CN116265488A - 一种高载量且高活性的固定化Fc受体蛋白磁珠的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种将Fc受体蛋白高载量且高活性地固定于磁珠表面的方法，即将聚酰胺‑胺型树枝状高分子(PAMAM dendrimer)固定于聚多巴胺包覆的磁性微球表面，利用其树枝结构为材料提供较大的比表面积和较多的蛋白结合位点，通过化学键合的方式将链霉亲和素大量固定于PAMAM包覆的材料表面，再利用链霉亲和素与生物素之间的高特异性亲和力，将生物素标记的Fc受体蛋白固定于整个磁珠的外表面。本方法通过使用亲和固定方式、添加表面活性剂稳定受体蛋白结构等，克服了传统路线中易发生Fc受体蛋白失活的问题，制得的固定化Fc受体蛋白磁珠具有更优异的选择性和结合活性。
Description
技术领域
本发明属于功能化纳米材料领域，具体涉及一种高载量且高活性的固定化Fc受体蛋白的磁珠的合成方法。
背景技术
生物技术药物是21世纪医药工业发展的中坚力量，其中抗体药物是生物技术药物的典型代表。在针对恶性肿瘤、自身免疫疾病等领域，抗体药物已经逐渐成为首选用药。IgG型抗体是现今全球抗体药物中应用最多的抗体亚型，其结构中的恒定区(Fc结构域)可稳定与多种Fc受体蛋白相结合，介导抗体的效应子功能和抗体体内循环转运等功能。Fc受体是表达于特定细胞表面的一类受体家族，包括FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcRn等等。在抗体-Fc受体亲和力分析、复杂基质(如工程细胞发酵液)中抗体的选择性提取富集等实验中，通常需要使用到固定有Fc受体蛋白的磁珠。然而，由于Fc受体蛋白家族是一种哺乳动物细胞膜蛋白，其稳定性弱于酶、免疫球蛋白等常规用于磁珠表面修饰的分泌蛋白，极易在固定化的过程中失活，因此迄今为止尚未有商品化的固定Fc受体蛋白的磁珠。科研人员必须购买通用的蛋白化学偶联磁珠或者固定有链霉亲和素的蛋白亲和偶联磁珠，在使用前自行偶联Fc受体蛋白，但无论化学偶联还是对Fc受体蛋白进行生物素标记后偶联，都需要将Fc受体蛋白序列中的碱性氨基酸残基(如赖氨酸、精氨酸等)引入偶联反应中，一定程度上改变了Fc受体蛋白的天然构象，进而导致偶联后磁珠表面的Fc受体蛋白载量低且活性显著降低。此外，上述通用的蛋白偶联磁珠往往以聚乙烯等聚合物作为四氧化三铁微球表面包覆材料，这又导致了磁珠在使用过程中极易与基质中无关蛋白发生非特异性吸附，使磁珠提取IgG抗体分子的选择性下降。
发明内容
本发明提出的一种高载量且高活性的固定化Fc受体蛋白磁珠的合成方法，包括以下步骤：
(1)合成聚多巴胺包覆的磁性四氧化三铁微球：将四氧化三铁磁性微球分散于碱性条件的溶液中，使盐酸多巴胺单体在其表面聚合，形成聚多巴胺包覆的磁性微球，在磁场作用下，收集反应产物，并将所得产物反复洗涤，以除去杂质；
(2)合成聚酰胺-胺型树枝状高分子修饰的聚多巴胺包覆的磁性微球：取步骤(1)合成的产物10-1000mg均匀分散于碱性溶液中，加入PAMAM树枝状大分子溶液100-1000μL，在20-40℃振摇的同时孵育2-6小时，随后再次加入PAMAM树枝状大分子溶液100-1000μL，在20-40℃振摇的同时继续孵育6-20小时，收集产物，并以去离子水和无水乙醇反复洗涤，烘干备用；
(3)合成固定化Fc受体蛋白的磁珠：取步骤(2)合成的产物10-1000mg均匀分散于pH呈中性的缓冲液中，加入0.1-10mL戊二醛水溶液，在20-40℃振摇反应1-24小时，反应完成后以中性缓冲液反复洗涤材料，将洗涤过的材料重新分散于0.1-10mL链霉亲和素的溶液中，加入0.01-1mL硼氢化钠水溶液，将反应体系置于4-37℃环境中，缓慢振摇反应1-24小时，以获得连接有链霉亲和素的磁珠；以中性缓冲液反复洗涤除去杂质；随后将所得材料分散于0.1-10mL经生物素标记的Fc受体蛋白的水溶液中，将反应体系置于于4-37℃缓慢振摇孵育2-48小时，向体系中加入牛血清白蛋白溶液以封闭潜在的蛋白结合位点，在4-37℃环境中，缓慢振摇孵育0.5-10小时完成封闭；随后将所得到的固定化Fc受体蛋白磁珠以中性缓冲液反复冲洗，低温条件下储存，即得高载量且高活性的固定化Fc受体蛋白磁珠。
本发明中，步骤(1)中所述碱性条件的溶液，控制其pH值为7.5～9.5，使盐酸多巴胺单体在四氧化三铁微球表面聚合形成聚多巴胺包覆的磁性微球。
本发明中，步骤(2)中所述碱性溶液，其pH值为7.5～9.5，使树枝状大分子PAMAM修饰于聚多巴胺包覆的磁性微球表面。
本发明中，步骤(3)中所使用的Fc受体蛋白的水溶液为含有缓冲盐5-100mM、经生物素标记过的Fc受体蛋白0.05-2mg/mL以及非离子型表面活性剂0.001-0.5％。
本发明中，步骤(3)中所使用的Fc受体蛋白应在其C-末端携带生物素标记，并且其他氨基酸残基上无生物素标记。
本发明中，步骤(3)中所述的Fc受体蛋白经由生物素与链霉亲和素之间的亲和作用被固定于磁珠表面。
本发明中，步骤(3)中固定Fc受体蛋白磁珠是在磁珠表面固定Fc受体蛋白之后，使用0.1-5％的蛋白溶液(非抗体溶液)对材料中潜在的蛋白结合位点进行封闭，以避免材料在后续使用过程中发生对蛋白的非特异性吸附。
本发明中创造性地设计了一种可使Fc受体保持高活性且高载量地固定于磁珠表面的材料合成路线，即：首先将聚多巴胺包覆在磁性微球表面以增加纳米材料的表面亲水性，避免磁珠在使用过程中基质干扰物质在磁珠表面发生非特异的疏水性吸附，同时将反应活性较高的四氧化三铁内核完全包裹，增加磁珠整体对酸碱环境的耐受性，进而增加磁珠材料的化学稳定性。其次，将树枝状大分子PAMAM共价连接于聚多巴胺表面，该大分子具有较多的亲水性支链与末端活性氨基基团，可以提供大量的蛋白固定化位点，大幅度提升磁珠材料的蛋白载量。随后，将链霉亲和素大量共价结合于树枝状大分子PAMAM的支链末端氨基上，再通过链霉亲和素与生物素之前的特异性亲和作用，将C-末端生物素标记的Fc受体蛋白固定于整个磁珠外表面，这一固定方式可以使Fc受体蛋白仅以末端位置作为与磁珠表面的连接点，在固定的同时保证蛋白天然构象、不损失其结合活性。此外，本发明方法中在Fc受体蛋白固定步骤引入了适量的非离子型表面活性剂，以增加Fc受体蛋白这一膜蛋白的理化稳定性。本发明中提出的磁珠材料结构及合成路线可以保证Fc受体蛋白保持高活性和高载量地固定于磁珠表面，克服了传统合成路线中Fc受体蛋白易失活，磁珠表面蛋白载量低、非特异性吸附严重等问题。
本发明的有益效果在于：
本发明将聚多巴胺包覆在磁性微球表面以增加纳米材料的表面亲水性，同时将四氧化三铁磁性内核完全包裹以增加材料的耐酸耐碱性质；利用树枝状大分子PAMAM修饰在聚多巴胺包覆的磁珠表面以增加蛋白共价结合位点；利用共价结合链霉亲和素于材料外表面，再通过链霉亲和素与生物素之前的特异性亲和作用固定Fc受体蛋白以保证受体蛋白在磁珠表面固定的同时保证天然构象、不损失其结合活性；利用合成过程中加入适量的非离子型表面活性剂以保持Fc受体蛋白的结合活性。
附图说明
图1为实施例中以本发明提出的方法制备固定化FcγRIIIa磁珠(Fe3O4@PDA@PAMAM-FcγRIIIa)的合成路线图。
图2为实施例中：(A)包覆了聚多巴胺的磁珠(Fe3O4@PDA)；(B)包覆了聚多巴胺和树枝状大分子PAMAM的磁珠(Fe3O4@PDA@PAMAM)的透射电子显微镜照片(注：偶联蛋白后由于表面活性剂的存在导致透射电子显微镜仪器无法准确聚焦，因此无法拍摄偶联Fc受体蛋白后的照片)。
图3为实施例中以传统方法制备的固定化FcγRIIIa磁珠(Fe3O4-FcγRIIIa，曲线B)与使用本发明中的合成路线制备的固定化FcγRIIIa磁珠(Fe3O4@PDA@PAMAM-FcγRIIIa，曲线C)与IgG的结合曲线。其中：阳性对照为游离FcγRIIIa与IgG的结合曲线(曲线A)，阴性对照为未偶联蛋白的Fe3O4@PDA@PAMAM与IgG的结合曲线(曲线D)。
图4为实施例中使用固定化FcγRIIIa磁珠(Fe3O4@PDA@PAMAM-FcγRIIIa)在细胞发酵液(Harvested cell culture fluid,HCCF)这一复杂基质中的磁响应表现。
图5为实施例1中，曲线a以传统方法制备的固定化FcγRIIIa磁珠(Fe3O4-FcγRIIIa)，曲线b使用本发明中的合成路线制备的固定化FcγRIIIa磁珠(Fe3O4@PDA@PAMAM-FcγRIIIa)分别用于提取细胞发酵液中IgG后进样所得的色谱图。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实施例1.使用本发明中的合成路线制备固定化FcγRIIIa磁珠(Fe3O4@PDA@PAMAM-FcγRIIIa)并与传统合成方式制备的固定化FcγRIIIa磁珠(Fe3O4@PDA@PAMAM-FcγRIIIa)进行性能对比。
1.1使用本发明中的合成路线制备固定化FcγRIIIa磁珠(Fe3O4@PDA@PAMAM-FcγRIIIa)(图1)
(1)合成聚多巴胺包覆的磁性四氧化三铁微球(Fe3O4@PDA)：于烧杯中加入3.5g无水乙酸钠、0.63g柠檬酸三钠、1.35g六水合三氯化铁、75mL乙二醇，超声处理1小时，至完全溶解呈棕色溶液，随后将反应溶液转移至200mL高压反应釜中，于200℃反应16h合成平均直径为200nm的四氧化三铁磁性微球。反应后以无水乙醇洗涤8次，50℃真空干燥。取80mg干燥后的磁性四氧化三铁微球，分散于80mL的10mM Tris缓冲液中(pH＝8.5)，超声处理30min后，在搅拌同时加入160mL无水乙醇再逐滴缓慢加入120mL盐酸多巴胺的水溶液(2.7mg/mL)。将整个反应体系置于25℃搅拌反应12h以得到聚多巴胺包覆的磁球(Fe3O4@PDA)。反应完成后通过施加外部磁场收集产物Fe3O4@PDA，以去离子水和无水乙醇交替洗涤去除杂质。随后于50℃真空干燥。
(2)合成链接有树枝状大分子PAMAM的聚多巴胺包覆的磁珠(Fe3O4@PDA@PAMAM)：取80mg步骤(1)中所合成的Fe3O4@PDA微球分散于800μL的10mM Tris缓冲液中(pH＝8.5)，超声处理10分钟后加入600μL的5％PAMAM甲醇溶液。将反应体系置于37℃振摇的同时恒温孵育4h。随后，再次向反应体系中加入600μL的5％PAMAM甲醇溶液，继续在37℃振摇的同时恒温孵育12h。
(3)合成固定化FcγRIIIa的磁珠(Fe3O4@PDA@PAMAM-FcγRIIIa)：取步骤(2)合成的Fe3O4@PDA@PAMAM磁珠80mg均匀分散于磷酸盐缓冲液中(pH＝7.4)，加入1.5mL的25％戊二醛水溶液，超声混匀后在25℃振摇反应8小时，反应完成后以磷酸盐缓冲液反复洗涤材料，随后将洗涤过的材料重新分散于4mL含有0.5％链霉亲和素和0.01％吐温-80的磷酸盐缓冲液中，加入0.05mL硼氢化钠水溶液(1.0mg/mL)，将反应体系置于15℃环境中，缓慢振摇反应16小时，以获得连接有链霉亲和素的磁珠。反应结束后以磷酸盐缓冲液反复洗涤除去杂质，随后将所得材料分散于含有0.5mg/mL FcγRIIIa、5％海藻糖、5％甘露醇、0.01％吐温-80的磷酸盐缓冲液中，其中FcγRIIIa带有C-末端特异生物素标记。将反应体系置于于4℃缓慢振摇孵育24小时，随后向体系中加入含有1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液以封闭潜在的蛋白结合位点，在4℃环境中继续缓慢振摇孵育1h完成封闭。随后将所得到的Fe3O4@PDA@PAMAM-FcγRIIIa磁珠以磷酸盐缓冲液反复冲洗，最后以40mg/mL混悬液的形式保存于磷酸盐缓冲液中，并于4℃低温条件下储存备用。
1.2将本发明中的合成路线制备固定化FcγRIIIa磁珠(Fe3O4@PDA@PAMAM-FcγRIIIa)与传统合成方式制备的固定化FcγRIIIa磁珠(Fe3O4-FcγRIIIa)进行性能对比
(1)对比二者表面FcγRIIIa蛋白活性：以基于ELISA的实验测定各磁珠表面的FcγRIIIa与IgG的结合曲线，用以表征各磁珠表面的FcγRIIIa的活性高低。在96孔酶标板中，使用5μg/mL游离FcγRIIIa蛋白(阳性对照)溶液以每孔100μL在4℃过夜孵育包板。另取三个96孔酶标板，分别将本发明中的合成路线制备的Fe3O4@PDA@PAMAM(阴性对照)、Fe3O4@PDA@PAMAM-FcγRIIIa、传统合成方式制备的固定化FcγRIIIa磁珠(Fe3O4-FcγRIIIa)通过施加一外部磁场而固定在96孔酶标板中(96孔酶标板未经FcγRIIIa包被，但已经牛血清白蛋白封闭。固定量为每孔5mg磁珠)。将上述四个酶标均放置于37℃，以1％牛血清白蛋白封闭处理1h。洗板后，平行向每个酶标板中以每孔100μL加入系列稀释的IgG溶液(浓度范围为10μg/mL至0.17ng/mL)，在37℃孵育2h。洗板后，加入羊抗人IgG的二抗(F(ab)’2fragment，不含Fc结构域，偶联辣根过氧化物酶)。二抗由于不含Fc结构域因此不会与材料表面FcγRIIIa发生交叉反应。37℃孵育45分钟后加入底物四甲基联苯胺，由于酶标板中固定了磁珠后无法直接检测光密度，因此在反应30分钟后，将各酶标板上清溶液转移至新的空白酶标板中，再以硫酸终止反应，于酶标仪上读取450nm光密度并以650nm处光密度值作为参比进行扣除。分布绘制Fe3O4@PDA@PAMAM-FcγRIIIa、Fe3O4-FcγRIIIa、阳性对照、阴性对照与IgG的结合曲线(图3)，可见本发明中设计的Fe3O4@PDA@PAMAM-FcγRIIIa磁珠表面结合活性显著高于传统合成路线制备的磁珠Fe3O4-FcγRIIIa。
(2)对比二者与IgG结合的选择性：分别将Fe3O4@PDA@PAMAM-FcγRIIIa和Fe3O4-FcγRIIIa用于从同一份细胞发酵液样品中提取IgG，提取液经过滤后进样至高相液相色谱系统中进行分析。色谱柱为分子排阻柱，提取液中各组分洗脱顺序为：IgG聚集体、IgG单体、发酵液基质相关杂质。从色谱图(图5)中可以看出，本发明中设计的Fe3O4@PDA@PAMAM-FcγRIIIa磁珠对IgG的结合选择性显著高于传统合成路线制备的Fe3O4-FcγRIIIa，以Fe3O4@PDA@PAMAM-FcγRIIIa磁珠提取复杂基质中的IgG具有更好的提取效果和更低的非特异性吸附。
Claims (7)
1.一种高载量且高活性的固定化Fc受体蛋白磁珠的合成方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)合成聚多巴胺包覆的磁性四氧化三铁微球：将四氧化三铁磁性微球分散于碱性条件的溶液中，使盐酸多巴胺单体在其表面聚合，形成聚多巴胺包覆的磁性微球，在磁场作用下，收集反应产物，并将所得产物反复洗涤，以除去杂质；
(2)合成聚酰胺-胺型树枝状高分子修饰的聚多巴胺包覆的磁性微球：取步骤(1)合成的产物10-1000mg均匀分散于碱性溶液中，加入PAMAM树枝状大分子溶液100-1000μL，在20-40℃振摇的同时孵育2-6小时，随后再次加入PAMAM树枝状大分子溶液100-1000μL，在20-40℃振摇的同时继续孵育6-20小时，收集产物，并以去离子水和无水乙醇反复洗涤，烘干备用；
(3)合成固定化Fc受体蛋白的磁珠：取步骤(2)合成的产物10-1000mg均匀分散于pH呈中性的缓冲液中，加入0.1-10mL戊二醛水溶液，在20-40℃振摇反应1-24小时，反应完成后以中性缓冲液反复洗涤材料，将洗涤过的材料重新分散于0.1-10mL链霉亲和素的溶液中，加入0.01-1mL硼氢化钠水溶液，将反应体系置于4-37℃环境中，缓慢振摇反应1-24小时，以获得连接有链霉亲和素的磁珠；以中性缓冲液反复洗涤除去杂质；随后将所得材料分散于0.1-10mL经生物素标记的Fc受体蛋白的水溶液中，将反应体系置于于4-37℃缓慢振摇孵育2-48小时，向体系中加入牛血清白蛋白溶液以封闭潜在的蛋白结合位点，在4-37℃环境中，缓慢振摇孵育0.5-10小时完成封闭；随后将所得到的固定化Fc受体蛋白磁珠以中性缓冲液反复冲洗，低温条件下储存，即得高载量且高活性的固定化Fc受体蛋白磁珠。
2.根据权利要求1所述的一种高载量且高活性的固定化Fc受体蛋白磁珠的合成方法，其特征在于：步骤(1)中所述碱性条件的溶液，控制其pH值为7.5～9.5，使盐酸多巴胺单体在四氧化三铁微球表面聚合形成聚多巴胺包覆的磁性微球。
3.根据权利要求1所述的一种高载量且高活性的固定化Fc受体蛋白磁珠的合成方法，其特征在于：步骤(2)中所述碱性溶液，其pH值为7.5～9.5，使树枝状大分子PAMAM修饰于聚多巴胺包覆的磁性微球表面。
4.根据权利要求1所述的一种高载量且高活性的固定化Fc受体蛋白磁珠的合成方法，其特征在于：步骤(3)中所使用的Fc受体蛋白的水溶液为含有缓冲盐5-100mM、经生物素标记过的Fc受体蛋白0.05-2mg/mL以及非离子型表面活性剂0.001-0.5％。
5.根据权利要求1所述的一种高载量且高活性的固定化Fc受体蛋白磁珠的合成方法，其特征在于：步骤(3)中所使用的Fc受体蛋白应在其C-末端携带生物素标记，并且其他氨基酸残基上无生物素标记。
6.根据权利要求1所述的一种高载量且高活性的固定化Fc受体蛋白磁珠的合成方法，其特征在于：步骤(3)中所述的Fc受体蛋白经由生物素与链霉亲和素之间的亲和作用被固定于磁珠表面。
7.根据权利要求1所述的一种高载量且高活性的固定化Fc受体蛋白磁珠的合成方法，其特征在于：步骤(3)中固定Fc受体蛋白磁珠是在磁珠表面固定Fc受体蛋白之后，使用0.1-5％的蛋白溶液(非抗体溶液)对材料中潜在的蛋白结合位点进行封闭，以避免材料在后续使用过程中发生对蛋白的非特异性吸附。
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