KR20040087356A - 생쥐 뇌에 있는 새로운 수모-프로테아제와 그 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유비퀴틴-유사 단백질의 하나인 SUMO의 C-말단을 특이적으로 절단하는 단백질 분해효소인 SUMO-프로테아제, mUlpB와 그 유전자에 관한 것이다. 즉, 쥐의 뇌 조직 mRNA에서 SUMO-특이 단백질 분해효소를 찾아내는 5'-RACE 방법과 이 방법으로 찾은 SUMO-프로테아제의 유전자, mUlpB 단백질 그리고 이 단백질을 발현하는 벡터에 관한 것이다.

Description

생쥐 뇌에 있는 새로운 수모-프로테아제와 그 유전자 {A new SUMO-specific protease, mUlpB from mouse brain}

본 발명은 유비퀴틴-유사 단백질 중 마우스의 새로운 SUMO-특이 단백질 분해효소인 SUMO-프로테아제 (SUMO-specific protease), mUlpB와 그의 유전자에 관한 것이다.

본 발명은 4주령 마우스의 뇌 조직의 mRNA에서 얻은 새로운 SUMO-특이 단백질 분해효소 (mUlpB)의 유전자와 분자량 약 55 킬로달톤의 단백질 및 상기 유전자를 포함하는 발현 플라스미드에 관한 것으로서, 표적 단백질에 결합되어 있는 SUMO의 카르복시 말단에 작용하여 이소펩티드 결합만을 선택적으로 절단하는 효소 기능을 포함한다.

유비퀴틴(ubiquitin, 이하 Ub)은 76개의 아미노산으로 구성된 작은 단백질로서 세포 내 다양한 단백질들에 결합되는데 일단 결합된 유비퀴틴 분자에는 또 다른 유비퀴틴 분자가 이소펩티드 결합으로 연결되어 유비퀴틴-중합체를 형성한다. 유비퀴틴과 다른 단백질과의 결합 즉, 유비퀴틴화 (ubiquitination)에 의해 유비퀴틴-중합체로 표지 된 단백질 분자는 세포 내에서 프로테오좀이라는 ATP-의존성 단백질 분해효소 복합체에 의해 분해되며, 세포주기 조절이나 단백질 분해 등의 중요한 세포 내 조절 과정에 관여하고 있다 (Hershko & Ciechanover (1998) Annu. Rev. Biochem. 67, 425, Review).

최근에는 유비퀴틴의 아미노산 서열과 약 30% 내외의 유사성을 가진 Nedd8, SUMO, ISG15 등의 유비퀴틴-유사 단백질 (Ub-like proteins, 이하 Ubl)들이 밝혀지고 있다 (Kawakami et al., (2001) EMBO J. 20, 4003; Saitoh & Hinchey, (2000) J. Biol. Chem. 275, 6252; Potter et al., (1999) J. Biol. Chem. 274, 25061). 이러한 유비퀴틴-유사 단백질들도 유비퀴틴과 아주 유사한 방식을 통해서 PML (promyelocytic leukemia protein), RanGAP1 (Ran-GTPase activating protein), p53 (tumor suppressor), 그리고 IkappaBalpha (inhibitor of NF-kappaB) 등의 다양한 단백질들과 결합하게 된다 (Tanaka et al., (1998) Mol. Cell 8, 503; Hochstrasser, (2000) Nat. Cell Biol. 2, E153-E157; Melchior F. (2000) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 16, 591; Yeh et al., (2000) Gene 248, 1; Mueller et al., (2001) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 202). 그러나 유비퀴틴-유사 단백질과 표적 단백질의 결합은 유비퀴틴-중합체의 결합처럼 단백질의 분해를 유발하는 것은 아니다.

유비퀴틴-유사 단백질들 중에서 SUMO (small ubiquitin like modifier)는 유비퀴틴과 유사하게 성숙된 형태로 생성되지 않고, 4개의 아미노산이 SUMO의 카르복시 말단에 펩티드 결합으로 연결된 전구체의 형태로 만들어진다. 전구체 형태의 SUMO 단백질은 연결부위의 α-펩티드 결합이 절단되면서 다른 단백질과의 결합에 필요한 카르복시 말단의 글라이신-글라이신 (G-G) 잔기가 드러난 성숙한 형태로 되며, 이 때 SUMO의 전구체로부터 연결부위 (G-G)의 펩티드 결합만을 정확하게 절단하는 단백질 분해 효소가 SUMO-프로테아제이다.

또한, SUMO는 유비퀴틴과 유사하게 E1, E2 및 E3 효소들에 의해 카르복시 말단의 글라이신과 표적 단백질 내의 라이신 (Lys)사이에 펩티드 결합을 형성함으로써 여러 단백질과 결합되는데 이를 SUMO화 (sumoylation)라고 한다. SUMO화된 단백질에서 SUMO의 G-G 잔기 뒤의 펩티드 결합은 SUMO-특이 단백질 분해효소에 의해 절단되며, 표적 단백질에 결합되어 있는 SUMO가 제거되는 것을 탈-SUMO화 (desumoylation)라 한다. 이와 같은 SUMO의 결합 또는 분리는 표적 단백질의 핵으로의 이동, 핵 내 구조물의 형성, 전사활성의 조절 혹은 전사인자의 DNA 결합능, 그리고 단백질의 안정성 조절 등과 관련되어 세포분화, 세포주기, 배 발생, 종양발생에 직접적인 연관성이 있는 것으로 보고되고 있다.

현재까지 알려져 있는 SUMO-프로테아제를 살펴보면, 효모에서는 Ulp1과 Ulp2가 밝혀졌다. Ulp1은 SUMO-1 전구물질에서부터 성숙한 형태의 SUMO-1을 만들어 낼 수 있으며, 표적 단백질에서 SUMO-1을 제거할 수도 있다 (Li & Hochstrasser, (1999) Nature 398, 246). Ulp2는 소위 Smt4라고 불리던 단백질로 중심립 결합단백질을 조절하는 것으로 보고되었다 (Li & Hochstrasser, (2000) Mol. Cell Biol. 20, 2367).

최근에 사람과 마우스에서 몇 개의 SUMO-프로테아제들이 발견되었는데 이 효소들은 효소활성과 관련하여 카르복시 말단에 아주 잘 보존된 히스티딘/아스파르트산/시스테인 부위를 가지고 있는 반면 (도 1 참조), 아미노 말단은 거의 유사성이 없다. 이들 SUMO-프로테아제들 중에서, SUSP1은 SUMO-1이 결합된 베타 갈락토시데이즈로부터 SUMO-1을 효과적으로 제거하며, SUMO-1 전구물질에서 성숙한 형태의 SUMO-1을 만들어 낼 수 있는 효소이다 (Kim et al., (2000) J. Biol. Chem. 275, 14102). 한편 SENP1, SMT3IP1, 그리고 SMT3IP2/Axam 등의 SUMP-프로테아제들도 SUMO-1과 결합단백질 사이의 이소펩티드 결합을 절단함으로 SUMO-1을 제거하는 것으로 보고되었다 (Gong et al., (2000) J. Biol. Chem. 275, 3355; Nishida et al., (2000) Eur. J. Biochem. 267, 6423; Kadoya et al., (2002) Mol. Cell Biol. 22, 3803).

이상과 같은 SUMO-프로테아제 단백질들은 세포 내에서의 위치나 조직들간의 발현정도가 다른 것으로 보아, 각기 다른 표적 단백질로부터 SUMO를 절단하는 활성을 가지며, 따라서 그 조절 기능도 다양할 것으로 시사된다.

본 발명에서는 SUMO-프로테아제들 간에 카르복시 말단부위의 잘 보존되어 있는 염기서열의 유사성을 이용하여 마우스의 유전자 database로부터 5'-RACE 방법으로 새로운 SUMO-프로테아제인 UlpB를 찾았다. 이 유전자의 단백질을 발현하는 플라스미드를 제조하였으며, 이 단백질 효소의 활성을 측정한 결과 그 표적 단백질에서 SUMO-1을 제거할 수 있었다.

본 발명은 마우스 뇌 조직 mRNA로부터 5'-RACE 방법으로 찾은 SUMO의 C-말단을 자르는 새로운 단백질 분해효소의 유전자와 단백질의 제조 및 SUMO-프로테아제의 분해효소 활성 측정 방법을 제공하는 것이 목적이다.

제 1도. 새로운 유전자를 클로닝하기 위한 시스템 구축과 primer 합성

제 2도. mUlpB 및 다른 SUMO-프로테아제 단백질 간의 아미노산 서열 비교-SENP1, Ulp1, SUSP1/2 의 잘 보존되어 있는 히스티딘, 아스파르트산, 그리고 시스테인의 서열을 비교

제 3도. mUlpB 단백질을 정제하여 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 확인한 사진

제 4도. mUlpB의 SUMO-프로테아제로서의 세포 내 효소활성을 SUMO에 대한 항체를 사용하여 확인한 사진.

본 발명은 마우스의 SUMO-1의 C-말단을 자르는 단백질 분해 효소인 새로운 SUMO-프로테아제, mUlpB를 제공한다.

본 발명의 mUlpB 효소는 SUMO에 결합된 단백질을 절단할 수 있다. 서열 1의 아미노산 서열 전부를 포함하며 분자량은 약 55 킬로달톤이다.

본 발명은 마우스의 뇌에서 분리한 mUlpB의 유전자를 제공한다.

또한 본 발명은 mUlpB 효소를 생성할 수 있는 발현 플라스미드 및 이를 숙주세포에 전환시킨 형질전환체를 제공한다.

상기의 숙주세포로는 박테리아, 효모 및 진핵세포 등을 포함한다.

구체적으로, 본 발명은 서열 1의 전부 또는 일부 유전자를 포함하는 발현 플라스미드 pET32a-mUlpB 그리고 그들의 돌연변이형 플라스미드 및 상기 발현 플라스미드로 박테리아 BL 21 균주를 형질전환시킨 형질전환체를 제공한다.

본 발명은 상기의 과정으로 얻은 새로운 SUMO-프로테아제인 mUlpB 효소 단백질 및 그들의 돌연변이체 단백질을 제공한다.

본 발명에서는 다음과 같은 구성으로 UlpB 유전자 분리 및 효소의 활성 측정을 수행하였다.

1. 5'RACE 방법에 의한 유전자의 클로닝

2. 유전자의 염기서열과 아미노산 서열 확인

3. 단백질 발현 플라스미드 제조 및 단백질 발현

4. 효소 활성 측정

본 발명을 이하 실시예를 통하여 상세히 설명한다.

이들 실시예는 오로지 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

<실시예1> 5'RACE 방법에 의한 UlpB의 클로닝

SUMO-프로테아제들의 카르복시 말단부위에 잘 보존되어 있는 활성부위 유전자 서열을 이용하여 마우스의 유전자 database (Genbank AI019650)로부터 새로운 SUMO-프로테아제의 하나로 추정되는 유전자 단편을 찾아낸 다음, 이 유전자 단편을 바탕으로 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 방법으로 전체 유전자를 클로닝하였다. 즉, 4 주령의 마우스 뇌조직을 분리한 후 트리졸 (Trisol, Gibco BRL)을 넣고 분쇄기로 갈아서 전체 RNA를 분리하였고 이를 다시 폴리 아데노신 말단 (poly A tail)이 부착하는 column을 사용하여 mRNA를 분리하였다 (Qiagen, 미국). 그리고 이 mRNA를 주형으로 역전사 연쇄중합반응에 의해 cDNA들을 복제한 후, 이들 cDNA를 주형으로 하고, 유전자 database에서 얻은 유전자 단편의 서열에 따라 아래와 같이 프라이머를 제한 다음, 3회의 연쇄중합반응을 통해 1.8kb에 달하는 새로운 SUMO-프로테아제 유전자를 획득하였다.

RACE 에 사용한 역전사 효소는 Superscript II (Gibco BRL)이다.

RACE 에 사용한 중합효소는 Tag polymerase (Takara)이다.

RACE 에 사용한 프라이머는 하나의 정방향 상용 프라이머 (Gibco BRL)와 3개의 유전자 특이 역방향 프라이머이다.

정방향 프라이머

5'- CUG CUG CUG CUG GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC -3'

역방향 프라이머

5'- CAT CAT TGA GCC ACT GAC CGT -3'

5'- TGA CCG TTC TCC AGG GGT CT -3'

5'- GGT CTG GAT ATC TCC TCT GC -3'

이상과 같이 5'RACE의 방법으로 얻은 UlpB 유전자는 pGEM-T easy 벡터(promega)에 클로닝하였다 (도 1).

<실시예 2> mUlpB 유전자의 염기서열과 아미노산 서열

상기 실시예1에서 찾아낸 유전자의 염기서열은 자동 DNA서열 분석기 (Applied Biosystem 373A)를 사용하여 디데옥시 방법으로 DNA 염기 서열을 결정하였다 (서열 1). 이 때 모든 서열은 유전자의 양쪽 방향으로 분석되었으며, 모든 제한효소의 위치도 확인되었다.

이 유전자 서열을 마우스의 유전자 database에서 blast search하여 비교하였을 때 본 발명에서 찾아낸 mUlpB가 기존에 알려져 있지 않은 새로운 유전자임을 확인할 수 있었으며, 시작 코돈 (ATG)으로부터 종료 코돈 (TAA)까지 1500개의 염기 쌍으로 이루어져 있었다 (서열 2).

상기 유전자에 의해 발현되는 효소 단백질은 499개의 아미노산으로 구성되고, 단백질의 분자량은 약 55킬로달톤이었으며, 이 단백질을 mUlpB로 명명하였다. 이 효소 단백질과 다른 SUMO-프로테아제들의 아미노산 서열을 비교 분석해 보면, 효소 단백질인 SENP1, Ulp1, 그리고 SUSP1 등과 카르복시 말단의 효소 활성 부위가 매우 유사한 것으로 나타났다 (Gong et al., (2000) J. Biol. Chem. 275, 3355); Li & Hochstrasser, (1999) Nature 398, 246-251; Kim et al., (2000) J. Biol. Chem. 275, 14102). 즉, 히스티딘, 아스파르트산, 그리고 시스테인으로 구성된 효소의 활성에 중요부위를 공통적으로 가진 구조를 나타내었다 (도 2).

<실시예 3> mUlpB의 발현 및 정제

mUlpB 유전자로부터 효소 단백질을 발현시키기 위해서 상기 유전자를 박테리아 발현벡터인 pET-32a (Novagen)과 포유류의 발현벡터인 pCMV-Tag3A (Stratagene)에 클로닝하였다. 먼저 5' 말단에 제한효소 BamHI의 절단 부위 서열을 만드는 프라이머를 합성하여 중합효소연쇄반응으로 제한효소 절단부위를 만들었다. 3'말단은 pGEM-T easy 벡터의 SalI 절단부위를 이용하여 박테리아 발현벡터인 pET-32a과 포유류 발현 벡터인 pCMV-Tag3A에 제한효소 BamHI과 SalI을 각각 사용하여 단백질 발현벡터를 구축하였다. 그리고 각각 대장균주인 BL21과 마우스 세포인 NIH3T3을 사용하여 형질전환 시켰다.

His-mUlpB 단백질을 발현하도록 형질전환된 대장균주 BL21은 엠피실린이 100 ㎍/㎖이 들어간 루리아-베르타니 배지에 배양하였다. 기하 급수적으로 성장하는 단계 (OD600 = 0.6)에서 이소프로필-시오-베타-D-갈락토피라노시드 (isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG)를 최종농도 1 mM이 되게 가하여 단백질 발현을 유도한 후 3시간 더 배양하였다. 단백질을 발현하는 세포를 원심분리를 이용하여 침전시켜 수거한 다음, 5 mM β-머캅토에탄올, 1 mM 에틸렌디아미노테트라아세테이트 (EDTA), 10% 글리세롤을 함유한 25 mM 트리스 완충액 (이하 '완충액 A' 라고 약칭함)에 현탁하였다. 세포 현탁액을 초음파 분쇄기로 분쇄한 후 15,000 ×g에서 1시간 원심분리하여 얻은 상층액을 세포추출물로 사용하였다 (도 3, 레인 a). 이 세포추출물로부터 mUlpB를 정제하기 위하여 엔티에이-아가로스 (NTA-agarose, Pharmacia) 컬럼에 통과시킨 후 (도 3, 레인 b), 흡착되는 단백질들을 이미다졸을 이용하여 용출시켜 모았다. 용출된 시료로 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 실시한 다음 쿠마지블루 염색을 하여 발현된 mUlpB를 확인하였다 (도 3). 확인된 단백질들을 완충액 A에 투석하여 평형에 이르게 한 후 -70℃에 보관하였다가 효소 활성 분석에 사용하였다.

NIH3T3 세포를 12-well 조직 배양 플레이트에 well 당 8×10⁴세포가 되도록 접종하고 10% 송아지 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포가 well 표면의 70-80% 정도를 덮을 정도로 자라면, 무혈청 배지에서 1-2 ㎍의 pCMV-Myc-mUlpB 또는 활성부위 돌연변이체인 pCMV-Myc-mUlpB/C460S 발현 벡터 DNA를 4-6 ㎕의 LIPOFECTAMINE PLUS (GibcoBRL)를 사용하여 감염시켰다. 감염세포를 3시간 배양 후 혈청이 10% 함유된 배지로 바꿔서 24-48시간 더 배양하였다. 형질전환 된 세포들은 SDS-세포추출용액으로 단백질을 추출하여 전기영동 후 Myc에 대한 항체를 사용하여 Western blotting을 실시하였다. 10% SDS-아크릴아마이드 겔에 전기영동하여 단백질을 전개하였다. 분리된 단백질 밴드들을 PVDF 막 (Millipore)에 옮긴 다음, Myc에 대한 항체로 반응시킨 후 ECL 용액으로 발현정도를 확인 할 수 있었다 (도 3B).

이상과 같은 방법으로 His-mUlpB와 Myc-mUlpB가 각각 박테리아와 포유류 세포에서 과발현된다는 것을 확인한 다음 효소 활성 측정에 사용하였다.

<실시예 4> mUlpB의 효소 활성 측정

포유류 세포 내에는 많은 단백질들이 SUMO에 결합되는 것으로 알려져 있으므로 이러한 SUMO 결합 단백질들의 SUMO-결합 양상의 변화를 통하여 세포 내 mUlpB의 SUMO 분해 효소활성을 측정하였다. SUMO를 배양 세포에 감염시켜 단백질을 과발현시킨 다음, SUMO에 대한 항체를 사용하여 Western blotting을 실시하면 SUMO에 결합된 단백질 밴드들이 증가하는 양상을 볼 수 있다. 이때 SUMO-특이 분해효소를 함께 과발현시키면 SUMO가 결합된 단백질들이 감소되는 현상을 관찰할 수 있었다. 즉, mUlpB의 SUMO-특이 단백질 분해효소로서의 기능을 확인하기 위하여, NIH3T3 세포에 Flag-SUMO 또는 Flag-SUMO와 Myc-mUlpB, Flag-SUMO와 Myc-mUlpB/C460S를 함께 감염시켜 단백질을 과발현시킨 다음 그 세포들의 세포추출액을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 실시하고 PVDF (Milipore)에 옮긴 후 FLAG 항체를 이용하여 SUMO가 결합된 단백질 밴드의 양상을 확인하였다. 그 결과 SUMO-1만을 과발현하는 세포들에서는 SUMO-1과 결합된 단백질 밴드들이 많은데 반해 (도 4, 레인 2 & 3) SUMO와 mUlpB가 함께 과발현된 세포에서는 SUMO 결합 단백질 밴드들이 현저히 줄어들었다 (도 4, 레인 4). 한편, 효소활성 부위를 돌연변이 시킨 mUlpB/C460S를 SUMO와 함께 과발현 시킨 경우는 SUMP 결합단백질 밴드의 감소 현상이 나타나지 않았다 (도 4, 레인 5). 따라서, mUlpB의 과발현에 의한 SUMO-결합 단백질 감소는 mUlpB의 SUMO-프로테아제로서의 활성에 의한 것임을 확인할 수 있었다.

SUMO는 유비퀴틴과 달리 기질 단백질에 결합하면 기질 단백질의 세포 내 혹은 핵 내 이동, 전사활성 조절 등과 연관되어 세포분화, 세포주기, 배 발생, 종양발생 등에 직접적인 연관성이 있다는 보고들에 의해 많은 관심이 주목되고 있다. 그 예로 유전병의 하나인 급성 백혈병의 치료제로 사용되는 retinoic acid (RA)의 경우 SUMO와 결합된 PML분자의 양을 증가시키는 것으로 밝혀졌고, 이러한 PML의 SUMO화는 정상적 세포분화를 위해서도 필수적이라는 사실이 밝혀졌다. 뿐만 아니라, SUMO가 결합된 단백질로부터 SUMO를 제거하는 SUMO-프로테아제는 각 결합단백질에 대해 특이적으로 작용함이 밝혀졌고, SUMO-프로테아제의 종류 또한 세포의 형태나 세포 내 위치에 따라 다양하게 나타난다. 따라서, 이러한 단백질기질에 특이적인 SUMO-프로테아제를 발굴하고 이들의 발현 조절에 대한 연구 및 이 효소들에 대한 저해제 개발은 급성 백혈병을 포함한 여러 가지 암에 대한 치료제 개발의 관건이 될 수 있을 것이다.

<110> CHUNG, chinha <120> SUMO-protease, mUlpB <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2059 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 ggcagagggg cagagagaag tgggcagggc agagcgtgtg attccagacc ccttggagaa 60 cggtcaatct ctgactattc accaataggt ctctgatatt gacagcttaa ttatctccat 120 cctttgactg accctgacct gcaaagtcaa ctgtttataa aggagcctca taggtttgcg 180 accttggacc aaccatctac tggaagaagt aattcttcgg acatcagggt gaacaacccc 240 gagagtttcc acccagagcc aggtataagg ttgctttcac ttggaaattt gaaaggcagt 300 actatactgg agtaaacacc ctctaaaaag cagtccaagc cgttgtccat gtggcaacct 360 aaactgcctg ggttggagat gaagcccgaa gcttcagcaa tagggcaaac ccgaaaatac 420 cacgatgaaa gtgggacaga gatagagtct gaagctttgg gacaagagcc aaaaaggaaa 480 tgccaggatg gatcagggat ggtatttaaa gagcccggca aggcccagaa gaagacttct 540 caggagcctc aagacctaga gctcccgaga gaacagccta gcaagggtca ggtacggaaa 600 ccccagggaa agactccaaa acaactaaaa cccctagagt tgaccgaagg acctccagag 660 caggctgtga ctgggaggaa gcctgctgat ggtggcaagg gtcacaagcg gccctattcc 720 gtcatggaag aagacgaaca aagcccccaa aaggaaaagt acggaaggtt gcttcaacac 780 cttcagtgcg accaagatgt gaggtcagac caacacaggc ctcacccaat ccttacaaac 840 acctggaaga tcaaaggggg cgagtcagga gacagtcatg gatcagaaac aactcagaga 900 gatcgagaac aatctactgt tgtggctcta aaagaatgtc tttcaccaga ggagagagag 960 aagtggtgtt ctgaggagaa atgtgttaca gagaagaaag gttgtgtaaa gggtgaagga 1020 agaaggggga acagcttgga gccgggaaca cgggctcaga tcatcctgga tagaggcaga 1080 ggcaatagct tactccccaa caagatggca gtacttgcag cagagaaaaa gcctctcaca 1140 gaccaagaaa agggcagaga aatgtatcaa atccttgtta ttacagagga catagagaag 1200 gaaattgaga atgcgctggg tccaggaccc caagaggaaa tcctaagttc cagattcaag 1260 ttgcaaatca gcagaggaga tatccagacc ctggagaacg gtcagtggct caatgatgag 1320 gtcatcaatt tctacatgaa ccttctggtt gagagaaatg aaaaccaagg ctacccagct 1380 ctgcatgtct ttagcacttt cttttacccc atgctaaagc atagcggtta cagttccgtg 1440 aaaagatgga ctcgaggcat caatctcttt gaaaaagaac tcatcttggt gcctattcac 1500 cagaatgtac actggagcct ggtggtaatt gatttaagaa aaagaagtat tgtatacctc 1560 gattccgtgg gagagacagg gaagtctatc tgtgagacca tcttccaata tttacaaaac 1620 gagagcaaga cacgcaggaa cattgagctg gaccctttgg agtggaagca gtacagtgtg 1680 acatcagagg agattcctct gcaacagaat gggagtgact gtggaatgtt tacctgtaaa 1740 tatgcagatt acattgctag ggaccagcct gtgacctttt ctcagcaacg catgcccacc 1800 ttcaggaaga ggatggtatg ggcaatccta catagtcact tactgtaaca acacccacct 1860 ggttgctatg gtcccctatc cctgttcttt tccgtctttg tttctaatat acctcaggta 1920 ggatgagttg aagagatata aaacaggtac tgagctgtct cactagagga agcccactct 1980 cttcaatata gtcctaacgt gggatttcgg actgatgcac taatgccatc tctaggatgc 2040 atgcaactat tgcaagctt 2059 <210> 2 <211> 499 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Trp Gln Pro Lys Leu Pro Gly Leu Glu Met Lys Pro Glu Ala Ser 1 5 10 15 Ala Ile Gly Gln Thr Arg Lys Tyr His Asp Glu Ser Gly Thr Glu Ile 20 25 30 Glu Ser Glu Ala Leu Gly Gln Glu Pro Lys Arg Lys Cys Gln Asp Gly 35 40 45 Ser Gly Met Val Phe Lys Glu Pro Gly Lys Ala Gln Lys Lys Thr Ser 50 55 60 Gln Glu Pro Gln Asp Leu Glu Leu Pro Arg Glu Gln Pro Ser Lys Gly 65 70 75 80 Gln Val Arg Lys Pro Gln Gly Lys Thr Pro Lys Gln Leu Lys Pro Leu 85 90 95 Glu Leu Thr Glu Gly Pro Pro Glu Gln Ala Val Thr Gly Arg Lys Pro 100 105 110 Ala Asp Gly Gly Lys Gly His Lys Arg Pro Tyr Ser Val Met Glu Glu 115 120 125 Asp Glu Gln Ser Pro Gln Lys Glu Lys Tyr Gly Arg Leu Leu Gln His 130 135 140 Leu Gln Cys Asp Gln Asp Val Arg Ser Asp Gln His Arg Pro His Pro 145 150 155 160 Ile Leu Thr Asn Thr Trp Lys Ile Lys Gly Gly Glu Ser Gly Asp Ser 165 170 175 His Gly Ser Glu Thr Thr Gln Arg Asp Arg Glu Gln Ser Thr Val Val 180 185 190 Ala Leu Lys Glu Cys Leu Ser Pro Glu Glu Arg Glu Lys Trp Cys Ser 195 200 205 Glu Glu Lys Cys Val Thr Glu Lys Lys Gly Cys Val Lys Gly Glu Gly 210 215 220 Arg Arg Gly Asn Ser Leu Glu Pro Gly Thr Arg Ala Gln Ile Ile Leu 225 230 235 240 Asp Arg Gly Arg Gly Asn Ser Leu Leu Pro Asn Lys Met Ala Val Leu 245 250 255 Ala Ala Glu Lys Lys Pro Leu Thr Asp Gln Glu Lys Gly Arg Glu Met 260 265 270 Tyr Gln Ile Leu Val Ile Thr Glu Asp Ile Glu Lys Glu Ile Glu Asn 275 280 285 Ala Leu Gly Pro Gly Pro Gln Glu Glu Ile Leu Ser Ser Arg Phe Lys 290 295 300 Leu Gln Ile Ser Arg Gly Asp Ile Gln Thr Leu Glu Asn Gly Gln Trp 305 310 315 320 Leu Asn Asp Glu Val Ile Asn Phe Tyr Met Asn Leu Leu Val Glu Arg 325 330 335 Asn Glu Asn Gln Gly Tyr Pro Ala Leu His Val Phe Ser Thr Phe Phe 340 345 350 Tyr Pro Met Leu Lys His Ser Gly Tyr Ser Ser Val Lys Arg Trp Thr 355 360 365 Arg Gly Ile Asn Leu Phe Glu Lys Glu Leu Ile Leu Val Pro Ile His 370 375 380 Gln Asn Val His Trp Ser Leu Val Val Ile Asp Leu Arg Lys Arg Ser 385 390 395 400 Ile Val Tyr Leu Asp Ser Val Gly Glu Thr Gly Lys Ser Ile Cys Glu 405 410 415 Thr Ile Phe Gln Tyr Leu Gln Asn Glu Ser Lys Thr Arg Arg Asn Ile 420 425 430 Glu Leu Asp Pro Leu Glu Trp Lys Gln Tyr Ser Val Thr Ser Glu Glu 435 440 445 Ile Pro Leu Gln Gln Asn Gly Ser Asp Cys Gly Met Phe Thr Cys Lys 450 455 460 Tyr Ala Asp Tyr Ile Ala Arg Asp Gln Pro Val Thr Phe Ser Gln Gln 465 470 475 480 Arg Met Pro Thr Phe Arg Lys Arg Met Val Trp Ala Ile Leu His Ser 485 490 495 His Leu Leu

Claims (12)

1. 마우스의 뇌 조직에 존재하는 SUMO-프로테아제 (SUMO-specific protease).
2. 제 1항에 있어서, SUMO에 결합된 단백질 또는 펩티드를 절단하는 SUMO-프로테아제.
3. 제 1항에 있어서, 서열 2의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 SUMO-프로테아제.
4. 제 1항에 있어서, 분자량이 55 킬로달톤인 SUMO-프로테아제.
5. 마우스의 뇌 조직에서 분리한 SUMO-프로테아제 유전자.
6. 제 5항에 있어서, 유전자는 마우스의 SUMO-프로테아제를 선별하는 5'-RACE 방법과 이 방법에 사용한 프라이머
7. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 서열 1의 염기 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 SUMO-프로테아제 유전자.
8. 서열 1의 유전자 염기 서열의 전부 또는 일부를 포함하여 유전자로부터 SUMO-프로테아제를 생산할 수 있는 발현 플라스미드.
9. 제 8항에 있어서, 발현 플라스미드 pET32a-mUlpB.
10. 제 8항에 있어서, 발현 플라스미드 pCMV-Tag3-mUlpB.
11. SUMO-프로테아제 유전자를 포함하는 발현 플라스미드로 숙주세포를 형질전환시킨 형질전환체.
12. 제 10항에 있어서 발현 플라스미드 pET32a-mUlpB로 박테리아 균주 BL21을 형질전환시킨 형질전환체