KR101219683B1 - 아스퍼질러스 오라이제 및 황기를 발효시킨 곡류 입국의 타이로시네이즈 저해 활성을 가지는 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 코지산 고생산 균주 (KCCM 60345, Aspergillus oryzae) 접종과 약용 천연 소재 황기 첨가로 인한 약용 발효제 곡류 입국의 타이로시네이즈 저해 활성을 가지는 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 코지산 고생산 균주 (KCCM 60345, Aspergillus oryzae) 접종과 약용 천연 소재 황기 첨가로 인한 약용 발효제 곡류 입국의 타이로시네이즈 저해 활성을 가지는 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
세포 내에서 타이로시네이즈에 의해 타이로신으로부터 도파(dopa), 도파퀴논(dopaquinone)으로 변환되어 도파크롬(dopachrome) 등을 거처 생성되어 지는 멜라닌은 피부에 존재하여 자외선 등으로부터 신체를 보호하는 중요한 기능을 가지고 있다. 그러나 멜라닌이 과잉생산됨으로써 기미, 주근깨 등을 형성하고, 피부노화를 촉진하며, 피부암 유발에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있으며, 또한 과실류나 채소류등의 식품에서의 과잉 축적으로 인해 갈변화 현상을 일으키는 주요 원인으로 작용하기도 한다. 이미 멜라닌 생성 저해제로서는 파라-메톡시페놀(p-metoxyphenol), 하이드로퀴논(hydroquinone), 코지산(kojic acid), 알부틴(arbutin) 등이 사용되고 있으나, 이들은 활성이 약하거나 색소세포의 변성 또는 치사를 일으키거나 세포 본래의 기능을 손상시키는 등 부작용이 있는 경우도 있다(Biol . Pharm . Bull ., 32, 264-268 (2009)).
한편, 멜라닌 생성 억제를 목적으로 비타민 C 및 그 유도체 등이 사용되고 있으나, 이들 또한 저해활성이 낮다는 단점을 가지고 있다(J. Soc . Cosmet . Chem.,4 2, 361-368 (1991)).
따라서 소량으로도 멜라닌 생합성 저해활성을 나타내며, 멜라닌 생합성 저해를 나타내는 물질의 개발이 요구된다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 타이로시네이즈 저해 활성을 가지는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 타이로시네이즈 저해 활성을 가지는 피부 미백용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 타이로시네이즈 저해 활성을 가지는 피부 미백용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 Aspergillus oryzae KCCM 60345를 곡류에 접종하고 황기를 첨가하여 발효한 곡류 입국 추출물을 포함하는 타이로시네이즈 저해 활성을 가지는 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서 상기 발효는 4일에서 12일간 발효하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서 상기 곡류는 쌀, 밀, 또는 보리인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 Aspergillus oryzae KCCM 60345를 곡류에 접종하고 황기를 첨가하여 4일에서 12일간 발효한 쌀, 밀 및 보리로 구성된 군으로부터 선택된 곡류 입국 추출물을 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 Aspergillus oryzae KCCM 60345를 곡류에 접종하고 황기를 첨가하여 4일에서 12일간 발효한 쌀, 밀 및 보리로 구성된 군으로부터 선택된 곡류 입국 추출물을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 Aspergillus oryzae KCCM 60345를 곡류에 접종하고 황기를 첨가하여 4일에서 12일간 발효한 쌀, 밀 및 보리로 구성된 군으로부터 선택된 곡류 입국 추출물을 포함하는 피부 미백용 식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 a) Aspergillus oryzae KCCM 60345를 쌀, 밀 및 보리로 구성된 군으로부터 선택된 곡류에 접종하고 황기를 첨가하여 4일에서 12일간 발효하는 단계; 및 b) 상기 발효 입국을 물 또는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올로 구성된 군으로부터 선택된 알코올로 추출하는 단계를 포함하는 타이로시네이즈 저해 활성을 가지는 피부 미백용 조성물의 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명자들은 이 목적에 부합되는 코지산 고생산 균주(KCCM 60345, Aspergillus oryzae)와 황기를 첨가한 약용 발효제 쌀 입국로부터 타이로시네이즈 저해 활성을 확인하였다. 따라서 본 발명은 코지산 고생산 균주와 황기 첨가에 의한 쌀 입국 추출물의 타이로시네이즈 저해 활성에 관한 내용으로 기존에는 보고된 적이 없는 새롭고도 진보적인 천연물 유래 타이로시네이즈 저해 활성 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 우수한 타이로시네이즈 저해활성을 나타내는 추출물과, 이러한 활성을 확인 분리하는 방법에 관한 것이다.
KCCM 60345 (A. oryzae)과 황기(Astragali Radix ) 첨가한 쌀입국 추출물을 추출 분리하는 방법은 다음 단계를 포함한다:
1) 쌀에 KCCM 60345 (A. oryzae) 포자 0.1%를 접종하는 단계,
2) 쌀에 분말 상태의 황기(Astragali Radix ) 10%를 접종하는 단계,
3) 상기 쌀 입국을 발효시키는 단계,
4) 상기 쌀 입국을 동결 건조하여 보관, 가루상태로 분쇄하는 단계,
5) 쌀 입국 분말을 80 % 메탄올로 추출하는 단계 및
6) 추출물을 원심분리기를 이용하여 상등액을 얻는 단계로 이루어졌다.
KCCM 60345 (A. oryzae)와 황기(Astragali Radix)를 접종한 쌀 입국으로부터 쌀 입국 추출물 또는 그의 타이로시네이즈 저해 활성 측정 과정을 그 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.
먼저, 쌀에 전체 쌀 양의 0.1%의 포자상태의 KCCM 60345 (A. oryzae)과 10%의 분말상태의 황기(Astragali Radix) 을 접종한다. 접종된 쌀 입국을 30 ℃에 14일간 발효시킨 후, 2일 간격으로 회수하여, 동결건조 한다.
동결건조 된 쌀 입국을 분말상태로 쇄절하여, 1 g을 80 % 메탄올 5 ml에 24시간 환류추출한다. 그리고, 원심분리기를 통해 추출된 메탄올 상등액을 회수한다. 이상의 추출 공정에 의해 최종적으로 분리된 활성추출물은 타이로시네이즈 억제 효과가 있는 바,
따라서 본 발명은 상기 추출물이 함유된 피부미백제를 포함한다. 본 발명에서의 피부미백제는 의약품으로서 직접 사용할 수 있고, 화장품,식품 등에 함유되어 피부질환치료나 피부 미백효과를 달성할 수도 있으며, 또한 식품의 갈변 방지에도 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 피부미백제를 의약품으로 사용하는 경우, 상기 본 발명의 추출물을 임상적으로 이용시에는 약학적 분야에서 통상적인 담체와 함께 배합하여 약학적 분야에서 통상적인 제제, 예를 들면 정제, 캅셀제, 트로키제,액제, 현탁제 등의 경구투여용 제제; 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사시에 주사용 증류수로 제조하여 사용할 수 있는 즉시 사용형 주사용 건조분말 등의 형태인 주사용 제제로 제형화할 수 있다.
또한, 이러한 제제들은 국소 투여에 적절한 고체 또는 액체 부형제나 희석제를 이용하여 통상의 방법으로서 연고제와 같은 형태의 적절한 국소 투여 형태로 제 형화될 수 있다.
통상적인 담체를 상용하여 제조된 약학적 제제는 경구적으로 투여하거나, 비경구적으로 예를 들면 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적용할 수 있다. 본 발명의 추출물의 투여량은 환자의 나이, 상태 등에 따라 차이가 있으나, 일반적으로 성인에게 1일에 10 ～ 500 ㎎, 바람직하게는 50 ～ 300 ㎎의 양이 투여되도록 하며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 수회, 바람직하기로는 1회 내지는 6회 분할 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 피부미백제를 화장품으로 사용하는 경우, 본 발명의 추출물을 기초제품 화장료(화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩), 바디제품 화장료(바디 로션, 바디 오일, 바디 젤), 색조제품 화장료(화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스), 두발제품 화장료(샴푸, 린스, 헤어 콘디셔너, 헤어 젤) 등에 화장료의 건조중량에 대하여 0.05 ～ 10.0 중량% 함량으로 배합하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 추출물을 각종 식료품의 건조중량에 대하여 0.05 ～ 10.0 중량% 함량으로 배합하여 미백효과를 가지는 식품을 제조할 수도 있으며, 음료에 0.05 ～ 10.0 중량% 함량으로 배합하여 기능성 음료를 제조할 수 있다.
상기 본 발명의 추출물의 타이로시네이즈 저해 활성은 검체 5 μl를 마이크로플레이트(96 well microplate)에 넣고, 0.1 M 인산완충액(pH 6.5) 153 μl와 1.5 mM L-타이로신 용액 36 μl를 넣은 후, 효소용액(타이로시네이즈, 시그마제) 6 μl를 첨가하여 마이크로플레이트 리이더(Microplate reader, ALISA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 플레이트를 37oC에서 20분간 반응시킨 후 다시 490 nm에서 흡광도를 측정한 후 다음식에 의하여 타이로시네이즈 저해율(%)을 계산하였다.
A : 저해제를 넣은 것의 반응전 흡광도
B : 저해제를 넣은 것의 반응후 흡광도
C : 저해제를 넣지 않은 것의 반응전 흡광도
D : 저해제를 넣지 않은 것의 반응후 흡광도
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 균주 첨가와 황기첨가 추출물은 현재까지 보고되지 않은 기능성 발효 약용제로써 신규 기능성 생리활성 물질을 이용한 약제 및 식품 개발에 유용하다.
도 1. Aspergillus 균주의 (A)타이로시네이즈 저해 활성 탐색 및 (B)코지산 생성량 측정 결과에 대한 그래프로 x축은 균주번호를 나타낸다.
도 2. A. oryzae (KCCM 60345)균주 이용 황기 첨가시 쌀 입국의 발효시간별 타이로시네이즈 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3. A. oryzae (KCCM 60345)균주 이용시 쌀입국 내의 코지산 생성량 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2. A. oryzae (KCCM 60345)균주 이용 황기 첨가시 쌀 입국의 발효시간별 타이로시네이즈 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3. A. oryzae (KCCM 60345)균주 이용시 쌀입국 내의 코지산 생성량 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
실시예
1 :
타이로시네이즈
저해 활성 및
코지산
생성 우수 균주 스크리닝
Aspergillus sp.의 총 37 개 strain(표 1)의 에틸아세테이트 추출물에서 타이로시네이즈 저해 활성을 확인하였고, 그 결과 A. oryzae (KCCM 60345) 균주에서 약 100% (추출물 200 ug/ml)의 활성을 보였고, 코지산 생성량 또한 가장 우수하게 생성되는 것을 확인하였다(도 1a 및 b 참조).도 1에서는 37개의 Aspergillus균주 중 코지산 생성 균주가 있는 종만(A. flavus , A. oryzae) 선택하여 타이로시네이즈 저해 활성을 스크리닝한 것이다. 다른 여타의 종에서는 코지산 생성이 발견되지 아니하여 도시하지 않았다.
표 1은 타이로시네이즈 저해 활성 및 코지산 생성 우수 균주 스크리닝에 사용된 균주 및 구입처를 나타낸 표이다.
실시예
2 : 약용 발효제 쌀 입국 추출물 제조
상기 실시예 1에 따른 활성 결과 A. oryzae (KCCM 60345) 균주를 선별, 이를 쌀 입국에 적용하였다. 쌀에 0.1 %의 A. oryzae (KCCM 60345) 종균과 10%의 분말 상태의 황기( Astragali Radix)를 접종 배양하여 생산된 쌀 입국을 24 시간 동결 건조하였다. 건조된 쌀 입국을 쇄절하고 80% 메탄올로 14 시간 동안 환류추출하여 2500 RPM, 5 분동안 원심분리하여 상등액을 회수하여, 쌀 입국의 추출물을 얻었다.
실시예
3 : 물질의
역가
상기 실시예 2에 따른 쌀 입국으로부터 얻은 추출물로부터 각각에 대해서 타이로시네이즈 저해 활성을 조사하였고, 그 결과 상기 활성 추출물은 발효 4일을 기준으로 KCCM 60345 (A. oryzae) 접종 쌀 입국 1.6 mg에서 40.8%, KCCM 60345 (A. oryzae)와 황기 (Astragali Radix) 접종 쌀 입국 1.6 mg에서 52.4% 을 나타내었다. 본 발명자 연구실 조건에서 타이로시네이즈 저해활성을 조사한 결과 다음 표와 같은 값을 나타내었다.(표 2)
| 쌀 입국 시료 (1.6 mg) | 타이로시네이즈 저해 활성 (%) | |||||||
| 발효0일 | 발효 2일 |
발효 4일 |
발효 6일 |
발효 8일 |
발효 10일 |
발효 12일 |
발효 14일 |
|
| KCCM60345 (A.oryzae)균주 접종 | 4.9 ± 4.0 |
22.2± 2.4 | 40.8± 2.4 | 35.0± 8.6 | 34.0± 2.4 | 32.1± 10.0 | 40.4± 7.4 | 35.2± 8.8 |
| KCCM60345균주와 황기 첨가 | 2.6 ± 3.0 |
26.9± 9.1 | 52.4± 8.0 | 50.2± 9.8 | 54.6± 9.1 | 51.7± 8.0 | 55.9± 8.9 | 48.2± 6.6 |
| Kojic acid (50 uM) |
62.3 ± 2.1 | |||||||
상기 표 2는 타이로시네이즈 저해 활성을 비교한 표이다.
상기 표 2에 따르면, 상기 추출물은 타이로시네이즈 저해활성을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
한편 입국 제조시 14일 이상 발효가 진행되는 경우 그 신맛이 강해지며 입국 표면의 견고성이 약해져 입국 자체로서의 활용가치가 떨어지므로 최대 14일까지만 발효된 입국을 사용하였다. 또한 코지산의 단일물질에서의 저해 활성과 쌀 입국 내에서의 총체적 추출물의 활성 비교는 추출물 내의 코지산 함량을 동일하게 컨트롤 할 수 없으므로 동일 농도에서의 활성 비교가 불가능하다. 따라서 단일물질인 코지산의 활성보다 본 발명의 추출물의 활성이 더 높고 낮음을 설명하는 것은 어렵다.
또한 도 2는 A. oryzae (KCCM 60345)균주 이용 제조된 쌀입국의 타이로시네이즈 저해 활성을 나타낸 그래프이고, 도 3은 A. oryzae (KCCM 60345)균주 이용시 쌀입국 내에서의 코지산 생성량을 나타낸 것인데, 쌀입국의 코지산 생성량과 타이로시네이즈 저해 활성의 패턴이 유사한 것으로 보아 쌀입국의 타이로시네이즈 저해활성은 균주의 코지산 생성과 관련이 있다고 판단되어진다.
Claims (7)
- Aspergillus oryzae KCCM 60345를 곡류에 접종하고 황기를 첨가하여 4일에서 12일간 발효한 곡류 입국 추출물을 이용하여 인 비트로에서 타이로시네이즈 활성을 저해하는 방법.
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- 제 1항에서 상기 곡류는 쌀, 밀, 또는 보리인 것을 특징으로 하는 인 비트로에서 타이로시네이즈 활성을 저해하는 방법.
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