FR2823217A1 - Procede d'obtention d'une suspension de cellules individualisees issues d'un equivalent de peau humaine reconstruite et applications - Google Patents

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Abstract

L'invention conceme un procédé d'obtention d'une suspension de cellules individualisées issues d'un équivalent de peau humaine reconstruite, ladite suspension étant utile pour la réalisation de tests de génotoxicité. L'invention concerne également des méthodes d'évaluation de la génotoxicité d'un traitement appliqué à un équivalent de peau humaine reconstruite.

Description

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PROCEDE D'OBTENTION D'UNE SUSPENSION DE CELLULES
INDIVIDUALISEES ISSUES D'UN EQUIVALENT DE PEAU HUMAINE
RECONSTRUITE ET APPLICATIONS L'invention concerne un procédé d'obtention d'une suspension de cellules individualisées issues d'un équivalent de peau humaine reconstruite, ladite suspension étant utile pour la réalisation de tests de génotoxicité.
L'invention concerne également des méthodes d'évaluation de la génotoxicité d'un traitement appliqué à un équivalent de peau humaine reconstruite.
La peau humaine est destinée à protéger l'organisme de la déshydratation et des agressions extérieures, chimiques, mécaniques ou infectieuses.
Parmi ces agressions, les agressions génotoxiques constituent l'ensemble des agressions susceptibles d'entraîner des lésions à l'ADN des cellules et en particulier de l'ADN du noyau des cellules. On citera notamment, parmi les agents potentiellement agressifs, les rayonnements ultra-violets de la lumière solaire, ainsi que tous composés chimiques ou mixtures complexes.
En contact direct avec l'environnement extérieur, la peau est naturellement soumise aux agressions génotoxiques. Les lésions observées sur l'ADN sont notamment des cassures d'un brin de l'ADN ou des modifications chimiques des bases nucléotidiques (formation de dimères de thymine par exemple). Ces lésions sont en principe réparées par la machinerie cellulaire dans un intervalle de temps pouvant aller de quelques minutes pour les lésions de type cassure d'ADN, à quelques heures pour les lésions altérant la structure chimique de l'ADN. Lors de la réparation de de)'ADN endommagé, il arrive cependant que des erreurs surviennent entraînant des mutations ponctuelles ou des dégâts chromosomiques. Ces mutations irréversibles issues des agressions génotoxiques constituent un des
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événements prépondérants dans le déclenchement de cancer, et notamment des cancers de la peau (basal cell carcinoma, Squamous cell carcinoma pour les cancers impliquant les kératinocytes).
La recherche et le développement de nouvelles compositions efficaces pour la protection de la peau vis-à-vis des agressions génotoxiques, en particulier de compositions susceptibles de participer à la photoprotection, requiert la mise en oeuvre de méthodes d'évaluation précises des effets génotoxiques en présence ou en absence de ces compositions. Ces méthodes doivent permettre de quantifier l'efficacité de la protection apportée par les nouvelles compositions cosmétiques, prophylactiques ou thérapeutiques.
En outre, l'utilisation de matières premières nouvelles dans les compositions destinées à être appliquées sur la peau constitue par ailleurs un risque génotoxique potentiel pour la peau. Il est donc important de pouvoir évaluer ce risque vis-à-vis de l'organe cible du produit testé (MacGregor et al., Mutation Research 455 (2000) pp 3-20).
On comprend qu'il est donc nécessaire de disposer de tests d'évaluation de la génotoxicité d'un traitement appliqué à la peau, d'une part, pour évaluer la génotoxicité d'un composé nouveau destiné à être inclus dans une composition, et d'autre part, pour évaluer l'effet protecteur de certaines compositions et traitements vis-à-vis des agressions génotoxiques extérieures.
Différentes techniques permettant la détection sensible des lésions sur l'ADN ont été rapportées dans des études de toxicologie environnementale, de carcinogenèse et de vieillissement cellulaire (Ames, B. N., 1983, Science 221 : 1256-1264 ; Cerutti, P. A., 1985, Science 227 : 367-381). Singh et al. ont notamment développé un test de génotoxicité applicable sur des cellules individualisées connu sous le nom de"test des comètes" (encore appelé single cell gel electrophoresis) permettant de mettre en évidence la
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fragmentation de l'ADN génomique induite par un stress génotoxique (Singh et al., 1991, Mutation Research, 252 : 289-296).
Ce test est aujourd'hui très largement utilisé pour l'évaluation du potentiel génotoxique de tout type de stress (physique ou chimique) et ce aussi bien in vivo sur différents organes (foie, reins, poumons, moelle épinière) (Sazaki, Y. F. et a/., M < . Res. 393 : 201-214) que in vitro sur différents types de cultures cellulaires (Singh N. P. et al., 1991, Mutat. Res. 252 : 289- 296 ; Marrot et al., 1999, Photochem. Photobiol. 69 : 686-693). La technique du test des comètes a été harmonisée lors de la conférence International Workshop on Genotoxicity test Procedures (Tice R. R et al., 2000, Environ. Mol. Mutagen. 35 : 206-221) et est maintenant considérée comme une alternative possible dans la stratégie d'évaluation du risque génotoxique (Comittee on mutagenicity of chemicals in food, consummer products, and the environment (COM) (2000) : Guidance on a strategy for testing of chemicals for mutagenicity, J. Parry ; L. Mu)) er e a/., Mutation research 436 (1999) pp 195-225).
Les tests de génotoxicité sur cellules de mammifères (test des comètes, test du micronoyau in vitro, test des aberrations chromosomiques) reposent sur l'observation de l'altération du patrimoine génétique de cellules individuelles. C'est pourquoi, les tests de génotoxicité reposent en général sur l'observation de l'ADN de cellules individualisées. La réalisation de ces tests sur des tissus (équivalents de peau) nécessite donc en préalable l'individualisation des cellules. Une étape critique est l'obtention d'une suspension de cellules individualisées à l'aide d'un traitement qui ne soit pas lui-même, génotoxique, voire cytotoxique. En particulier, la méthode d'individualisation des cellules doit conserver les membranes des cellules intactes afin d'éviter la lyse cellulaire. En outre, la méthode doit être réalisée dans un temps suffisamment court pour permettre l'observation des lésions temporaires sur l'ADN. Certaines lésions, et notamment celles induites par les UVA, sont en effet réparées très rapidement.
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L'individualisation des cellules dans de telles conditions est relativement aisée pour des cellules cultivées in vitro. En effet, les cellules forment généralement une seule couche adhérant sur un support et le détachement des, cellules est obtenu à l'aide de méthodes connues de l'homme du métier, notamment via l'utilisation de protéases telles que la trypsine.
En revanche, l'obtention d'une suspension de cellules individualisées issues d'organes est plus délicate selon la cohésion plus ou moins forte des tissus.
A ce titre, les cellules de la peau forment un tissu très cohésif et difficile à dissocier.
Parmi les méthodes d'obtention de suspension cellulaire à partir d'organes, on peut notamment citer :
La technique décrite par R. Tice (Tice R. R ef a/., 2000, Environ. Mol.
Mutagen. 35 : 206-221) pour l'individualisation des cellules de foie comprenant l'éminçage des tissus dans un tampon salin (Tampon phosphate pH7.1, PBS, HBSS,...) ;
La technique décrite par Yendle et a/. pour l'individualisation de kératinocytes de la peau de souris (Yendle et al., 1997, Mutation
Research 375 : 125-136) comprenant une étape d'éminçage et une étape d'incubation dans une solution de Dispase (Dispase Ici.,
Boerhinger Mannheim). Les temps d'incubation varient de 30 minutes à 24 heures et les températures d'incubation varient de 4 C à 42 C ;
La technique décrite par Thein et al. pour l'individualisation d'hépatocytes et de cellules d'épiderme de souris (Thein et al"2000,
Mutation Research 468 : 117-124) comprenant une étape d'éminçage et une étape d'incubation dans une solution de trypsine (Trypsine EDTA, Gibco BRL). Là encore, les temps d'incubation
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varient de 30 minutes à 24 heures et les températures d'incubation varient de 4 C à 42 C ;
La combinaison des deux techniques précédentes ;
La technique décrite par Sasaki e a/. (Sasaki et al., Mutation
Research 391 : 201-214) consistant à isoler les noyaux des cellules.
L'état de la technique ne décrit pas de procédés appliqués à des peaux humaines ou des équivalents de peaux humaines reconstruite. La peau de souris est le modèle le plus proche de la peau humaine sur lequel des procédés d'individualisation de cellules sont décrits. Cependant, la peau de souris présente des caractéristiques différentes de celles de la peau humaine : épiderme plus fin, moins de couches de cellules vivantes, qui peuvent expliquer que les cellules y sont plus facilement individualisables.
Or, à la fois pour des raisons éthiques (l'utilisation d'animaux pour la réalisation de tests de génotoxicité dans l'industrie cosmétique) et scientifiques (les processus de réparation de l'ADN sont différents entre la souris et l'homme), Il existe un réel besoin de développer de nouvelles techniques alternatives à l'expérimentation animale dans le domaine des tests de génotoxicité.
Dans le domaine de la dermatologie, ces nouvelles alternatives comprennent le récent développement de systèmes de culture cellulaire tentant de reproduire l'organisation tri-dimensionnelle cellulaire des tissus de la peau. Lesdits systèmes sont appelés équivalents de peau . Par équivalent de peau, on entend un système tridimensionnel composé de deux équivalents de tissus à savoir un équivalent d'épiderme et un équivalent de derme.
Un équivalent d'épiderme est un tissu reconstitué in vitro comprenant au niveau des couches basales des kératinocytes vivants qui se différencient en stratum corneum (couche cornée). Mais bien entendu l'équivalent
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d'épiderme peut contenir en outre tout type de cellules comme par exemple des mélanocytes et/ou des cellules de Langerhans.
Un équivalent de derme est tout type de tissu fournissant un support solide à l'équivalent d'épiderme. Ainsi, l'équivalent de derme utilisé selon l'invention peut être choisi parmi les lattices mixtes collagène/fibroblastes, les substituts sous-cutanés à base de collagène contenant des fibroblastes, ou tout autre support compatible avec la viabilité cellulaire des kératinocytes, particulièrement ceux dans lesquels pourraient être inclus des fibroblastes.
L'équivalent d'épiderme peut être physiquement séparé de l'équivalent de derme qui lui sert de support pour être utilisé seul.
Selon l'invention, tout équivalent de peau qui présente un équivalent d'épiderme vivant est utilisable et ce quel que soit l'équivalent de derme sur lequel l'équivalent d'épiderme a été préparé.
On citera à cet égard par exemple les équivalents de peau décrits dans les brevets ou dans les demandes de brevets EP 0502172, EP 0285471, EP 0285474, EP-A-0789074, EP 0418035, WO-A-90/02796, WO-A- 91/16010, WO-A-9510600, EP 0197090, EP 020753, CA 2119064, FR 2665175.
Préférentiellement selon l'invention, on utilise l'équivalent de peau décrit dans le brevet EP 0502172, c'est-à-dire l'équivalent de peau vendu par la société Episkin France, constitué d'un biomatériau à base de collagène comportant intimement un support ou substitut dermique comprenant une couche essentiellement de collagène de type IV et un épithélium épidermique à cellules différenciées obtenu par culture de cellules épidermiques sur ladite couche dudit support ou substitut dermique.
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Dans le but de réaliser un test de génotoxicité applicable aux cellules issues d'un équivalent de peau humaine reconstruite, les inventeurs ont confirmé qu'aucune des techniques d'individualisation des cellules citées plus haut ne permettait d'obtenir une suspension de cellules individualisées à partir d'un équivalent de peau humaine reconstruite dans un intervalle de temps suffisamment court pour la détection de lésions à l'ADN par le test des comètes. En particulier, la longueur de certains protocoles ainsi que l'agressivité de certaines enzymes (trypsine) sont la source de dégâts sur l'ADN artefactuels importants, incompatibles avec l'observation des dégâts génotoxiques vrais. Les dégâts sur l'ADN, observés et décrits, sont sans doute plutôt liés à la cytotoxicité du traitement.
Les inventeurs ont recherché des conditions appropriées pour obtenir l'individualisation des cellules de peau humaine compatible avec la mise en oeuvre de tests de génotoxicité, définissant pour cela des compositions enzymatiques susceptibles d'agir sur les cellules de peau, selon notamment une cinétique compatible avec l'obtention de cellules individualisées de qualité telle que des tests de génotoxicité puissent leur être appliqués de façon pertinente.
Les inventeurs ont ainsi constaté de manière inattendue, que l'utilisation d'une composition d'enzymes comprenant les isoformes 1 et Il des collagénases purifiées de Clostridium histolyticum, et une protéase neutre dans des proportions spécifiques permettait l'obtention d'une suspension de cellules individualisées issues d'un équivalent de peau humaine reconstruite.
En outre, Ils ont constaté que le procédé d'obtention d'une suspension de cellules individualisées à l'aide du mélange d'enzymes selon les caractéristiques mentionnées ci-dessus n'était ni génotoxique, ni cytotoxique et pouvait être mis en oeuvre dans un temps suffisamment
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court et par conséquent, était approprié pour son application aux tests de génotoxicité sur cellules individuelles.
Par tests de génotoxicité sur cellules individuelles, on entend selon l'invention tout type de test permettant une mesure qualitative eUou quantitative des effets génotoxiques d'un traitement quelconque, ledit test nécessitant pour son application, l'obtention d'une suspension de cellules individualisées à partir de laquelle les dégâts génotoxiques sont quantifiés.
Des exemples de tels tests de génotoxicité sont notamment le test des comètes décrit par Singh et al., le test du micronoyau in vitro (Fenech, Mutation Research 392 (1997) pp 11-28 ; M. Kirsch-Volders, Mutation Research 392 (1997) pp 1-4), et des aberrations chromosomiques (Guidelines OCDE 473). L'invention a donc pour objet un procédé d'obtention d'une suspension de cellules individualisées issues d'un équivalent de peau humaine reconstruite, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) le prélèvement d'un échantillon d'un équivalent de peau humaine reconstruite ; b) le cas échéant,)'éminçage dans un volume de tampon salin de l'échantillon prélevé ; et, c) l'incubation de l'éminçat en présence d'une composition d'enzymes comprenant la combinaison de collagénases 1 et Il et de protéases selon une proportion telle que le ratio des activités [caséinase (unité FITC caséine)]/ [collagénase (unité Wünsch)] du mélange résultant est compris entre 85 et 3900, de préférence supérieur à 600, et de manière encore préférée compris entre 600 et 1000, pendant une durée suffisante pour obtenir une suspension de cellules individualisées, appropriée pour la réalisation de tests de génotoxicité.
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Les étapes b) et c) permettent de combiner les effets d'un traitement mécanique et d'un traitement enzymatique pour individualiser les cellules.
Le cas échéant, l'étape b) peut être supprimée si l'efficacité des seules enzymes est suffisante.
Selon un premier mode de réalisation particulier de l'invention, une fois un échantillon de peau prélevé d'une culture d'un équivalent de peau humaine reconstruite, celui-ci est émincé par exemple à l'aide de ciseaux fins dans un volume de tampon salin. De préférence, un équivalent de peau par test est émincé dans 200 à 500 microlitres de tampon salin. Selon l'invention, tout type de tampon salin peut être utilisé. Selon certains modes de réalisation de l'invention, l'éminçage de l'échantillon prélevé est réalisé dans un tampon salin sélectionné parmi l'une des solutions suivantes : un tampon phosphate ; une solution PBS ; une solution HBSS ; ou, une solution de EARLE.
Selon un mode de réalisation particulier, on élimine de l'échantillon de peau prélevé, les cellules de la couche supérieure de l'épiderme afin de ne préserver que les cellules basales.
L'équivalent de peau émincé ou non est ensuite incubé selon le procédé de l'invention en présence d'une composition d'enzymes comprenant la combinaison de collagénases 1 et Il et de protéases selon une proportion telle que le ratio des activités caséinase 1 collagénase du mélange résultant est compris entre 85 et 3900, de préférence supérieur à 600, et de manière encore préférée compris entre 600 et 1000 pendant une durée suffisante minimale pour obtenir une individualisation complète des cellules.
Les collagénases et protéases utilisées peuvent être extraites de mammifères, champignons ou bactéries. Dans un mode de réalisation
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préféré, la composition d'enzymes utilisée dans les procédés de l'invention est réalisée à partir d'enzymes extraites de C. Iypolyticum.
Les préparations de collagénases utilisées dans la composition d'enzymes sont de préférence purifiées à un taux supérieur à 95%, voire supérieur à 98%, afin de diminuer la présence de contaminants non protéiques et en particulier d'endotoxines éventuelles, et d'obtenir un résultat reproductible en terme d'efficacité de dissociation des cellules.
La composition d'enzymes peut comprendre tout type de protéase, incluant les protéases à sérine, telles que la trypsine, la chymotrypsine ou l'élastase ; les protéases à cystéine telles que la papaïne ou la chymopapaïne et préférentiellement, les protéases neutres, telles que la protéase neutre de C. histolyticum ou les thermolysines (EC 3.4. 24. 4).
Des compositions d'enzymes utilisables dans les procédés de l'invention sont notamment décrites dans les brevets US 5,753, 485 (Boerhinger Mannheim Corporation) et US 5,830, 741 (Boerhinger Mannheim Corporation).
Les inventeurs ont montré qu'une composition d'enzymes particulièrement adaptée pour les procédés de l'invention était constituée d'un mélange de collagénases purifiées de C. histolyticum et d'une thermolysine, le ratio d'activité protéase [caséinase (unité FITC caséine)]/ [cottagénase (unité Wünsch)] étant compris entre 600 et 1000.
Selon les modes de réalisation, la concentration de la composition enzymatique pendant la phase d'incubation est comprise entre 0,05 et 0,35 Wünsch units/ml ou environ 0,05 à 2 mg/ml.
Le temps d'incubation de l'éminçat en présence de la composition d'enzymes peut être compris entre 15 minutes et 3 heures et mieux encore, inférieur à 1 heure, par exemple environ 30 minutes. Bien entendu,
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l'homme du métier ajustera le temps d'incubation en fonction de la concentration d'enzymes utilisée. Un temps d'incubation réduit permet l'application du procédé à l'évaluation des stress génotoxiques dont les dégâts sur l'ADN sont rapidement réparés, notamment ceux induisant des cassures de l'ADN réparées par les ligases, comme les stress dus aux UVA.
L'incubation doit être telle qu'elle permet la digestion des protéines de la matrice extracellulaire, permettant aux cellules de se détacher les unes des autres, sans toutefois altérer la membrane cellulaire significativement, ce qui aurait pour conséquence d'altérer l'ADN.
L'invention porte donc sur une utilisation d'une composition d'enzymes comprenant la combinaison de collagénases 1 et Il et de protéases selon une proportion telle que le ratio des activités caséinase 1 collagénase du mélange résultant est compris entre 85 et 3900, de préférence supérieur à 600, et de manière encore préférée compris entre 600 et 1000 pour l'obtention d'une suspension de cellules individualisées d'un équivalent de peau humaine reconstruite.
L'invention use également une suspension de cellules individualisées issues d'un équivalent de peau humaine caractérisée en ce que lesdites cellules individualisées sont détachées les unes des autres et dépourvues de matrice extracellulaire. Une telle suspension peut être obtenue par les procédés de l'invention décrits ci-dessus.
En particulier, l'invention porte sur un procédé d'évaluation de la génotoxicité d'un traitement appliqué à un équivalent de peau humaine reconstruite caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'application du traitement à évaluer à un équivalent de peau humaine reconstruite ;
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b) l'obtention d'une suspension de cellules individualisées issue de l'équivalent de peau traité selon le procédé d'obtention de l'invention défini ci-dessus ; c) l'évaluation de la génotoxicité du traitement appliqué à l'aide d'un test de génotoxicité sur cellules individualisées.
L'évaluation de la génotoxicité du traitement appliqué peut être obtenue à l'aide de tout type de tests de génotoxicité sur cellules individualisées, tel que défini plus haut. Citons à titre d'exemples le test des comètes, le test des aberrations chromosomiques ou le test du micronoyau.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le test de génotoxicité utilisé dans le procédé ci-dessus défini est un test des comètes (Single Cell Gel Electrophoresis assay), ledit test des comètes comprenant : a) l'inclusion des cellules individualisées dans un gel d'électrophorèse ; b) la lyse des cellules contenues dans le gel ; c) l'application d'un champ électrique au gel pour provoquer la migration des fragments d'ADN nucléaire dans ledit gel ; d) l'analyse et/ou la quantification des profils de migration d'ADN nucléaire pour chaque cellule ; et, e) la détection de l'effet génotoxique du traitement à évaluer, appliqué initialement.
Le test des comètes doit ainsi son nom à la forme des profils de migration de l'ADN nucléaire. L'ADN non altéré, de haut poids moléculaire, migre peu et forme la tête de la comète. Les fragments d'ADN altéré migrent plus rapidement et forment la queue de la comète. Le nombre, la taille et l'intensité des profils de migration en forme de queue de comètes sont corrélés à l'effet génotoxique du traitement appliqué initialement.
Une description détaillée des paramètres importants dans la réalisation du
Figure img00120001

test des comètes est notamment donné par Tice et a/. (Tice R. R et al., 2000, Environ. Moi. Mutagen. 35 : 206-221).
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Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, à l'étape a) du procédé, les cellules sont incluses dans un gel d'électrophorèse étalé sous une lame de microscope. Il existe différentes techniques pour préparer les lames contenant les cellules. On utilisera de préférence des lames pour microscope contenant une à trois couches de gels. Selon le protocole simple couche, les cellules individualisées issues d'un équivalent de peau humaine reconstruite sont incluses dans un gel d'agarose à faible température de fusion (LMP) (généralement à 37OC) puis le gel est placé directement sur la lame. Selon le protocole en trois couches, le gel d'agarose contenant les cellules est placé sur une lame recouverte d'une couche d'agarose normal. Après avoir ajouté la couche de gel contenant les cellules, une autre couche d'agarose LMP est ajoutée pour combler les trous résiduels. Selon le protocole double-couche, la dernière couche d'agarose LMP est omise. Des lames prêtes à l'emploi (pre-coatées) sont commercialisées (Trevigen inc, USA, Biotechniques vol 27, no 4, (1999)).
La concentration du gel contenant les cellules est généralement comprise entre 0,5 et 1%. La concentration de la première couche de gel est généralement comprise entre 1 et 1,5%. Le nombre de cellules incluses dans l'agarose est compris entre 1000 et 60 000 (l'optimum se situant aux alentours de 30 000).
Lorsque le gel d'agarose est solidifié, les lames sont placées dans une solution de lyse consistant en une teneur élevée en sels et en détergents. Une solution de lyse préférée est celle décrite par Tice et al. : 100mM EDTA, 2,5M NaCI, 1% N-lauroylsarcosine, 10mM base Trizma, ajusté à pH 10, 0, 10% DMSO et 1% Triton X-100 ajouté extemporanément (1991, In : Witmer CR, Snyder RR, Jollow DJ, Kalf GF, Kocsis JJ, Sipes IG, editors. Biological reactive intermediates IV. Molecular and cellular effects and their impact on human health. New York : Plenum Press. P157-164). Dans un mode mise en oeuvre préféré du procédé de l'invention, le temps de lyse
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est d'au moins deux heures compte tenu de la spécificité des cellules provenant d'épidermes reconstruits.
A la fin de la période de lyse, les lames peuvent être rincées dans un tampon alcalin, de façon à éliminer toutes traces de détergents ou de sels.
L'incubation des lames dans un tampon d'électrophorèse alcalin, de préférence supérieur à pH 13, avant l'électrophorèse permet la dénaturation de l'ADN et la visualisation des cassures d'ADN simple brin et des sites alcali-labiles.
Le gel est ensuite soumis à un champ électrique, de préférence dans le même tampon d'électrophorèse alcalin. Selon notamment le tampon et l'appareil d'électrophorèse utilisés, l'homme du métier saura déterminer les conditions optimales de migration et notamment de voltage, d'ampérage et de temps d'électrophorèse pour le test de génotoxicité.
Pour visualiser certaines lésions de l'ADN, la migration de l'ADN doit être suffisamment importante, en particulier pour permettre l'observation d'une migration des ADN des cellules contrôlées qui n'ont pas subi de traitements génotoxiques. En effet, lorsque des cross-linking ADN-ADN ou ADNprotéines sont induits, ceux-ci peuvent être détectés par le test des comètes, via l'étude du retard de migration de l'ADN des cellules traitées (Tice et a/., 1997, Mutat Res 386 : 315-334).
Les gels sont ensuite rincés dans une solution neutralisante appropriée, par exemple, un tampon trizma à pH 7.5. Les gels peuvent être séchés pour le stockage ou analysés immédiatement. Pour la visualisation des comètes, tout type de colorant de l'ADN peut être utilisé. Parmi les colorants classiquement utilisés, on citera le bromure d'éthidium, l'iodure de propidium, le DAPI (4,6 diamidino-2-phénylindole), le SYBR Green 1, ou encore le YOYO-1 (homodimère de benzoxazolium-4-quinolinum oxazole yellow).
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Les lames contenant les gels sont par exemple analysées sous microscopie à fluorescence. La quantification des comètes est faite à l'aide de logiciels d'analyse d'image disponibles dans le commerce. Les comètes sont généralement classées en différentes catégories (environ quatre ou cinq), en fonction de la longueur de la migration et/ou de la proportion relative d'ADN dans la queue de la comète. La longueur de la comète est théoriquement reliée à la taille des fragments et donc directement proportionnelle au niveau de cassures simples brins et de sites alcalilabiles, et inversement proportionnelle aux lésions de type cross-linking. Un exemple de logiciel utilisable pour l'analyse quantitative des images est le logiciel Komet 3. 1 commercialisé par Kinetic Imaging. La quantification des comètes se fait alors par le calcul du tail moment prenant en compte pour chaque cellule, la taille et l'intensité de la queue de la comète.
Les procédés de l'invention permettent l'évaluation de tout type de traitement, physique ou chimique, susceptible d'être génotoxique.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, un traitement appliqué à un équivalent de peau reconstruite est un traitement aux UV solaires ou aux UVA seuls. L'équivalent de peau reconstruite est par exemple irradié en lumière solaire (UVB+UVA) ou sous UVA seul sous simulateur solaire.
Le procédé de détermination de la génotoxicité mis en oeuvre après ce type de traitement permet l'évaluation de la photogénotoxicité.
Dans un autre mode de réalisation, un traitement appliqué à un équivalent de peau reconstruite est un traitement aux UV solaires ou aux UVA seuls, ledit équivalent de peau étant préalablement mis en contact avec un produit ou une composition susceptible d'entraîner une photoprotection vis-à-vis de la génotoxicité du traitement aux UV. Ce mode de réalisation permet d'évaluer l'effet photoprotecteur d'un produit ou d'une composition et est particulièrement utile dans des procédés de criblages de produits ou de compositions susceptibles d'entraîner une photoprotection de la peau vis-àvis de la génotoxicité de la lumière solaire et notamment des UV.
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Dans un autre mode de réalisation de l'invention, un traitement appliqué à un équivalent de peau humaine reconstruite est un traitement aux UV solaires ou aux UVA seuls, ledit équivalent de peau étant préalablement mis en contact avec un produit ou une composition susceptible d'induire une photosensibilisation vis-à-vis de la génotoxicité du traitement aux UV.
Le procédé ainsi mis en oeuvre permet d'évaluer la photosensibilisation induite par l'application sur la peau d'un produit ou d'une composition et est particulièrement utile dans le criblage pour l'identification de produit ou de composition susceptible d'induire une photosensibilisation de la peau.
Alternativement, l'invention peut être appliquée à des échantillons d'équivalent de peau préalablement soumis à l'action de stimuli chimiques tels que des mutagènes ou des carcinogènes.
Dans un autre mode de réalisation, l'équivalent de peau est mis en contact avec un produit ou une composition constituant un stimulus chimique de génotoxicité.
Les exemples qui suivent permettent d'illustrer certains mode de réalisation des procédés de l'invention.
En particulier, l'exemple 1 décrit un mode de réalisation du procédé d'obtention d'une suspension de cellules individualisées issues d'un équivalent de peau humaine reconstruite, ladite suspension étant appropriée pour la réalisation de tests de génotoxicité.
L'exemple 2 décrit un procédé d'évaluation de la photogénotoxicité des UV solaires ou des UVA seuls appliqués à un équivalent de peau humaine reconstruite, comprenant la réalisation du test des comètes.
L'exemple 3 décrit un procédé d'évaluation de l'effet photoprotecteur d'un filtre solaire, le MexorylOE) SX vis-à-vis de la photogénotoxicité.
L'exemple 4 décrit un procédé d'évaluation de la photosensibilisation induite par un produit spécifique, l'antibiotique Lomefloxacine après irradiation aux UV-A.
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L'exemple 5 illustre un procédé d'évaluation de la génotoxicité d'une molécule chimique mise en contact avec un équivalent de peau humaine reconstruite et comprenant la réalisation du test des comètes.
Ces exemples montrent que les procédés de l'invention sont adaptés aux différentes problématiques de phototoxicité : photogénotoxicité, photoprotection et photosensibilisation médicamenteuse, ainsi qu'aux études de toxicité d'une molécule chimique. Bien entendu, en aucun cas ces exemples sont limitatifs, les procédés de l'invention sont d'une manière plus large applicables à tout type de stress génotoxiques, et notamment à l'évaluation des matières premières et des mélanges complexes formulés destinés à être appliqués sur la peau en absence ou en présence de lumière.
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Figure img00180001

DESCRIPTION DES FIGURES
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Figure 1 : Test des comètes après traitement aux UV solaires et UV-A La figure 1A comprend des photo-micrographies des préparations après la réalisation du test des comètes sur des cellules individualisées de peau reconstruite sans traitement (témoins), après traitement aux UV solaires (30 min) et après traitement aux UV-A (1 heure).
La figure 1B est un histogramme illustrant la quantification des comètes après analyse des photo-micrographies.
Figure 2 : Test des comètes après traitement aux UV solaires et application sur l'épiderme d'un filtre Mexoryl &commat; SX La figure 2A comprend des photo-micrographies des préparations après la réalisation du test des comètes sur des cellules témoins individualisées de peau reconstruite (sans traitement), après traitement aux UV solaires (30 min) et après application du filtre et traitement aux UV solaires.
La figure 2B est un histogramme illustrant la quantification des comètes après l'analyse des photo-micrographies.
Figure 3 : Test des comètes après traitement aux UV-A, précédé ou non de l'application de l'antibiotique Loméfloxacine (en topique ou dilué dans le milieu de culture) La figure 3A comprend des photo-micrographies des préparations après la réalisation du test des comètes sur des cellules témoins individualisées de peau reconstruite (traitement aux UV-A 15 minutes), après traitement aux UV-A 15 minutes et application d'une formule HIE à 4% de Loméfloxacine en topique et après traitement aux UV-A 15 minutes et 50 pM de Loméfloxacine dans le milieu.
La figure 3B est un histogramme illustrant la quantification des comètes après l'analyse des photo-micrographies.
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Figure 4 : Test des comètes après traitement au 4-NQO La figure 4 comprend des photomicrographies des préparations après la réalisation du test des comètes sur des cellules individualisées témoin non traité et traité avec des doses croissantes de 4-NQO.
Figure 5 : Kératinocytes isolées de peaux reconstruites, fixées, étalées comme requis pour le test du micronoyau in vitro La figure 5 présente des photomicrographies de cellules isolées d'équivalents de peaux, fixées et étalées sur lame de microscopie, après application des deux protocoles décrits ci-après (figure 5A : Protocole 1, figure 5B : Protocole 2).
EXEMPLE 1 : Procédé d'obtention d'une suspension de cellules individualisées issues d'un équivalent de peau humaine reconstruite Les équivalents de peaux humaines reconstruites utilisées dans les exemples qui suivent sont des produits Episkin, après 6 jours de culture (stade J6) ou après 13 jours de culture (stade J13) ou des épidermes MatTek au stade J12. A la réception des kits Episkin, les épidermes sont transférés sur du milieu de maintenance (Episkin) et placés dans l'étuve à 37 C. Au moins 2 heures avant le début des tests, les nacelles sont transférées sur du milieu d'essai (Episkin). Les kits MatTek sont placés en chambre froide à 4 C à leur arrivée puis transférés sur du milieu d'essai (MatTek) à 37 C au moins 1 heure avant les tests.
Les procédés d'obtention de suspensions de cellules individualisées ont été systématiquement testés sur les épidermes Episkin. En particulier, les cinq protocoles suivants ont été testés : Essai 1 : Découpage des épidermes dans un tampon salin (méthode
Tice pour organe in vivo)
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Prélever le ou les épidermes correspondant au traitement considéré ; éliminer le maximum de couche cornée par stripping à l'aide de scotch 3M : l'épiderme est immobilisé sur un papier collant, face collagène ou nylon collée au support. Un masque comprenant un trou d'une taille très légèrement inférieure au diamètre de l'épiderme est posé dessus de manière à maintenir celui-ci. Cinq strippings successifs sont ensuite effectués avec un morceau de scotch (renouvelé à chaque fois) ; le ou les épidermes est (sont) ensuite détaché (s) du support, récupéré (s) dans un tube contenant 500 microlitres de tampon
HBSS ; L'épiderme est découpé très finement à l'aide d'une paire de ciseaux fins. Les gros débris sont séparés par décantation et le surnageant récupéré pour inclusion dans le gel d'agarose ; La suspension est ensuite observée entre lame et lamelle au microscope à fluorescence équipé du filtre acridine orange après coloration par une solution d'acridine orange à 0, 1%. La présence de cellules individualisées (noyau bien visible) est recherchée.
Essai 2 : Individualisation enzymatique à l'aide de la dispase (Boehringer Mannheim) Prélever le ou les épidermes correspondant au traitement considéré ; Eliminer le maximum de couche cornée par stripping à l'aide de scotch 3M : l'épiderme est immobilisé sur un papier collant, face collagène ou nylon collée au support. Un masque comprenant un
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trou d'une taille très légèrement inférieure au diamètre de l'épiderme est posé dessus de manière à maintenir celui-ci. Cinq strippings successifs sont ensuite effectués avec un morceau de scotch (renouvelé à chaque fois) ; le ou les épidermes est (sont) ensuite détaché (s) du support, récupéré (s) dans un tube contenant 500 microlitres de solution de dispase Il 1x concentrée (soit 2,4 U/ml) et finement découpés à l'aide de ciseaux fins ; Les épidermes sont incubés à 37 C ou à 4 C pendant 15 minutes ou
30 minutes ou 1 heure ; La réaction enzymatique est arrêtée par l'ajout de 20 mM de EDTA ; Les gros débris sont séparés par décantation et le surnageant prélevé ; La suspension est ensuite observée entre lame et lamelle au microscope à fluorescence équipé du filtre acridine orange après coloration par une solution d'acridine orange à 0, 1%. La présence de cellules individualisées est recherchée.
Essai 3 : Par action de la trypsine Prélever le ou les épidermes correspondant au traitement considéré ; Eliminer le maximum de couche cornée par stripping à l'aide de scotch 3M : l'épiderme est immobilisé sur un papier collant, face collagène ou nylon collée au support. Un masque comprenant un trou d'une taille très légèrement inférieure au diamètre de l'épiderme est posé dessus de manière à maintenir celui-ci. Cinq strippings
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successifs sont ensuite effectués avec un morceau de scotch (renouvelé à chaque fois) ; le ou les épidermes est (sont) ensuite détaché (s) du support, récupéré (s) dans un tube contenant 500 microlitres de solution de trysine-EDTA (Gibco BRL) à la concentration de 0,05% et finement découpés à l'aide de ciseaux fins ; Les épidermes sont incubés à 37 C ou à 4 C pendant 5 minutes,
15 minutes, 30 minutes ou 1 heure. Un essai d'incubation à 42 C a été réalisé ainsi qu'un essai d'incubation à 4 C pendant 18 heures ; La réaction enzymatique est arrêtée par l'ajout de 500 microlitres de
PBS contenant 2% de sérum de veau foetal (Sigma) ; Les gros débris sont séparés par décantation et le surnageant prélevé ; La suspension est ensuite observée entre lame et lamelle au microscope à fluorescence équipé du filtre acridine orange après coloration par une solution d'acridine orange à 0, 1%. La présence de cellules individualisées est recherchée.
Essai 4 : Par action conjuguée de la trypsine et de la dispase Prélever le ou les épidermes correspondant au traitement considéré ; * Eliminer le maximum de couche cornée par stripping à l'aide de scotch 3M : l'épiderme est immobilisé sur un papier collant, face collagène ou nylon collée au support. Un masque comprenant un trou d'une taille très légèrement inférieure au diamètre de l'épiderme est posé dessus de manière à maintenir celui-ci. Cinq strippings
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successifs sont ensuite effectués avec un morceau de scotch (renouvelé à chaque fois) ; le ou les épidermes est (sont) ensuite détaché (s) du support, récupéré (s) dans un tube contenant 500 microlitres de solution de trysine-EDTA (Gibco BRL) à la concentration de 0,025% et de dispase à la concentration de 1,2 U/ml et finement découpés à l'aide de ciseaux fins ; Les épidermes sont incubés à 37 C ou à 4 C pendant 5 minutes,
Figure img00230001

15 minutes, 30 minutes ou 1 heure. Un essai d'incubation à 42 C a été réalisé ainsi qu'un essai d'incubation à 4 C pendant 18 heures ; La réaction enzymatique est arrêtée par l'ajout de 500 microlitres de
PBS contenant 2% de sérum de veau foetal (Sigma) et 20mM d'EDTA ; Les gros débris sont séparés par décantation et le surnageant prélevé ; La suspension est ensuite observée entre lame et lamelle au microscope à fluorescence équipé du filtre acridine orange après coloration par une solution d'acridine orange à 0, 1%. La présence de cellules individualisées est recherchée.
Essai 5 : Extraction des noyaux Prélever le ou les épidermes correspondant au traitement considéré ; éliminer le maximum de couche cornée par stripping à l'aide de scotch 3M : l'épiderme est immobilisé sur un papier collant, face collagène ou nylon collée au support. Un masque comprenant un trou d'une taille très légèrement inférieure au diamètre de l'épiderme
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est posé dessus de manière à maintenir celui-ci. Cinq strippings successifs sont ensuite effectués avec un morceau de scotch (renouvelé à chaque fois) ; le ou les épidermes est (sont) ensuite détaché (s) du support, récupéré (s) dans un tube contenant 2 ml de tampons de lyse (listés ci-dessous) et transférés dans un potier de type Dounce ; Les peaux sont potterisées une dizaine de fois à l'aide du piston
B et incubées 10 minutes dans la glace ; Les noyaux sont récupérés par centrifugation à 700 g pendant 10 minutes et repris dans 200 microlitres de HBSS contenant 20mM de
EDTA ; Divers tampons de lyse ont été testés :
Tampon D (NaCI 0. 075M, EDTA 0. 024 M, Hepes 0. 01 M)
Tampon DNP : idem que précédent mais contenant 0,5% (V/V) de
Nonidet P40)
Tampon DNP +10% de DMSO
Tampon DNP1 : idem que le tampon DNP mais la concentration en
Nonidet P40 est de 0, 1%
Tampon DNP1+ 10% de DMSO
Tampon de lyse Stratagene (BigBlue&commat; DNA isolation kit) suppémenté ou non avec 100 microgrammes/ml de proteinase K
Tampon A (TrisHCL 20 mM, glycerol 20%, NaCI 10mM, MgCl2 1,5 mM, EDTA 5 mM, Nonidet P40 0, 1%) La suspension est ensuite observée entre lame et lamelle au microscope à fluorescence équipé du filtre acridine orange après
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coloration par une solution d'acridine orange à 0, 01%. La présence de cellules individualisées est recherchée.
Aucun des essais listés de 1 à 5 ci-dessus n'a permis d'obtenir des suspensions de cellules individualisées appropriées pour la réalisation du test des comètes. En particulier, les procédés listés ci-dessus conduisent à un nombre trop faible de cellules individuelles et à la présence de gros agrégats de cellules non dissociées. De plus, les cellules sont souvent dégradées par la seule mise en oeuvre du procédé d'individualisation résultant en un bruit de fond important.
Au moment où le test de génotoxicité doit être réalisé, le protocole suivant est appliqué pour individualiser les cellules : Prélever le ou les épidermes correspondant au traitement considéré ; éliminer le maximum de couche cornée par stripping à l'aide de scotch 3M : t'épiderme est immobilisé sur un papier collant, face collagène ou nylon collée au support. Un masque comprenant un trou d'une taille très légèrement inférieure au diamètre de l'épiderme est posé dessus de manière à maintenir celui-ci. Cinq strippings successifs sont ensuite effectués avec un morceau de scotch (renouvelé à chaque fois) ; Le ou les épiderme (s) est (sont) ensuite détaché (s) du support, récupéré (s) dans un tube eppendorff ; Les peaux sont découpées finement et incubées % heure à 37 C dans 500 ut de Liberase, Blendzyme 4 (Roche molecular biochemical) à 0,09 mg/ml, soit 0,28 Wünsch units/ml dans du tampon salin HBSS (tous tampons salins de type PBS, tampon phosphate conviennent) ;
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Les enzymes sont ensuite inactivées avec 500 u) de PBS+2% de sérum de veau foetal (SVF) pendant 5 min dans de la glace ; Les tubes sont ensuite centrigués (5 min., 5000 tours par minute), et le culot resuspendu dans 100 u) de tampon HBSS ; Une filtration (sur tamis 0, 6 um) peut être effectuée à cette étape pour se débarrasser des plus gros débris.
Variations autour de ce protocole optimal : La concentration optimale en mélange enzymatique est de 0,28
Wünsch units/ml (concentration maximale conseillée) mais des concentrations comprises entre 0, 05 et 0,28 Wünsch units/ml seraient utilisables en adaptant le temps d'incubation ; Les temps d'incubation à 37 C peuvent varier de 30 minutes à 2 heures ; Si besoin, le tampon d'inactivation d'enzyme et tous les tampons suivants peuvent être supplémentés par 20 mM de EDTA afin d'inactiver d'éventuelles activités DNAse ; L'étape de stripping préalable des peaux est facultative ; Le culot peut être resuspendu dans des volumes variables de HBSS (de 25 à 500 microlitres).
L'utilisation du mélange d'enzymes Libérase Bledzyme TM 4 permet ainsi d'obtenir une suspension de cellules individualisées d'un équivalent de peau humaine appropriée pour les tests de génotoxicité sur cellules individualisées et en particulier pour la réalisation du test des comètes.
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EXEMPLE 2 : Procédé d'évaluation de la photogénotoxicité des UV solaires ou des UVA seuls appliqués à un équivalent de peau reconstruite Les unités de peaux reconstruites (produits Episkin tels que définis dans l'exemple 1) ont été irradiées pendant 30 minutes en lumière solaire (UVA + UVB) sous le simulateur solaire ORIEL. Le simulateur ORIEL est équipé d'une lampe au Xenon 1000W, d'un miroir dichroique et des filtres suivants : WG320 1,5 mm (Schott) pour les irradiations en UV atmosphérique (UVB+A, de 290 à 400 nm) et WG335 3 mm pour les irradiations aux UV-A seuls (de 320 à 400 nm). Les spectres de la lumière transmise aux échantillons sont analysés par spectroradiométrie (spectroradiometre Instaspect IV., Oriel).
Les puissances délivrées sont de 21,8 mW/cm2/min pour les UV atm (290- 400 nm) et de 15,72 mW/cm2/min pour les UV-A (de 320 à 400 nm).
Lors de l'irradiation, les nacelles reposent dans du PBS (les contrôles sont également transférés dans du PBS). Les épidermes sont remis dans du milieu d'essai à l'étuve pendant un temps de recouvrement variable de 30 minutes à 2 heures.
L'irradiation aux UVA se déroule pendant 15 minutes à 2 heures. Les nacelles reposent dans du PBS.
Les résultats de l'application du test des comètes sur les suspensions de cellules individualisées obtenues selon les procédés de l'invention montrent un effet génotoxique significatif des deux types de traitement par rapport au contrôle non irradié et sont présentés dans les figures 1A et 1B. On constate notamment que les cellules témoins ne comportent pas de comètes, démontrant ainsi que le procédé d'individualisation des cellules de l'invention n'est ni génotoxique, ni cytotoxique.
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EXEMPLE 3 : Procédé d'évaluation de l'effet photoprotecteur d'un filtre solaire, le Mexoryl&commat; SX, vis-à-vis de la photogénotoxicité Les essais de photoprotection consistent en l'application d'une solution de Mexoryl&commat; SX à 16. 10-3% dans du PBS sur les unités de peau reconstruites
Figure img00280001

(Produit Eposkin tel que décrit dans l'exemple) (100 ut par unité de peau).
Une fois protégées, les peaux sont irradiées sous UV atm. ou UVA comme indiqué dans l'exemple 2.
Les résultats obtenus par le test des comètes appliqué aux suspensions de cellules individualisées obtenues selon les procédés de l'invention sont présentés dans la figure 2. On constate que le test permet de révéler un effet protecteur à 100% du filtre Mexoryl&commat; SX vis-à-vis de la photogénotoxicité des UV solaires. Ces résultats montrent que le test est approprié pour la quantification de l'effet protecteur de filtres solaires.
EXEMPLE 4 : Procédé d'évaluation de la photosensibilisation induite par un produit spécifique, l'antibiotique Lomefloxacine après irradiation aux UVA Les essais de photosensibilisation sont réalisés par application de 2 mg/cm2 d'une crème formulée à 4% de Loméfloxacine (émulsion Huile dans Eau Arlacel 165, ou une solution de Loméfloxacine à 50 uM dissoute dans le milieu d'essai. Les unités de peaux reconstruites sont laissées en contact avec le produit photosensibilisant pendant 1 h à l'étuve puis irradiés 15 minutes aux UVA.
Les résultats du test des comètes appliqué aux suspensions de cellules individualisées obtenues selon les procédés de l'invention sont présentés dans la figure 3. On constate que le test permet non seulement de montrer un effet photosensibilisateur de l'antibiotique Loméflaxine mais en plus qu'il permet de quantifier l'effet photosensibilisateur selon le mode d'application, en topique ou dilué dans le milieu.
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EXEMPLE 5 : Procédé d'évaluation de la génotoxicité induite par une molécule chimique génotoxique, le 4 nitroquinoline N oxyde (4-NQO) (SIGMA).
Les équivalents de peaux sont traités par voie topique avec des solutions de 4-NQO (Sigma) dissous dans le PBS. La gamme de concentration suivante a été testée : 50,75, 100 et 150 micromolaires de 4-NQO.
Les équivalents de peaux sont laissés pendant trois heures à l'étuve à 37OC, 5% de CO2, en contact avec le produit. Au bout des trois heures de traitement, les équivalents de peaux sont rincés et les cellules individualisées selon le protocole décrit dans l'invention. Le test des comètes est ensuite réalisé selon le protocole décrit.
Les résultats du test des comètes appliqué aux suspensions de cellules individualisées selon les procédés décrits dans l'invention sont présentés dans la figure 4. On constate que le test permet de mettre en évidence de façon dose dépendante la génotoxicité induite par ce composé chimique de référence sur les systèmes d'équivalents de peaux.
EXEMPLE 6 : Utilisation d'une suspension de cellules individualisées telle qu'obtenue par le procédé de l'invention, à la mise en oeuvre du test du micronoyau.
Le test du micronoyau est utilisé pour mettre en évidence les dommages chromosomiques : cassure de chromosome (clastogénèse) ou perte de chromosome entier (aneugénèse) lors de la division de la cellule (Fenech M., Mutation Research 392 (1997) pp 11-18).
Ce test est utilisé de façon réglementaire pour l'évaluation in vivo des dommages chromosomiques et fait partie des différents tests de génotoxicité recommandée par les instances réglementaires internationales (ICH).
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Le test du micronoyau in vitro est réalisé sur tous types cellulaires (CHO, CHL, Lymphomes de souris, Lymphocytes humains normaux). Il permet de la même façon de mettre en évidence les dégâts chromosomiques induits par un xénobiotique donné (Rayonnement ultra violet, produits chimiques).
Ce test dans sa version in vitro est en cours de validation par les instances réglementaires et est recommandé par la nouvelle directive anglaise Comittee on mutagenicity of chemicals in food, consummer products, and the environment (COM) (2000) : Guidance on a strategy for testing of chemicals for mutagenicity, (J. Parry).
Le développement d'un test du micronoyau sur équivalents de peaux permet de disposer d'un test de génotoxicité sur un organe cible modélisé in vitro présentant ainsi une alternative aux tests in vivo chez l'animal.
Comme pour le test des comètes, le développement du test du micronoyau sur peaux reconstruites nécessite en préalable l'individualisation des cellules de l'équivalent de peau.
Les résultats obtenus par l'application des protocoles décrits ci-après et présentés dans la figure 5 confirment que la technique d'individualisation des cellules, décrite dans l'invention, permet d'obtenir des suspensions de cellules adaptées à la réalisation du test du micronoyau.
Le procédé d'obtention d'une suspension de cellules individualisées à partir d'équivalent de peaux, décrit dans l'exemple 1, a été utilisé.
La suspension cellulaire résultante a ensuite été filtrée sur un filtre 0,7 micromètre (Falcon), par centrifugation à 1000 tours par minute pendant 5 minutes.
Les cellules sont reprises dans 500 microlitres de tampon salin.
La réalisation du test du micronoyau nécessite la réalisation d'un choc osmotique, afin de faire gonfler le cytoplasme des cellules pour y
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distinguer la présence de micronoyaux éventuels. Les cellules sont ensuite fixées et étalées sur des lames de microscopie.
Deux protocoles de fixation ont été testés.
Protocole 1 : sur 2 peaux de chaque groupe, ajouter sur la suspension cellulaire 5 ml de KCI 0, 075M à température ambiante mis goutte à goutte sous agitation faible ; -laisser incuber 15 minutes à 37 C ; - ajouter 2,5 ml de fixateur méthanol/acide acétique (3/1) mis goutte à goutte sous agitation faible ; - centrifuger 5 minutes à 1000 rpm ; - enlever le surnageant, laisser 1000 ui pour suspendre le culot ; - ajouter 2,5 ml de fixateur méthanol/acide acétique (3/1) mis goutte à goutte sous agitation faible ; - centrifuger 5 minutes à 1000 rpm ; - enlever le surnageant, laisser 500 ul pour suspendre le culot ; - ajouter 2,5 ml de fixateur méthanol/acide acétique (3/1) mis goutte à goutte sous agitation faible ; - centrifuger 5 minutes à 1000 rpm ; - enlever le surnageant et laisser 250 ut pour suspendre le culot ; - ajouter 2,5 ml de fixateur méthanol/acide acétique (1%) mis goutte à goutte sous agitation faible ; - laisser incuber 15 minutes à température ambiante ; - centrifuger 5 minutes à 1000 rpm ; - enlever le surnageant, laisser 100 l pour suspendre le culot puis étaler les cellules sur lames de microscopie en verre ;
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- ajouter le colorant giemsa 5%.
Protocole 2 : sur 2 peaux de chaque groupe, - ajouter sur la suspension cellulaire 5 ml de KO 0, 075M à température ambiante mis goutte à goutte sous agitation faible ; - centrifuger 5 minutes à 1000 rpm ; - ajouter 2,5 mi de fixateur méthanol/acide acétique (6/1) mis goutte à goutte sous agitation faible ; - centrifuger 5 minutes à 1000 rpm ; - enlever le surnageant, laisser 1000 u) pour suspendre le culot ; - ajouter 2,5 ml de fixateur méthanol/acide acétique (6/1) mis goutte à goutte sous agitation faible ; - centrifuger 5 minutes à 1000 rpm ; - enlever le surnageant, laisser 500 u) pour suspendre le culot ; - ajouter 2,5 ml de fixateur méthanol/acide acétique (3/1) mis goutte à goutte sous agitation faible ; - centrifuger 5 minutes à 1000 rpm ; - enlever le surnageant, laisser 250 ut pour suspendre le culot ; - ajouter 2,5 ml de fixateur méthanol/acide acétique (3/1) mis goutte à goutte sous agitation faible ; - laisser incuber 15 minutes à température ambiante ; - centrifuger 5 minutes à 1000 rpm ; - enlever le surnageant, laisser 1000 ul pour suspendre le culot, puis étaler des cellules sur lame de microscopie en verre ; - ajouter le colorant giemsa 5%.

Claims (19)

  1. Wünsch)] du mélange résultant est compris entre 85 et 3900, de préférence supérieur à 600, et de manière encore préférée compris entre 600 et 1000 pendant une durée suffisante minimale pour obtenir une suspension de cellules individualisées, appropriée pour la réalisation de tests de génotoxicité.
    REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention d'une suspension de cellules individualisées issues d'un équivalent de peau humaine reconstruite, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) le prélèvement d'un échantillon d'un équivalent de peau humaine reconstruite ; b) le cas échéant, l'éminçage dans un volume de tampon salin de l'échantillon prélevé ; et, c) l'incubation de l'éminçat en présence d'une composition d'enzymes comprenant la combinaison de collagénases I et Il et de protéases selon une proportion telle que le ratio des activités [caséinase (unité FITC caséine)]/ [collagénase (unité
  2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en que le temps d'incubation de l'éminçat en présence de la composition d'enzymes est compris entre 15 minutes et 3 heures, de préférence inférieur à 1 heure.
  3. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'éminçage de l'échantillon prélevé est réalisé dans un tampon salin sélectionné parmi l'une des solutions suivantes : un tampon phosphate ; une solution PBS ;
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    une solution HBSS ; ou, une solution de EARLE.
  4. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le ratio des activités caséinase/collagénase de la composition d'enzyme utilisée est compris entre 600 et 1000.
  5. 5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel la composition d'enzymes est constituée d'un mélange de collagénases 1 et Il et de protéases neutres purifiées de C. histolyticum.
  6. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la concentration de la composition enzymatique pendant la phase d'incubation est comprise entre 0,05 et 0,35 Wünsch units/ml ou environ 0,05 à 2 mg/ml.
  7. 7. Procédé d'évaluation de la génotoxicité d'un traitement appliqué à un équivalent de peau humaine reconstruite, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. l'application du traitement à évaluer à un équivalent de peau humaine reconstruite ; b. l'obtention d'une suspension de cellules individualisées issue de l'équivalent de peau traité, par mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 ; c. l'évaluation de la génotoxicité du traitement appliqué à l'aide d'un test de génotoxicité sur cellules individualisées.
  8. 8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel le test de génotoxicité sur cellules individualisées est un test des comètes (Single Cell Gel
    Electrophoresis assay), ledit test des comètes comprenant :
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    a, l'inclusion des cellules individualisées dans un gel d'électrophorèse, b. la lyse des cellules contenues dans le gel, c. l'application d'un champ électrique au gel pour provoquer la migration des fragments d'ADN nucléaire dans ledit gel, d. l'analyse et/ou la quantification des profils de migration d'ADN nucléaire pour chaque cellule, et e. la détection de l'effet génotoxique du traitement à évaluer, appliqué initialement.
    Figure img00350001
  9. 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel la lyse des cellules est réalisée pendant 2 heures environ dans le tampon de lyse de Singh.
  10. 10. Procédé selon la revendication 7, dans lequel un test de génotoxicité sur cellules individualisées est le test du micronoyau ou le test des aberrations chromosomiques.
  11. 11. Procédé selon l'une des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que un traitement appliqué à un équivalent de peau reconstruite est la mise en contact de l'équivalent de peau avec un produit ou une composition constituant un stimulus chimique de génotoxicité.
  12. 12. Procédé selon l'une des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que un traitement appliqué à un équivalent de peau reconstruite est un traitement aux UV solaires ou aux UVA seuls.
  13. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que, préalablement au traitement appliqué, l'équivalent de peau reconstruite est mis en contact avec un produit ou une composition susceptible d'entraîner une photoprotection ou avec un produit ou
    <Desc/Clms Page number 36>
    une composition susceptible d'induire une photosensibilisation vis-àvis de la génotoxicité du traitement aux UV.
  14. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que l'équivalent de peau reconstruite est constitué d'un équivalent d'épiderme vivant et d'un équivalent de derme.
  15. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que l'équivalent de peau reconstruite est constitué d'un biomatériau à base de collagène comportant intimement associés un support ou substitut dermique comprenant une couche essentiellement de collagène de type IV et un épithélium épidermique à cellules différenciées obtenu par culture de cellules épidermiques sur ladite couche dudit support ou substitut dermique.
  16. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que l'équivalent de peau reconstruite comprend en outre des mélanocytes et/ou des cellules de Langerhans.
  17. 17. Utilisation d'un mélange d'enzyme comprenant la combinaison de collagénases 1 et Il et de protéases selon une proportion telle que le ratio des activités caséinase 1 collagénase du mélange résultant est compris entre 85 et 3900, de préférence supérieur à 600, et de manière encore préférée compris entre 600 et 1000 pour l'obtention d'une suspension de cellules individualisées issues d'un équivalent de peau humaine reconstruite.
  18. 18. Suspension de cellules individualisées issues d'un équivalent de peau humaine, caractérisée en ce que lesdites cellules individualisées sont détachées les unes des autres et dépourvues de matrice extracellulaire.
    <Desc/Clms Page number 37>
  19. 19. Suspension de cellules individualisées selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
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