KR20000059470A

KR20000059470A - 항산화, 미백, 보습, 면역증강 및 항여드름 작용을 나타내는 목질진흙버섯 자실체 및 배양균사체 추출물, 그 제조방법 및 용도

Info

Publication number: KR20000059470A
Application number: KR1019990007092A
Authority: KR
Inventors: 이준우; 정훈; 백성진; 김용석; 정원태; 조길도
Original assignee: 우재영; 일양약품 주식회사
Priority date: 1999-03-04
Filing date: 1999-03-04
Publication date: 2000-10-05
Also published as: KR100320743B1

Abstract

본 발명은 목질진흙버섯(Phellinus linteus, 桑黃)의 자실체 또는 액체배양에 의해 수득된 목질진흙버섯의 균사체 배양물을 열수추출한후 분리정제하여 수득되는, 항산화, 미백, 보습, 면역증강 및 항여드름 작용 등을 나타내는 목질진흙버섯 추출물, 그의 제조방법 및 화장료 또는 식품으로서의 그의 용도에 관한 것이다.

Description

항산화, 미백, 보습, 면역증강 및 항여드름 작용을 나타내는 목질진흙버섯 자실체 및 배양균사체 추출물, 그 제조방법 및 용도{Extracts of Phellinus linteus having anti-oxidizing, whitening, moisturizing, immunoenhancing and anti-acne activities, preparation method and use thereof}

본 발명은 항산화, 미백, 보습, 면역증강 및 항여드름 작용을 나타내는 목질진흙버섯(Phellinus linteus, 桑黃) 추출물과 그 제조방법 및 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 목질진흙버섯의 자실체 또는 액체배양에 의해 수득된 목질진흙버섯의 균사체 배양물을 열수추출한후 분리정제하여 수득되는, 항산화, 미백, 보습, 면역증강 및 항여드름 작용을 나타내는 목질진흙버섯 추출물과 그의 제조방법 및 화장료 또는 식품으로서의 그의 용도에 관한 것이다.

목질진흙버섯은 분류학적으로 담자균아문(Basidiomycotina), 민주름버섯목(Aphyllophorales), 소나무비늘버섯과(Hymenochaetaceae), 진흙버섯속(Phellinus Quel. em. Imaz.)에 속한다. 목질진흙버섯은 뽕나무 줄기에 자생하며 자실체 표면을 제외한 전체가 황색을 띄므로 상황(桑黃)이라는 이름으로 잘 알려져 있다. 상황은 중약대사전(상해과학기술)에 류(柳), 상(桑) 및 저(楮)의 수간(樹幹)에 자생하는 버섯이라 하여, 상이(桑耳), 상신(桑臣), 호고안(胡孤眼) 등의 이명(異名)을 갖고 있다. 또한 신농본초경(新農本草經)에서 상이는 상근백피(桑根白皮)(상목, Morus alba L., 근피(根皮))의 항에 기록하고 있고, 명대의 이시진(李時珍)은 본초강목(本草綱目)에 목이(木耳)의 항으로 분류하여 상이, 상유(桑孺), 상아(桑蛾), 상신 및 상황 등으로 기록하고 있으며, 동의보감(東醫寶鑑)에서는 상이, 상황 등으로 분류하고 있다. 목질진흙버섯(桑黃)은 Phellinus linteus (Berk. et Curt) Aoshima, P. igniarius (L. ex Fr.) Quel, P. yucatensis (Murr.), Imazek, Fomes yucatensis Murrill, Pyropolyporus yucatensis Murr. 등의 여러가지로 명명되고 있으나, 상목, 양(楊), 사견(社鵑) 등의 광엽수에 자생하는 말똥진흙버섯(Phellinus igniarius (L. ex Fr.) Quel)은 광의적으로 해석한 상황의 학명이고, 진정한 의미의 상황인 목질진흙버섯은 말똥진흙버섯과 달리 상수(桑樹)에서만 자생하며, 학명은 Phellinus linteus (Berk. et Curt) Aoshima이다(원색일본균류도감, 1975).

목질진흙버섯은 뽕나무의 그루터기에 자생하는 버섯으로 그 모양은 초기에는 황색 진흙덩이가 뭉친것 같은 형태를 유지하다가 다 자란후의 형태는 그루터기에 혓바닥을 내민 모습이어서 수설(樹舌)이라고도 한다. 혓바닥같은 형태의 윗부분이 상황의 품종에 따라 약간의 차이는 있지만 진흙과 같은 색깔을 나타내기도 하고, 감나무의 표피와 같이 검게 갈라진 모습을 나타내기도 한다.

목질진흙버섯의 약리작용은 소화기 계통의 암인 위암, 식도암, 십이지장암, 결장암, 직장암을 비롯하여 간암의 절제수술후 화학요법을 병행할때 면역기능을 항진시키는 것으로 알려져 있다. 또한 자궁출혈, 대하, 월경불순, 장출혈을 치료하고 오장 및 위장기능을 활성화시키며 해독하는 작용도 한다.

이케가와(Ikegawa) 등(Gann 59, 155, 1968)은 목질진흙버섯이 구름버섯(Coriolus versicolor)과 표고버섯(Lentinus edodes) 보다 종양저지율이 높다고 보고하였으며, 마에다(Maeda) 등(Protein Nucleic acid Enzyme, 21, 426, 1976)은 목질진흙버섯의 항암활성이 96.7%라고 보고하였다. 또한 정 등(약학회지, 38, 158, 1994)은 균사체의 다당단백체가 육종(sarcoma) 180 복수암 및 고형암을 효과적으로 억제한다고 보고하였으며, 김 등(Arch, Pharm. Res., 17, 337, 1994)은 항종양 활성을 갖는 다당류를 분석한 결과 글루코스가 주(主)를 이루고 있으며 그외 갈락토스, 만노스, 아라비노스 등으로 이루어져 있다고 보고하였다. 또한 공 등(생약학회지, 22, 233, 1991)은 목질진흙버섯 균사체의 열수추출물이 NK 세포기능에 작용하여 숙주의 비특이적 면역기능을 증강시킴으로써 항암활성을 나타내며, 마우스에 투여한 결과 LD₅₀은 1,500mg/kg 이상으로 안전하다고 보고하였다.

이와 같이 목질진흙버섯이 우수한 항암활성과 면역증강효과를 갖는 것으로 보고된이후, 국내에서도 민방에서 항암치료를 위하여 고가로 시판되고 있는 실정이다. 그러나 자연산의 진정한 목질진흙버섯은 희귀할 뿐만 아니라 가격 또한 매우고가이기 때문에 입수가 곤란하며 산지와 종균에 따라 약리효과에도 차이가 있는 것으로 알려져 있다. 목질진흙버섯은 크게 자실체와 균사체로 구분할 수 있는데, 자실체는 인공적으로 재배가 어려운 것으로 알려져 있었으나, 최근에는 국내에서 자연산과 유사한 목질진흙버섯의 재배가 가능한 것으로 보고되었다. 그러나 그 재배에는 약 2년이라는 장기간이 소요되는 것으로 알려져 있다. 한편 목질진흙버섯의 자실체와 액체배양된 균사체의 유효성분은 그 생리학적 기능 및 물리화학적 특성이 유사한 것으로 알려져 있으므로, 경제성과 공업화를 위해서는 균사체를 대량으로 액체배양하는 방법이 유리하다 할 것이다. 따라서 자실체와 유사한 약리학적 활성을 갖는 균사체성 고분자물질을 단기간내에 대량으로 생산할 수 있을 뿐 아니라 물리화학적으로도 균일한 제품을 생산해낼 수 있는, 균사체의 새로운 배양방법과 균사체성 고분자물질의 분리정제 방법의 수립이 절실하게 요구되어 왔다.

본 발명은 상기한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 첫째, 목질진흙버섯의 균사체를 배양하기 위한 액체배지 조성물을 제공하고, 둘째, 상기 액체배지에서 목질진흙버섯의 균사체를 배양하는 방법을 제공하며, 셋째, 목질진흙버섯의 자실체 또는 상기 방법으로 수득된 목질진흙버섯의 균사체 배양물을 열수추출한후 분리정제하여 수득되는, 항산화, 미백, 보습, 면역증강 및 항여드름 작용을 나타내는 목질진흙버섯의 추출물을 제공하고, 넷째, 상기 목질진흙버섯의 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 또는 식품 조성물을 제공하며, 다섯째, 항산화, 미백, 보습, 면역증강 및 항여드름 작용을 나타내는 목질진흙버섯의 추출물을 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

첫째, 본 발명은 포도당 0.1-5%, 효모추출물 0.05-3%, 펩톤 0.05-3%, 황산마그네슘 0.05%, 인산제2수소칼륨 0.046%, 인산제1수소칼슘 0.01%, 미량원소로서 FeCl₃·6H₂O 0.01%, MnCl₂·4H₂O 0.0072%, CuSO₄·5H₂O 0.0025% 및 ZnCl₂0.004%를 함유하는 것을 특징으로 하는 목질진흙버섯의 균사체 배양용 액체배지 조성물을 제공한다.

둘째, 본 발명은 목질진흙버섯의 균사를 포도당 0.1-5%, 효모추출물 0.05-3%, 펩톤 0.05-3%, 황산마그네슘 0.05%, 인산제2수소칼륨 0.046%, 인산제1수소칼슘 0.01%, 미량원소로서 FeCl₃·6H₂O 0.01%, MnCl₂·4H₂O 0.0072%, CuSO₄·5H₂O 0.0025% 및 ZnCl₂0.004%를 함유하는 액체배지에서 pH 4.5-6.5 및 온도 25-35℃로 3-10일간 배양하는 것을 특징으로 하는 목질진흙버섯 균사체의 배양방법을 제공한다.

셋째, 본 발명은 목질진흙버섯의 자실체 또는 상기와 같은 방법에 의해 수득된 목질진흙버섯의 균사체 배양물에 정제수를 가하여 열수추출한후 여과하여 열수추출물을 회수하고, 그 열수추출물을 농축한후 동결건조하거나, 농축한후 다이아필트레이션(diafiltration)하여 재농축하고 동결건조하여 수득되는 것을 특징으로 하는 항산화, 미백, 보습, 면역증강 및 항여드름 작용을 나타내는 목질진흙버섯 추출물을 제공한다. 특히, 본 발명에서 사용되는 목질진흙버섯은 Pellinus linteus IY003(수탁번호 제 KCTC 8927P 호)인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 따른 추출물은 목질진흙버섯의 자실체에 정제수를 가하여 열수추출한후 여과하여 열수추출물을 회수하고, 그 열수추출물을 농축한후 다이아필트레이션하여 재농축하고 동결건조하여 수득되는 것이거나, 상기와 같은 방법에 의해 수득된 목질진흙버섯의 균사체 배양물에 정제수를 가하여 열수추출한후 여과하여 열수추출물을 회수하고, 그 열수추출물을 농축한후 다이아필트레이션하여 재농축하고 동결건조하여 수득되는 것을 특징으로 하는 목질진흙버섯 추출물인 것이 바람직하다.

넷째, 본 발명은 상기한 목질진흙버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

다섯째, 본 발명은 상기한 목질진흙버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물을 제공한다.

마지막으로, 본 발명은 목질진흙버섯의 자실체 또는 상기와 같은 방법에 의해 수득된 목질진흙버섯의 균사체 배양물에 정제수를 가하여 열수추출한후 여과하여 열수추출물을 회수하고, 그 열수추출물을 농축한후 동결건조하거나, 농축한후 다이아필트레이션하여 재농축하고 동결건조하는 것을 특징으로 하는 항산화, 미백, 보습, 면역증강 및 항여드름 작용을 나타내는 목질진흙버섯 추출물의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 하기와 같다.

본 발명에서는, 먼저 다양한 경로를 통하여 입수 및 채집한 자연산 목질진흙버섯중에서 우수한 항산화, 보습 및 면역증강 효과를 나타내는 목질진흙버섯의 자실체를 분리하고 동시에 그 자실체로부터 균사체를 분리해낸다. 특히 본 발명에서 사용되는 목질진흙버섯은 Phellinus linteus IY003으로서, 이것은 1999년 1월 21일자로 한국과학기술원 부설 생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Culture)에 수탁번호 제 KCTC 8927P 호로 기탁 완료되었다. 목질진흙버섯은 감자 포도당 한천배지(potato dextrose agar medium, PDA medium)에 보존하며, 보존된 목질진흙버섯의 균사를 일부 분리하여 포도당 0.1-5%, 효모추출물 0.05-3%, 펩톤 0.05-3%, 황산마그네슘 0.05%, 인산제2수소칼륨 0.046%, 인산제1수소칼슘 0.01%, 미량원소로서 FeCl₃·6H₂O 0.01%, MnCl₂·4H₂O 0.0072%, CuSO₄·5H₂O 0.0025% 및 ZnCl₂0.004%를 함유하는 액체배지에서 종균배양한후, pH 4.5-6.5 및 온도 25-35℃로 3-10일간 배양하여 목질진흙버섯의 균사체를 대량으로 배양한다.

상기와 같이 수득한 목질진흙버섯의 균사체 배양물에 정제수를 가하여 열수추출한후, 여과하여 균사체를 제거하고 열수추출물을 회수한후, 그것을 한외여과장치 등을 이용하여 농축하고 동결건조시켜 항산화, 미백, 보습, 면역증강 및 항여드름 작용을 나타내는 목질진흙버섯 추출물(PM-741)을 수득한다.

또한 상기와 같이 수득한 목질진흙버섯의 균사체 배양물에 정제수를 가하여 열수추출한후, 여과하여 균사체를 제거하고 열수추출물을 회수한후, 그것을 한외여과장치 등을 이용하여 농축하고, 다시 물을 가하고 다이아필트레이션하여 저분자물질을 제거한후 재농축하고 동결건조시켜 항산화, 미백, 보습, 면역증강 및 항여드름 작용을 나타내는 목질진흙버섯 추출물(PM-742)을 수득한다.

한편, 분리해낸 목질진흙버섯의 자실체에 정제수를 가하여 열수추출한후, 여과하여 자실체를 제거하고 열수추출물을 회수한후, 그것을 한외여과장치 등을 이용하여 농축하고 동결건조시켜 항산화, 미백, 보습, 면역증강 및 항여드름 작용을 나타내는 목질진흙버섯 추출물(PF-711)을 수득한다.

또한 분리해낸 목질진흙버섯의 자실체에 정제수를 가하여 열수추출한후, 여과하여 자실체를 제거하고 열수추출물을 회수한후, 그것을 한외여과장치 등을 이용하여 농축하고, 다시 물을 가하고 다이아필트레이션하여 저분자물질을 제거한후 재농축하고 동결건조시켜 항산화, 미백, 보습, 면역증강 및 항여드름 작용을 나타내는 목질진흙버섯 추출물(PF-712)을 수득한다.

본 발명에 따른 목질진흙버섯 추출물은 화장료 조성물 또는 식품 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다. 즉 본 발명의 목질진흙버섯 추출물은 피부노화 억제, 보습성 유지, 미백, 면역증강 및 항여드름용 화장료 조성물로 사용될 수 있다. 이때, 목질진흙버섯 추출물은 전체 화장료 조성물에 대하여 0.01-0.5w/w%로 함유되는 것이 바람직하나, 특히 치료목적으로 사용하고자 할때에는 1.0w/w%까지 함유될 수 있으며, 화장수, 화장유, 로션, 크림, 팩 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다. 화장료로 사용되어왔던 기존의 고분자물질들이 대부분 보습 작용만을 강조한 측면이 있었음에 비하여, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 보습 작용이외에도, 항산화, 미백, 면역증강 및 항여드름 작용 등의 복합적 작용을 나타낼 수 있다. 따라서 본 발명의 화장료 조성물을 이용하면 보습 작용에 의하여 피부에 생생함과 탄력성을 제공하고, 피부 노화를 억제시키며, 미백 작용에 의하여 피부미용 효과도 갖게 한다. 또한 본 발명의 목질진흙버섯 추출물은 건강보조식품을 비롯한 다양한 식품 조성물의 유효성분으로도 사용될 수 있다.

[실시예]

이하 본 발명을 바람직한 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명하고자 하나, 이것은 본 발명의 구성 및 효과의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 어떤식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.

[실시예 1] 목질진흙버섯의 자실체 및 균사체의 분리

강원도 횡성군 태기산에서 자연산 목질진흙버섯을 채집하였다. 그의 자실체로부터 항산화, 보습 및 면역증강 작용이 우수한 목질진흙버섯(Phellinus linteus IY003, 수탁번호 제 KCTC 8927P 호)을 선별해내고 동시에 자실체로부터 균사체를 분리하여, 이후의 액체배양에 사용하였다.

[실시예 2] 목질진흙버섯 균사체의 액체배양

목질진흙버섯을 보존하기 위한 배지로는 감자 포도당 한천배지를 사용하였다. 목질진흙버섯 균사체를 생산하기 위한 배지로는 포도당 0.1-5%, 효모추출물 0.05-3%, 펩톤 0.05-3%, 황산마그네슘 0.05%, 인산제2수소칼륨 0.046%, 인산제1수소칼슘 0.01%, 미량원소로서 FeCl₃·6H₂O 0.01%, MnCl₂·4H₂O 0.0072%, CuSO₄·5H₂O 0.0025% 및 ZnCl₂0.004%를 함유하는 액체배지를 사용하였다. 이때 pH는 4.5-6.5로 조절하였다. 상기한 생산용 배지 100㎖가 담긴 500㎖용 삼각 플라스크를 121℃에서 15분간 멸균하고, 보존배지내에 보존된 균사의 일부를 분리해내어 접종한후 25-35℃에서 7일간 배양하였다. 이 배양액을 200㎖의 생산용 배지를 가한 1ℓ 삼각 플라스크에 접종하여 1차 종균으로 하였다. 그런 다음 30ℓ의 생산용 배지를 가한 50ℓ 발효조에 1차 종균을 접종하여 2차 종균으로 하였다. 그런 다음 500ℓ의 발효조에 300ℓ의 생산용 배지를 가하여 121℃에서 20분간 멸균하고, 2차 종균을 접종하여 25-35℃에서 3-10일간 배양하였다.

[실시예 3] 목질진흙버섯의 균사체 추출물의 제조

실시예 2에서 수득한 목질진흙버섯 균사체를 하기의 방법으로 추출한 후, 분리정제하였다. 즉, 목질진흙버섯 균사체의 총 배양액에 1배량의 정제수를 가하고 100℃에서 3시간동안 열수추출하였다. 그후 여과하여 균사체를 제거하고 상등액을 수획하였다. 이 상등액을 한외여과장치를 이용하여 ¼배량으로 농축한후, 그 일부를 동결건조하여 목질진흙버섯의 균사체 추출물 PM-741을 수득하였다. 나머지 농축액에는 다시 4배량의 물을 가하고 다이아필트레이션을 행하여 ⅛배량으로 농축한후 동결건조하여 목질진흙버섯의 균사체 추출물 PM-742를 수득하였다.

[실시예 4] 목질진흙버섯의 자실체 추출물의 제조

실시예 1에서 분리해낸 목질진흙버섯 자실체 100g에 20배량의 물을 가해 100℃에서 3시간 열수추출한 후 여과하여 자실체를 제거하고 상등액을 수획하였다. 이 상등액을 한외여과장치를 이용하여 ¼배량으로 농축한 후, 그 일부를 동결조하여 목질진흙버섯의 자실체 추출물 PF-711을 수득하였다. 나머지 농축액에는 4배량의 물을 가하고, 다이아필트레이션을 행하여 ⅛배량으로 농축한후 동결건조하여 목질진흙버섯의 자실체 추출물 PF-712를 수득하였다.

[실험예 1] 항산화 시험 1 - 지질 과산화 억제 시험

1. 마이크로좀(Microsomes)의 조제

마이크로좀을 분리하기 위하여, 24시간 절식시킨 랫트(SD, 200∼250g)를 펜토바비탈(pentobarbital) 40mg/kg을 사용하여 마취시킨 후, 쥐의 복부를 개방하고 50㎖용 주사기로 50mM 트리스(Tris)-Cl 완충액(pH 7.4) 30㎖를 문맥(portal vein)에서 하대정맥으로 혈액이 흘러나오도록 관류시켰다. 그후, 간을 적출하여 50mM 트리스-Cl/150mM KCl 완충액으로 세척하고 세절하여, 폴리트론(polytrone)을 이용하여 빙냉하에서 균질화시켰다. 또한 원심분리를 8,000×g에서 20분간 실시한 후, 상등액을 취하여 다시 105,000×g에서 60분동안 4℃를 유지하면서 초원심분리하였다. 그후, 침전된 마이크로좀을 74.5mM 트리스-Cl/154mM KCl 완충액(pH 8.0)으로 현탁시켜 단백질의 농도가 20mg/㎖ 되도록 조정하여 -20℃에서 보관하면서 사용하였다.

2. 지질 과산화의 유도

마이크로좀을 이용한 지질 과산화반응의 유도는 키소(Kiso) 등(Planta Med., 50, 298, 1984)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다.

1) 아스코르베이트/Fe²⁺에 의한 지질 과산화의 유도

83.5mM의 KCl, 37.2mM의 트리스-HCl 완충액(pH 8.0), 0.2mM의 아스코르베이트, 10μM FeSO₄·6H₂O, 마이크로좀 현탁액(단백질로 2mg) 및 적량의 시료를 가하고 혼합액을 최종 1㎖가 되게 하여 37℃에서 20분간 반응시켰다.

2) ADP/Fe³⁺/NADPH에 의한 지질 과산화의 유도

83.5mM의 KCl, 37.2mM의 트리스-HCl 완충액(pH 8.0), 1mM의 ADP, 10μM FeCl₃·7H₂O, 0.2mM NADPH, 마이크로좀 현탁액(단백질로 2mg) 및 적량의 시료를 가하고 혼합액을 최종 1㎖가 되게 하여 37℃에서 20분간 반응시켰다.

3) CCl₄/NADPH에 의한 지질 과산화의 유도

83.5mM의 KCl, 37.2mM의 트리스-HCl 완충액(pH 8.0), 10mM의 CCl₄, 2mM의 NADPH, 마이크로좀 현탁액(단백질로 2mg) 및 적량의 시료를 가하여 최종 용량이 1㎖가 되게 조정한 후 37℃에서 20분간 반응을 시켰다.

3. 과산화 지질의 정량

반응이 완료된 후, 지질 과산화 정도는 오카와(Ohkawa) 등(Anal. Biochem., 95, 351, 1979)의 방법에 의하여 정량하였다. 즉 반응이 끝난 각각의 시험관에 8.1% SDS 0.2㎖, 0.27M HCl이 함유된 20% 아세트산 용액 1.5㎖ 및 0.8% TBA 1.5㎖을 가하고 pH가 약 3.5가 되도록 NaOH를 가하여 총 반응용량이 5㎖이 되도록 조정하였다. 그런후 95℃에서 60분동안 발색시키고, 흐르는 물로 냉각시키고, n-부탄올-피리딘(15:1, v/v) 혼합액 5㎖을 가하고 격렬히 흔들어 주었다. 3800rpm에서 10분동안 원심분리하고 상등액을 취하여 532nm에서 흡광도(OD)를 측정하였다. 표준물질로 1,1,3,3-테트라메톡시프로판(1,1,3,3-tetramethoxypropane(TMP))을 이용하여 검량선을 작성함으로써 시료의 말론디알데히드[malondialdehyde(MDA)]의 양을 측정하였다. 또한 지질 과산화 억제정도(%)는 (대조군의 MDA값-시료의 MDA값)/대조군의 MDA값 × 100으로 계산하여 나타내었다.

실시예 3에서 수득한 균사체 배양물의 추출물(PM741, PM742) 및 실시예 4에서 수득한 자실체 추출물(PF711, PF712)의 지질 과산화 억제활성을 조사하기 위하여, 간 마이크로좀에 시료를 가한 후, 생성된 MDA의 양을 측정하였고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

지질 과산화 억제효과

샘플	IC₅₀(㎍/㎖)
샘플	아스코르베이트/Fe²⁺	ADP/Fe³⁺/NADPH	CCl₄/NADPH
PF-711	447.6	232.9	미시험
PF-712	120.5	35.7	미시험
PM-741	212.5	93.9	미시험
PM-742	111.8	37.6	1838.0
비타민 E	미시험	〉2000	미시험

아스코르베이트/Fe²⁺반응계에서의 IC₅₀은 목질진흙버섯의 자실체 추출물 PF-712와 균사체 배양물의 추출물 PM-742의 경우 각각 120.5㎍/㎖과 111.8㎍/㎖로 나타났다. ADP/Fe³⁺/NADPH 반응계에서의 IC₅₀은 PF-712와 PM-742는 각각 35.7㎍/㎖과 37.6㎍/㎖로 나타났다.

[실험예 2] 항산화 시험 2 - OH기 제거 시험

실시예 3에서 수득한 균사체 배양물의 추출물 및 실시예 4에서 수득한 자실체 추출물의 OH기의 제거 효과를 아루오마(Aruoma) 등(Method in Enzymology, 223, 57, 1994)의 방법에 따라 2-데옥시리보스 방법으로서 하이드록시 래디칼(OH·)에 의한 2-데옥시리보스의 단편화(fragmentation)를 유발하는 방법을 사용하여 측정하였다. 즉 인산칼륨 완충액(20mM, pH 7.4), 2-데옥시리보스(2.87mM), 시료, 과산화수소(2.8mM), EDTA(0.1mM)에 착화합물시킨 염화철(ferrus chloride)(0.02mM) 및 아스코르베이트(0.1mM)를 첨가하여 반응을 개시하였다. 이것을 항온 수조에서 37℃로 1시간동안 반응시켰으며, 반응 종료후 5.6% TCA 0.5㎖와 2% TBA(0.05M NaOH에 용해시킨 것) 0.5㎖를 첨가하여 100℃에서 20분간 발색시켰다. 여기에 부탄올:피리딘(15:1, v/v) 3㎖를 가하여 혼합하고 원심분리한 후, 그중 상등액을 취하여 532nm에서 흡광도를 측정하였다. 50% 억제농도(IC₅₀)를 저해효과의 지표로 사용하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

하이드록실기 제거효과

샘플	IC₅₀(mg/㎖)	비고
PF-711	4.38
PF-712	0.71
PM-741	1.20
PM-742	0.68
Morus alba Ex.	4.47	상백피 열수추출물
만니톨	1.66

목질진흙버섯의 자실체와 균사체 배양물의 추출물인 PF-712와 PM-742의 OH기 제거효과에 대한 IC₅₀은 각각 0.71mg/㎖과 0.68mg/㎖로 나타났다.

[실험예 3] 항산화 시험 3 - 자유기 제거 시험

실시예 3에서 수득한 균사체 배양물의 추출물 및 실시예 4에서 수득한 자실체 추출물의 자유기 제거효과를 우치야마(Uchiyama) 등의 방법에 따라 1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질[1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)]을 이용하여 측정하였다. 즉 0.1M 아세트산 완충액(pH 5.5) 1㎖, 각 시료 0.1㎖, DW 0.9㎖ 및 0.5mM DPPH(에탄올에 용해시킨 것) 0.5㎖을 가하여 총량을 2.5㎖로 하여 실온에서 30분간 반응시킨후, 517nm에서 흡광도의 감소량을 측정하였다. 자유기 저해(Free radical inhibition)(%) = [1-(블랭크-샘플)/대조군] × 100으로 나타내었으며, DPPH의 농도가 50% 감소하는데 필요한 시료의 농도(IC₅₀)으로 나타내었다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

자유기 제거효과

표본	농도(㎍/㎖)	자유기 저해율(FRI,%)	IC₅₀(㎍/㎖)
PF-711	400	18.7
PF-711	200	11.2
PF-712	400	65.2
PF-712	200	45.7
PM-741	400	22.1
PM-741	200	8.9
PM-742	400	60.0	235.3
PM-742	200	49.2	235.3
아스코르베이트	400	30.4
아스코르베이트	200	27.8

그 결과 자실체와 균사체 배양물의 추출물은 서로 유사한 결과를 보였으며, 저분자물질보다 고분자물질에서 효과가 우수한 것으로 나타났다.

[실험예 4] 미백 시험

실시예 3에서 수득한 균사체 배양물의 추출물 및 실시예 4에서 수득한 자실체 추출물의 미백효과를 이시하라(Ishihara) 등(J. Antibiot., 44, 25, 1991)의 방법을 이용하여 측정하였다. 즉 적정량의 검체 15㎕를 96-웰 플레이트에 가하고, 0.1M 인산 완충액(pH 6.5) 150㎕, 1.5mM L-티로신 용액 25㎕, 2,100 U/㎖에 해당하는 버섯 티로시나아제(0.05M 인산 완충액, pH 6.5) 7㎕를 가하여, 30℃에서 10분간 반응시킨후, 생성되는 도파크롬(dopachrome)의 양을 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 티로시나아제에 대한 저해율(%)은 하기 식에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 효소활성 저해율 50%에 달하는 저해물질의 농도로 결정하였다.

저해율(%) = (D-C)-(B-A) / (D-C) × 100

A: 저해제를 넣은 것의 반응전 흡광도

B: 저해제를 넣은 것의 반응후 흡광도

C: 저해제를 넣지 않은 것의 반응전 흡광도

D: 저해제를 넣지 않은 것의 반응후 흡광도

그 결과를 표 4에 나타내었다.

티로시나아제 저해효과

샘플	IC₅₀(㎍/㎖)	비고
PF-711	1218.8	자실체 추출물
PF-712	212.3	자실체 추출물
PM-741	633.4	균사체 배양물 추출물
PM-742	203.5	균사체 배양물 추출물
알부틴	135.3	미백화장품 원료
코지산	6.5	미백화장품 원료

[실험예 5] 항균 시험

실시예 3에서 수득한 균사체 배양물의 추출물 및 실시예 4에서 수득한 자실체 추출물의 여드름균에 대한 항균효과를 P. acnes ATCC 11827, P. acnes ATCC 11828 및 P. acnes ATCC 6919 등의 균주를 이용하여 측정하였다.

항균효과

샘플	MIC(mg/㎖)
샘플	P. acnes ATCC 11827	P. acnes ATCC 11828	P. acnes ATCC 6919
PF-711	〉20.0	〉20.0	〉20.0
PF-712	20.0	20.0	20.0
PM-741	20.0	20.0	20.0
PM-742	20.0	20.0	20.0
CFX(㎍/㎖)	0.2	0.790	0.790
DMSO(%)	100.0	100.0	100.0

DMSO: 최종 10%, CFX: 세포탁심(Cefotaxime)(Claforan)

MIC: 최소저해농도(Minimum inhibitory concentration)

여드름균에 대한 항균효과는 일반적으로 생약물질에서 얻은 고분자 다당류들의 MIC 치가 약 100mg/㎖ 이상임을 고려할 때, 본 발명의 추출물에서의 MIC 치가 약 20mg/㎖으로 나타난 것은 목질진흙버섯의 자실체와 균사체 배양물 유래 물질들이 다른 천연물질들에 비하여 여드름균에 대해 비교적 높은 항균력을 갖는 것을 보여주는 것이다.

[실험예 6] 면역증강 시험

실시예 3에서 수득한 균사체 배양물의 추출물 및 실시예 4에서 수득한 자실체 추출물이 면역능에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 보체(complement) 활성을 이 등(한국균학회지, 18, 145-148, 1990)의 방법을 변형하여 측정하였으며, 실험의 정확성을 기하기 위하여, 보체와 헤모라이신(hemolysin)에 대한 활성 역가를 측정하여 실험에 이용하였다. 시험관에 150㎕의 GVB²⁺완충액(0.15mM CaCl₂, 0.5mM MgCl₂, 1.8mM 소듐 바비탈(sodium barbital), 3.1mM 바비튜릭 애시드(barbituric acid), 141mM NaCl 및 0.1% 젤라틴(pH 7.4)과 시료 50㎕(50㎍/㎖)를 가한 다음, 100U/㎖로 조정된 기니아 피그 보체 50㎕를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시킨후, GVB²⁺완충액을 가하여 보체의 최종농도가 1유닛/㎖이 되게 조정하였다. 조정된 보체 혼합물을 1.0유닛/㎖, 1.2유닛/㎖ 및 1.6유닛/㎖이 되게 각 시험관에 분주한후 여기에 항-양 헤모라이신(antisheep hemolysin)(2MHU/㎖)과 동량의 양 적혈구 세포(sheep red blood cell, SRBC) 5×10⁸세포를 혼합하여 실온에서 30분간 감작시킨 감작(sensitized)-SRBC 2㎖씩을 가하고, GVB²⁺완충액으로 최종 용량을 5㎖로 조정하여 37℃의 수욕조에서 60분간 반응시켰다. 70㎕의 0.5M EDTA를 가하여 반응을 중단시킨 다음 400×g에서 5분간 원심분리하여 상등액을 얻은 다음 541nm에서 흡광도를 측정하였다. 항보체 활성은 대조군 대비 총보체 용혈율(50% of total complement hemolysis, TCH₅₀)의 저지율(inhibition of TCH₅₀, ITCH₅₀%)로 나타내었으며, 그 결과를 표 6에 나타내었다.

보체활성화효과

샘플	ITCH₅₀(%)	비고
PF-711	6.8
PF-712	14.6
PM-741	3.1
PM-742	28.6
만난(Mannan)	27.6	효모 세포벽 다당류

표 6에 나타낸 바와 같이, 목질진흙버섯의 자실체와 균사체 배양물로부터 추출한 PF-712와 PM-742의 보체활성화효과는 각각 14.6%와 28.6%였다. 즉 항산화효과와 미백효과가 높았던 PM-742가 가장 우수한 보체활성화 효과를 나타내었다.

[실험예 7] NO 생성 시험

실시예 3에서 수득한 균사체 배양물의 추출물 및 실시예 4에서 수득한 자실체 추출물이 대식세포로부터 NO를 생성하는 정도를 측정하기 위해서, 96-웰에 대식세포를 분주하고, 2시간동안 전 배양하여 비부착 세포를 제거하였다. 각 시료 및 대조물질은 각 웰에 10㎍/㎖ 농도로 가하여 37℃에서 5% CO₂하에서 24시간동안 배양한 후, 생성된 NO는 딩(Ding) 등의 방법(1988)에 따라 정량하였다. 즉, 100㎕의 배양액과 동량의 그리에스 시약(Griess reagent)(1% 설파닐아미드(sulfanilamide), 0.1% 나프틸렌 디아민 디하이드로클로라이드(naphthylene diamine dihydrochloride, 2.5% H₃PO₄)를 가하여 실온에서 10분동안 반응시킨후, 540nm에서 ELISA(Bio-Tek instrument, Inc. Ceres UV. HDi)를 이용하여 측정하였다. NO₂ ^-의 농도는 아질산나트륨(sodium nitrite)을 이용하여 얻어진 흡광도로부터 표준곡선을 작성하여 측정하였다. 발색반응시킨 후, NO(nitric oxide)의 분비능을 측정하였다. 그 결과를 표 7에 나타내었다.

NO 생성능

샘플	생성된 NO(μM)	비고
대조군(배지)	0.7
PF-711	0.5
PF-712	26.7
PM-741	0.7
PM-742	25.6
인터페론 감마(IFN)	23.4	면역활성 물질
리포폴리사카라이드(LPS)	25.1	면역활성 물질
IFN+LPS	20.3

표 7에 나타낸 바와 같이, 대조군에서는 0.7μM의 NO를 분비한데 비하여, 자실체와 균사체 배양물의 추출물인 PF-712와 PM-742는 각각 26.7μM과 25.6μM의 NO를 분비하였다.

본 발명에 따르면, 목질진흙버섯의 균사체를 대량으로 액체배양할 수 있고, 목질진흙버섯의 자실체 또는 액체배양에 의해 수득된 목질진흙버섯의 균사체 배양물을 열수추출한후 분리정제하여 목질진흙버섯 추출물을 수득할 수 있으며, 그 목질진흙버섯 추출물은 항산화, 미백, 보습, 면역증강 및 항여드름 작용을 나타내므로 화장료 또는 식품으로 유용하다.

Claims

포도당 0.1-5%, 효모추출물 0.05-3%, 펩톤 0.05-3%, 황산마그네슘 0.05%, 인산제2수소칼륨 0.046%, 인산제1수소칼슘 0.01%, 미량원소로서 FeCl₃·6H₂O 0.01%, MnCl₂·4H₂O 0.0072%, CuSO₄·5H₂O 0.0025% 및 ZnCl₂0.004%를 함유하는 것을 특징으로 하는 목질진흙버섯 (Phellinus linteus, 桑黃)의 균사체 배양용 액체배지 조성물.
목질진흙버섯의 균사를 포도당 0.1-5%, 효모추출물 0.05-3%, 펩톤 0.05-3%, 황산마그네슘 0.05%, 인산제2수소칼륨 0.046%, 인산제1수소칼슘 0.01%, 미량원소로서 FeCl₃·6H₂O 0.01%, MnCl₂·4H₂O 0.0072%, CuSO₄·5H₂O 0.0025% 및 ZnCl₂0.004%를 함유하는 액체배지에서 pH 4.5-6.5 및 온도 25-35℃로 3-10일간 배양하는 것을 특징으로 하는 목질진흙버섯 균사체의 배양방법.
목질진흙버섯의 자실체 또는 제 2 항에 따른 방법에 의해 수득된 목질진흙버섯의 균사체 배양물에 정제수를 가하여 열수추출한후 여과하여 열수추출물을 회수하고, 그 열수추출물을 농축한후 동결건조하거나, 농축한후 다이아필트레이션(diafiltration)하여 재농축하고 동결건조하여 수득되며, 항산화, 미백, 보습, 면역증강 및 항여드름 작용을 나타내는 것을 특징으로 하는 목질진흙버섯 추출물.
제 3 항에 있어서, 목질진흙버섯이 Pellinus linteus IY003(수탁번호 제 KCTC 8927P 호)인 것을 특징으로 하는 목질진흙버섯 추출물.
제 3 항에 있어서, 목질진흙버섯의 자실체에 정제수를 가하여 열수추출한후 여과하여 열수추출물을 회수하고, 그 열수추출물을 농축한후 다이아필트레이션하여 재농축하고 동결건조하여 수득되는 것을 특징으로 하는 목질진흙버섯 추출물.
제 3 항에 있어서, 제 2 항에 따른 방법에 의해 수득된 목질진흙버섯의 균사체 배양물에 정제수를 가하여 열수추출한후 여과하여 열수추출물을 회수하고, 그 열수추출물을 농축한후 다이아필트레이션하여 재농축하고 동결건조하여 수득되는 것을 특징으로 하는 목질진흙버섯 추출물.
제 3 항에 따른 목질진흙버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 3 항에 따른 목질진흙버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
목질진흙버섯의 자실체 또는 제 2 항에 따른 방법에 의해 수득된 목질진흙버섯의 균사체 배양물에 정제수를 가하여 열수추출한후 여과하여 열수추출물을 회수하고, 그 열수추출물을 농축한후 동결건조하거나, 농축한후 다이아필트레이션하여 재농축하고 동결건조하는 것을 특징으로 하는 항산화, 미백, 보습, 면역증강 및 항여드름 작용을 나타내는 목질진흙버섯 추출물의 제조방법.