JPH11504225A - 組織を解離するための酵素組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 組織から細胞または細胞集団を分離するための酵素組成物およびその使用が開示されている。前記組成物は２種類のコラゲナーゼ酵素およびエンドプロテアーゼを含む。前記酵素組成物の総ＦＩＴＣカゼイン活性対コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの質量のヴンシュ単位活性の比は約８５：１乃至約３９００：１である。

Description

【発明の詳細な説明】 組織を解離するための酵素組成物発明の分野 本発明は、組織の再構成並びに生きている細胞および細胞集団の組織からの効 率的分離を可能にする、細胞外組織基質の酵素的解離のための組成物に関するも のである。発明の背景 組織を個々の細胞および細胞集団に酵素的に解離することは、検査、診断およ び治療等の幅広い用途に有用である。これら用途としては、種々の用途の様々な タイプの細胞（例えば小径の合成血管グラフトに播種（seeding）するための微 小血管内皮細胞、遺伝子治療・薬物毒性スクリーニングおよび体外肝補助装置の ための肝細胞、軟骨再生のための軟骨細胞、およびインスリン依存性真性糖尿病 治療のためのランゲルハンス島など）の分離が含まれる。酵素処理は、細胞外基 質蛋白質並びに細胞間の接触を維持する蛋白質を断片化するように作用する。コ ラーゲンは組織の超微細構造の主要蛋白質成分であるから、酵素コラゲナーゼは 所望の組織崩壊を実現するためによく用いられる。 ヒストリチクス菌（Clostridium histolyticum）に由来する種々の種類の粗細 菌コラゲナーゼが市販されており、組織から細胞および細胞集団を解離するため に使用される。細胞培養上澄液から誘導されるこれら粗コラゲナーゼは、一般に はプロテアーゼ酵素（コラーゲン分解活性および非特異的蛋白分解活性の両方を 示す）と非プロテアーゼ成分（例えば発酵副産物、媒質成分、色素、その他の酵 素類、例えばホスホリパーゼ、および内毒素など）との混合物を含む。 市販の粗コラゲナーゼの分析結果は、プロテアーゼおよび非プロテアーゼ成分 の濃度および比率の著しい変動を示している。このような組成的変動は、組織解 離プロトコルにおけるコラゲナーゼ製品の性能の変動となってあらわれ、したが ってロット間予測は不可能になる。この固有の活性変動性に加えて、市販コラゲ ナーゼの各ロットは、時の経過につれて活性および性能特性を失う。結局、組成 的変動に関連するこれらの問題に加えて、細胞収穫／組織解離プロトコルに粗コ ラゲナーゼを使用することは、細胞生存能力の回復、細胞数および細胞機能の点 で所望以下の結果をもたらすのが普通である。これらの問題は、それら細胞を移 植に使用すること、または細胞機能に与えるエフェクター分子の影響をモニター することが目的である場合に特に重要である。例えば、島の移植効率は一部分、 島の量およびそれらの生育能力に依存する。その上、回収された肝細胞の薬物解 毒機能は、肝組織解離および細胞分離中におきる細胞損傷によって著しく阻害さ れる。回収細胞の大部分の用途では、最適細胞性能を得るために、回収細胞およ び細胞集団に対する損傷を最小にすることが重要である。 当業者は、効率的細胞分離のためには組織解離プロトコルに用いるプロテアー ゼ酵素の確実かつ予測可能の活性が重要であることを理解している（すなわち、 細胞の完全性の維持、より大きい細胞集団およびより多くの細胞または細胞集団 の回収）。特に、コラゲナーゼ組成物の純度、および好適には、決められた量の ヒストリチクス菌コラゲナーゼ・クラスＩ（コラゲナーゼＩ）およびコラゲナー ゼ・クラスＩＩ（コラゲナーゼＩＩ）の両酵素が少なくとも２種類の中性プロテ アーゼと共に存在することが膵島の分離効率に影響を与えることがわかった。し かし、組織の速やかな分離、および生育可能細胞のより多量の回収をもたらす最 適酵素組成物を決定する必要性がいまだに存在する。発明の開示 本発明は、ヒストリチクス菌由来のコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを 含む決められた量の精製プロテアーゼと、酵素組成物の総ＦＩＴＣカゼイン活性 単位対コラゲナーゼＩプラス コラゲナーゼＩＩ質量のヴンシュ活性単位（Wunsc h units）の比を約８５：１乃至約３９００：１にするような量のエンドプロテ アーゼとを組み合わせるという方法で調製された酵素組成物を提供する。細胞分 離のための組織解離プロトコルに用いるとき、生成した上記酵素組成物は細胞外 基質の改善された、より速やかな解離をおこすようにはたらき、粗コラゲナーゼ 組成物を含む先行技術の酵素組成物を用いて収穫した細胞の数および生育力に対 して改善された生育力を有する所望細胞をより多量回収することができる。 本発明のもう一つの実施態様において、実質上ヒストリチクス菌由来のコラゲ ナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩ、およびエンドプロテアーゼからなる酵素組成 物が提供され、この酵素組成物においてはコラゲナーゼＩの質量 プラス コラゲ ナーゼＩＩの質量に対するコラゲナーゼＩＩの質量は約０.３乃至約０.６である 。ここで生成した上記酵素組成物もまた、細胞外組織基質のより速かな解離、お よびより多数の生育可能細胞の回収を可能にし、そのため従来公知の組成物より すぐれている。 本発明は、組織から生きている細胞を分離するための酵素組成物の製法であっ て、ヒストリチクス菌由来の既知量のコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩと 、酵素組成物の総ＦＩＴＣカゼイン活性を、酵素組成物の総ＦＩＴＣカゼイン活 性対酵素組成物におけるコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩ質量の総ヴンシ ュ活性単位の比が約８５：１乃至約３９００：１であるようなレベルにまで高め るために十分な量のエンドプロテアーゼとを一緒にする段階を含んでなる製法を も提供する。発明の詳細な説明 本発明は、ヒストリチクス菌に由来するコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩ Ｉを、決められた量のエンドプロテアーゼと組み合わせると、ドナー器官組織か ら細胞を分離するために最適の活性プロフィールを有する新規の酵素組成物が得 られる、という発見に基づくものである。 より詳細に述べるならば、酵素組成物の総ＦＩＴＣカゼイン活性対前記組成物 におけるコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩ質量のヴンシュ活性単位の比が 約８５：１乃至約３９００：１であり、より好適には約１３０：１乃至約１４０ ０：１であるように上記組成物の諸成分を調節することによって調製されたコラ ゲナーゼ酵素組成物を用いて、細胞外組織基質の最適酵素分解およびそれに伴う 器官組織からの生育可能細胞および細胞集団の効率的遊離が実現することが発見 された。本発明の一実施態様において、ラット肝組織を効率的に解離して高収量 の肝細胞を与えるのに有用な酵素組成物が提供される。その酵素組成物は、酵素 組成物の総ＦＩＴＣカゼイン活性 対 前記組成物のコラゲナーゼＩおよびコラ ゲナーゼＩＩ質量のヴンシュ活性単位の比が約２５０：１乃至約６００：１で、 平均約４００：１になるような量のヒストリチクス菌由来のコラゲナーゼＩおよ びコラゲナーゼＩＩ、およびエンドプロテアーゼを含む。 本発明のもう一つの態様は、実質上コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩおよび エンドプロテアーゼからなる本発明の酵素組成物における２成分コラゲナーゼ酵 素の質量比の最適化である。組成物中のコラゲナーゼＩＩ対総コラゲナーゼ、す なわちコラゲナーゼＩＩ／（コラゲナーゼＩ＋コラゲナーゼＩＩ）の最適質量比 は約０.３乃至約０.６である。ヒストリチクス菌由来のコラゲナーゼＩおよびコ ラゲナーゼＩＩをこの質量比でエンドプロテアーゼと組み合わせるとき、生成す る酵素組成物は特に有用であり、従来公知のコラゲナーゼ酵素組成物を用いる組 織解離プロトコルに比べて、組織サンプルから細胞および細胞集団をより多く、 より高い生育能力、改善された再現性をもって回収する。ラット肝の解離に有用 な本発明の酵素組成物の一実施態様において、組成物中の総コラゲナーゼに対す るコラゲナーゼＩＩの質量比は約０.３５乃至約０.４５である。 本発明の酵素組成物はヒストリチクス菌由来のコラゲナーゼＩおよびコラゲナ ーゼＩＩを両方含む。コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩは、ヒストリチク ス菌粗コラゲナーゼから、熟練せる当業者には公知の種々の方法、例えば色素リ ガンド親和性クロマトグラフィー、ヘパリン親和性クロマトグラフィー、硫酸ア ンモニウム沈殿、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロ マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび金属キレート化クロマト グラフィーなどによって精製される。粗コラゲナーゼは多くのソースから市販さ れている（例えばベーリンガー・マンハイム・コーポレーション（Boehringer M annheim Corporation）からのコラゲナーゼＰ）。 本発明の酵素組成物のエンドプロテアーゼ成分は、セリンプロテアーゼ（例え ばトリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ）、システインプロテアーゼ（例 えばパパイン、キモパパイン）などを含むいかなるエンドプロテアーゼでもよい 。中性プロテアーゼ（例えばヒストリチクス菌中性プロテアーゼ、ジスパーゼ、 またはサーモリシン）がより好ましい（すべてＥＣ３.４.２４.４）。（ＥＣは 酵素委貢会分類のことである。ＥＣ３.４.２４.４は細菌性金属プロテアーゼの 分類である。） ６乃至１２グラムのラット肝を解離して肝細胞を回収するには、酵素組成物に おけるコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの質量の活性は約７.７乃至約６ ２.７ヴンシュ単位、好適には約１５.１乃至約５２.６ヴンシュ単位、より好適 には約２４乃至約３３ヴンシュ単位で、平均活性は約３０ヴンシュ単位である。 この酵素組成物の総ＦＩＴＣカゼイン活性は約５,５００乃至約２９,７００ＦＩ ＴＣカゼイン単位であり、好適には約７,０００乃至約２２,０００ＦＩＴＣカゼ イン単位、より好適には約８,５００乃至約１４,５００ＦＴＴＣカゼイン単位で 、平均活性は約１２,０００ＦＩＴＣカゼイン単位である。よって組成物のＦＩ ＴＣカゼイン単位 対 組成物のヴンシュ単位の比は５,５００／６２.７乃至２９ ,７００／７.７または約８５：１乃至約３,９００：１の範囲であり、好適には ７,０００／５２.６乃至２２,０００／１５.１または約１３０：１乃至約１,４ ００：１、より好適には８,５００／３３乃至１４,５００／２４または約２５０ ：１乃至約６００：１で、平均活性比は１２,０００／３０または約４００：１ である。 肝細胞分離のための肝臓の解離に加えて、上記組成物は上皮脂肪を解離して微 小血管内皮細胞を分離するために有用である。上記組成物は膵臓細胞の解離、火 傷および潰瘍除去のための局所治療および創傷治癒、ペイロニー病の治療および 異常またはヘルニヤ化円板の再構成に有用であることも期待される。概して本発 明の組成物は、細胞除去または細胞外基質の変形が所望されるいかなる用途にも 使用できる。 或る用途では、酵素組成物は実質上内毒素を含まないのが好ましい。概してク ロストリパインはこの酵素組成物の性能に影響を与えないように見えるとはいえ 、この酵素組成物は実質上酵素クロストリパインも含まないのが好ましい。ヒス トリチクス菌由来の粗コラゲナーゼに存在するこれら不都合な成分は上記の精製 法の１つ以上を用いて精製コラゲナーゼＩおよびＩＩ成分と分離することができ る。 本発明を説明するためにここに用いる用語“実質上含まない”とは、言及され た不純物を組成物から排除する努力が行われる、または行われてきた場合のこと を意味し、そのような不純物が、もしも組成物中にあったとしても、ほんの痕跡 量しか存在せず、すなわち一般的には２重量％以下、より一般的には１重量％以 下、そして少なくとも組成物の凝集機能に影響を与える量以下であることを意味 する。 本発明の酵素組成物は好適に精製された酵素の特定活性単位数（すなわちコラ ゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩのヴンシュ単位）、または特定量を混合する ことによって調製できる。下記は、精製コラゲナーゼ成分類の特異的活性並びに 全酵素組成物の総活性（ＦＩＴＣ）を決定するために用いられたコラゲナーゼ、 中性プロテアーゼおよびクロストリパインの酵素アッセイである。熟練せる当業 者は、機能的に等価の酵素組成物類を決定、調製するためには、以下に開示する 試験法以外の酵素アッセイも用いられることを理解している。 コラゲナーゼ活性アッセイ コラゲナーゼ活性は、合成ペプチド基質を用い、ヴンシュ＆ハイドリッヒ（Wu nsch & Heidrich）の方法（Z．Physil Chem．１９６３；３３３：１４９）によ って測定した。これはコラゲナーゼ精製に熟練せる当業者には周知の標準的方法 である。基質としてヴンシュ−ペプチドを用いるコラゲナーゼＩの測定活性は一 般的には０.２乃至０.６単位（Ｕ）／ミリグラム（ｍｇ）の範囲で、より一般的 には０.３乃至０.５Ｕ／ｍｇであった。基質としてヴンシュ−ペプチドを用いる コラゲナーゼＩＩの測定活性は一般的には９.５乃至１３.５Ｕ／ｍｇの範囲で、 より一般的には１１乃至１３Ｕ／ｍｇであった。１ヴンシュ単位（Ｕ）の活性と は、２５℃、ｐＨ７.１において１分間に１マイクロモル（μｍｏｌ）を加水分 解する活性であると決められている。コラゲナーゼ活性アッセイに用いる試験法 を以下に説明する。 サンプル希釈緩衝液（１００ミリモル（ｍＭ）／リットル（ｌ）tris−（ヒド ロキシメチル）−アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７.１）：１.２１グラム（ｇ ）Ｔｒｉｓを脱イオン（ＤＩ）水に溶解した。１.０ノルマル（Ｎ）塩酸（ＨＣl ）でｐＨを７.１に調節し、容量をＤＩ水で１００ミリリットル（ｍｌ）に調節 した。 ＰＺ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ基質：各ブランクまたは 試験サンプルを２回づつ測定した。アッセイに必要な基質総量＝実施する各試験 のための基質２ｍｇと、余分の基質２ｍｇ。（例えば、２回づつ試験した２サン プル＋２ブランク管＝６アッセイ管。必要な基質の目標量は１４.０ｍｇである 。）秤取した総基質量を５０で割り、その基質を溶解するのに必要なメタノール のミリリットル数を決めた。計算量のメタノールを基質に加えた。その基質を渦 状に撹拌して徹底的に混ぜ合わせ、完全に溶解した。溶解した基質にサンプル希 釈緩衝液を加え、基質濃度が１ｍｇ／ｍｌになるような最終容量にした。 １００ｍＭ／ｌ 塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂）：ＣａＣｌ₂１.４７ｇ、式量（ ＦＷ）１４７、をＤＩ水に溶解した。容量をＤＩ水で１００ｍｌに調節した。 ２５ｍＭ／ｌクエン酸：クエン酸０.５２５ｇ、ＦＷ２１０.１、をＤＩ水に溶 解した。容量をＤＩ水で１００ｍｌに調節した。 アッセイ混合物：ＰＺ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ基質２ .０ｍｌと１００ｍＭＣａＣｌ₂０.４ｍｌを１２×７５ミリメーター（ｍｍ）試 験管に入れ、蓋をした。試験前にアッセイ混合物を水浴中で２５℃で平衡化した 。２回づつのブランクまたは試験サンプルの各々のために１本づつの管を用意し た。 抽出混合物：酢酸エチル５.０ｍｌおよび２５ｍＭ／ｌクエン酸１.０ｍｌを１ ６×１２５ｍｍ試験管に加えた。各試験管に蓋をした。２回づつのブランクまた は試験サンプルの各々に１本づつ管を用意した。 乾燥管：無水硫酸ナトリウム０.３５乃至０.４ｇを１６×１２５ｍｍ試験管に 加えた。各試験管に蓋をした。２回づつのブランクまたは試験サンプルの各々に １本づつの管を用意した。 アッセイ法：濃・希酵素サンプルはすべて、基質に加えるまで２℃から８℃に 保持した。全酵素組成物、またはその成分の１つ（例えばコラゲナーゼＩ、コラ ゲナーゼＩＩまたは中性プロテアーゼ）のサンプルをサンプル希釈緩衝液で、推 定サンプル活性によって０.０５乃至０.８ｍｇ／ｍｌの濃度範囲に希釈した。ア ッセイインキュベーション時間は、ブランクコントロール（サンプル希釈緩衝液 をブランクとして用いた）１００マイクロリットル（μｌ）をアッセイ混合物の 第１の管に加えた後に開始した。その後そのアッセイ混合物に蓋をし、徹底的に 混合し、２５℃の水浴に入れた。６０秒の間隔で次のブランクまたは試験サンプ ル１００μｌを同様な方法でアッセイ混合物の管に加えた。各アッセイ混合物を 、ブランクまたは試験サンプルを加えたときから１５分間（ｍｉｎ）２５℃でイ ンキュベートした。１５分のインキュベーション後、第１のブランクアッセイ混 合物０.５ｍｌを抽出混合物を含む管に移した。抽出混合物管に蓋をし、２０秒 間渦状に撹拌することによって徹底的に混合した。６０秒間隔で残りのブランク または試験サンプルを抽出混合物管に移し、同様にして混合し、各サンプルの総 インキュベーション時間が１５分になるようにした。有機相（上部）３ｍｌを各 抽出混合物からピペットで取り、乾燥管に移した。乾燥管に蓋をして混合し、室 温でヒュームフード中で３０乃至６０分インキュベートした。この時間中に管を 再び混合した。有機相をピペットで取り、石英キュベットに移し、２５℃で、温 度調節スペクトロフォトメーターを用いて各ブランクおよびサンプルの吸光度を ３２０ナノメーター（ｎｍ）で読んだ。 計算：Ａ₃₂₀＝サンプルの平均吸光度−緩衝液ブランクの平均吸光度。活性（ Ｕ／ｍｌ）＝（Ａ₃₂₀×２.５×５×希釈ファクター）／（２１×０.１０×０.５ ×１５）。簡単にすると、Ｕ／ｍｌ＝Ａ₃₂₀×０.７９×希釈ファクター。 Ｕ／ｍｌ比活性を各サンプルで下記の計算により算出した。 比活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ｕ／ｍｌ）／（ｍｇ／ｍｌ）。 中性プロテアーゼ活性アッセイ 中性プロテアーゼ活性は、トワイニングの方法（Anal．Biochem．１９８４； １４３：３０）の改良法によって、基質ＦＩＴＣ−カゼインからのトリクロロ酢 酸（ＴＣＡ）可溶性蛍光ペプチドの遊離によって測定した。蛍光ペプチドは励起 波長４９１ｎｍ、発光波長５２５ｎｍを用いて定量した。中性プロテアーゼであ るジスパーゼで測定されたＦＩＴＣ−カゼイン比活性の範囲は典型的には６００ 乃至１４００Ｕ／ｍｇで、より典型的には１１００乃至１４００Ｕ／ｍｇであっ た。中性プロテアーゼ、サーモリシン、で測定したＦＩＴＣ−カゼイン比活性の 範囲は典型的には３０００乃至６５００Ｕ／ｍｇで、より典型的には３５００乃 至６０００Ｕ／ｍｇであった。１単位の活性は、３７℃、ｐＨ７.５で、１分間 あたりのバックグラウンドを補正して１００,０００蛍光単位（カウント／秒） を発生する。中性プロテアーゼ活性アッセイに用いた試験法を以下に説明する。 サンプル希釈緩衝液（１００ｍＭ／ｌ トリス、１０ｍＭ／ｌ ＣａＣｌ₂、ｐ Ｈ７.５）：６.０６ｇトリスおよび０.７４ｇ ＣａＣｌ₂をＤＩ水に溶解した。 ｐＨを１.０Ｎ ＨＣｌで７.５に調節し、容量をＤＩ水で５００ｍｌに調節した 。 ＦＩＴＣ−カゼイン基質溶液（０.２５％ｗ／ｖ）：５０.０ｍｇＦＩＴＣ−カ ゼインをサンプル希釈緩衝液に溶解した。サンプル希釈緩衝液で容量を２０.０ ｍｌに調節した。 停止溶液（Quenching Solution）（５.０％ｗ／ｖ）：トリクロロ酢酸５.０ｇ をＤＩ水に溶解した。容量をＤＩ水で１００ｍｌに調節した。 中和溶液（５００ｍＭ／ｌ トリス；ｐＨ８.５）：Ｔｒｉｓ３０.３ｇをＤＩ 水に溶解した。ｐＨを１.０Ｎ ＨＣｌで８.５に調節し、容量をＤＩ水で５００ ｍｌに調節した。 アッセイ法：すべての濃・希酵素サンプルは基質に加えるまで２℃乃至８℃に 保持した。各ブランクまたは試験サンプルを２度づつ試験した。全酵素組成物か 、またはその成分の１つ（例えば、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、または 中性プロテアーゼ）のサンプルをサンプル希釈緩衝液で、推定サンプル活性によ って、１乃至５０マイクログラム（μｇ）／ｍｌ の濃度範囲に希釈した。希釈 したサンプル１０μｌを１.５ｍｌエッペンドルフ管中のＦＩＴＣ−カゼイン基 質溶液４０μｌに加え（ブランクコントロールとしてサンプル希釈緩衝液を用い た）、水浴中、３７℃で、撹拌しながら４５分間インキュベートした。管を水浴 から取り出し、停止溶液１２０μｌを加えた。管を渦状に撹拌し、室温で最低６ ０分間放置した。その後、それらの管を微量遠心分離器で１４,０００ｒｐｍで ２分間遠心分離した。上澄液５０μｌを取り、キュベット中の中和緩衝液２ｍｌ に加えた。キュベットに蓋をし、反転させながら溶液を混合した。その後蛍光を 測定した（励起波長４９１ｎｍ、発光波長５２５ｎｍ、スリット巾０.２ｎｍ） 。 計算：ＣＰＳ＝平均酵素サンプル蛍光−平均緩衝液ブランク蛍光。活性（Ｕ／ ｍｌ）＝（ＣＰＳ×０.１７ｍｌ×希釈ファクター）／（０.０５ｍｌ×０.０１ ｍｌ×４５ｍｉｎ×１００,０００）。簡単にすると、Ｕ／ｍｌ＝ＣＰＳ×０.０ ０００７５５×希釈ファクター。ＳＰＥＸ蛍光計の直線範囲は４０００から１０ ０,０００ＣＰＳまでである。 上記の中性プロテアーゼのアッセイに用いる基質カゼインは、トリプシン、ク ロストリパイン、ジスパーゼ、サーモリシン、および他の多くを含める種々プロ テアーゼ活性のための一般的基質としても役立つ。ここで説明された総酵素組成 物におけるＦＩＴＣ−カゼイン活性のための好適範囲を測定し、最終的酵素組成 物の活性単位と決めたが、上記好適範囲は混合前に単独で測定した中性プロテア ーゼ成分の実際の単位ではなかった。 クロストリパイン活性アッセイ クロストリパイン活性はホワイテカー（Whitaker）およびベンダー（Bender） の方法（J．Am．Chem．Soc．１９６５年；８７巻：２７２８ページ）の変法によ り、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）のエステル分 解によって測定された。クロストリパインはジチオスレイトール（ＤＴＴ）の ような還元剤によって活性化されるシステインプロテアーゼである。測定クロス トリパイン活性はＤＴＴ活性化酵素とＤＴＴ未処理酵素との差である。上記の活 性は１.８ｍＭ ＢＡＥＥを用いて発生させた。１単位は２５℃、ｐＨ７.６にお ける１分間あたり１μｍｏｌ ＢＡＥＥの加水分解と定義される。クロストリパ イン活性アッセイの試験法を下に説明する。 燐酸緩衝液（７５ｍＭ／ｌ）：一塩基性燐酸ナトリウム（ＮａＨ₂ＰＯ₄）１. １７ｇをＤＩ水に溶解した。容量をＤＩ水で１００ｍｌに調節し、“溶液Ａ”と ラベルした。二塩基性燐酸ナトリウム（Ｎａ₂ＨＰＯ₄）１.０７ｇをＤＩ水に溶 解した。溶液をＤＩ水で１００ｍｌに調節し、“溶液Ｂ”とラベルした。溶液Ｂ のｐＨ値を溶液Ａで７.６に調節した。 ＤＴＴ溶液（７.５ｍＭ／ｌ）：ジチオスレイトール（ＤＴＴ）２８.９ｍｇを ＤＩ水に溶解し、容量をＤＩ水で２５ｍｌに調節した。 ＢＡＥＥ溶液（１.８ｍＭ／ｌ）：ＢＡＥＥ１５.４ｍｇをＤＩ水に溶解し、容 量をＤＩ水で２５ｍｌに調節した。 １０Ｘ活性化溶液（１０ｍＭ／ｌ 酢酸カルシウム、２５ｍＭ／ｌ ＤＴＴ）： 酢酸カルシウム１７.６ｍｇとＤＴＴ３８.６ｍｇをＤＩ水に溶解し、容量をＤＴ 水で１０.０ｍｌに調節した。 １０Ｘブランク溶液（１０ｍＭ／ｌ 酢酸カルシウム）：酢酸カルシウム１７. ６ｍｇをＲＯ／ＤＩ水に溶解し、容量をＤＩ水で１０.０ｍｌに調節した。 サンプル調製：濃・希酵素サンプルすべては基質に添加するまで２℃乃至８℃ に保持された。コラゲナーゼＩは１０Ｘ活性化溶液とＤＩ水との組み合わせによ って希釈し、最終的サンプル濃度が１Ｘ活性化溶液中０.１５ｍｇ／ｍｌになる ようにした。（例えば、２６.７ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩサンプルをアッセイ のための０.１５ｍｇ／ｍｌに希釈するために、２６.７ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ Ｉサンプル１０μｌを、１０Ｘ活性化溶液１７８μｌプラスＤＩ水１５９２μｌ と混合する。）コラゲナーゼＩＩは１０Ｘ活性化溶液とＤＩ水との組み合わせに よって希釈し、最終的サンプル濃度が１Ｘ活性化溶液中０.４ｍｇ／ｍｌとなる ようにした。（例えば３１.２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＩサンプルを希釈して 、アッセイ用の０.４ｍｇ／ｍｌにするために、３１.２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ ＩＩサンプル１０μｌを１０Ｘ活性化溶液７８μｌプラス６９２μｌＤＩ水と混 合した。）そのサンプルをその後室温で４.５時間インキュベートした。 トリプシン ブランクの調製：トリプシン ブランクは、１０Ｘ活性化溶液の代 わりに１０Ｘブランク溶液を、そして１Ｘ活性化溶液の代わりに１Ｘブランク溶 液を用いてサンプル希釈を繰り返すことによって調製した。 分光光度測定試験（波長２５３ｎｍ、最終的容量０.９３ｍｌ、温度２５℃） ：トリプシン ブランク混合物および活性化されたサンプル混合物は下記を混合 することによって作った。 ４個の石英キュベットをスペクトロフォトメーター内に置いた。トリプシンブ ランク混合物０.９ｍｌをピペットで取り、最初の２個のキュベットの各々に入 れた。活性化サンプル混合物０.９ｍｌをピペットで取り、残る２個のキュベッ トの各々に入れた。吸光度を１.５分間読み、ブランク速度を確立した（ブラン ク速度は０.０１デルタ（Δ）Ａ₂₅₃／ｍｉｎを超えてはいけない）。その後、希 トリプシンブランク標本０.０３ｍｌをピペットで取り２個のトリプシンブラン クキュベットに入れ、希サンプル標本０.０３ｍｌを２個の活性化サンプルキュ ベットに取り、徹底的に混合することにより、反応が開始した。各キュベットを １.５分間読んで、反応速度を決定した。（ΔＡ₂₅₃／ｍｉｎは０.００７と０.０ ４０との間でなければならない。） 計算：各サンプルで、Ｕ／ｍｌ活性を下記のように計算した： Ｕ／ｍｌ＝［（ΔＡ／ｍｉｎ）×（希釈ファクター）×（０.９３）×（１００ ０）］／［（１１５０）×（０.０３）］、ここでΔＡ／ｍｉｎ＝ΔＡ₂₅₃／ｍｉ ｎサンプル−ΔＡ₂₅₃／ｍｉｎブランクである。簡単にすると、Ｕ／ｍｌ＝（Δ Ａ／ｍｉｎ）×（希釈ファクター）×（２６.９６）。各サンプルのＵ／ｍｇ比 活性は下記の計算によって算出した： 比活性（Ｕ／ｍｇ）＝（Ｕ／ｍｌ）／（ｍｇ／ｍｌ）。 例１：粗細菌性コラゲナーゼからコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの精製 市販の粗細菌性コラゲナーゼ（コラゲナーゼＰ、ベーリンガー・マンハイム・ コーポレーション）を出発材料として用いた。アミコン（Amicon）からの３種類 の色素リガンド親和性クロマトグラフィー支持体が良好に使用できることがわか った。これらの支持体はマトレックス（登録商標、グレース社（W．R．Grace & Co.））ゲル ブルーＡ、マトレックス ゲル レッドＡ、およびマトレックス ゲ ル グリーンＡであった。その他のメーカーからの匹敵する製品でも同様に行わ れることがわかった。活性の最大回収のために、全精製段階を２℃乃至８℃で行 った。 粗細菌性コラゲナーゼおよび選択した支持体をｐＨ６.０乃至７.５で低イオン 強度カルシウム含有緩衝液に対して平衡化した。精製効率、酵素安定性および樹 脂能力の最良の組み合わせのためには、ｐＨ範囲６.５乃至７.０が好ましい。こ れらのクロマトグラフィーでは、２０ｍＭ ４−［２−ヒドロキシエチル］−１ −ピペラジン エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）かまたは２０ｍＭ［ビス−（２ −ヒドロキシエチル）−イミノ］−トリス−（ヒドロキシメチル）メタン（ＢＩ Ｓ−トリス）、１ｍＭ 塩化カルシウムｐＨ７.０緩衝液を用いて、樹脂および酵 素を平衡化した。粗細菌性コラゲナーゼを溶解するために、凍結乾燥出発材料を 、選択した平衡化緩衝液に約４０ｍｇ／ｍｌのサンプル濃度で懸濁した。１乃至 １００ｍｇ／ｍｌの濃度を用い、約４０ｍｇ／ｍｌの濃度が酵素安定性および短 いサンプル担持時間の最良の組み合わせをもたらした。不溶性材料は遠心分離お よび／またはセルロース、酢酸セルロース、ポリエーテルスルフォンまたは他の 低蛋白質結合膜を通す濾過によって除去できる。 澄明サンプルを流速０.１乃至２.０センチメーター（ｃｍ）／ｍｉｎで樹脂に 添加した。精製は流速には敏感に反応しないから、生産スケジュールに最も良く 合う流速を用いる。樹脂のロットにより、１０乃至１５ｍｇの酵素がレッドＡお よびグリーンＡ樹脂に結合できる。それはこれら支持体１ミリリットルあたりコ ラゲナーゼＰ ２０乃至４０ｍｇの結合能力に相当する。ブルーＡ樹脂はこの能 力の約１／２を有する。サンプルをカラム上に注入した後、保持されない材料は カラムから平衡化緩衝液の使用によって洗い流される。この仕事のために通常は ２カラム乃至３カラムの容量の緩衝液で十分である。 結合した酵素は、塩および／またはｐＨ勾配を用いて樹脂から溶出することに よって回収した。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ 塩化カルシウムおよび４００ｍ Ｍ塩化ナトリウムｐＨ７.５、または２０ｍＭトリス、１ｍＭ塩化カルシウムお よび１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ９.０を含んでなる溶出緩衝液が、結合した 蛋白分解活性の大部分を回収するのに十分であった。 色素リガンドアフィニティーで精製したコラゲナーゼ酵素混合物を、ＳＰセフ ァロース・ファストフロー樹脂（登録商標、ファルマシア社、Pharmacia，Inc． ）を用いる強カチオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。使用前 に樹脂をナトリウム型からカルシウム型に変換した。これは樹脂を過剰の塩化カ ルシウム溶液で洗うことによって行われた。５００ｍＭ塩化カルシウム溶液の１ ／２カラム容量が充填樹脂をカルシウム型に変換するためには十分であった。充 填カルシウム型樹脂および色素リガンドアフィニティー精製酵素溶液を、ｐＨ６ .５乃至７.５に維持された低イオン強度カルシウム含有緩衝液に対して平衡化し た。これらのクロマトグラフィーでは、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ 塩化カル シウムｐＨ７.０緩衝液を平衡化のために用いた。平衡化色素リガンドアフィニ ティー精製酵素混合物をカルシウム型ＳＰセファロースＦＦカラムに、流速８ｃ ｍ／ｍｉｎまであげて添加した。大部分の精製では、流速２ｃｍ／ｍｉｎがプロ セスコントロールのスピードおよび容易さの点で最も便利であった。サンプルを 適用後、平衡化緩衝液を使用してコラゲナーゼ酵素を溶出した。通常、コラゲナ ーゼ酵素をすべてカラムから溶出するためには約２カラム容量の緩衝液で十分で あった。ひとたびコラゲナーゼ酵素がカラムから溶出されたならば、５乃至１ ００ｍＭ塩化カルシウム勾配を用いて結合蛋白質（主としてクロストリパインと 数種の非プロテアーゼ蛋白質）を溶出できる。これは１０乃至１５カラム容量の 直線勾配を用いて行われ、精製クロストリパインを回収し、または段階的勾配に よってカラムを清浄にし再使用できるようにする。平均１または２ミリグラムの クロストリパインが樹脂１ミリリットルに結合した。この樹脂をカルシウムで飽 和することが重要である。なぜならば、もしこれをしない場合は、調製中に樹脂 はカルシウムを酵素から取り、その結果酵素分解の増加および回収の低下がおこ る。その他の強カチオン交換樹脂もこの樹脂と同様に振る舞うことが期待される 。 カルシウム飽和ＳＰセファロースＦＦカラムからフラクションを通る、コラゲ ナーゼ酵素およびクロストリパイン中性プロテアーゼを含む流れをジエチルアミ ノエチル（ＤＥＡＥ）またはトリメチルアミノエチル（Ｑ）セファロース ファ ストフロー（Sepharose Fast Flow）（ファルマシア社）のいずれかを用いてア ニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。支持体も酵素サンプルも両方 共、ｐＨ６.５乃至９.０の低イオン強度カルシウム含有緩衝液に対して平衡化し た。このｐＨ範囲内では、両方の樹脂が同様な精製効率および回収率を与えた。 しかし、そのより簡単な再生および平衡化プロトコルのために、Ｑセファロース ＦＦ支持体を用いた。これらのクロマトグラフィーでは、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、 １ｍＭ塩化カルシウムｐＨ７.５緩衝液を用いた。平衡化コラゲナーゼ酵素プー ルを平衡化樹脂に８ｃｍ／ｍｉｎまでの流速で添加した（普通は１乃至２ｃｍ／ ｍｉｎ）。樹脂１ｍｌにつき平均２０乃至５０ｍｇの酵素混合物を投与した。混 合物を樹脂に投与した後、酵素を１乃至１００ｍＭ塩化カルシウム直線勾配によ って溶出した。２０乃至３０カラム容量勾配を用いた。コラゲナーゼＩＩ酵素は 約１５乃至２０ｍＭカルシウムで溶出し、コラゲナーゼＩは約３０乃至３５ｍＭ カルシウムで溶出し、中性プロテアーゼは約６０乃至７０ｍＭカルシウムで溶出 した。 回収された酵素を５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ塩化カルシウムｐＨ７.５緩衝液 に対して平衡化し、−２０℃以下で凍結保存した。この方法で精製し、これらの 条件下で保存したとき、コラゲナーゼ酵素は最低２年間は活性損失の形跡を示す ことなく保存できる。 この方法で調製したコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩはクロストリパイ ンを実質的に含まないことが判明した。我々の経験ではこの方法で調製した材料 はクロストリパイン活性が３ＢＡＥＥ単位以下であり、通常は１単位以下の活性 を有する。これは、両コラゲナーゼ成分共、非常に高い純度レベル（９８乃至９ ９％）を有することを意味する。下の表１は精製酵素成分の典型的酵素活性を示 す。 例２：肝臓から肝細胞を分離するための酵素組成物の調製 非常に高い溶解度を有するコラゲナーゼＩおよびＩＩを例１に記載のように調 製し、凍結溶液として保存した。しかしサーモリシンははるかに低い溶解度をも ち、特に２.０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度では非常に溶液になりにくい。この酵素の 再現性のある可溶化を達成するために、マツブラ（Matsubra）が発表した方法（ 酵素学における方法（Methods in Enzymology）、１９巻、６４２〜６５１ペー ジ）の変法を用いた。所望量の乾燥サーモリシン（ベーリンガー・マンハイム・ コーポレーション、Biochemicals cat．＃１６１５８６）の所望量を適した大き さの容器に入れた。十分高純度の水を加えて、８ｍｇ／ｍｌサーモリシン懸濁液 を作った。氷浴中で混合してサーモリシン結晶を水和させた後、十分に冷した希 水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを約１０.５に調節した。必要ならば、ｐＨ を１１.５まで高めて可溶化を完全にすることができる。完全に溶解したとき、 その溶液は明黄色〜明淡褐色を示した。それから希酢酸溶液を用いてこの溶液の ｐＨを８.５まで低めた。ＨＥＰＥＳ遊離酸もよく作用し、緩衝溶液に匹敵する 。この可溶化過程後、蛋白質濃度５乃至６ｍｇ／ｍｌのサーモリシン溶液を最低 数時間にわたって、０乃至８℃に維持することができる。 酵素組成物は、各酵素の特定量を混合することによって作った。各酵素量は２ ８０ナノメーターにおけるその吸光度に基づいて決めた。コラゲナーゼＩおよび ＩＩでは、１.０ｍｇ／ｍｌ溶液は１.４吸光度単位（ＡＵ）の吸光度を有し、１ .０ｍｇ／ｍｌサーモリシン溶液は１.１ＡＵの吸光度を有する。これらの数値を 使用して各成分の溶液を作り、計算した吸光度単位数の各成分を混合して所望混 合物を作った。 上記の例１からのコラゲナーゼＩおよびＩＩサンプルを解凍した。（酵素安定 性を最大にするために、すべての操作は０乃至８℃で行わなければならない。） 蛋白質３.４８ｍｇ（４.８７ＡＵ）を含むコラゲナーゼＩ酵素のサンプルを作っ た。このサンプルに蛋白質２.３２ｍｇ（３.２５ＡＵ）を含むコラゲナーゼＩＩ 酵素のサンプルを加えた。このコラゲナーゼＩおよびＩＩの混合物に、サーモリ シン溶液を、この酵素１.８２ｍｇ（２.００ＡＵ）を提供する容量を加え、よく 混合した。 ブレンドした後、その酵素組成物を氷浴中で、活性を損失せずに数時間保持す ることができる。しかしより長期間保存するためには、その組成物を−２０℃以 下で、凍結液体として、または凍結乾燥物として保存することを薦める。この方 法で作られたこれらブレンドは数年間安定である。６乃至１２グラム肝のために は、下の表２に示される量の酵素類が肝細胞分離のために最適の混合物をもたら す。 上の表２に記載した酵素組成では、コラゲナーゼＩが約０.７乃至約１.７ヴン シュ単位のコラゲナーゼ活性をもたらし、コラゲナーゼＩＩが約２３.２乃至約 ３１ヴンシュ単位の活性をもたらす。サーモリシンは顕著なヴンシュ活性を提供 しなかったから、総組成物は約２４乃至約３３ヴンシュ単位の活性を与え、平均 活性は約３０ヴンシュ単位である。総組成物は約８,５００乃至約１４,５００Ｆ ＩＴＣカゼイン単位の活性を有し、平均活性は約１２,０００ＦＩＴＣカゼイン 単位である。よって、組成物のＦＩＴＣカゼイン単位 対 組成物のヴンシュ単 位の比の範囲は８,５００／３３乃至１４,５００／２４、または２５０：１乃至 約６００：１の範囲であり、平均活性比は１２,０００／３０または約４００： １である。 ラット肝解離のための上記の酵素組成物はその他の組織型のためにも良好に振 る舞うことが期待される。当業者には明らかなように、特定組織型を解離するた めに精製酵素混合物を最適化するためには若干の変更が必要である。例えばより 多くのコラーゲンを含む組織は高められたコラゲナーゼ活性を必要とし、非コラ ーゲン蛋白質をより多く含む組織は高められたプロテアーゼ活性を必要とする。 同様に、より大きいまたはより小さい組織サンプルでは酵素活性をそれぞれに対 応して調節する必要があるかも知れない。 例３：肝細胞を分離するためにラット肝の消化 精製酵素組成物の組み合わせを、ラット肝を遊離肝細胞に解離するそれらの能 力によって試験した。セグレン（Seglen）法をわずかに変更した方法を用いて評 価した（セグレン、Exp．Cell Res．８２巻、３９１〜３９８ページ、１９７３ 年）。臓器の解離のためには下記の緩衝液を用いた。すべての緩衝液は高純度の 水を用いて調製し、０.２ミクロンフィルターを通して完全に滅菌した。 潅流緩衝液：塩化ナトリウム８.３ｇ、塩化カリウム０.５ｇおよびＨＥＰＥＳ ２.４ｇを水８００ｍｌに加えた。完全に溶解した後、ｐＨを７.４に調節し、容 量を１,０００ｍｌにした。 消化緩衝液：塩化ナトリウム３.９ｇ、塩化カリウム０.５ｇ、塩化カルシウム 二水加物０.７ｇ、ＨＥＰＥＳ２４ｇを水８００ｍｌに加えた。完全に溶解した 後、ｐＨを７.６に調節し、容量を１,０００ｍｌにした。 懸濁緩衝液：塩化ナトリウム４.０ｇ、塩化カリウム０.４ｇ、ＨＥＰＥＳ７. ２ｇ、塩化カルシウム二水加物０.１８ｇ、燐酸カリウム０.１５ｇ、硫酸ナトリ ウム０.１ｇ、塩化マグネシウム六水加物０.１３ｇ、（２−（（トリス−（ヒド ロキシメチル）メチル）−アミノ）−エタンスルホン酸）（ＴＥＳ）６.９ｇ、 （Ｎ（トリス−（ヒドロキシメチル）−メチル）グリシン）（ＴＲＩＣＩＮＥ） ６.５ｇおよび水酸化ナトリウム２.１ｇを水８００ｍｌに加えた。完全に溶解し た後、ｐＨを７.６に調節し、容量を１,０００ｍｌにした。 洗浄緩衝液：塩化ナトリウム８.３ｇ、塩化カリウム０.５ｇ、ＨＥＰＥＳ２. ４ｇおよび塩化カルシウム二水加物０.１８ｇを水８００ｍｌに加えた。完全に 溶解後、ｐＨを７.４に調節し、容量を１,０００ｍｌにした。 雄ウィスターラット（１５０乃至２００ｇ）をペンタバルビトール（１０ｍｇ ／１００ｇ体重）のＩ．Ｐ．注射によって麻酔した。腹腔を開き、肝臓と腎臓と の間の下大静脈にカニューレを挿入した。大静脈を肝臓の上で結紮し、門脈を切 り、またはカニューレを挿入して肝臓からの還流を可能にした。肝臓を潅流緩衝 液で流速３０ｍｌ／ｍｉｎで最低５分間潅流した。上の例２からの酵素組成物を 消化溶液３００ｍｌに溶解し、温まるまで３７℃でインキュベートした。その後 肝臓を解離するために、その消化溶液に、流速３０ｍｌ／ｍｉｎで臓器が軟化す るまでその臓器を通過させた。消化時間を記録した。 軟化した臓器を取り出し、あらかじめ９５％酸素および５％二酸化炭素を通気 した懸濁緩衝液中で注意深く引き離してばらばらにした。残りの組織はすべて小 片に切り、血管および膜はすべて除去した。その組織懸濁液を懸濁緩衝液で最終 容量１５０ｍｌとし、３７℃で２５分間おだやかに撹拌しながらインキュベート し、肝細胞を分散させた。組織の厚い部分を濾過して除去した後、肝細胞を４℃ 、２０×Ｇ、５分間の遠心分離によってペレット化した。非肝細胞性細胞、損傷 肝細胞、および細胞屑が上澄液に存在し、吸引によってこれらを除去し、棄てた 。肝細胞をさらに最低２回、冷洗浄溶液で洗い、遠心分離した。最終的細胞数お よび％生育能力を測定した。４００万個の肝細胞を６０ｍｌ直径のコラーゲン塗 布培養プレートに置き、９５％空気および５％二酸化炭素中、９５％相対湿度、 ３７℃でインキュベートした。適切な時間間隔で機能アッセイ（Function assay s）を行った。 例４：微小血管内皮細胞を分離するためのラット上皮脂肪の消化 コラゲナーゼＩＩ ２.３２ｍｇ、コラゲナーゼＩ ３.４８ｍｇおよびサーモリシ ン１.８２ｍｇを含む酵素組成物を用いて、微小血管細胞を回収する目的でラッ ト脂肪パッド組織サンプルを解離した。使用した方法はロドベル（Rodbell）の 方法（J．Biol．Chem.、２３９巻、３７５ページ１９６４年）を若干変更したも のである。好適ブレンド組成物を、脂肪酸を含まないウシ血清アルブミン（ＢＳ Ａ）１.０ｍｇ／ｍｌを含む生理的燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）２０ｍｌ中に再構 成し、０.２ミクロン酢酸セルロースフィルターを通して滅菌した。齢８乃至１ ０週のラットから取った４個の細かく細切した上皮組織脂肪パッド（脂肪量平均 ３乃至５ｍｌ）を酵素ブレンド溶液１０ｍｌ中に入れた。消化は３７℃の振とう 水浴中で１０乃至１５分間行われた。細胞は４分間の７００×Ｇ遠心分離によっ て回収された。脂肪および酵素ブレンド浮遊溶液を吸引し、棄てた。内皮細胞ペ レットは１.０ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含むＰＢＳ緩衝液に２回懸濁し、細胞を７０ ０×Ｇ、４分間の遠心分離によて回収し、最後に単なるＰＢＳ緩衝液を用いて遠 心分離した。そこで細胞は計数、生育能力試験、培養またはその他の分画化の準 備ができた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒストリチクス菌由来のコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩとエンド プロテアーゼとを含む酵素組成物であって、ヴンシュ単位約０.２Ｕ／ｍｇ乃至 約０.６Ｕ／ｍｇの活性を有するコラゲナーゼＩと、ヴンシュ単位約９.５Ｕ／ｍ ｇ乃至約１３.５Ｕ／ｍｇの活性を有するコラゲナーゼＩＩとを、前記酵素組成 物におけるコラゲナーゼＩＩの質量対コラゲナーゼＩプラスコラゲナーゼＩＩ質 量の比が約０.３乃至約０.６であるように組み合わせ、かつ前記酵素組成物の総 ＦＩＴＣカゼイン単位活性対コラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの組み合わせ 質量の総ヴンシュ単位活性の比を約２５０：１乃至約６００：１に高めるのに十 分な量のエンドプロテアーゼを加えることによって調製される酵素組成物。 ２．エンドプロテアーゼが中性プロテアーゼである請求項１記載の酵素組成物 。 ３．エンドプロテアーゼがサーモリシンで、前記組成物が内毒素を実質的に含 まない請求項１記載の酵素組成物。 ４．ヒストリチクス菌由来のコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む酵 素組成物であって、ヴンシュ単位約０.２Ｕ／ｍｇ乃至約０.６Ｕ／ｍｇの活性を 有するコラゲナーゼＩと、ヴンシュ単位約９.５Ｕ／ｍｇ乃至１３.５Ｕ／ｍｇの 活性を有するコラゲナーゼＩＩとを、前記酵素組成物中コラゲナーゼＩＩの質量 対コラゲナーゼＩの質量プラス コラゲナーゼＩＩの質量の比が約０.３乃至約０ .６になるように組み合わせ、前記酵素組成物の活性の総ＦＩＴＣカゼイン単位 対コラゲナーゼＩの質量とコラゲナーゼＩＩの質量との組み合わせの活性の総ヴ ンシュ単位の比を約４００：１にまで高めるのに十分な量のサーモリシンを加え ることによって調製される酵素組成物。 ５．生きている細胞を組織から分離するために適応させた酵素組成物の製法で あって、ヴンシュ単位約０.２Ｕ／ｍｇ乃至約０.６Ｕ／ｍｇの活性を有するヒス トリチクス菌由来のコラゲナーゼＩと、ヴンシュ単位約９.５Ｕ／ｍｇ乃至約１ ３.５Ｕ／ｍｇの活性を有するヒストリチクス菌由来のコラゲナーゼＩＩと、前 記酵素組成物のＦＩＴＣカゼイン活性を、前記酵素組成物の総ＦＩＴＣカゼイン 活性単位対コラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩを組み合わせた総質量の総ヴンシ ュ活性単位の比が約２５０：１乃至約６００：１であるようなレベルにまで高め るのに十分な量のエンドプロテアーゼとを組み合わせる段階を含む前記製法。 ６．エンドプロテアーゼがサーモリシンである請求項５記載の方法。