JP2006325540A

JP2006325540A - オリゴデオキシヌクレオチドおよびこれを利用する免疫修飾剤

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Publication number: JP2006325540A
Application number: JP2005157224A
Authority: JP
Inventors: Tadao Saito; 忠夫齋藤; Haruki Kitazawa; 春樹北澤; Tamotsu Ka; 方何; Masataka Hosoda; 正孝細田; Hirotsugu Morita; 裕嗣森田
Original assignee: Tohoku University NUC; Takanashi Milk Products Co Ltd
Current assignee: Tohoku University NUC; Takanashi Milk Products Co Ltd
Priority date: 2005-05-30
Filing date: 2005-05-30
Publication date: 2006-12-07

Abstract

【課題】免疫修飾剤として強い活性を有しながら、安全性の高いオリゴデオキシヌクレオチドを開発すること。
【解決手段】式（Ｉ）
５'−ＡＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＣＧＴＣＡＡ−３' （Ｉ）
で示される塩基配列を含むオリゴデオキシヌクレオチド、これを有効成分とする免疫修飾剤およびラクトバチルスラムノーサスに属する微生物のゲノムＤＮＡから、マウスおよびヒト由来Ｂリンパ球に対するマイトジェン活性を有するＤＮＡ断片を選択することを特徴とする上記式（Ｉ）で示される塩基配列を含むオリゴデオキシヌクレオチドの製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、乳酸菌から得られた新規なオリゴデオキシヌクレオチドおよびこれを利用する免疫修飾剤に関する。

免疫刺激をする病原菌由来ＤＮＡ中に、ＣｐＧモチーフと呼ばれる特異的配列が発見されて以来、ＣｐＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）に関する研究が盛んになった。２０００年に、Ａｋｉｒａらは、樹状細胞などの抗原提示細胞上に発現するＴｏｌｌ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）９がＣｐＧＯＤＮの受容体であり、種々の免疫応答に関与することを明らかにした。その後、ＣｐＧＯＤＮの免疫修飾剤としての応用を目指し、強い活性のあるＯＤＮの発見および開発が期待され、研究が進められている。

例えば、クリーグ（Krieg）らの免疫刺激オリゴヌクレオチドについての研究が報告されており（非特許文献１）、この研究については特許も出願されている（特許文献１）。

しかしながら、従来から知られている免疫修飾ＤＮＡは、いずれも病原菌由来ＤＮＡ配列かもしくは化学合成ＯＤＮであり、その安全性については疑問の残るものであった。

Ｎａｔｕｒｅ１９９５，５４６−５４９特開２００４−２１５６７０

従って、免疫修飾剤として強い活性を有しながら、安全性の高いＯＤＮの開発が求められており、本発明の課題は、このようなＯＤＮの提供である。

本発明者らは、上記課題を解決すべく、人類の長い歴史の中で、長期間にわたり食品に利用され、ヒトに対する安全性が担保されている乳酸菌に着目し、研究を行った。そしてその結果、乳業用乳酸菌として世界で広く利用されている、ラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ（ＬＧＧ）のゲノムＤＮＡから、マウスおよびヒトに対して強い免疫修飾作用を有する新規なＯＤＮ配列を見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、下式（Ｉ）
５'−ＡＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＣＧＴＣＡＡ−３' （Ｉ）
で示される塩基配列を含むオリゴデオキシヌクレオチドである。

また本発明は、上記オリゴデオキシヌクレオチドを有効成分とする免疫修飾剤である。

更に本発明は、ラクトバチルス・ラムノーサスに属する微生物のゲノムＤＮＡから、マウスおよびヒト由来Ｂリンパ球に対するマイトジェン活性を有するＤＮＡ断片を選択する前記オリゴデオキシヌクレオチドの製造方法である。

本発明のオリゴデオキシヌクレオチド（以下、「ＯＤＮ」という）は、リンパ球活性化、樹状細胞活性化、サイトカイン誘起等の免疫修飾作用を有するものである。そして、このＯＤＮは、長期間にわたり食品として利用された乳酸菌から導かれたものであるため、その安全性が高く、医薬品や健康食品などの食品等として有利に利用できるものである。

本明細書中において免疫修飾剤とは、免疫応答の修飾作用を応用し、疾病の予防・治療に貢献する薬剤を意味する。より具体的には、ワクチン、抗アレルギー剤、抗感染症剤、抗リウマチ剤、抗癌剤などを意味する。

本発明のＯＤＮは、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus GG）に属する微生物のゲノムＤＮＡを抽出し、これを適当な手段により断片化した後、マウスやヒト由来Ｂリンパ球に対するマイトジェン活性を有するＤＮＡ断片を選択し、これから、あるいはその配列に基づいてＯＤＮを合成することにより取得することができる。

本発明のＯＤＮを得るためのラクトバチルス・ラムノーサスに属する微生物としては、特に限定されるものではないが、例えば、ラクトバチルス・ラムノーサスＧＧＴＭＣ０５１４株が有利に利用できる。この微生物の性質については、既に、バリー・Ｒ・ゴールディンら等により報告されており（"Digestive Diseases and Sciences" Vol.37, No.1,p121-128 およびＵＳＰ４,８３９,２８１）、微生物自体も、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）に、ＡＴＣＣ５３１０３として寄託されている。上記菌株に限らず、他のラクトバチルス・ラムノーサスに属する微生物を使用しても、本発明ＯＤＮを得られることはいうまでもない。

前記ラクトバチルス・ラムノーサスに属する微生物からのゲノムＤＮＡの抽出は、例えば、この微生物を培養後、適当な酵素、例えば、リゾチーム、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、リボヌクレアーゼ等を作用させ、次いで、適当な沈澱剤、例えば、エタノール等によりＤＮＡのみを沈澱させればよい。

上記のようにして抽出されたＤＮＡは、次に、適当な制限酵素を用いて切断し、適当な長さ、例えば、１００〜５００ｂ程度のＤＮＡ断片を取得する。切断に用いる制限酵素としては、Ｓａｕ３ＡＩ等を利用することができ、切断されたＤＮＡ断片から目的とするものを得るためには、アガロースゲル電気泳動等の手段を用いることができる。

次いで、上記のようにして得られたＤＮＡ断片は、適当なベクターに組み込み、このベクターに対応した宿主細胞中で増殖させ、プラスミドＤＮＡとして分離、取得する。ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１１９ベクターが使用され、宿主細胞としては、Ｅ.ｃｏｌｉＤＨ５α等を利用することができる。

得られたプラスミドＤＮＡについて、例えば、リンパ球幼若化試験などの試験方法等により、マイトジェン活性を有するものを見いだし、これに組み込まれているＯＤＮ配列から、上記式（Ｉ）で表される断片が含まれているクローンを取得すればよい。

本発明のＯＤＮは、上記クローンから、適当な手段により切り出したものを使用することもできるし、また、上記クローンに含まれる配列を元に、例えば、ホスホアミダイド法等の方法により合成したものを使用することもできる。

かくして得られた本発明ＯＤＮを、免疫修飾剤として使用するには、例えば、前記式（Ｉ）のＯＤＮ、これを含むＤＮＡまたはこのＤＮＡを含む微生物を、経口または非経口で投与すればよい。このＯＤＮ（Ｉ）の投与量は、投与を受ける人や動物の状態によって異なるが、一般には、体重１ｋｇ当たり、１〜１００ｍｇ程度が好ましく、特に、３〜３０ｍｇが好ましい。また、本発明の免疫修飾剤は、通常の薬剤の製造方法に準じて製造することができ、更には、食品添加用剤とすることもできる。

上記した本発明の免疫修飾剤は、リンパ球および樹状細胞活性化や、サイトカイン誘起の他、ワクチンアジュバント等の作用を有するため、アレルギー、感染症、炎症性腸疾患、リウマチ、癌等の疾患の治療、予防薬として使用することができる。

以下実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。なお、本実施例において、実験動物としては、日本エスエルシー（浜松、静岡）から購入した６ないし８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪおよびＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスを使用し、微生物であるラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ（Lactobacillus rhamnosus GG ）ＴＭＣ０５１４、ラクトバチルス・ガッセリ（Lactobacillus gasseri）ＴＭＣ０３５６およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＴＭＣ３１１７は、高梨乳業（横浜）より提供を受けた。また、本試験で用いたリン酸ジエステルオリゴデオキシジヌクレオチド（ＯＤＮ）は、株式会社キアゲン（東京）により化学合成されたものであり、リムルスキット（生化学工業、東京）を用い、その使用説明書に従って、これらがエンドトキシンを含まないことを確認している。

実施例１
ラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ（ＬＧＧ）からＤＮＡの抽出：
ＬＧＧＴＭＣ０５１４を、ＭＲＳ培養液（Difco, Detroit, USA）中で、３７℃、１６時間培養し、更にルチャンスキー（Luchansky）ら（1991年）の方法により、染色体ＤＮＡを単離した。すなわち、培養したＬＧＧ細胞を、５０００ｇで１０分間遠心後、細胞を５０ｍＭＥＤＴＡ、０.５％Ｔｗｅｅｎ２０、０.５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２０ｍｇ／ｍＬリゾチーム、１０ｍｇ／ｍＬＮ−アセチルムラミダーゼＳＧ（生化学工業、東京）および１００μｇ／ｍＬＲＮＡａｓｅＡを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.０）に再懸濁した。

この懸濁液を、３７℃で１時間培養後、２００μＬ／ｍＬのプロテイナーゼＫ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ、宝酒造、京都）を添加し、この混合液をさらに１６時間、３７℃で培養した。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／ｖ）の溶媒による抽出を繰り返してＤＮＡを精製し、酢酸ナトリウムおよびエタノールを用いて沈殿させた後、ＭｉｌｉＱ水に溶かし、ＤＮＡを得た。

上で得たＤＮＡ中の、エンドトキシン混入の有無の検査を、リムルスキットを用いて行ない、エンドトキシン混入のないことを確認した。更に、ＤＮＡの純度を、スマートスペック３０００スペクトロホトメーター（SmartSpec 3000 Spectrophotometer；Bio-Rad, Zarareth, Belgium）を用いて検査したところ、Ａ_２６０／Ａ_２８０は１.８であった。このＤＮＡは、−２０℃で保存した。

実施例２
リンパ球の精製および増殖の測定：
本発明者らが以前発表した方法（リンパ球幼若化活性試験：Kitazawaら、1992年）により、ネズミ脾臓からリンパ球を調製した。すなわち、ＭＡＣＳシステム（MACS、Miltenyi Biotec., Germany）を用いて脾細胞懸濁液からＢ細胞を精製した。ビオチン標識抗ＣＤ４５ＲｍＡＢ（Caltag Laboratory, Burlingame, CA, USA）で脾細胞懸濁液を染色し、ストレプトアビジン（streptavidin）ミクロビーズで対比染色を行った。ＣＤ４５Ｒ＋細胞の陽性細胞をカラム（VarioMACS、Miltenyi Biotec., Germany）上で選別した。

フローサイトメトリー（FACSCalibur, Becton-Dickinson, Mountain View, CA, USA）により、Ｂ細胞の純度が９６％を超えることを確認した。この細胞懸濁液をＰＢＳ（ｐＨ７）で３回洗浄した後、細胞（２×１０⁵個／ｍＬ）を９６穴のミクロプレートの各ウェルに入れ、２％ウシ胎児血清（FCS、Sigma）を添加したＲＰＭＩ１６４０完全培地（Sigma）中で、３７℃、４８時間、１００μＬの培養を３回実施した。

種々の濃度のＬＰＳ(E. coli 0111:B4、Sigma由来）、２μｇ／ｍＬのコカナバリン（concanavalin）Ａ（Con A、Sigma）、または種々の濃度のゲノムＤＮＡ、クローンＤＮＡまたはＯＤＮでこの細胞を刺激した。１６時間の最終培養で、９.２５ｋＢｑ／ｗｅｌｌの［メチル−^３Ｈ］チミジン（Amersham Biosciences、UK）によりこの細胞を放射性同位体標識した。細胞を回収し、液体シンチレーションカウンタ（Beckman Instruments, Palo Alto, Ca, USA）により放射能を計測した。下記の式によりリンパ球の増殖インデックスを算出し、結果をＳＩとして表示した。

ＳＩ＝Ａｔ−Ａｂ／Ａｃ−Ａｂ
Ａｔ：１分あたりの処理培養液中放射能
Ａｂ：１分あたりのバックグラウンド中放射能
Ａｃ：１分あたりの対照培養液中放射能

ＬＧＧ細胞からのＤＮＡのＳＩ並びにラクトバチルス・ガッセリＴＭＣ０３５６およびビフィドバクテリウム・ロンガムＴＭＣ３１１７から実施例１に準じた方法で得たＤＮＡのＳＩを比較した結果を図１に示す。図中、塗りつぶした棒グラフは、５０μｇ／ｍｌ、斜線が付された棒グラフは５μｇ／ｍｌでの結果である。

実施例３
マイトジェン活性ＤＮＡクローンのクローニングと単離：
ＬＧＧの染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ（宝酒造、京都）で消化し、２％アガロースゲル電気泳動法により０.５ｋｂ、０.５‐１.０ｋｂおよび１.０ｋｂ以上の３画分に分別した。クアンタム・プレップ・キット（Quantum Prep kit；Bio-Rad、Nazareth、Belgium）を用いてＤＮＡを採取し、０.５ｋｂ未満のＤＮＡをｐＵＣ１１９ベクター（宝酒造、京都）のＢａｍＨＩ部位に結紮した。組換体プラスミドを用いてコンピテント（Competent）Ｅ.コリＤＨ５α細胞を形質転換させた。コロニーの色調およびＰＣＲプライマー、Ｍ１３プライマーＭ４：５'−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３'およびＭ１３プライマーＲＶ：５'−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３'を用いた直接的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づいて、形質転換細胞のスクリーニングを実施した。Ｅ.コリの組換体として６７個の白いコロニーを得た。

プラスミド・ミニプレップ・キット（Plasmid miniprep kit；Bio-Rad, Nazareth, Belgium）を用い、製造業者の使用説明書に従って、形質転換コロニーからプラスミドＤＮＡを分離した。すなわち、ベクターのマルチクローニング部位のＭ１３プライマーＭ４およびＭ１３プライマーＲＶを用いてＰＣＲ法によりＤＮＡテンプレートを増幅した。ＰＣＲ反応の条件は、最初の変性ステップ、９５℃で５分間、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間の３５サイクルとした。増殖したＤＮＡクローンを、ＱＩＡクイック・ＰＣＲ精製キット（QIAquick PCR Purification kit；株式会社キアゲン、東京）によりＰＣＲ混液から精製し、コッテン（Cotten）ら（１９９４年）の方法に従ってＴｒｉｔｏｎＸ１１４で処理し、夾雑するＬＰＳを除いた。

各クローンから精製したＤＮＡについて、最終濃度１０μｇ／ｍｌでのマイトジェン活性を、マウスリンパ球を用いて検査した結果、ＳＩが１.２〜７.０６のものとして３９クローンからのＤＮＡを得た。この結果を図２に示す。

実施例４
クローンの配列決定：
精製した組換体プラスミドから、セクイサーム・エクセルＩＩ・ロング−リード・シークエンシング・キット（SequiTherm EXCEL II Long-Read Sequencing kit；Epicenter Technology, Madison, WI, USA）を用いてマイトジェン性ＤＮＡ挿入断片の配列を決定した。一次配列を、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＳＶ・バージョン６・ソフトウエア・パッケージ（GENETYX-SV Version 6 software package；ソフトウェア・デベロップメント、東京）を用いて解析した。

上記３９クローンについて配列を調べ、このうちから活性クローンにしばしば見いだされる１１個の配列を有するものについて、ホスホジエステルＯＤＮを合成し、その脾臓Ｂ細胞に対するマイトジェン活性を調べた。この結果を図３に示す。この結果、ＯＤＮＩＤ３５、ＯＤＮＩＤ２４２０およびＯＤＮＩＤ２０に活性が見いだされた。なお、ＯＤＮＩＤ３５の活性は、ＯＤＮ１８２６のそれと同程度であった。

実施例５
活性ＯＤＮ配列の確認：
実施例４で活性が認められたＤＮＩＤ３５、ＯＤＮＩＤ２４２０およびＯＤＮＩＤ２０について、配列を３'方向あるいは５'方向へ一部シフトしたＯＤＮを合成し、そのマイトジェン活性を調べた。この結果を図４に示す。この結果から、コア配列が失われることにより、活性も大幅に減少することが明らかになった。

実施例６
フローサイトメトリー：
脾細胞（４×１０^５個／ウェル）をゲノムＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）またはＯＤＮ（１０μＭ）で６時間、１２時間および２４時間にわたり刺激した。刺激後、２％ＦＣＳ＋０．０１％アジ化ナトリウムを含むリン酸塩緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で細胞をよく洗浄し、ＣＤ４５Ｒ、３３Ｄ１、ＣＤ６９およびＣＤ８６（PharMingen, San Diego, Ca, USA）に対する抗体とインキュベートした後、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（streptavidin-phycoerythrin；PharMingen）とともにインキュベートした。続いて細胞を、４℃の１％パラホルムアルデヒド中で２０分間固定し、ＦＡＣＳキャリバーＴＭ（FACSCaliburTM；Becton-Dickinson, Mountain View, CA, USA）を用いて分析した（細胞４００００個／試料）。この結果、ＯＤＮＩＤ３５の活性は、ＯＤＮ１８２６のそれとほぼ同じであった。

実施例７
培養上清中サイトカインの測定および脾細胞における遺伝子発現：
ネズミ脾細胞懸濁液を、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０完全培地（Sigma）中で最終濃度１×１０^７個／ｍＬ（計２００μＬ／ウェル）で３通り培養した。５０μｇ／ｍＬのゲノムＤＮＡあるいは１０μＭのリン酸ジエステルＯＤＮを培養液に添加した。培地のみで培養した細胞を非刺激対照とした。２４時間刺激後に培養上清を採取し、サイトカインの分析まで−８０℃で保存した。ＩＬ−１２ｐ７０およびＩＦＮ−γの濃度（１：２あるいは１：４に希釈）を、ｅバイオサイエンス（eBioscience；San Diego, CA, USA）より購入した試薬を含むサンドウィッチＥＬＩＳＡを用いて、製造業者の使用説明書に従って測定した。この結果を図５に示す。

サイトカインの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）法による分析のため、トライゾール・リージェント（Trizol reagent；Invitrogen, CA, USA）を用いて、６時間刺激後の脾細胞からＲＮＡを分離した。２.５μｇのＲＮＡを用いて、特異的プライマーを有する総量２０μＬの所定の各遺伝子について、別々にＲＴ−ＰＣＲ・キット（RT-PCR kit；Invitrogen, CA, USA）を用いて逆転写反応を実施した。１μｇのｃＤＮＡと５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造、京都）を用いてＰＣＲ反応を実施した。ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ３５、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γのプライマーは株式会社キアゲン（東京）から入手した。アガロースゲル中の製品バンド強度を、ＦＡＳＩＩＩシステム（東洋紡、大阪）を用い、スキオン・イメージ・ソフトウエア（Scion Image Software；Frederick, Maryland, USA）により定量した。

上記方法により、細胞ＤＮＡおよび種々の合成ＤＮＡの、抗炎症ないし免疫調節サイトカインについての作用を試験した結果を図６に示す。

実施例８
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対する作用：
末梢血単核細胞を、フィコール−ハイパック（Ficoll-Hypaque；Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を用いる密度勾配遠心法により分離した。２％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｍＭグルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０（Sigma）中にＰＢＭＣを懸濁した。この細胞を２×１０^５個／ウェルの濃度で、９６穴培養プレート中、４８時間培養した。また、各ＯＤＮの濃度は、１０μとした。ネズミＢ細胞の増殖測定の項に記載した方法により、ＰＢＭＣの培養、刺激および増殖測定を実施した結果を表１に示す。

本発明のＯＤＮは、免疫調節作用を有し、しかも、乳酸菌由来のものであるので、食品、医薬品等として安全に使用しうるものである。従って、医薬や、食品等の成分として使用しうるものである。

ＬＧＧ細胞からのＤＮＡのＳＩ並びにラクトバチルス・ガッセリＴＭＣ０３５６およびビフィドバクテリウム・ロンガムＴＭＣ３１１７からのＤＮＡのＳＩを比較した図である。図中、塗りつぶした棒グラフは、５０μｇ／ｍｌ、斜線が付された棒グラフは５μｇ／ｍｌでの結果である。各クローンから精製したＤＮＡについて、最終濃度１０μｇ／ｍｌでのマイトジェン活性を、マウスリンパ球を用いて検査した結果を示す図である。活性クローンにしばしば見いだされる配列を有するクローンのＯＤＮについて、ホスホジエステルＯＤＮを合成し、脾臓Ｂ細胞に対するマイトジェン活性を調べた結果を示す図である。ＯＤＮＩＤ３５、ＯＤＮＩＤ２４２０およびＯＤＮＩＤ２０について、配列を３'方向あるいは５'方向へ一部シフトするように合成したＯＤＮのマイトジェン活性を調べた結果を示す図である。培養上清中のＩＬ−１２ｐ７０およびＩＦＮ−γの濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である。細胞ＤＮＡおよび種々の合成ＤＮＡの、杭炎症ないし免疫調整サイトカインについて試験した結果を示す図である。

Claims

下式（Ｉ）
５'−ＡＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＣＧＴＣＡＡ−３' （Ｉ）
で示される塩基配列を含むオリゴデオキシヌクレオチド。
下式（Ｉ）
５'−ＡＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＣＧＴＣＡＡ−３' （Ｉ）
で示されるオリゴデオキシヌクレオチドを有効成分とする免疫修飾剤。
ラクトバチルスラムノーサスに属する微生物のゲノムＤＮＡから、マウスおよびヒト由来Ｂリンパ球に対するマイトジェン活性を有するＤＮＡ断片を選択することを特徴とする下式（Ｉ）
５'−ＡＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＣＧＴＣＡＡ−３' （Ｉ）
で示される塩基配列を含むオリゴデオキシヌクレオチドの製造方法。