%가 되도록 처리하고 37℃에서 30분간 배양 하였다. 배양 후, pronase(Protease, Streptomyces griseus, Sigma-Aldrich) 용액을 0.3mg/ml로 처리하고 밤새 37℃에서 배양하였다. 최종농도가 0.3mg/mL가 되도록 pronase 한 번 더 추가하고 2시간동안 추가 배양하였다. 최종농도 0.4%가 되도록 TCA를 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 용액을 원심 분리하여 상층액을 3 Volume의 냉각 된 에탄올에 옮기고 밤새 -20℃에서 배양하였다. 원심 분리 후, 상등액을 제거하고 펠릿을 건조하여 잔류 에탄올을 제거하였다. 펠렛을 100mM Tris 버퍼(pH 7.5)로 현탁하고 동일한 양의 페놀을 처리하고 여러 번 뒤집어 잘 섞었다. 용액을 원심 분리하고 상층을 새로운 튜브로 옮기고 페놀을 반복하여 처리하였다. 용액을 원심 분리하고 상층액을 새 튜브에 옮기고 동일한 양의 isomyl Alcohol:Chloroform 1:29 (v:v) 용액을 처리하고 잘 섞었다. 원심 분리한 뒤 상층액을 옮기고 이를 한번 더 반복하였다. 다당류를 증류수에서 3일간 투석하고 동결 건조하여 수득하였다. 다당류의 농도는 산성 페놀 분석으로 측정하였다(42).
β-1,3-glucan이 제거된 효모 벽유래의 다당류를 정제하기 위해, zymolase를 효모 추출물의 혼합 용액에 처리하여 제조사의 프로토콜에 따라 β-1,3-glucan을 제거하였다. 이후, 다당류를 분리하기 위해 상기한 것과 동일한 프로토콜이 수행되었다. CSGG를 분리하기 위해서는 본 발명자들의 이전의 보고와 동일한 절차를 수행했다(26). 요약하면, L-cystein을 함유하는 MRS 배지에서 B.bifidum(Bifidobacterium bifidum)을 배양하고 박테리아로부터 단백질, DNA, RNA를 제거하여 CSGG를 수득하였다.
3. 림프구의 분리 및 유동 세포계측 분석(flow cytometry analysis)
미접촉 CD4 T 세포(Naive CD4 T cell)는 FACs 분류기(FACs sorter, Astrios, Beckman Coulter) 또는 EasySepTM 마우스 Naive® CD4+ T 세포 분리키트(STEMCELL Technology)를 사용하여 pLN, mLN 및 비장으로부터 제조사의 프로토콜에 따라 분리되었다. 대장 및 소장으로부터의 분리에 있어서, 장을 세로로 절개하여 열고 PBS로 세척하여 점액과 대변을 제거했다. 장을 작은 조각으로 잘라내어 10mM EDTA, 20mM HEPES, 1mM 피루브산 나트륨 및 3% FBS를 포함하는 PBS와 함께 자석 막대로 교반하면서 37℃에서 20 분간 배양하였다. 조직을 분쇄하고 37℃에서 45분간 3% FBS, 20mM HEPES, 1mM 피루브산 나트륨, 0.5mg/ml Collageanse D(Roche) 및 DNase I(Sigma-Aldrich)이 첨가 된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 조직을 10mM EDTA하에서 추가 5 분 배양 하였다. 상등액을 100 mm 셀 스트레이너(cell strainer)로 여과하고, 냉각된 PBS로 옮겨 남은 효소 및 EDTA를 제거하였다. 세포를 Percoll ™(GE Healthcare) 그라디언트에 40 % 및 75 %로 로드했다. 림프구를 percoll 그라디언트 막의 표면으로부터 수확하고 1% FBS, 1% 페니실린/스트렙토신이 첨가된 DMEM 배지로 세척하였다. 사이토카인의 분석을 위해, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 2mM L-글루타민, 1mM 피루브산 나트륨, 비필수 아미노산 및 0.1% ββ-ME(v/v)를 함유하는 완전한 RPMI 배지에서37 ℃ 및 4-5 시간 동안 Golgistop(BD Biosciences)의 존재하에 PMA(Calbiochem) 및 이오노마이신 (Calbiochem)을 가지고 세포를 자극하였다. 세포는 유동 세포계측 분석을 위해 제조사의 프로토콜에 따라 염색되었다.
세포의 염색에는 하기의 시약이 사용되었다:
Live/DEAD 고정 가능 염료(Life Technologies), 고정/투과 버퍼 (eBioscience), 투과 버퍼 (eBioscience), IC 고정 버퍼 (eBioscience) 및 항체.
상기 실험에는 하기의 항체 클론이 사용되었다:
CD4 (RM4-5), CD44 (IM7), CD62L (MEL-14), CD45.1 (A20), CD103 (2E7), Foxp3 (FJK-16s), CTLA4 (UC10-4B9), Nrp1 (3E12), IL-10 (JES5-16E3), IFN-γ (XMG1.2), IL-17A (17B7), CD11c (N418), CD11b (M1/70), F4/80 (BM8), MHCII (M5/114.15.2).
4. In vitro에서 항원제시세포 의존적 T 세포 분화
2x104 개의 표지 조직(indicated tissues)유래의 CD11c+ DC를 표지된 다당류 또는 MGCP로 처리하고 10ng/mL의 GM-CSF(Perprotech)의 존재 하에 14시간동안 RPMI 1640 완전배지에서 배양하였다. MGCP를 처리하여 DC를 자극하는 경우에, DC는 MGCP 농도가 별도 기재된 경우를 제외하고 대부분의 in vitro 실험에서 50μg/mL의 MGCP로 자극되었다. 자극된 DC를 세척하고 2x105 미접촉 CD4 T 세포와 함께 3일동안 공동 배양하였다. 대부분의 실험은 0.1μg/ml의 anti-CD3(BioXcell), 100 U/ml의 IL-2, 0.1 또는 0.05 ng/ml의 TGF-β1(Miltenyi Biotech) 및 10ng/ml의 GM-CSF를 포함하는 비최적(suboptimal) Treg 세포 스큐잉(skewing) 조건에서 수행되었다. 비최적 Th1 주행환경을 위해, 0.1μg/mL의 항-CD3, 100 U/ml의 IL-2, 2.5 ng/ml의 IL-12, 10 ng/ml의 GM-CSF 및 10 μg/ml의 항-IL-4 존재 아래에서 세포를 배양하였다. 3일의 배양 이후에 세포를 상기한 유동 세포계측법으로 분석하였다. 몇몇 실험에서 길항제는 MGCP의 자극에 앞서 비장DC에 처리되었다. 다당류 분해효소를 사용하는 실험 절차의 경우 비장 DC에 처리하기 전에 자이모산 또는 MGCP를 제조사의 프로토콜에 따라 동일한 효소로 분해하였으며, 미접촉 CD4 T 세포와 함께 배양하였다. celecoxib을 사용한 실험에서, 억제제는 MGCP를 사용하여 비장 DC를 자극하기전에 30분동안 처리되었으며, 그 후 celecoxib의 존재 조건 하에 미접촉 CD4 T 세포와 함께 배양하였다.
상기 실험에는 하기의 시약이 사용되었다:
α-(1-6) core mannosidase(QAbio), pustulanase(Prokazyme), zymolyase(MPbio), Mincle 단일클론항체(anti-Mincle mAb, MBL), DC-SIGN 항체(anti-DC-SIGN Ab, Abcam), 재조합 마우스 MMR 단백질(R&D systems)
5. 종양 유도
B16F10 흑색종 세포를 10% FBS 보충된 DMEM에서 성장시켰다(27). B16F10 세포(100μl PBS 중 1x105세포)를 피하주사하고 시간경과에 따라 종양 성장을 모니터링 하였다. 종양의 부피는 다음의 식으로 계산되었다:
(주원주(major circumference)/부원주(minor circumference)2)/2
종양 보유 마우스에 격일로 복강 내로 자이모산(200μg) 또는 β-1,3-glucan 제거된 자이모산을 투여했다. Zymolase 효소를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 200μg의 β-1,3-glucan이 자이모산으로부터 제거되었다.
6. CD4 T 세포 전달을 통한 실험성 대장염(experimental colitis)의 유도
실험성 대장염은 과거 알려진 방법에 따라 유도되었다(Powrie F, Leach MW, Mauze S, et al. Inhibition of Th1 responses prevents inflammatory bowel disease in scid mice reconstituted with CD45RBhi CD4+ T cells. Immunity 1994;1(7):553-62. 및 Leach MW, Bean AG, Mauze S, et al. Inflammatory bowel disease in C.B-17 scid mice reconstituted with the CD45RBhigh subset of CD4+ T cells. Am J Pathol 1996;148(5):1503-15.). 구체적으로, 유사유전자형(congenic, CD45.1+) Foxp3-EGFP 마우스 또는 CBir 마우스로부터 분류된 CD4+Foxp3GFP-CD44loCD62Lhi 미접촉 T 세포(1X106) FACs가 Rag1 결핍 마우스로 전달되었다. In vitro에서 생성된 MGCP로 유도된 Treg 세포의 효능을 평가하기 위해, 미접촉 CD4 T 세포를 표지된 Treg 세포(2x105)와 동시에 입양 전달(adoptively transferred)하였다. CBir 생쥐 유래의 미접촉 CD4 T 세포를 가지고 대장염을 유도하기 위해, 전체 실험 기간 동안 격일로 mock 또는 MGCP를수용체에 경구 투여하였다. 일주일에 두 번 체중을 측정하여 대장염의 진행을 모니터링 하였으며, 마우스는 체중이 약 20%로 감소되면 희생되었다. 질병의 중증도는 대장의 길이, 조직학적 평가 및 공여자 미접촉 CD4 T 세포로부터의 사이토카인 생성을 측정하여 분석하였다.
7. In vivo 입양 전달
미접촉 CD4 T 세포를 전달시키기 전에, 200μg의 MGCP를 C57BL/6 또는 Dectin1-/- 마우스에 매일 2주간 경구 투여하였다. 유사유전자 대립형질(congenic allele)을 보유하는 Foxp3-EGFP 또는 OT-II 마우스에서 분리된 CD4+Foxp3EGFP-CD44loCD62Lhi 미접촉 T 세포(정제 >99 %, 1.5-2X106)를 MGCP가 투여된 결핍 마우스에게로 정맥투여를 통해 옮겼으며, MGCP를 1주동안 매일 추가적으로 투여하였다. OT-II 미접촉 CD4 T 세포를 수여 받은 마우스에게는 20mg의 OVA단백질을 세포 전달 전날부터 실험이 끝날 때까지 1주동안 격일로 보충해 주었다.
8. 실험성 자가면역 뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis; EAE)의 유도.
0일에 400μg의 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis, BD Difco)를 함유하는 CFA(BD Difco) 에멀전 중의 200μg의 합성 MOG35-55펩타이드(Anygen, Korea)로 마우스를 면역화하였다. 홉합물 또는 MOG35-55 펩타이드, CFA 및 M.tuberculosis를 마우스의 좌우 플랭크 사이드(flank side)에 피하주사하였다. 마우스는 0일 및 2일에 복강 내 경로를 통해 400ng의 백일해 독소(pertussis toxin, List Biological Laboratories Inc)를 수여받았다. 매일 임상적 징후가 관찰되었다. 질병 점수(Disease score)는 다음과 같이 측정되었다:
0, 질병의 징후 없음; 1, 늘어진 꼬리(limp tail) 및 하부 약화(hind weakness); 2, 부분적 뒷다리 마비(partial hind limb paralysis) 또는 신체조정력 저하(uncoordinated movement); 3, 완전한 뒷다리 마비(complete hind limb paralysis); 4, 뒷다리 마비 및 앞다리 마비(hind limb paralysis and both forelimbs paralysis); 5, morbidund 또는 사망.
0일부터 면역화 마우스에 실험이 끝날 때까지 격일로 mock(DW) 또는 MGCP(200μg)를 복강 내 주사하였다.
9. RNA 염기 서열 분석(RNA sequencing)
비장으로부터 CD8-CD11b+DC를 FACs 분류하고 mock(DW) 또는 MGCP(25μg)으로 2, 4 및 8시간동안 처리하였다. DC를 추거하여 Trizol 시약에 용해하였다. RNA 단리 키트(GeneAll biotechnology)를 사용하여 총 전사체를 정제하였다. 대장대장대장리보스핀 TMII(Ribospin TMII, GeneAll biotechnology)를 전체 RNA의 분리에 사용하였다. TruSeq Stranded mRNA 샘플 준비 키트(Illumina, San Diego, CA)를 라이브러리를 제조했다. RNA 염기서열분석은 NextSeq 500 Sequencing platform을 가지고 수행되었다. 생체 내 대장 DC에서의 전사체 분석을 위해 GF 마우스에 2주동안 매일 mock 및 MGCP를 투여하였다. mock 및 MGCP 보충된 GF 마우스로부터의 대장 CD11c+DC는 대장 점막 고유층 전체 세포로부터 제조자의 프로토콜에 따라 마이크로비드를 사용하여 분리하였다. 리보스핀 TMII(Ribospin TMII, GeneAll biotechnology)를 사용하여 mock 또는 MGCP 급여 마우스의 대장 DC로부터 총 RNA를 정제하였으며, 비장 CD8α-CD11b+ DC의 분석방법과 동일하게 TruSeq Stranded mRNA 샘플 준비 키트(Illumina, San Diego, CA)를 라이브러리를 제조했다. NextSeq 500 Sequencing platform로 전사체 분석을 수행하였다. RNA 염기서열 데이터는 Gene Expression Omnibus (NCBI) 데이터 저장소에 기탁되었다(등록 번호 GEO: RNA-seq data: GSE126937).
10. 정량 역전사 중합효소 PCR(QrtPCR)
비장 CD8-CD11b+ DC를 FACs 분류하고 8시간동안 mock(DW) 또는 MGCP(25μg)로 자극하였다. 세포를 수확하고 TRIzol 시약에 용해시켰다. 총 전사체는 제조업체의 프로토콜에 따라 정제하였다. 대장정제된 mRNA는 M-MLV 역전사효소(promega)를 사용하여 cDNA로 합성되었다. mock 및 MGCP 보충된 GF 마우스로부터의 대장 CD11c+DC의 총 전사체를 확인하기 위해 GF 마우스에 2주간 매일 mock 또는 MGCP(200μg)을 공급하였다. 대장 CD11c+ DC 세포를 마이크로 비드(MACs)로 분류하고 TRIzol 시약에 용해하였다. 총 RNA의 정제 및 cDNA의 합성을 위해 비장 CD8-CD11b DC에서의 전사체 분석과 동일한 프로토콜을 수행했다. 표지된 마커의 발현량은 하기 표 1의 프라이머 쌍 및 상기 방법으로 제조된 cDNA를 이용하여 분석하였다. 모든 데이터는 hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HPRT)의 발현 수준으로 정상화(normalized) 되었다. 결과는 mock 대조군의 발현수준에 대한 상대적인 발현수준으로서 추가적으로 분석되었다.
프라이머 염기서열
표지 마커 프라이머 염기서열 서열
번호
HPRT Forward 5'-TTA TGG ACA GGA CTG AAA GAC-3' 1
Reverse 5'-GCT TTA ATG TAA TCC AGC AGG T-3' 2
IL-10 Forward 5'-ATA ACT GCA CCC ACT TCC CA-3' 3
Reverse 5'-TCA TTT CCG ATA AGG CTT GG-3' 4
TGF-β Forward 5'-CTC CCG TGG CTT CTA GTG C-3' 5
Reverse 5'-GCC TTA GTT TGG ACA GGA TCT G-3' 6
PD-L1 Forward 5'-GCT CCA AAG GAC TTG TAC GTG-3' 7
Reverse 5'-TGA TCT GAA GGG CAG CAT TTC-3' 8
IDO Forward 5'-GCT TTG CTC TAC CAC ATC CAC-3' 9
Reverse 5'-CAG GCG CTG TAA CCT GTG T-3' 10
COX2 Forward 5'-TGG CTG CAG AAT TGA AAG CCC T-3' 11
Reverse 5'-AAA GGT GCT CGG CTT CCA GTA T-3' 12
11. 조직학적 분석
실험성 대장염의 임상학적 점수는 H&E 염색을 통한 조직학적 분석으로 측정하였다. 간단히 말해, 콜론1cm를 10% 포름알데히드에 고정시키고 파라핀 조각에 포매하였다. 파라핀 조각을 3μm 두께로 절단하고 Hematoxylin(Sigma-Aldrich) 및 Eosin(Sigma-Aldrich)으로 염색 하였다.
10. 통계분석
통계 분석은 그래프패드 프리즘 소프트웨어(Graphpad Prism software, La Jolla, USA)를 사용하여 수행되었다. 대조군과 실험군의 차이는 양측의 비짝지음-스튜던트 t-테스트를 사용하여 평가하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다.
실시예 1: 자이모산(zymosan)에서 염증성(pro-inflammantory) 성분의 확인
면역 시스템에서 이스트 다당류의 면역 조절 기능을 연구하기 위해 DC에 자이모산을 처리한 후, 각각의 T helper 세포 스큐잉(skewing) 사이토카인의 존재 하에서 미접촉 CD4 T 세포와 함께 배양하였다. FOX3 발현에 의해 결정된 바와 같이, 유도 Treg(iTreg) 생성은 영향을 받지 않았지만, 자이모산 프라이밍된(primed) DC는 Th1 스큐잉(skewing) 조건에서, CD4 T 세포로부터의 IFN-γ이 증가하도록 촉진하였다(도 1A 및 1B). 자이모산의 주요 구성 요소가 각각 면역 시스템에 어떠한 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해, 각 구성에 특이적인 절단 효소를 사용하여 자이모산에서 각 개별 다당류를 제거하였다. 흥미롭게도, β-1,3-글루카나아제를 처리하여 자이모산에서 β-1,3-glucan을 제거하면, Treg 세포의 유도가 급격히 증가하는 것을 확인하였다(도 1C). 반면, 위에서 확인한 자이모산의 Th1-분화 촉진 특성은 β-1,3-glucan을 제거하는 경우에 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 1D). β-1,6-glucan 또는 만난(mannan)을 각각 제거하는 경우, T 세포의 분화에 거의 영향을 미치지 않는다(도 S1A 및 S1B).
상기 결과는 개별적인 세포 표면 다당류 각각의 상반되는 효과가 조합되는 방식으로 자이모산의 면역 조절 특성을 형성하며, 실험 조건에 따라 자이모산의 면역 시스템에 대한 상반된 효과를 보고한 이전의 문헌들을 설명할 수 있다. 자이모산의 염증성 역할은 β-1,3-glucan, β-1,6-glucan 및/또는 만난(mannan)에 의해 매개되지만 이들의 기능은 각각 반대된다. 항 종양 면역과 관련하여 상기한 면역 조절 개념을 테스트하기위해, 자이모산 또는 β-1,3-glucan이 제거된 자이모산을 B16.F10 종양을 가진 마우스에 투여하였다. 종래의 보고서에 따르면, 자이모산이 종양의 성장 및 크기를 현저히 감소시키는 효과를 가져야 하나(Taghavi, M., et al., J Inflamm (Lond), 2018. 15: p. 5), β-1,3-glucan이 제거된 자이모산의 경우는 자이모산이 가지는 항종양성을 제거하였다(도 1E 내지 1G). 이는 자이모산 매개 IFN-γ의 생산증가효과가 감소뿐 아니라, 종양 배출 림프절(tumor draining lymph nodes)에서의 CD4+Foxp3+ Treg 세포의 빈도가 유의하게 증가함에서 비롯한 것으로 확인되었다(도 1H 및 1I).
실시예 2: 자이모산에서 β-1,6-glucan의 Treg 세포 유도효과 확인
상기 실시예 1의 결과는 정상 조건에서도 자이모산에서 β-1,3-glucan의 풍부성이 염증 유발 및 면역 증진을 촉진하는 반면, β-1,6-glucan 및/또는 만난(mannan)에 의해 매개되는 고유의 면역 조절 특성은 β-1,3-glucanase의 처리와 같이 β-1,3-glucan이 제거된 경우에만 발현된다는 것을 의미한다. 자이모산의 면역 증진에 대한 염증성은 광범위하게 연구되고 있으며, 많은 보고가 있으나, 면역 억제에 관해서는 거의 보고된 바 없다(Sanguedolce, M.V., et al., J Immunol, 1992. 148(7): p. 2229-36, Gantner, B.N; et al., J Exp Med, 2003. 197(9): p. 1107-17; Young, S.H., et al., Exp Lung Res, 2013. 39(1): p. 48-57). 수용성 다당류의 선택적 정제방법(Zekovic, D.B., et al., Crit Rev Biotechnol, 2005. 25(4): p. 205-30)을 사용하여, 수 불용성인 β-1,3-glucan을 제거하여 자이모산의 면역 억제능을 활성화한 효모 세포벽 유래의 다당류 추출물(YE)을 수득하였다(상세는 재료 및 방법 참조). 정제된 YE는 비최적(sub-optimal) Treg 유도 조건에서, iTreg 세포의 생성을 극적으로 촉진하였다. 정제된 YE에 대한 추가적인 β-1,3-glucanase의 처리는 이러한 특성을 매우 조금 증가시켰으며, 이는 정제된 YE에서 β-1,3-glucan이 효율적으로 제거되었음을 입증한다(도 2A).
온전한 효모 세포벽으로부터 유래된 정제 다당류의 조성 및 고저의 분석은 효모 유래 다당류가 주로, 만노스(mannose, 80.6%), 글루코스(glucose, 14.9%)로 구성된 것으로 나타났으며(도 S2A), 이는 만난(mannan)과 β-1,6-glucan의 중합체 형태로 존재한다(도 2B, 2C 및 S2B). 상기 분석과 같이, β-1,3-glucan을 함유하는 β-1,3-글루코시드 결합으로 구성된 다당류는 검출되지 않았으며, 효모 세포벽에서 β-1,3-glucan을 제거하고 수득한 상기 다당류를 Mannan/β-glucan Containing Polysaccharides(MGCP)로 명명하였다. 만난 구조는 구체적으로, 알파-1,6-결합 만노스 골격과 α-1,2-결합 또는 α-1,3-결합으로 연결된 단일 유닛 만노스(30%), 2유닛 만노스(16.8%) 또는 3 유닛 만노스(28.4%)를 사이드 체인으로 구성되어 있음을 확인하였다(사이드 체인이 없는 만노스(24.8%)(도 2B). β-1,6-glucan 분획은 β-1,6-연결 글루코스 골격을 가지며, 골격의 글루코스 중 18%는 β-1,3-결합된 단일 유닛 글루코스를 사이드 체인으로 한다(도 2C). 상기 MGCP로 프라이밍된 비장 DC는 iTreg 세포 분화를 촉진할 뿐만 아니라(도 2D), 용량 의존적으로 Th1 세포의 분화를 극적으로 억제하였다(도 2E). 이어서, 시중에서 구매한 만난(mannan; Sigma aldrich, Saccharomyces cerevisiae (효모) 유래), β-1,6-glucan(Pustulan; Invivogen, Lasallia pustulata 유래) 및 β-1,3-glucan(Curdlan; Wako chemical, Alcaligenes faecalis 유래)과 상기 MGCP의 면역 억제세포 생성능력을 비교하였다. 도 S2C 및 S2D에 도시된 바와 같이, 일반적인 만난, β-1,6-glucan(Pustulan) 및 β-1,3-glucan(Curdlan)의 처리는 Treg 세포(CD4+FOXP3+ T cell)가 거의 생성되지 않은데 반해, 상기 MGCP의 처리는 약 10배에서 20배 이상의 Treg세포 유도능을 나타내었다.
MGCP의 분자량을 확인하기 위하여, 본 기술분야에 알려진 방법으로, HPLC를 이용하여 분석하였다. TSK G-G5000PWXL 크기 배제 컬럼을 사용하였으며, 용리제(Eluent)는 50mM의 암모늄 중탄산염(ammonium bicarbonate)을 0.8ml/min의 유속으로 흘려주었다. 분석 결과는 시차 굴절 분석기(refractive index detector)와 206nm 파장의 자외선 분석기(UV detector)를 사용하여 확인하였다. 분자량의 확인을 위해 사용한 기준 물질은 Dextran standard를 사용하였고 이에 대한 정보는 하기 표 2와 같다.
MGCP의 HPLC 분석 결과
Dextrans(kDa) logPM 머무름 시간 (min)
(retention time) 		머무름 부피(mL)
(retention volume)
1 3 13.156 10.5248
5 3.698970004 12.528 10.0224
50 4.698970004 10.71 8.5680
150 5.176091259 9.843 7.8744
410 5.612783857 9.122 7.2976
670 5.826074803 8.809 7.0472
HPLC 결과, 크게 두 개의 피크를 확인하였고, MGCP의 분자량은 4kDa 내지 60kDa임을 확인하였다(도 S2E 및 하기 표 3). MGCP 전체의 HPLC 분석 결과를 바탕으로, 도 S2E에 도시된 바와 같이, 전체 MGCP를 분자량에 따라 두 부분으로 분획하였으며, 면역 조절을 담당하는 MGCP의 필수 요소를 확인하기 위해, 겔 여과 컬럼을 갖는 액체 크로마토 그래피(liquid chromatography)를 통해 분자량에 따라 MGCP를 분획하고 각 분획의 면역 조절 효능을 평가하였다 (도 S2E 및 하기 표 3).
MGCP 분획의 HPLC 분석 결과
샘플 머무름 시간(min) 분자량(kDa)
총 MGCP 10.529 59.026
12.020 7
12.399 4
High M.W. 분획 10.512 60
Low M.W. 분획 10.620 51
12.001 7
12.523 3.5
MGCP의 크로마토그램(chromatogram)은 높은 분자량(>50kDa) 및 낮은 분자량(<50kDa)을 갖는 2개의 피크를 나타냈다(도 S2E). 분자량이 다른 각 분획의 화학적 동일 성 및 면역학적 특성을 확인하였다. 높은 분자량을 가진 분획에는 만난(mannan)이 함유되어 있으나, β-1,6-glucan은 없었다. 만난과 β-1,6-glucan을 완벽히 분리하는 것이 기술적으로 어렵기 때문에 추가적인 분리는 불가능 하였으며, 높은 분자량을 가진 분획에 만난만 존재하는 반면, 낮은 분자량을 가진 분획에는 β-1,6-glucan과 만난을 모두 함유하고 있음을 확인할 수 있었다(도 S2E 및 S2F). 흥미롭게도 β-1,6-glucan을 포함하는 낮은 분자량을 가진 분획은 Treg세포로의 분화를 현저하게 유도하여, MGCP의 실험과 동일한 결과를 나타내었으나, 만난(mannan)만을 포함하는 높은 분자량 분획은 Treg 세포로의 분화를 촉진하지 않는 것으로 나타났다(도 S2G). MGCP의 면역 조절 특성에 있어서, β-1,6-glucan의 역할이 필수적임을 확인하기 위해, 동족 절단 효소(cognate cleaving enzymes)로 MGCP에서 β-1,6-glucan을 제거하였다. β-1,6-glucan의 제거는 Treg 생성의 현저한 감소로 이어졌으며, 이는 Treg 유도가 주로 β-1,6-glucan에 의존적임을 의미한다(도 2F) 또한, MGCP로부터 β-1,6-glucan을 제거한 결과 Th1 분화 억제능력을 상실하였다(도 2G). 본 발명자들은 활성 성분으로, β-1,6-glucan을 함유하는 B.bifidum 유래의 캡슐 다당류가 Treg 세포가 유도할 수 있음을 이미 증명하고 출원한 바 있으므로(대한민국 특허출원 제10-2018-0067535호(출원 공개) 및 제10-2019-0086354호), 효모 세포벽 유래의 다당류인 MGCP와 B.bifidum 유래의 다당류인 CSGG의 면역 조절능을 비교하였다. 상기 MGCP와 CSGG의 구조는 도 S2H에 도시된 바와 같다. 두 다당류 모두 확인한 바와 같이, Treg 세포로의 분화를 유도하여 Treg 세포의 생성을 극적으로 증가시켰으나, IFN-γ의 생성에 있어서 현격한 차이를 나타내었다. MGCP는 IFN-γ의 생성을 현저히 억제하는 반면, CSGG는 IFN-γ의 생성을 약간 증가시켰다(도 S2I). 이는 신규한 효모 세포 표면 다당류의 면역 조절 특성이 주로 MGCP 만의 특유한 β-1,6-glucan의 활성 또는 매커니즘에 기인할 수 있음을 의미한다.
실시예 3: In vivo에서 MGCP로 유도된 Treg 세포의 염증성 대장염 완화효능 확인
MGCP가 Treg으로의 세포 분화를 촉진할 수 있음을 증명한 바 있으므로, 이러한 결과가 대장염 유발 마우스(Powrie, F., et al., Immunity, 1994. 1(7): p. 553-62)의 염증 환경에서 생채 내(in vivo)에서도 동일한 효능을 나타낼 수 있는지를 확인했다. 유사유전자형 마커(congenic marker)로서 CD45.1+를 갖는 Treg 세포를 MGCP에 프라이밍 DC를 사용하여 시험관 내(in vitro)에서 생성하였으며, 수용자 마우스에 (adoptively transferred) 미접촉 CD4+ T 세포와 동시 입양하여 MGCP 유도 Treg 세포의 면역 억제능을 확인하였다. MGCP 유도 Treg 세포는 대장염의 발달을 방해하였으며, 체중 감소 및 대장 길이 단축은 MGCP 유도 Treg 세포를 수령한 마우스에 유의하게 감소함을 확인하였다(도 2H 및 2I). 대장염의 임상적 증상과 일치하여 MGCP 유도 Treg 세포의 전달은 대장 조직에서 상피 세포 구조의 파괴를 방지하였으며, 개선된 조직 병리학 점수(histopathology score)로 표시된 대장 점막 고유층(colonic lamina propria)으로의 림프구의 침윤을 억제하였다(도 2J). 대장염의 발병기전에서 IFN-γ의 역할이 입증된 바 있으므로, 대장 점막 고유층의 CD4 T 세포로부터 병원성 사이토카인, 및 IFN-γ의 생성을 평가하였다. 공여자 미접촉 CD4 T 세포의 IFN-γ 수준은 미접촉 CD4 T 세포만을 수여 받은 마우스보다 MGCP-Treg을 수여받은 마우스에서 극적으로 감소되었다(도 2K). 상기 결과는 MGCP-유도 Treg 세포가 염증성 사이토카인의 생성을 억제하고, 염증성 대장염을 개선시키는 기능을 할 수 있음을 입증한다.
실시예 4: MGCP 경구 투여를 통한 장내 Treg 세포의 생성 및 IFN-γ의 감소.
실시예 3에서 MGCP는 시험관 내에서(in vitro) 기능적 Treg 세포의 유도를 촉진하며, 유도된 Treg 세포는 생체 내에서 기능적으로 활성임을 확인하였다. 이어서, MGCP가 생체 내에서(in vitro) Treg 세포를 생성할 수 있는지 여부를 확인했다.
MGCP를 경구 투여한 마우스(CD45.2+)에 유사유전자형 미접촉 CD4 T 세포(CD45.1)를 전달하였다(도 3A). 흥미롭게도, MGCP의 투여는 대조군에 비하여, 대장 및 소장 모두에서, 공여자 CD4 T 세포로부터 상당히 높은 빈도로 Treg 세포를 생성하였다(도 3B, 3C, 3D 및 3E). 수용자 유래의 Treg 세포의 빈도 및 수는 대장 및 소장 모두에서 대조군과 유사하게 나타났지만(도 S3A 및 도 S3B), MGCP 투여 마우스의 소장 및 대장에 존재하는 수용자 Treg 세포 중에 헬리오스(Helios)를 발현하는 세포가 증가한 것으로 관찰 되었다 (도 S3C 도 S3D). 기능적으로, MGCP의 투여는 오직 소장과 대장 모두의 Treg 세포의 IL-10 생산을 유의하게 증가시켰다(도 3F 및 3G). 장 점막 점막 고유층(intestinal lamina propria) 이펙터 CD4 T 세포로부터의 IFN-γ의 생성은 MGCP의 처리 후 감소되었다(도 3H 및 3I). 종합하면, MGCP는 개선된 IL-10의 생성으로 생체 내 기능성 Treg 세포의 신규한(de novo) 생성을 촉진시키면서, 장내 이펙터 CD4 T 세포로부터 염증성 사이토카인인 IFN-γ을 현저히 억제하였다. 이러한 결과는 MGCP의 경구투여를 통해 항상성 조건(homeostatic conditions)에서 장에서 면역 조절 환경을 증진시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 5: MGCP 처리를 통한 염증성 자가면역 질환의 개선
MGCP가 항원-반응성 Treg 세포를 유도하고 생체 내 염증성 면역 반응을 억제하는지 여부를 확인하기 위해, 미생물 플라젤린 반응성 CD4 T 세포를 보유한 CBir 마우스를 사용하였다(Brandwein, S.L., et al., J Immunol, 1997. 159(1): p. 44-52). CBir 마우스의 미접촉 CD4 T 세포를 Rag1-/- 마우스로 전달고 경구투여를 통해 mock(DW) 또는 MGCP를 매일 투여했다(도 4A). 면역이 약화된 마우스에 미생물 반응성 미접촉 CD4 T 세포(microbe responsive 미접촉 CD4 T cells)를 입양전달(adoptive transfer)하는 것은 공생 마이크로바이오타에 대한 과도한 면역반응으로 인한 실험성 대장염을 유발한다는 보고가 있다(Cong, Y., et al., J Exp Med, 1998. 187(6): p. 855-64). 그러나 MGCP의 보충은 체중 감소에 현저한 저항성을 나타냈다(도 4B). 체중 감소 방지 효과에 더하여, 대장 길이의 단축 또한 MGCP의 투여로 예방되는 것으로 확인되었다(도 4C). 일관적으로, MGCP의 처리는 mock 처리된 마우스와 비교하여, 상피 세포의 증식 및 림프구의 대장 내 침윤을 억제하였으며(도 4D), 병리학적 점수를 완화하였다(도 4E). 이전 실시예에서, 병원성 사이토 카인의 생성을 억제하고 기능성 Treg 세포의 신규 생성을 철진하는 MGCP의 능력을 입증한 바 있다(도 2 및 도 3). 이와 마찬가지로, MGCP의 투여는 mock 처리 마우스와 비교하여 미생물 반응성 Treg 세포의 분화를 증가시켰다(도 4F). 추가적으로 MGCP의 처리를 통해 염증 환경에서 공생 항원 반응성 CD4 T 세포(commensal antigen-reactive CD4 T cells)로부터의 유해한 사이토카인의 생산도 억제할 수 있는지 여부를 확인하였다. 공여자 CD 4 T 세포로부터의 MGCP 투여 마우스의 대장에서 IFN-γ의 생성이 실질적으로 억제되었으나 IL-17A는 억제되지 않았으며, mock 처리된 마우스에서는 그렇지 않았다(도 4G 및 도 S4A). Treg 세포 단위에서 활성 관련 유전자의 발현은 유사하였다(도 S4B). 상기 데이터는 MGCP의 투여가 공생 항원(commensal antigen)에 반응하는 Treg 세포의 생성을 촉진하고, 유해한 사이토카인, IFN-γ의 생성을 억제함으로써 염증성 대장염의 발생을 억제함을 입증하였다.
실시예 6: 다른 면역질환(뇌척수염)에서의 MGCP의 효과 확인
MGCP의 투여가 다른 자가 면역 질환을 억제할 수 있는지 여부를 추가로 확인하기 위해, 본 발명자들은 실험성 자가면역 뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis; EAE)을 유도하기 위해 MOG35-55 펩타이드로 면역화된 마우스에 MGCP를 적용하였다. MOG35-55 면역화된 마우스에 매일 DW(mock) 또는 MGCP를 경구투여와 복강투여하였다(도 4H). 두 가지 방법의 MGCP의 투여는 EAE의 증상을 완화시키는 경향성을 보였으며, 특히 복강 투여는 완벽하게 EAE의 발달을 방지하였다 (도 4I). MGCP 복강 투여는 EAE의 발달을 방지하고 척수로 면역 세포의 침윤을 억제했지만, mock 처리 마우스는 그렇지 않았다(도 4J 내지 4L). 증상과 일치하여, IFN-γ+IL17A+ 유해 사이토카인 생산 CD4 T 세포는 MGCP 수용 마우스의 척수에서 현저히 억제되었다(도 4M). 또한, IFN-γ 및 IL17A 생산 CD4 T 세포는 MGCP 투여 마우스의 척수 및 배출 림프절 모두에서 감소되었지만, mock을 주사한 마우스에서는 그렇지 않았다(도 S4C 내지 S4E). 척수에서의 Treg 세포의 빈도는 MGCP와 mock가 유사했으나, MGCP는 배출 림프절에서의 Treg 세포를 증가시켰다(도 S4F 및 S4G). 이를 종합하면, MGCP의 투여는 Treg 세포를 유도하고 병원성 사이토카인의 생성을 억제하는 상이한 매커니즘을 통해 염증성 자가면역질환을 억제함을 의미한다.
도 7: MGCP에 의한 면역 억제 메커니즘의 확인
이전의 보고는 D-(+)-mannose가 CD 4 T 세포에 직접적으로 영향을 미침으로써 Treg 세포 분화를 유도할 수 있다고 설명한다(31). MGCP가 Treg 세포를 유도하는 메커니즘을 확인하기 위해, MGCP가 CD4 T 세포에 직접적으로 영향을 미쳐 Treg 세포를 유도할 수 있는지 여부를 확인했다. 그 결과 CD4 T 세포에 직접적으로 영향을 미쳐 Treg 세포로의 분화를 유도하는 D-(+)-mannose와 달리, MGCP는 직접적으로 Treg 세포로의 분화를 유도할 수 없으나, MGCP는 DC를 매개로 하여 Treg 세포를 유도함을 하였으며, D-(+)-mannose는 DC 매개의 Treg 세포 유도능을 나타내지 않았다(도 5A). DC는 비장에서 CD8α와 CD11b의 발현에 따라 구분할 수 있다(32). 상기 각각의 비장 DC 서브셋(subset)을 MGCP로 자극한 후 미접촉 CD4 T 세포와 함께 배양하였다. 흥미롭게도 비장 CD8α-CD11b+DC는 총 CD11c DC의 반복 활성(recapitulating activity)으로 약 15배 증가한 Treg 세포 분화 유도능을 나타내었다(도 5B 및 5C). CD8α+CD11b+ DC도 Treg 세포 분화를 증가시켰으나, CD8α-CD11b+DC에 비해 50% 감소된 Treg 분화 유도능을 나타내었다(도 5B 및 5C). MGCP 프라이밍된 DC가 Treg 세포를 유도하면서도 IFN-γ를 억제하는 메커니즘을 확립하기 위해, 비장 CD8α-CD11b+DC를 분류하고 DW(mock) 또는 MGCP로 처리한 후 전사체 형태(transcriptomic configuration)를 확인하였다.
MGCP의 처리는 Il10, Cd274 (PD-L1 코딩 유전자), Arginase (Arg) 및 Il27과 같은 면역관용성 DC(tolerogenic DC) 관련 마커의 발현을 향상 시켰다(34)(도 5D 및 5E). 흥미롭게도, MGCP는 Ptgs2(cyclooxygenase-2, Cox2 코딩 유전자)의 발현을 mock DC와 비교하여 극적으로 향상시켰다(도 5D 및 5E). 또한, MGCP의 투여가 면역 관용성 표현형(tolerogenic phenotype)으로 DC의 전사체를 조절하고 생체 내의 비장 DC를 모방하는지 여부를 확인하기 위해, MGCP를 무균 마우스(germ free mice; GF 마우스)에 급여하였다. 미생물 자극제에 의한 DC 활성화 가능성을 배제하기 위해 GF 마우스를 사용하였다. CD11c+DC를 MGCP 보충된 마우스의 대장으로부터 분리하고, 이의 전사체 형태를 분석하였다. 비장 CD8-CD11b+ DC와 유사하게 MGCP 처리는 면역 관용성 DC 관련 마커의 발현을 극적으로 향상시켰으며, 대장 DC에서의 Ptgs2 발현을 극적으로 증가시켰다(도 S5A 및 S5B). Cox2는 종양환경에서 Treg 세포를 유도하나, IFN-γ의 발현 및 Th1 면역을 억제하는 것으로 이미 보고된 바 있으므로, MGCP에 의한 면역 조절에서 Cox2의 역할을 평가하였다. 비장 DC를 MGCP로 자극하고, Cox2의 선택적 억제제인 Celcecoxib의 존재 하에 미접촉 CD4 T 세포와 함께 배양하였다. MGCP에 의한 Treg 세포의 유도능은 비최적(suboptimal) Treg 스큐잉(skewing) 환경에서 Cox2를 억제함으로써 크게 상실되었으며(도 5F 및 도 5G), 반면, Cox2 억제는 Th1 세포 구동 사이토카인(Th1 cell driving cytokine)의 존재 아래에서 MGCP에 의해 억제된 IFN-γ의 발현을 회복시켰다(도 5H 및 5I). 상기 결과는 MGCP에 의한 Treg 세포의 유도 및 Th1 세포로의 분화 억제가 Cox2 의존적 방식으로 CD8-CD11b+DC 서브셋에 의해 특이적으로 매개됨을 의미한다. 또한, MGCP 는 DC 전사체 지형(transcriptome landscape)을 면역관용성 DC의 표현형으로 나타나도록 변형시켰다.
실시예 8: MGCP의 Dectin1-Cox2 축 메커니즘을 통한 면역 억제능
DC는 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptors, PRRs)를 발현하여 장내에 존재하는 다당류를 포함한 미생물 항원을 인식한다. MGCP 매개 면역 조절에서 선천적 면역 수용체의 역할을 조사하기 위해, β-glucan을 포함하는 곰팡이 다당류를 인식하는 것으로 알려진 다른 C-형 렉틴 수용체(CLR)의 역할을 확인하였다. Dectin1이 결핍된 비장DC는 MGCP에 의한 Treg 세포의 생성을 유의하게 감소시켰지만, Dectin2의 결핍은 Treg 세포의 분화를 비교적 적게 감소시켰다(도 6A). 흥미롭게도 MGCP는 DC의 Dectin1을 통해 Treg 세포의 생성을 유도하는 반면, CSGG는 TLR2를 통해 Treg 세포의 생성을 유도하는 것을 확인하였다(도 6A). MGCP는 Dectin1 이외에도 MGCP는 일부 TLR과 그 신호 전달 체계를 통해 Treg 세포의 생성을 유도할 수 있는 것을 확인하였다 (도 S6A). 또한, DC-SIGN, Mincle 및 만노스(mannose) 수용체 각각의 길항작용 차단 항체(antagonistic blocking antibody)를 이용하여 다른 C-형 렉틴 수용체의 역할을 조사하였다. DC에서 DC-SIGN 신호의 차단은 MGCP에 의한 Treg 세포의 분화를 어느 정도 감소시켰지만, 다른 수용체는 유의미한 효과를 나타내지 않았다(도 6B). MGCP 매개 Treg 세포의 생성에 있어서, Dectin1의 역할을 더욱 구체적으로 확립하기 위해, MGCP 자극후 Dectin1 충분 및 결핍 DC의 면역 관용성 유전자의 발현을 평가하였다. Dectin1 충분 DC는 MGCP 자극후 Ptgs2 및 기타 조절 마커의 발현 증가를 나타내었지만 Dectin1 결핍 DC에서는 그렇지 않았다(도 6C 및 S6B). 다음으로, 우리는 MGCP에 의한 생체 내 Treg 세포 유도에 있어서, Dectin1의 역할을 입증하기 위해, Dectin1 충분 또는 결핍 마우스에 MGCP를 급여했다. OT-II 마우스로부터 미접촉 CD4 T 세포를 수여 받은 마우스에 MGCP를 투여하였으며, MGCP와 오브알부민(ovalbumin)을 동시에 추가 1주일동안 지속적으로 급여하였다. 흥미롭게도, MGCP의 투여는 소장에서 오브알부민 반응성 Treg 세포의 분화를 극적으로 유도하였으나, Dectin1 결핍 수용체에서는 MGCP의 Treg 유도능이 상실되었다(도 6D). 그러나, 수용체 Treg 세포의 빈도는 유사했으며, MGCP 급여 전체 Treg 세포 중 Helios- iTreg 집단은 Dectin1 온전한 마우스의 소장에서 증가한 반면, MGCP 급여 Dectin 결핍 마우스는 그렇지 않았다(도 6E 및 S6C). 또한, Treg 세포의 절대 수는 mock 공급 마우스보다 MGCP 처리 생쥐에서 다소 증가하였다(도 S6D). 또한, 상기 마우스의 장간막 림프 절(mesenteric lymph node)에서도 MGCP가 Treg 세포의 유도에 영향을 주는지 여부를 확인했다. Dectin1 온전한 마우스에서 Treg 세포 분화의 빈도가 증가했지만, Dectin1 결핍 마우스에서는 MGCP의 영향을 무시할 수 있었다(도 S6E). 종합적으로, 상기 결과들은 MGCP에 의한 in vivo Treg 세포 유도 분자 매커니즘이 DC의 Dectin1 - Cox2 axis에 의존적임을 시사한다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> INSTITUTE FOR BASIC SCIENCE POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Yeast-derived polysaccharides inducing Treg cells and inhibiting pathogenic cytokines and uses thereofStructure and functional characterization of yeast derived polysaccharides in inducing Treg cells <130> P20-B064 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT primer Forward <400> 1 ttatggacag gactgaaaga c 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPRT primer Reverse <400> 2 gctttaatgt aatccagcag gt 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 primer Forward <400> 3 ataactgcac ccacttccca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 primer Reverse <400> 4 tcatttccga taaggcttgg 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta primer Forward <400> 5 ctcccgtggc ttctagtgc 19 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta primer Reverse <400> 6 gccttagttt ggacaggatc tg 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-L1 primer Forward <400> 7 gctccaaagg acttgtacgt g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-L1 primer Reverse <400> 8 tgatctgaag ggcagcattt c 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDO primer Forward <400> 9 gctttgctct accacatcca c 21 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDO primer Reverse <400> 10 caggcgctgt aacctgtgt 19 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX2 primer Forward <400> 11 tggctgcaga attgaaagcc ct 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX2 primer Reverse <400> 12 aaaggtgctc ggcttccagt at 22

Claims (16)

  1. 만난(mannan) 및 β-글루칸(β-glucan)을 포함하는 다당체로,
    상기 β-글루칸(β-glucan)은
    i) β-1,6-결합(β-1,6-linked)으로 결합된 글루코스 골격, 및
    ii) β-1,3-결합(β-1,3-link)으로 연결된 단일 유닛 글루코스 사이드 체인을 포함하며;
    iii) β-1,3-글루칸 골격(backbone)을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 다당체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 만난(mannan)은
    i) 알파-1,6-결합 (α-1,6-linked mannose)으로 연결된 만노스 골격(back bone); 및
    ii) 알파-1,3-결합 또는 알파-1,2-결합으로 연결된 단일 만노스(single mannose), 2 유닛 만노스(two unit mannose) 및 3 유닛 만노스(three unit mannose)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 사이드 체인을 포함하는 것을 특징으로 하는 다당체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 다당체는 분자량이 1kDa 이상 50kDa 이하인 것을 특징으로 하는 다당체.
  4. 제1항에 있어서, 만노스 70% 내지 90% : 글루코스 10% 내지 30%의 함량비로 포함된 것을 특징으로 하는 다당체.
  5. 제1항에 있어서, 조절 T 세포(Treg 세포)를 유도하는 것을 특징으로 하는 다당체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조절 T 세포(Treg 세포)는 CD4+Foxp3+ 조절 T 세포인 것을 특징으로 하는 다당체.
  7. 제1항에 있어서, CD4 T 세포의 IFN-γ 생성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 다당체.
  8. 제1항에 있어서, 효모(yeast) 유래인 것을 특징으로 하는 다당체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 다당체를 유효성분으로 함유하는 면역 조절용 조성물.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 다당체를 유효성분으로 함유하는 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 다당체를 유효성분으로 함유하는 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품.
  12. 다음의 단계를 포함하는 조절 T 세포(Treg 세포)의 제조방법:
    (a) 항원 제시 세포(antigen presenting cell)에 제1항 내지 제8항의 다당체를 처리하여 면역관용성 항원 제시 세포(tolerogenic antigen presenting cell)를 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 면역관용성 항원 제시 세포(tolerogenic antigen presenting cell)를 CD4+ T 세포와 공배양(co-incubation)하여 조절 T 세포(Treg 세포)를 유도하는 단계.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항원 제시 세포는 수지상 세포(Dendritic cell; DC)인 것을 특징으로 하는 조절 T 세포(Treg 세포)의 제조방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 항원 제시 세포는 Dectin1을 발현하는 것을 특징으로 하는 조절 T 세포(Treg 세포)의 제조방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 면역관용성 항원 제시 세포(tolerogenic antigen presenting cell)는 IL-10, Cd274, 인돌아민 2,3-디옥시게나아제(IDO), Tgfβ1 및 Cox2로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상을 과발현 하는 것을 특징으로 하는 조절 T 세포(Treg 세포)의 제조방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 조절 T 세포(Treg 세포)를 유효성분으로 함유하는 면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 세포치료제.
KR1020200046142A 2020-04-16 2020-04-16 Treg 세포의 유도 및 병원성 사이토카인의 억제능을 갖는 효모 유래 다당체의 구조 및 기능 특성 및 이의 용도 KR20210128551A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200046142A KR20210128551A (ko) 2020-04-16 2020-04-16 Treg 세포의 유도 및 병원성 사이토카인의 억제능을 갖는 효모 유래 다당체의 구조 및 기능 특성 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200046142A KR20210128551A (ko) 2020-04-16 2020-04-16 Treg 세포의 유도 및 병원성 사이토카인의 억제능을 갖는 효모 유래 다당체의 구조 및 기능 특성 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210128551A true KR20210128551A (ko) 2021-10-27

Family

ID=78287198

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200046142A KR20210128551A (ko) 2020-04-16 2020-04-16 Treg 세포의 유도 및 병원성 사이토카인의 억제능을 갖는 효모 유래 다당체의 구조 및 기능 특성 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20210128551A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW202045192A (zh) 細菌膜製劑
EP2590662B1 (fr) Complexe macromoleculaire provenant de bifidobacterium longum et utilisation dudit complexe pour prevenir et traiter les rhumatismes inflammatoires
KR100913405B1 (ko) Ｔｈ２－매개 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR102248111B1 (ko) 신규한 비피도박테리움 비피덤 균주 및 균주 유래 다당체
Xie et al. Lactobacillus plantarum NCU116 attenuates cyclophosphamide-induced immunosuppression and regulates Th17/Treg cell immune responses in mice
CA2973223A1 (en) Probiotic and prebiotic compositions, and methods of use thereof for modulation of the microbiome
JP5069556B2 (ja) Ｔ細胞アポトーシス誘導剤
KR20210008393A (ko) 세균 균주를 포함하는 조성물
JP7339450B2 (ja) 新規なラクトバシラスプランタルム菌株、菌株由来多糖体及びその用途
EP2722386B1 (en) Crushed cells and composition thereof
JPWO2009005124A1 (ja) 乳酸菌由来の２本鎖ｒｎａ
US20220370553A1 (en) Prebiotic-induced anti-tumor immunity
KR100913406B1 (ko) Ｔｈ１－매개 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR102226729B1 (ko) Treg 세포를 유도하는 효모 유래 다당체의 구조 및 기능 특성
KR20210128551A (ko) Treg 세포의 유도 및 병원성 사이토카인의 억제능을 갖는 효모 유래 다당체의 구조 및 기능 특성 및 이의 용도
CN111481565A (zh) 戈氏副拟杆菌的脂多醣用于抑制发炎反应的医药组合物的用途
WO2023222924A1 (en) Lachnospiraceae spp and ruminococcus lactaris strains for the treatment and prevention of alzheimer&#39;s disease and aging
Nanno et al. Lactobacillus casei strain Shirota: benefits based on a long history of usage
WO2024192172A1 (en) Dendritic cell populations that inhibit gvhd
JP2022552721A (ja) ビフィドバクテリウム・ビフィダムを含む免疫力増強または改善用組成物
KR20210035388A (ko) 키토산을 포함하는 면역억제용 조성물 및 이의 용도
Bernardo Intestinal Microbiota as Modulators of the Immune System