PT652771E - Producao de vacina do tetano - Google Patents

Description

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ΕΡ 0 652 771/PT DESCRIÇÃO "Produção de vacina do tétano" A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de toxina do tétano para utilização em vacinas do tétano. A vacina do tétano existente é produzida a partir de uma cultura em balão de 7 dias de Clostridium tetani que é inactivada ("transformada em toxóides") pela adição de formaldeído. 0 formaldeído é adicionado na forma de formalina. O toxóide é purificado para utilização numa vacina por fraccionamento salino até uma actividade específica de aproximadamente 1200 unidades de floculação (Floculação de Limes, Lf)/mg de azoto proteico (AP), que é equivalente a de 30% a 40% de pureza.

Foram feitas tentativas para aumentar a actividade específica da vacina por purificação do toxóide utilizando imunoadsorventes (Hughes et al., J. Appl. Bact., 37, 603-621, 1974). Isto contudo apenas resultou num aumento limitado, para 1600 Lf/mg de AP. Dawson & Mauritzen (Aust J. Biol. Sei., 1969 vol 22, p. 1217) descrevem estudos da interaeção de formaldeído com a toxina do tétano incluindo a ligação de formaldeído na presença dos aminoácidos leucina e lisina durante a destoxificação da toxina do tétano. Bacterial Vaccines (Ed. R. Germanier, Academic Press 1984, p. 48-50) descreve métodos que são utilizados na destoxificação da toxina do tétano para utilização em vacinas, e especialmente vacinas humanas. WO-A-91/1 2020 descreve um novo antigénio tóxico destoxificado, especialmente a toxina de B. pertussis, obtida por destoxificação parcial utilizando glutaraldeído seguida por reacção do antigénio parcialmente destoxificado com formalina na presença de aminoácidos seleccionados. A toxina de B. pertussis destoxif içada diz-se estável contra reversão para toxicidade. GB-A-969772 descreve um método para produção de um toxóide a partir de uma toxina bacteriana purificada, especialmente a toxina da difteria purificada, por tratamento da toxina num meio aquoso com formaldeído na presença de uma diamina alifática de peso molecular inferior a 200 que contém um grupo amino primário ou secundário. As diaminas preferidas são a lisina e a etilenodiamina. 2 85 640

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Desenvolvemos agora um novo processo para a preparação de toxóide do tétano. Em vez de transformar a toxina num toxóide e depois purificar o toxóide, purificámos a toxina e depois transformámos a toxina purificada num toxóide. Surpreendentemente, contudo, verificou-se que muitas destas preparações eram instáveis, apresentando vários graus de reversão para toxicidade quando armazenadas a 37°C na ausência de formalina.

Voltámo-nos então para a adição de aminoácidos na reacção de transformação da toxina em toxóide, em diferentes concentrações, variando também a concentração de formalina, o pH e os tempos de incubação. A reversão para toxicidade foi difícil de evitar, excepto à custa de baixas razões de poder de combinação total (PCT)/Lf que resultaram em preparações de pobre imunogenicidade. Apenas sob condições específicas foi possível obter preparações estáveis e altamente imunogénicas.

Assim, a presente invenção proporciona um processo para a preparação de toxóide do tétano, processo esse que compreende a incubação de toxina do tétano purificada possuindo uma actividade específica de 2000 Lf/mg de AP ou mais e um teor de Lf de 250 Lf/ml ou mais, com formaldeído a 0,2 a 1 % (v/v) na presença de lisina 0,005 a 0,25 M durante de 24 a 32 dias e a um pH de 6,0 a 8,0 e uma temperatura de 30 a 45°C. A toxina do tétano é tipicamente obtida a partir de uma cultura de Clostrídium tetani. Qualquer estirpe apropriada de C. tetani pode ser empregue. A toxina pode ser purificada a partir de um caldo de fermentação primeiro por centrifugação do caldo e depois por clarificação do sobrenadante da cultura, por exemplo através de uma filtração em duas etapas. O sobrenadante clarificado pode ser concentrado. 0 sobrenadante pode então ser submetido a diafiltração para remover espécies moleculares carregadas pequenas e depois a cromatografia de permuta iónica. A toxina purificada tem um teor de Lf de 250 Lf/ml ou mais, por exemplo de 250 a 500 Lf/ml. Se o teor de Lf for inferior a 250 Lf/ml, a toxina pode ser novamente processada através de um passo de concentração adicional para aumentar o rendimento da toxina. 3 85 640

EPO 652 771/PT A actividade específica da toxina pode ser determinada estimando o teor de azoto proteico (AP) do material purificado e calculando a razão de Lf para AP. A toxina purificada tem uma razão de Lf para AP de 2000 Lf/mg de AP ou mais, por exemplo de 2000 a 3000 Lf/mg de AP ou de 2000 a 2800 Lf/mg de AP. Se a actividade específica da toxina for inferior a 2000 Lf/mg de AP, o material purificado pode ser novamente processado através de uma coluna de permuta iónica. Uma actividade específica de 2000 Lf/mg de AP é equivalente a uma pureza de cerca de 70%. Está reportado que uma toxina 100% pura tem uma actividade específica de 3000 a 3200 Lf/mg de AP. A pureza da toxina pode ser, alternativa ou adicionalmente, avaliada por análise por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e/ou por electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE). A pureza é determinada preferivelmente por HPLC em que os picos eluídos são integrados e a área dos picos relacionados com a toxina é expressa como uma percentagem da área total integrada dos picos. A análise por SDS-PAGE sob condições redutoras separa a molécula da toxina nos seus constituintes de cadeias pesadas (100 kD) e leve (50 kD). As duas bandas podem ser identificadas após coloração e as suas intensidades combinadas, como determinadas por densitometria, são expressas como uma percentagem das bandas totais.

Se a análise por HPLC e/ou por SDS-PAGE mostrar que a toxina é menos de 70% pura, o material pode ser novamente processado através de uma coluna de permuta iónica para aumentar a pureza. Portanto, preferivelmente, a toxina é 70% pura ou mais, por exemplo de 70% a 100% pura, como determinado por HPLC e/ou SDS-PAGE. A toxina pode ser 80% pura ou mais ou 90% pura ou mais. A toxina do tétano purificada é transformada num toxóide através de formaldeído a de 0,2% a 1% (v/v) na presença de lisina 0,005 a 0,25 M. Tipicamente, é adicionado um tampão tal como tampão de ácido borossuccínico sódico, para ajustar o pH da solução de toxina purificada a de 6,0 a 8,0, preferivelmente de 6,5 a 7,5. A concentração da toxina purificada em solução é tipicamente ajustada a de 150 a 300 Lf/ml, preferivelmente a cerca de 200 Lf/ml. 4 85 640

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Tipicamente, a toxina purificada é primeiro pré-incubada com o formaldeído na ausência de lisina. A toxina purificada pode portanto ser pré-incubada com o formaldeído durante de 10 minutos a 2 horas e de 30 a 45°C. A pré-incubação ocorre preferivelmente durante de 20 a 40 minutos, por exemplo durante cerca de 30 minutos. A temperatura da pré-incubação é preferivelmente de 35 a 40°C, por exemplo de cerca de 37°C. A lisina é então adicionada. A lisina é tipicamente L-lisina tal como monocloridrato de L-lisina. Pode ser adicionado um tampão tal como tampão de bicarbonato de sódio, para ajustar o pH. A incubação da toxina purificada com o formaldeído e a lisina ocorre preferivelmente durante cerca de 28 dias. A temperatura da incubação é preferivelmente de 35 a 40°C, por exemplo de cerca de 37°C. A concentração de formaldeído é preferivelmente de 0,25 a 0,5% (v/v). A concentração de lisina é preferivelmente de 0,05 a 0,2 M. As condições adequadas são: - formaldeído a 0,25% (v/v) com L-lisina 0,05 a 0,1 M, e - formaldeído a 0,5% (v/v) com L-lisina 0,1 a 0,2 M. 0 toxóide resultante pode então ser purificado. O formaldeído e a lisina residuais são removidos. O toxóide pode portanto ser concentrado por ultrafiltração, dialfiltrado para remover o formaldeído e a lisina residuais e esterilizado por filtração em membrana. Preferivelmente, a razão de Lf para AP do toxóide é de 2000 Lf/mg de AP ou mais, por exemplo de 2000 a 3000 Lf/mg de AP ou de 2000 a 2800 Lf/mg de AP. Também preferivelmente, o toxóide tem uma pureza de 70% ou mais, por exemplo de 70% a 100%, como determinado por HPLC e/ou SDS-PAGE. O toxóide pode portanto ser 80% puro ou mais ou 90% puro ou mais, como determinado por HPLC e/ou SDS-PAGE. Se a razão de Lf para AP for inferior a 2000 Lf/mg de AP e/ou se o toxóide for menos de 70% puro como determinado por HPLC e/ou SDS-PAGE, o toxóide pode ser novamente processado através de uma coluna de permuta iónica.

Um toxóide do tétano assim produzido pode portanto não reverter 'na toxina quando armazenado a 37°C durante 3 meses ou mais, preferivelmente durante até 6 meses; tem uma actividade específica de 2000 a 2800 Lf/mg de AP, por exemplo de 2400 a 2700 Lf/mg de AP; e tem uma potência de 1 30 a 270 Unidades Internacionais (UI)/3,5 Lf, por exemplo 200 a 250 UI/3,5 Lf. 5 85 640

ΕΡ 0 652 771/PT 0 toxóide resultante não reverte para toxicidade e é mais imunogénico do que a vacina existente. O toxóide pode portanto ser formulado com um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável para formar uma composição de vacina. O toxóide pode ser misturado com um solvente fisiologicamente aceitável tal como solução salina fisiológica. O toxóide pode, alternativamente, ser precipitado sobre, ou adsorvido por um transportador mineral adequado numa solução salina fisiológica ou em outra solução adequada isotónica com o sangue. Estas formulações são geralmente armazenadas a de 2 a 8°C antes da utilização. Pode estar presente tiomersal na formulação da vacina. O toxóide pode ser parte de uma vacina de componentes múltiplos, tal como uma vacina combinada de difteria-tétano ou uma vacina combinada de difteria-tétano-tosse convulsa.

Um humano pode portanto ser imunizado contra o tétano por administração de uma quantidade eficaz do presente toxóide do tétano. Tipicamente, a administração é conseguida por via intramuscular ou subcutânea. Em qualquer dos casos, a dose inicial de toxóide administrado pode ser de 3 Lf a 10 Lf. Esta dose pode ser repetida até duas vezes a intervalos de 2 meses. Pode ser dada uma dose de reforço de 3 Lf a 10 Lf, 5 ou 10 anos mais tarde. O Exemplo que se segue ilustra a invenção. São também proporcionados um Exemplo de Referência e Exemplos Comparativos.

Exemplo de Referência: Preparação de toxina do tétano purificada

Fez-se uma cultura de C.tetani estirpe CN 3911, que é uma subcultura da estirpe Harvard de C. tetani (Mueller e Miller, J. Immunol. 50, 377-384, 1945), num meio de Meuller modificado (Latham et al., Appl. Microbiol. 10, 146, 1962). Mais especificamente, utilizou-se 10% (v/v) de cultura sementeira de 48 horas para inocular um frasco estático ou um fermentador controlado contendo meio de Mueller modificado. No caso da cultura estática, adicionou-se alumínio em pó ao meio antes da inoculação. O fermentador, um fermentador de 15 1, foi agitado a 50 rpm e com ar filtrado por 0,2 pm aplicado através da superfície da cultura a um caudal de 500 ml/min. A fermentação no balão estático ou no fermentador foi continuada durante 4 a 7 dias a 33 ± 2°C.

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Separou-se o caldo de fermentação por centrifugação em descontínuo (rotor de 6x1 litro) a 3000g durante 40 minutos. O sobrenadante foi adicionalmente clarificado através de uma filtração em duas etapas através de uma combinação de filtros de 1,2/0,8 pm e depois um filtro estéril de 0,2 pm. 0 sobrenadante da cultura foi então concentrado dez vezes utilizando uma membrana de ultrafiltração de exclusão nominal de 30K e depois dialfiltrado extensivamente utilizando a mesma membrana utilizando 10 volumes de tampão [Tris 20 mM, NaCI 25 mM, ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA), 0,2 mM, pH 7,5]. Isto resultou num aumento de dezoito vezes na pureza como determinado por HPLC. A recuperação média deste passo foi de 80%. 0 material filtrado foi então carregado numa coluna de permuta aniónica (DEAE Sepharose Fast Flow). Lavou-se a coluna com tampão Tris 20 mM, pH 7,5. Eluiu-se a toxina do tétano com NaCI 80 mM, tampão Tris, pH 7,5. O material eluído foi esterilizado por filtração através de um filtro estéril de 0,2 pm. O material assim purificado foi submetido aos seguintes testes: (i) ESTIMATIVA D0 TEOR DE Lf

Este teste monitorizou o rendimento da toxina do material de toxina purificada. Tomaram-se para o teste aproximadamente 5 ml de material de toxina purificada. A amostra não foi armazenada antes do teste. A determinação de Lf foi realizada pelo procedimento descrito em Ramon, G. (1922) Sur une technique de titrage in vitro due serum anti-diphtherique. C.P. SOC. BIOL. (Paris) 86, 711-712. 0 teor de Lf do material purificado era de 250-500 Lf/ml.

(ii) ESTIMATIVA DA RAZAO DE Lf:AZOTO PROTEICO

Este teste determinou a pureza do material purificado. Tomou-se para o teste não menos de 1 ml do material purificado. A amostra foi armazenada a 5°C ± 3°C quando não testada imediatamente. O teor de azoto proteico (AP) fui estimado utilizando a técnica de digestão de Kjeldahl (Kjeldahl J. (1888) C.R. CARLSBERG LABOR. (Copenhagen) 2, 1-12) após precipitação com ácido tricloroacético. A razão de Lf:AP era de 2000-3000 Lf/mg de AP. 7 85 640

ΕΡ 0 652 771/PT (iii) DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE HPLC POR EXCLUSÃO DE TAMANHOS Este teste assegurou que o perfil de HPLC da toxina purificada estava dentro de limites aceitáveis. Tomou-se para o teste não menos de 1 ml de material purificado. A amostra foi armazenada a +4°C antes do teste. Aplicou-se uma amostra do material de toxina purificado a uma coluna de HPLC de filtração em gel (TSK G 3000 SWx1). A separação dos componentes da amostra é monitorizada a 280 nm e as áreas dos picos sãn integradas. Resultados da HPLC: - pico 1 (tempo de retenção de 10,6-10,7 minutos) - monómero de toxina; - pico 2 (tempo de retenção de 12,4-12,5 minutos) - fragmento C da toxina; e pico 3 (tempo de retenção >14 minutos) - contaminantes.

As áreas integradas combinadas dos picos 1 e 2 eram de 70 a 100% do total das áreas integradas dos picos 1 a 3.

(iv) DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE SDS-PAGE

Este teste assegurou que o perfil de SDS-PAGE da toxina purificada estava dentro de limites aceitáveis. Tomou-se para o teste não menos de 0,5 ml do material de toxina purificado. Armazenou-se a amostra a 4°C antes do teste. Examinou-se a amostra, após redução utilizando mercaptoetanol, por SDS-PAGE pelo método descrito por Laemili (Nature, 227. 680-685, 1970). Pesquisou-se o gel com um densitómetro e integraram-se as áreas dos picos. As bandas pesada (100 kD) e leve (50 kD) da toxina representavam 70 a 100% das bandas totais coradas com azul de Coomassie, calculadas a partir das áreas integradas detectadas por densitometria. EXEMPLO: Transformação em toxóide da toxina do tétano purificada A toxina do tétano purificada do Exemplo de Referência foi diluída com tampão de ácido borossuccínico sódico (SBSA) pH 7,5 suficiente para obter uma concentração final de toxina de 200 Lf/ml. As alíquotas foram tratadas para transformação em toxóides como se segue: 1. Adicionou-se formaldeído a 0,25% (v/v) na forma de formalina a uma alíquota e pré-incubou-se a mistura durante 30 minutos a 37°C. Adicionou-se subsequentemente monocloridrato de L-lisina até uma concentração final de 0,05-0,1 M, na presença de bicarbonato de sódio 0,1 M. 8 85 640

EPO 652 771/PT 0 pH da mistura reaccional era de 6,5 a 7,5 e deixou-se prosseguir a transformação em toxóide durante 28 dias a 37°C ± 2°C. 2. Adicionou-se formaldeído a 0,5% (v/v) na forma de formalina a outra alíquota e pré-incubou-se a mistura durante 30 minutos a 37°C. Adicionou-se subsequentemente monocloridrato de L-lisina até uma concentração final de 0,1 a 0,2 M, na presença de bicarbonato de sódio 0,1 M. 0 pH da mistura reaccional era de 6,5 a 7,5 e deixou-se prosseguir a transformação em toxóide durante 28 dias a 37°C + 2°C.

Testou-se o teor de Lf do material incubado como descrito no Exemplo de Referência. Concentrou-se o material incubado por ultrafiltração numa membrana de ultrafiltração de exclusão nominal de 30K. Diafiltrou-se o concentrado utilizando a mesma membrana de 30K, contra tampão SBSA pH 7,5, para remover o formaldeído e a lisina residuais. Adicionou-se tiomersal (sal de sódio do ácido etilmercuriotiossalicílico) para obter uma concentração final de 0,1 g/litro (2,5 x 104 mol/litro) de tiomersal. A solução resultante foi esterilizada por filtração em membrana (membrana de 0,2 μιτι). Tomaram-se amostras e testaram-se como se segue:

(i) ESTIMATIVA DO TEOR DE AZOTO PROTEICO

Este teste foi conduzido como descrito no Exemplo de Referência. 0 resultado foi de 2000-2800 Lf/mg de AP. (ii) ESTIMATIVA DO PODER DE COMBINAÇÃO TOTAL (TCP)

Este teste determinou o teor de antigénio do toxóide do tétano. O TCP é um termo bastante utilizado no campo do tétano e é referido no manual do WHO (11, Apêndice T.10). É definido como o recíproco do volume de toxóide que, quando diluído, é equivalente a uma Unidade Internacional (WHO BLG/UNDP/77.1 Rev.1). A qualidade dos toxóides pode ser medida por determinação da razão de TCP (unidades de ligação) para unidades de Lf, que deve ser superior a um.

Tomou-se para o teste não menos de 5,0 ml de toxóide. Armazenou-se a amostra a 5°C ± 3°C quando não testada imediatamente. Distribuiu-se numa série de tubos uma gama de volumes adequada de 0,01-0,03 μΙ de material de 9 85 640

ΕΡ 0 652 771/PT teste e 87 Unidades Internacionais (UI) de um toxóide do tétano de referência/ml, formando uma progressão geométrica correcta. Adicionou-se uma dose fixa de 2 UI/0,5 ml de solução de antitoxina do tétano de referência a cada tubo e manteve-se à temperatura ambiente durante 60 minutos.

Adicionou-se a cada tubo um volume de toxina do tétano de teste equivalente a metade da dose de antitoxina e deixou-se em repouso durante 30 minutos. O conteúdo de cada tubo foi injectado por via subcutânea em ratinhos pesando 18-22 g cada um. Observaram-se os ratinhos durante 4 dias, quanto a sinais de paralisia típica do tétano.

Se ocorria paralisia específica do tétano em 3 dias, o material de teste continha toxóide do tétano equivalente a mais do que metade da dose de antitoxina adicionada. Se o ratinho sobrevivia durante mais de 3 dias sem paralisia específica do tétano, o material de teste continha toxóide do tétano equivalente a menos do que metade da dose de antitoxina adicionada. A ocorrência de paralisia específica do tétano no terceiro dia indicava que o volume de toxóide do tétano foi considerado como exactamente equivalente a metade da dose de antitoxina adicionada.

Os resultados foram aceites na foram da média de dois testes desde que estes não diferissem mais de 20% do valor médio. Os resultados foram de 200-350 u/ml. (iii) ESTIMATIVA DO TEOR DE Lf 0 teor de Lf foi determinado como descrito no Exemplo de Referência. Os resultados foram de 1 50-250 Lf/ml.

(iv) DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE HPLC 0 perfil de HPLC foi determinado como descrito no Exemplo de Referência. O resultado foi de 70-100% de pureza.

(v) TESTE À REVERSÃO

Este teste demonstrou isenção de reversão do toxóide para a toxina durante a armazenagem ou a utilização e satisfaz os requisitos de WHO Technical Report Series No. 725, p. 67. Tomaram-se 10 ml de material de toxóide diafiltrado e armazenou-se a 5 ± 3°C até o teor de Lf ter sido estimado 10 85 640 ΕΡ 0 652 771/PT como descrito anteriormente. Diluiu-se a amostra para 16 Lf/ml. Manteve-se a amostra diluída a 37°C. Testou-se a amostra quanto a não toxicidade após armazenagem durante 6 semanas, 2 meses e 3 meses. Inocularam-se 5 ml da amostra por via subcutânea a cada um de 2 porquinhos-da-índia saudáveis. Observaram-se os animais durante 14 dias quanto a morte ou sinais de paralisia específica. Não houve evidência de reversão para a toxina. (vi) CARACTERIZAÇÃO DO TOXÓIDE POR MOBILIDADE ELECTROFORÉTICA Este teste proporcionou uma previsão da potência do material de toxóide.

Tomaram-se para o teste 0,5 ml de material de toxóide diafiltrado. Armazenou-se a amostra a 5 ± 3°C quando não testada imediatamente. Cobríram-se placas de vidro (0,18 ml/cm2) com agarose a 1% (v/v) em tampão tris 60 mM pH 8,6. Submeteram-se amostras (5 μΙ) a electroforese na primeira dimensão a 20 volt/cm durante 60 minutos. A electroforese na segunda dimensão, em agarose contendo soro de cavalo anti-tétano (0,06% v/v), foi realizada a 6 volt/cm durante 16 horas.

Corou-se o gel com Azul de Coomassie e mediu-se a mobilidade do pico do toxóide a partir da origem. Os resultados, incluindo o resultado de um toxóide de referência (14 mm), foram de 5-30 mm.

(vii) TESTE À POTÊNCIA

Este teste satisfaz os requisitos da British Pharmacopoiea (1980), Vol. II, p.880, Ph. Eur., Supl. ao Vol. III (1977), p.175 e do WHO Technical Report Series No. 638, p.90, Secção A.3.5.6. Determinou-se a potência a partir da resposta à imunização com uma vacina preparada por adsorção do material de toxóide sobre um adjuvante (hidróxido de alumínio, Alhydrogel).

Tomou-se para o teste uma amostra de um recipiente de trânsito de vacina adsorvida em bruto final. Armazenou-se a amostra a 5°C ± 3°C quando não testada imediatamente. Testou-se a amostra pelo método descrito em Ph. Eur., Supl. ao Vol. III (1977), p.175. A potência foi determinada como 130 a 270 UI/3,5 Lf que é significativamente superior à potência de 70-110 UI/7 Lf da vacina actual preparada por transformação em toxóide com formaldeído e depois purificação do toxóide.

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ΕΡ 0 652 771 /PT (viii) TESTE DE TOXICIDADE ESPECÍFICA

Este teste é baseado nos requisitos da British Pharmacopoiea (1988), Vol. II, p.1062; Ph. Eur., 1985, p.452 e do WHO Technical Report Series No. 638, p.90, Secção A.3.5.5. O teste confirmou a ausência de toxicidade detectável atribuível ao toxóide do tétano. Tomou-se para o teste não menos de 12,5 ml de material transformado em toxóide. Armazenou-se a amostra a 5nC 1 3°C quando não testada imediatamente. O método baseia-se no teste descrito em Ph. Eur., 1985, p.452. Injectou-se 1 ml de uma diluição contendo pelo menos 500 unidades de Lf de toxóide do tétano, por via subcutânea, a cada um de cinco porquinhos-da-índia normais, cada um pesando 250g-350g. Observaram-se os animais durante 21 dias quanto a sinais de toxicidade ou paralisia específicas. Não houve evidência de toxicidade atribuível ao toxóide do tétano.

Exemplo Comparativo 1: Transformação em toxóides na ausência de lisina A toxina do tétano purificada do Exemplo de Referência foi transformada em toxóide por adição de apenas formalina. Incubou-se formaldeído a 0,25-1,0% na forma de formalina com toxina a 200 Lf/ml durante 14 dias a 37°C ± 2°C. Não foi portanto adicionada lisina.

Testaram-se os toxóides resultantes quanto a reversão como descrito no Exemplo. Os toxóides reverteram para toxicidade. A toxina revertida na realidade raramente induziu o tétano clássico mas produziu um síndrome neurológico diferente.

Exemplo Comparativo 2: Transformação em toxóide na presença de lisina sob diferentes condições A toxina do tétano purificada do Exemplo de Referência foi transformada em toxóide como se segue: (i) Diluiu-se a luxina do tétano purificada do Exemplo de Referência com tampão SBSA pH 7,5 suficiente para obter uma concentração final de toxina de 200 Lf/ml. Adicionou-se formaldeído a de 0,1 a 1,0%, na forma de formalina, a uma alíquota, e pré-incubou-se a mistura durante 30 minutos a 37°C. Subsequentemente adicionou-se monocloridrato de L-lisina até uma concentração final de 0,005 a 0,1 M, na presença de bicarbonato de sódio 12 85 640 ΕΡ 0 652 771/PT 0,1 Μ. Ο ρΗ da mistura reaccional era de 6,5 a 7,5 e deixou-se prosseguir a transformação em toxóide durante 14 dias a 37°C. (ii) Como em (i) mas fez-se variar o pH da reacção de transformação em toxóide de 6,0 a 8,5. (iii) Como em (i) mas utilizou-se arginina (0,05 a 0,1 M) em vez de lisina. (iv) Como em (i) mas o período de incubação foi aumentado de 14 dias para 21 dias. (v) Como em (i) mas sem período de pré-incubação.

Todos os toxóides resultantes foram testados quanto a reversão como descrito no Exemplo. Os toxóides reverteram para toxicidade.

Lisboa, T2. FiiV. cGJl

Por EVANS VACCINES LIMITED

ENG.* ANTÓNIO JOÀO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Rh· das Flores, 74 - 4.' 1E0O LISBOA

Claims (9)

1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a preparação de toxóide do tétano, processo que compreende a incubação de toxina do tétano purificada possuindo uma actividade específica de 2000 Lf/mg de AP (floculação de Limes/mg de azoto proteico) ou mais e um teor de Lf de 250 Lf/ml ou mais, com formaldeído a 0,2 a 1 % (v/v) na presença de lisina 0,005 a 0,25 M durante de 24 a 32 dias a um pH de 6,0 a 8,0 e a uma temperatura de 30 a 45°C.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a toxina do tétano foi purificada a partir de uma cultura de Clostridium tetani.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a toxina purificada tem uma actividade específica de 2000 a 3000 Lf/mg de AP e um teor de Lf de 250 a 500 Lf/ml.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a toxina purificada é 80% pura ou mais, como determinado por cromatografia líquida de alta pressão e/ou electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a toxina purificada é pré-incubada com o formaldeído na ausência da lisina durante de 20 a 40 minutos a de 35 a 40°C.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a toxina purificada é incubada com o formaldeído e a lisina durante cerca de 28 dias a 35 a 40°C.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que se emprega formaldeído a 0,25 a 0,5% (v/v) no passo de incubação.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que se emprega lisina 0,05 a 0,2 M no passo de incubação. 85 640 ΕΡ 0 652 771/PT 2/2

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a toxina transformada em toxóide é formulada com um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável para formar uma composição de vacina. Lisboa, j% fi'l clíJ Por EVANS VACCINES LIMITED - 0 AGENTE OFICIAL - O ADJUSTO

ENG.* ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Ru« dos Flores, 74 - 4/ 1600 LISBOA *