FR2986238A1 - Milieu de culture empirique acellulaire pour la croissance des bacteries intracellulaires - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé de préparation d'un milieu de culture empirique acellulaire apte à permettre la culture d'une bactérie intracellulaire donnée apte à être cultivée par culture cellulaire dans un type de cellule eucaryote donné caractérisé en ce qu'on réalise les étapes successives suivantes: 1) on casse les membranes des cellules eucaryotes d'un échantillon de cellules du dit type de cellules donné, et 2) on récupère une suspension aqueuse contenant les composants et résidus de plus petites tailles en dispersion ou solubles dans l'échantillon cellulaire déstructuré de l'étape 1. La présente invention fournit également un mmilieu de culture empirique obtenu par le procédé selon l'invention comprenant une suspension aqueuse d'un lysat cellulaire constitué d'un jus cytoplasmique comprenant le contenu endoplasmique de dites cellules eucaryotes d'un type donné et des composants et résidus dudit lysat cellulaire en dispersion ou solubles dans le jus cytosolique, de préférence de tailles inférieures à 5 microns.

Description

Milieu de culture empirique acellulaire pour la croissance des bactéries intracellulaires L'invention a pour objet des milieux de culture et une méthode pour cultiver des bactéries réputées intracellulaires dans un milieu composé essentiellement de jus cytoplasmique, en culture liquide ou solide, notamment les bactéries intracellulaires et plus particulièrement les bactéries pathogènes intracellulaires fastidieuses, c'est-à-dire difficile à cultiver, suivantes : - Coxiella burnetii, une bactérie intracellulaire stricte qui détermine la maladie appelée la fièvre Q, - Rickettsia conorii (agent de la Fièvre boutonneuse méditerranéenne), jusqu'à maintenant cultivé exclusivement sur les cellules, et - Tropheryma whipp/ei (agent de la maladie de Whipple).

L'invention visait initialement en particulier l'isolement et l'établissement en culture de la bactérie Coxiella burnetii à partir de d'échantillons de prélèvements biologiques de patients atteints de la fièvre Q, notamment de valve cardiaque des patients souffrant des endocardites infectieux à C. burnetii.

Cette bactérie est réputée difficilement cultivable sur un milieu axénique, comme la plupart des bactéries intracellulaires. Dans Renesto et al., 2003 [15], on a décrit un milieu supplémenté en acides aminés, déterminé à partir des données d'analyse du génome de la bactérie T. whipp/ei, qui a permis la culture sans cellules de cette autre bactérie réputée incultivable en milieu acellulaire. Le génome de C. burnetii (1.995.275-bp genome of Coxiella burnetii, Nine Mile phase I RSA493) est relativement assez grand et extrêmement bien équipé, et ne semble manquer d'aucune voie métabolique importante qui pourrait expliquer l'incapacité de cultiver C. burnetii en milieu axénique par la compensation des voies métaboliques [1]. Ogata et al., [2] ont élaboré un logiciel qui permet in silico de déterminer un milieu axénique pour la culture bactérienne en se basant sur les voies métaboliques pouvant être analysé grâce aux génomes séquences. Les inventeurs ont réalisé plusieurs essais préliminaires utilisant ces données, en particulier l'analyse des protéines de C. burnetii, lesquels montrent qu'elles gardent l'activité enzymatique en milieu acide. Les inventeurs ont essayé les milieux à pH acide (pH=5) (de type BCYE ou BSKH). Tous ces essais se sont révélés infructueux. D'autre équipe procédant à une autre analyse, basée sur la réponse en culture de C. burnetii par addition de différents réactifs, ont réussi la culture axénique de C. burnetii dans un milieu chimiquement défini. Cette culture a fait objet d'un brevet WO 2010/096640 revendiquant la mise au point d'un milieu de culture dénommé ACCM (ACCM=acidified citrate cysteine medium) amélioré en AACM-2 adapté aux bactéries pathogènes donnant comme exemple C. burnetii. Ce travail a aussi fait d'objet de publications [3,4]. Ce milieu a permis l'obtention de colonies (0.01mm de diamètre) en 6 jours [4]. Par ailleurs, ce milieu de culture ACCM ou ACCM-2 ne permet pas de cultiver des bactéries intracellulaires fastidieuses autres que Coxiella burnetii telles que les bactéries R. conorii, R. africae, T. whipplei, Orientia tsutsugamushi et Mycoplasmes.

Jusqu'à présent, la seule méthode de production industrialisable de la bactérie C. burnetii, c'est-à-dire suffisamment rapide et fiable, et qui permette de conserver l'antigénicité de la bactérie reste le passage de la bactérie chez l'animal pour garder C. burnetii en phase I (forme dite »virulente »). Une culture de la bactérie en laboratoire sur cellules [5] donne la forme dite « avirulente » (phase II). Une perte de virulence chez C. burnetii cultivée en milieu ACCM-2 est observée après plusieurs passages (23éme passage) en culture [6]. La conservation de la « virulence » est un facteur important pour le développement de vaccins. Le but de la présente invention est donc de fournir un nouveau milieu et nouveau procédé de culture acellulaire amélioré.

Plus particulièrement, le but de la présente invention est de fournir un nouveau milieu et nouveau procédé de culture acellulaire plus simple et plus rapide à réaliser et à mettre en oeuvre qui permette une production industrielle de la bactérie intracellulaires fastidieuses , notamment C. burnetii, notamment de phase I, mais aussi d'autres bactéries telles que R. conorii ou T. whipp/ei ou d'autres bactéries fastidieuses. Le concept à la base de la présente invention était fondé sur l'hypothèse qu'un milieu empirique constitué d'un extrait acellulaire comprenant seulement le jus cytoplasmique de cellules aptes à 15 permettre la culture d'une bactérie serait suffisant pour permettre la croissance de la bactérie en culture dans un tel milieu, en dépit de l'absence de l'intégrité de la cellule. Plus précisément, pour ce faire la présente invention fournit un procédé de préparation d'un milieu de culture empirique acellulaire apte 20 à permettre la culture d'une bactérie intracellulaire donnée apte à être cultivée par culture cellulaire dans un type de cellule eucaryote donné caractérisé en ce qu' on réalise les étapes successives suivantes: 1) on casse les membranes des cellules eucaryotes d'un échantillon de cellules du dit type de cellules donné, et 25 2) on récupère une suspension aqueuse contenant les composants et résidus de plus petites tailles en dispersion ou solubles dans l'échantillon cellulaire déstructuré de l'étape 1.

Ce procédé permet de fournir un milieu acellulaire empirique similaire à un milieu axénique pour cultiver des bactéries dont on ne connait pas de tel milieu axénique de culture. A l'étape 1), de façon connue, on réalise une lyse mécanique, de préférence par broyage et/ou une sonication, et on obtient un échantillon de cellules déstructurées encore appelé extrait cellulaire ou lysat cellulaire. Les membranes cellulaires comprennent ici les parois membranaires externes et les membranes plasmiques internes. D'autres modes de lyse mécanique comprennent la lyse par pression (« French Press ») ou des successions de cycles de congélation-décongélation. A l'étape 2), on réalise au moins une, de préférence plusieurs, centrifugation(s) à basse vitesse, de préférence de 200 g à 500 g, dudit échantillon cellulaire déstructuré de l'étape 1), et on en récupère le 15 surnageant. En d'autres termes, la suspension aqueuse visée à l'étape 2) est donc constituée par le surnageant de centrifugation du lysat cellulaire issu de l'étape 1). Ainsi, on élimine les débris cellulaires sédimentés dans le culot. 20 A l'étape 2), on récupère une suspension aqueuse de l'extrait cellulaire déstructuré issue de l'étape 1) , ladite suspension aqueuse comprenant le contenu endoplasmique de la cellule comprenant le jus cytosolique et les noyaux et organites et/ou morceaux de noyaux et organites et autres composants biochimiques du cytoplasme en 25 dispersion ou solubles dans le jus cytosolique, et on élimine les débris et autres morceaux ou particules non dispersables et/ou non solubles dans ladite suspension aqueuse. De façon connue, le contenu endoplasmique de la cellule comprend : le noyau, des macromolécules notamment des protéines 30 telles que des enzymes, des organites comprenant entre autres des mitochondries ou chloroplastes, des réticulums endoplasmiques, des vacuoles, des ribosomes, l'appareil de Golgi et d'autres espèces ou molécules biochimiques en dispersion ou soluble dans ledit jus. L'extrait cellulaire déstructuré récupéré à l'issue de l'étape 2) est une suspension ou dispersion liquide qui peut aussi comprendre des plus petits débris de membrane plasmique et/ou membranes d'organites et/ou des morceaux d'organites brisés le cas échéant. Toutefois, le cas échéant, à l'étape 2), les dits noyaux et organites en dispersion dans l'extrait cellulaire récupérés ne sont pas déstructurés.

En pratique, à l'issue de l'étape 1), l'échantillon cellulaire déstructuré comprend des composants et résidus de tailles inférieures à 10 microns (pm). Une telle procédure permet de ne pas dégrader les macromolécules, notamment les enzymes, contenus dans lesdites cellules. De préférence, après l'étape 2), on stérilise l'extrait cellulaire récupéré à l'étape 2), de préférence par filtration en avec un filtre de pores d'environ pas plus de 0,25 pm et on récupère le filtrat. Ceci permet d'éliminer les composants de tailles inférieures à 0,25 pm.

Avantageusement, lesdites cellules sont aptes à permettre une culture cellulaire de bactéries intracellulaires. Avantageusement encore, lesdites cellules sont aptes à permettre une culture cellulaire de bactéries intracellulaires « strictes » non cultivables en milieu axéniques conventionnels composés exclusivement de composés chimiques). Plus particulièrement encore, lesdites cellules « déstructurées » sont aptes à permettre une culture cellulaire de bactéries intracellulaires choisies parmi : Coxiella burnetii, les bactéries des genres Rickettsia, de préférence R. conorii et R. africae, Tropheryma, de préférence Tropheryma whipp/ei, mycobactéries, de préférence Mycobacterium tuberculosis, leptospira, Orientia, de préférence Orientia tsutsugamushi, les bactéries Mycoplasmes et les bactéries spirochètes. Plus particulièrement encore, lesdites cellules sont choisies parmi les cellules VERO, L929, MCR5 et HEL. Plus particulièrement encore, à l'étape 1, on réalise les deux sous étapes successives suivantes : la- on réalise une culture des cellules d'un dit type de cellules donné dans un premier milieu de culture apte à permettre la culture des 10 cellules du type de cellule donné, de préférence choisis parmi les cellules Vero, MRC5, L929 et HEL, et lb- on casse les parois membranaires et membranes plasmiques des cellules d'un échantillon d'une culture dudit type de cellules donné contenant un dit milieu de culture desdites cellules données. 15 Ainsi, L'extrait cellulaire déstructuré récupéré à l'étape 2) contient les composants dudit premier milieu de culture. La présente invention fournit donc également un milieu de culture obtenu par le procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend une suspension aqueuse d'un lysat cellulaire constitué d'un jus 20 cytoplasmique comprenant le contenu endoplasmique de dites cellules eucaryotes d'un type donné et des composants et résidus dudit lysat cellulaire en dispersion ou solubles dans le jus cytosolique, de préférence de tailles inférieure à 1/10 de la taille de la cellule , notamment inférieure à lOpm, de préférence inférieure à 5 pm. La taille 25 typique d'une cellule eucaryote est de 10-100pm, plus généralement de 20 à 40 pm. Plus particulièrement encore, un milieu de culture empirique selon l'invention comprend en outre les composants dudit premier milieu de culture apte à cultiver lesdites cellules eucaryotes.

Plus particulièrement encore, ledit premier milieu de culture comprend des espèces ioniques : Na+, Ca+, K+, Mg2+, Fe2+, Cl-, 504-,PO4, NO3-,HCO3- et des facteurs de croissances biochimiques tels que des sucres et des acides aminés, de préférence comprenant la L glutamine.

Plus particulièrement encore, ledit premier milieu de culture est choisi parmi les milieux EMEM, M4, RPMI, et DMEM F12 c. Le milieu M4 est un milieu EMEM supplémenté en SVF (4%) (sérum de veau foetal) et en Glutamine (1%). Plus particulièrement encore, ledit premier milieu de culture est le 10 milieu EMEM comprenant les composants suivants: KCI, KH2PO4, NaHCO3, NaCI, Na2HPO4 et D-glucose. Les inventeurs n'arrivaient pas toujours à obtenir des sous- cultures avec le milieu ci-dessus pour certaines bactéries C. burnetii, après avoir repiqué ces bactéries au 6ème jour, et, ces résultats n'étaient 15 pas toujours reproductibles d'une expérience à une autre expérience. Après de nombreux essais, les inventeurs ont amélioré les résultats et ont déterminé des conditions de culture reproductibles. La mise en place d'un protocole de coloration par l'acridine orange a permis de montrer qu'en réalité les bactéries se multipliaient pendant une courte période 20 initiale, mais qu'au bout de 48 heures, elles ne se multipliaient plus, et que la plupart d'entre elles étaient mortes dans certains cas. La présente invention a permis de découvrir qu'en changeant le milieu de culture, soit en rajoutant du milieu, soit en centrifugeant les bactéries pour les réinoculer dans un milieu frais à des intervalles de 25 temps de pas plus de 48hr, il est possible d'obtenir des sous-cultures en milieu microaérophile. En outre, après de nombreux essais , il a été découvert qu'il y avait un composant labile à l'intérieur de ce milieu de culture , à savoir principalement l'ATP, qui faisait que les bactéries n'arrivaient plus à se 30 multiplier au bout de 48 heures. L'ATP est la molécule qui stocke l'énergie et permet les réactions enzymatiques dans la plupart des cas.

Il peut, parfois être remplacé par de l'UTP ou du GTP. L'ajout de l'ATP à une concentration d'au moins 5 mM, de préférence 10 mM (soit un taux en excès par rapport au taux de l'ATP à l'intérieur d'une cellule, lequel varie entre 7.4pM à 3.3mM) a permis une croissance rapide des trois bactéries, mais cette croissance est aussi rapide et diminue rapidement du fait présumé de la labilité de l'ATP et l'ajout régulier d'ATP, tous les 24 ou 48 heures, permet d'obtenir un milieu de culture optimal. Une autre condition de culture à contrôler est celle de la tension d'oxygène. Les bactéries intracellulaires vivent dans des tensions basses d'oxygène et il faut, pour pouvoir les cultiver, avoir des tensions d'oxygène aux alentours de pas plus de 5%. Un des moyens de substituer cette diminution de la tension d'oxygène, qui a un coût élevé car il faut avoir des étuves à oxygène contrôlé spécifiques, est d'associer des composés antioxydants du type acide ascorbique qui 15 permettent de mettre en oeuvre ce milieu avec des tensions d'oxygène plus élevées. Un autre moyen pour minimaliser les pressions d'oxygène dans le milieu est la culture en tube gélose, ayant pour propriété de fournir une répartition plus homogène du gradient d'oxydo-réduction. De préférence, ledit milieu empirique selon l'invention est 20 supplémenté en composant(s) choisis parmi du sérum de bovin (SVF), de préférence du SVF, du methy1-13 -cyclodextrine (M- PC), un nucléoside triphosphate, de préférence de l'ATP, un agent anti oxydant, de préférence de l'acide ascorbique, des acides aminés non essentiels (Glycine, L-Alanine, L-Asparagine, L- acide Aspartique, L- acide 25 Glutamique, L-Proline, L-Serine), et de la glutamine. D'autres nucléosides triphosphates peuvent être UTP ou GTP notamment. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture présente un PH optimal de 4,5 à 7, de préférence tamponné à un PH de 4,5 à 5.

Les inventeurs ont évalué l'impact d'une lyophilisation sur la qualité de ce milieu de culture selon l'invention et mis en évidence que le milieu reste actif après lyophilisation. Les inventeurs ont aussi préparé un milieu de culture solide en ajoutant de l'agar et/ou de l'agarose, notamment de l'agar de Schaedler (0.25%-0.5%), et mis en évidence des colonies qui poussent à l'intérieur de l'agar en 5-6 jours. L'invention permet ainsi, de tester d'activité des antibiotiques in vitro dans les géloses avec des réponses en moins d'une semaine. Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture empirique selon l'invention se présente sous forme solide, de préférence de gel d'agarose ou d'agar, de préférence d'agar de Schaedler et de préférence encore mis en oeuvre dans un tube. Cette mise en oeuvre en tube est avantageuse car elle favorise la microaérophilie. 15 On réalise un milieu solide par mélange d'agarose ou d'agar, de 0,1 à 1%, avec un dit extrait cellulaire récupéré à l'issue de l'étape 2).11 peut s'agir aussi de gélatine ou amidon par exemple. Plus particulièrement encore, un milieu de culture empirique dit « amélioré » liquide ou solide est supplémenté en composants 20 comprenant une combinaison de : - sérum de bovin, de préférence du SVF, ou methy1-13 - cyclodextrine (M- PC), et - nucléoside triphosphate, de préférence de l'ATP, - tous les acides aminés non essentiels (à savoir Glycine, L25 Alanine, L-Asparagine, Acide Aspartique -L, Acide Glutamique-L, LProline, et L-Serine); - glutamine, et - le pH dudit milieu de culture est tamponné à pH de 4,5 à 5.

La présente invention fournit également un procédé de culture d'une bactérie intracellulaire donnée connue pour être apte à être cultivée par culture cellulaire dans un type de cellule eucaryote donné, caractérisé en que l'on ensemence un inoculum de ladite bactérie dans un milieu de culture empirique constitué d'une suspension aqueuse d'un extrait cellulaire déstructuré selon l'invention. Plus particulièrement encore, on cultive une bactérie choisie parmi les bactéries intracellulaires. Plus particulièrement encore, on cultive une bactérie choisie parmi 10 les bactéries intracellulaires non cultivables en milieu axéniques composés exclusivement de composés chimiques. Plus particulièrement encore, on cultive une bactérie choisie parmi les bactéries des genres Rickettsia, Leptospira, Mycobacterium, spirochètes, Mycoplasmes , Orientia, Coxiella, et Tropheryma, de 15 préférence les espèces Rickettsia conorli, Coxiella burnetii , Tropheryma whipp/ei, Mycobacterium tuberculosis et Orientia tsutsugamushi. Plus particulièrement encore, on cultive une bactérie Coxiella burnetii, de préférence la bactérie C. burnetii de phase I dite « virulent »., ladite bactérie conservant son caractère antigénique . La 20 bactérie C. burnetii de phase I est la bactérie pathogène utile pour préparer un vaccin. Plus particulièrement encore, on cultive une bactérie C. burnetii isolée et établie en culture à partir d'un échantillon tissulaire, de préférence de valve cardiaque. 25 De préférence, on réalise la culture en atmosphère microaérophilie, de préférence contenant pas plus de 2,5% d'oxygène, et on effectue des renouvellements périodiques de milieu de culture liquide, de préférence tous les 2 jours et/ou on rajoute de l'ATP périodiquement, de préférence tous les 24 à 48 h. On obtient des colonies de bactéries sur un dit milieu de culture empirique solide en pas plus de 6 jours. Plus particulièrement encore, on rajoute de l'ATP de manière à maintenir la concentration en ATP en excès par rapport à la concentration endogène intracellulaire, de préférence une concentration supérieure à 5 mM, compte-tenu de son caractère relativement labile. Plus particulièrement, le milieu empirique selon l'invention dit « amélioré » décrit ci-dessus (pH=4.5) permet l'obtention de colonies (de 0.05-0.1 mm de diamètre) en 5-6 jours d'incubation en conditions de microaérophilie. Au total, ce milieu et ces conditions de culture ont permis pour la première fois de cultiver Rickettsia conorii et Rickettsia africae qui sont des bactéries intracellulaires stricte, et le premier permettant de cultiver, en milieu sans cellule, une bactérie du groupe des Rickettsia.

Par ailleurs, ce milieu est le seul milieu axénique permettant la culture, à la fois, de Coxiella burnetii et Tropheryma whipp/ei. Ce milieu est donc à la fois très performant puisque c'est le premier à permettre la culture des Rickettsies et, d'autre part, c'est un milieu polyvalent puisqu'il permet la culture d'autres bactéries fastidieuses à travers un milieu unique, qui peut servir ainsi à cultiver toutes ces bactéries fastidieuses, fastidieuse voulant dire bactérie difficile à cultiver. En outre, les moyens et méthode de l'invention sont très avantageux, car la production rapide sur grande échelle de C. burnetii de phase I permet de conserver son antigénicité et donc mettre au point un vaccin acellulaire en particulier pour les animaux infectés mais aussi pour les humains. Enfin l'antigène conservé dans ces conditions peut aussi être utilisé dans les techniques de sérologies et du diagnostic moléculaire. Pour de nombreuses applications médicales, la culture de Coxiella burnetii sur un milieu de culture facile à préparer et manipuler, ouvre donc de nouvelles perspectives cliniques telles qu'une rapide réalisation de l'antibiogramme, une purification facile de la bactérie en vue d'extraction de protéines et/ou acides nucléiques, et donc développement de nombreuses technologies, telles que la sérologie et le vaccin. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont présentés dans la description détaillée et les exemples qui suivent en référence aux figures suivantes. La figure 1 représente un gel d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide du type SDS PAGE : - piste V = extrait de milieu empirique selon l'invention constitué d'un extrait cellulaire ou jus cytoplasmique microfiltré (0.22p), obtenu à partir de cellules Vero et du milieu M4 (milieu V) - piste F = filtrat d'ultrafiltration (3 kDa) du milieu V - piste C = concentrat d'ultrafiltration (3 kDa) du milieu V La figure 2 représente les courbes de croissance de C. burnetii dans différents milieux de culture empiriques suivants : - V = jus cytoplasmique microfiltré de cellules Véro - F = filtrat d'ultrafiltration de V - C = concentrat d'ultrafiltration de V La figure 3 représente des courbes de croissance de C. burnetii dans les différents milieux de cultures empiriques suivants : - A = milieu V de la figure 2 + PMSF - B = milieu V + PMSF + protéinase K (PK) - C = concentrat de V + PMSF + PK Les figures 4A et 4B représentent des courbes de croissance de C. burnetii de phase I et de phase II avec et sans changement de milieu de culture tous les 24 h. avec un milieu de culture V (pH=6.8). Les courbes A et B correspondent à C. burnetii de phase II sans (courbe A) ou avec (courbes B) changement du milieu tous les 24h. Les courbes C et D correspondent à C. burnetii phase I sans (courbes C) et avec (courbes D) changement du milieu tous les 24h. Pour les figures 2, 3B et 4A, la croissance de C. burnetii a été évaluée au moyen de la quantification de l'ADNc par la RT-PCR en temps réel, l'échelle du temps (t) en abscisse étant graduée en jours et le comptage des bactéries en ordonnée étant gradué en nombre de copies d'ADNc par ml. Pour la figure 4B, on a réalisé le comptage de bactéries colorées à l'acridine orange (AO), l'échelle de temps en abscisses étant graduée en jour (t) et le comptage des bactéries en ordonnées étant gradué en nombre de bactéries viables par ml. 15 La figure 5 représente des courbes de croissance de souches C. burnetii dans des milieux empiriques selon l'invention, obtenues à partir du milieu M4 et de cellules Vero (courbe A), MRC5 (courbe B), L929 (courbe C) et HEL (courbe D). Sur la figure 5, la croissance de C. burnetii a été évaluée au moyen de la coloration par l'acridine orange 20 (AO) et en parallèle par la RT-PCR en temps réel, l'échelle du temps (t) en abscisse étant graduée en jours et le comptage des bactéries en ordonnée étant gradué en nombre de copies d'ADNc par ml. Les figures 6 et 7 décrivent les courbes de croissance de C. burnetii avec différents milieux, dans lesquelles : 25 - La figure 6 représente une croissance de C. burnetii estimée par RT-PCR en temps réel dans : Courbe A= un milieu V à pH 6,8, Courbe B= milieu V acidifié avec de l'acétate (pH=4.5) (AVE), Courbe C= milieu V acidifié avec de l'acétate (pH=4.5) et lyophilisé (LAVE). Les résultats sont exprimés en ordonnées par le rapport normalisé égal à la moyenne de copies l'ADNc divisé par la moyenne de l'inoculum au départ, l'échelle du temps (t) en abscisse étant graduée en jours. La figure 7 représente les courbes de croissance de C. burnetii estimé au moyen de comptage des bactéries viables colorées par l'AO: Courbe A= un milieu V à pH 6,8, Courbe B= milieu V acidifié avec de l'acétate (pH=4.5) (AV), Courbe C=milieu V acidifié avec de l'acétate (pH=4.5) et lyophilisé (LAV), Courbe D= milieu V dit « amélioré » avec de l'ATP, L-Glutamine, des acides aminés non essentiels et du M-(3E au lieu du SVF dans le milieu M4 à pH 4-5. 15 La figure 8 représente la courbe de croissance comparative de C. burnetii dans du milieu empirique selon l'invention, obtenu à partir de cellules CD14+ (monocytes), cellules dans lesquelles C. burnetii ne peut pas être cultivée. La croissance de la bactérie a été quantifiée au moyen de la technique AO. 20 Exemple 1 : Milieu de culture empirique acellulaire pour la croissance de Coxiella burnetii, l'agent de la maladie de la Fièvre Q. 1. Matériels et méthodes. 1.1 Culture et purification de C. burnetii. C. burnetii souche Nine Mile phase II (RSA 439) a été propagée 25 sur les fibroblastes L929 (collection ATTC Institut Pasteur) cultivées dans le milieu RPMI (Invitrogen) auquel on a ajouté 2% du sérum d'origine bovine (Invitrogen) précédemment décomplémenté par chauffage (56°C, 30 min). Huit à dix jours post infection, les cellules ont été décrochées au moyen de billes de verre, ensuite centrifugées à basse vitesse (1000 rpm, 15 min, 4°C). Le surnageant est filtré (5 p) et à nouveau centrifugé (7500 rpm, 10 min, 4°C). Le culot obtenu est repris dans le tampon phosphate salin pH 7.4 et filtré (1.2 p). Le contrôle de la qualité et de la pureté de la préparation a été réalisé au moyen de la coloration de Gimenez (Figure 3)[7]. La quantification de C. burnetii a été réalisée par RT-PCR en temps réel par emploi des amorces (F : 5' CCGATGGTTCCCAGAGATAA3' et R : 5'TCTGGGAAGCTACCGCTTTA3' et de la sonde : 6-FAM-GCCGGCTACGACGTCACTCGA-TAMRA) spécifiques de la bactérie ciblant un gène de ménage CBIl 302 (rpoZ) [8] et en parallèle par comptage au microscope de bactéries colorées à l'AO. Les aliquotes de C. burnetii purifiée sont destinées au réensemencement du tapis cellulaire.

C. burnetii de phase I a été isolée à partir d'un organisme infecté (humain ou animal de laboratoire). Les passages répétées de C. burnetii NMI sur les cellules en cultures [18] engendrent le changement de phase (phase I devienne phase II). La réversion de phase est connue lorsqu' on réalise un passage de phase II à nouveau dans un animal [19]. Au laboratoire, on isole C. burnetii NMI à partir de la rate des souris infectées par C. burnetii sur les cellules L929. C. burnetii NM I garde ses propriétés antigéniques de phase I maximum en étant propagée 2 fois sur les cellules. L'inoculum de C. burnetii NMI est purifié à partir de ces cellules L929 dite de « peu de passages » (2 passages maximum) en suivant le même protocole que pour la C. burnetii phase II. 1.2 Extraction et purification de l'ARN et élimination de l'ADN contaminant Les bactéries sont lysées dans le tampon Tris EDTA pH 8, contenant 600 pg/ml de Lysozyme, pendant 5 à 10 minutes. L'extraction et la purification des ARNs totaux sont ensuite réalisées sur colonne de silice avec les MiniKit RNeasy (Qiagen) en suivant les instructions du fabricant. Ce protocole inclus le traitement à la DNAse I de Qiagen pendant 15 min. La réaction est inactivée par incubation à 65°C pendant 10min. L'ARN ainsi purifié est élue dans l'eau traitée pour être dépourvue de RNase. La qualité de l'ARN est vérifiée par l'électrophorèse capillaire sur nano-puces selon les instructions du fabricant (Agilent). 1.3 Estimation de la viabilité bactérienne par qRT-PCR. La viabilité de la bactérie est établie sur la base de l'amplification de l'ADNc par RT-PCR en une étape (SuperScript qRT-PCR, Invitrogen) en employant des oligonucléotides spécifiques du gène du ménage, présent en une seule copie sur le chromosome, CSIJ 302 (rpoZ): F : 5' CCGATGGTTCCCAGAGATAA3' et R : 5'TCTGGGAAGCTACCGCTTTA3' et de la sonde : 6-FAM-GCCGGCTACGACGTCACTCGA-TAMRA [9]. La courbe de viabilité est établie sur l'échantillonnage toutes les 24h durant au moins une semaine de culture. La courbe de croissance a été estimée au moyen de la coloration à l'Acridine Orange (AO). AO est une coloration sélective métachromatique des acides nucléiques. AO interagit aussi bien avec de l'ARN que de l'ADN comme agent intercalant et par les forces électrostatiques. L'ADN qui a été intercalé a une fluorescence verte (525 nm) et l'ARN lié au colorant par les interactions électrostatiques, possède une fluorescence rouge (>630 nm). Cette coloration par AO est très utilisée pour différencier ce qui est quiescent (coloré en vert) de l'activé (coloré en orange), donc c'est un moyen pour établir la courbe de croissance de C. burnetii dans le milieu acellulaire empirique. Le protocole réalisé dans cette expérience a été celui de Darzynkiewicz et al. [4]. Ce protocole est adapté pour un comptage direct en microscopie optique (Direct microscopic count) selon la méthode de Breed. Cette méthode consiste à déposer un volume connue (200 pl) sur une lame destinée à la coloration AO. La lame est observée à l'objectif x100. Le nombre de bactéries viables par champ est compté sur un nombre de champs compris entre 20 et 50. Le résultat peut s'exprimer par rapport à la formule suivante : N=nmoy x S frottis I V X S champ (nmoy= nombre moyen de bactéries par champ), S champ=nD2/4 (cm2), D=diamètre du champ en cm, S frottis=surface d'étalement (1 cm2), V=volume du prélèvement=200 pl (0,2 ml), N=concentration de bactéries/ml. 2. Préparation du milieu de culture empirique acellulaire et conditions de l'incubation selon l'invention. 2.1 Préparation du milieu liquide Les tapis cellulaires confluents de cellules Vero (fibroblastes provenant du rein de singe africain (Cercopitheus aethiops), (Institut Pasteur), ont été obtenus ayant un aspect de fibroblastes fusiformes et un pouvoir adhésif sur le support de verre ou plastique grâce aux ions Cal, ou Mg2+. Les cellules Vero (fibroblastes provenant du rein de singe africain (Cercopitheus aethiops), (Institut Pasteur ont été cultivées dans le milieu M4 (Invitrogen) en présence de 4% du sérum d'origine bovine précédemment décomplémenté (30 min, 56°C) (Invitrogen). Le milieu M4 est constitué de milieu EMEM (composition au tableau 1 ci-après) supplémenté avec du SVF (4%) et de la glutamine (1%). Tableau 1 : Milieu EMEM employé pour la culture des cellules Véro : COMPOSANTS Poids Moléculaire Concentration mM (mg/L) (KCI) 75 400 5,33 (KH2PO4) 136 60 0,441 (NaHCO3) 84 350 4,17 (NaCI) 58 8000 137,93 (Na2HPO4) anhydre 142 48 0,338 D-Glucose(Dextrose) 180 1000 5,56 Rouge de phénol 376,4 10 0,0266 Les cellules ont ensuite été détachées au moyen d'une lyse mécanique avec des billes de verre ou grattoir. Le contenu a été ensuite sonique (Q700, Qsonica, Newtown, CT06470, USA) en employant la puissance 30, 3 fois 1 minute de façon à délivrer à l'échantillon une énergie comprise entre 10-12 kJ. Ensuite, 3 centrifugations à basse vitesse (200-300 x g ce qui correspond à 1000 rpm, avec un appareil AllegraTM 25R centrifuge, Beckman Coulter, ont été pratiquées de façon à sédimenter des débris cellulaires et macrostructures cellulaires de plus grosses tailles. Le surnageant ainsi obtenu ici appelé le « jus cytoplasmique » ou « extrait acellulaire » a été récupéré.

Ce jus cytoplasmique est ensuite filtré (0,22 pm) pour le stériliser et peut être ensuite directement employé pour la culture de C. burnetii en milieu liquide, appelé ci-après milieu V de PH 6.5-7.5. Selon une formule améliorée du milieu empirique acellulaire V, on y ajoute 6% Lglutamine (concentration finale 7%) et 3% aminoacides non essentiels (concentration finale 3%), SVF (13.33% finale) et surtout de l'ATP (10 mM). L'ensemble est ensuite tamponné à un pH=4.5 par ajout de tampon de l'acétate pour donner le milieu appelé ci-après milieu V dit « amélioré ». Le tampon acétate est préparé selon le protocole de Pearse, 1980 en combinant 147m1 de la solution d'acide acétique 0.1N avec 53 ml d'acétate trihydrate de sodium 0.1N. Pour faciliter la gestion de ce milieu, on a ensuite réalisé une lyophilisation de cet extrait acellulaire (Lyophilisateur Christ, Bioblock 12h). Ainsi une grande boite de cellules est lyophilisée dans une fiole qui est régénéré avec 2 ml de l'eau millipore (Fresenius, France). Une filtration (0.22 pm) est appliquée chaque fois avant de l'ensemencer. Le milieu lyophilisé se conserve bien dans les fioles de lyophilisation à l'air ambiant. 2.2 Culture en milieu liquide. Le milieu V ainsi préparé est ensemencé avec l'inoculum de C. burnetii contenant entre 104 et 106 bactéries par ml de milieu de culture. C. burnetii est une bactérie microaérophile qui ne se développe qu'à une certaine pression en oxygène. L'incubation se fait en jarre au moyen de sachets gaz-pack (Bio-Mérieux) qui permettent de générer une pression en oxygène comprise entre 2 à 5% dans l'étuve à 37°C, 5% CO2. Le changement du milieu se fait chaque 48 h. La culture est maintenue pendant 7 à 15 jours et, à chaque fois. Un aliquote est prélevé pour réaliser une coloration Gimenez, AO et une qRT-PCR en temps réel. Le milieu V dit « amélioré » en plus de milieu V de base contient davantage de SVF (13.33%), 7% L-glutamine, 3% aminoacides non essentiels, de l'ATP (10mM) et de tampon d'acétate. Tous les 24 à 48 h de l'ATP fraichement préparé est ajouté au milieu. Les conditions d'incubation sont les mêmes que pour le milieu V de base. 2.2 Préparation du milieu solide. 2.2.a Boites de Pétri. 15 La préparation de la gélose à partir du « jus cytoplasmique » s'effectue comme suit. On ajoute (i) 20 ml du sérum d'origine bovine (SVF 13%) (SVF est riche en protéines et nutriments animales) à 150 ml de jus cytoplasmique ci-dessus (formule améliorée) qui contient de 10 ml de 2 mM Glutamine (6%) (aminoacide qui est considéré comme 20 carrefour de voies métaboliques), 5 ml des aminoacides non essentiels (3%) et de l'ATP (10 mM), l'ensemble tamponné avec de l'acétate à un pH =4.5. Puis, on mélange 10 ml d'agarose 1% avec 10 ml de milieu culture. Puis, on verse environ 20 ml dans la boite de Pétri moyenne et on attend la solidification avant de l'ensemencer. 25 2.2.b Milieu dit « amélioré »en tube. Après avoir aliquote de l'ATP (0.275g, 10mM) en flacons de 50m1 (conservation à -20°C), on y ajoute : 25 ml de la base de milieu V, 3 ml de SVF, 2 ml de 2mM L-glutamine, 1m1 d'aminoacides non essentiels et 2 ml de tampon acétate. Ensuite, on filtre (0.22p) pour stériliser et on 30 dégaze l'ensemble de filtrat au moyen d'une pompe sous vide. Le milieu V dit « amélioré (8m1) est distribué en tubes stériles en évitant la variation de pression de l'oxygène. Enfin, on ajoute 2m1 de l'agar Schaedler 1% (fondre la solution stock à 1% au microonde) pour 8 ml de milieu liquide. Le milieu V dit« amélioré » semi-solide en tube est ainsi prêt à être ensemencé avec 200p1 de l'inoculum et incubé dans des conditions appropriées à chaque bactérie étudiée. La culture en tubes est particulièrement adaptée à des bactéries microaérophiles car le gradient de l'oxygène peut être mieux maîtrisé pour conserver la microaérophilie dans un tube en comparaison avec une boite de Pétri. 2.3 Culture en milieu solide. La culture sur milieu solide s'effectue de la même manière que pour la culture de C. burnetii en milieu liquide, à savoir dans des conditions d'atmosphère de microaérophilie dans un incubateur à 5%CO2 à 37°C.

Pour rendre les minuscules colonies (diamètre 0.01-0.5mm) obtenues en milieu V dit « amélioré » solide, les inventeurs ont coloré les colonies bactériennes obtenues en milieu solide sur les boites de Pétri, au moyen de Bleu de Coomassie colloïdal. Le procède consiste à couvrir l'ensemble de la surface de la boite de Pétri avec le colorant (solution commerciale de bleu de Coomassie colloïdal ; « Brillant Blue G- Colloidal Concentrate » de Sigma) pendant 3 à 5 minutes, avant de l'en débarrasser. Le rinçage est effectué avec l'eau distillée 5 min (1 ou 2 fois selon l'intensité de coloration). 2.4 Ultrafiltration du milieu liquide V et culture.

Le milieu axénique correspondant au jus cytoplasmique V a été filtré par ultrafiltration (voir 1.4) au moyen d'une membrane à porosité qui ne laisse passer que des molécules 3 kDa (Amicon, Millipore) pour obtenir un deuxième filtrat. Le deuxième filtrat ainsi obtenu après ultrafiltration (fraction du 30 milieu quasi-dépourvue de protéines) a été employé pour tester la culture de C. burnetii (ensemencé avec un inoculum comprenant 0.5x105 bactéries par ml de filtrat). Le concentrat contenant majoritairement les protéines cellulaires 3 kDa) a été traité de la même façon. La culture de bactéries a été maintenue pendant 14 jours avec un échantillonnage à Oj (témoin), 3j, 6j, 9j, 12j et 14j avec les différents milieux testés (figure 2 : V= jus cytosplasmique, F= filtrat d'ultrafiltration (petites molécules < 3kDa), C = concentrat d'ultrafiltration (essentiellement les protéines provenant de SVF kDa). 2.5 Analyse des contenus des milieux par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Le contrôle de qualité du deuxième filtrat d'ultrafiltration a été réalisé sur le gel SDS-PAGE (Figure 1). 2.5.1 Protocole A un volume de chaque échantillon on ajoute un volume égal de tampon Laemmli-DTT (2x), on chauffe 5min à 95°C avant de déposer sur le gel SDS-PAGE 10% acrylamide, 30 pl de mélange. La migration se fait selon un protocole standard [10]. Le gel est coloré par le Bleu colloïdal comme décrit par le fabriquant (Sigma). 2.5.2 Analyse Le deuxième filtrat (F) contient essentiellement des petites molécules solubles, telles que des ions, des carbohydrates et probablement de très courts peptides lesquels ne sont pas visibles sur un gel SDS-PAGE (piste F, figurel). Le concentré d'ultrafiltration contient essentiellement les protéines cellulaires avec en abondance de l'albumine (piste C du gel SDS-PAGE de la figurel) correspondant à une bande d'environ 66 kDa sur un gel SDS-PAGE provenant du milieu M4 employé pour la culture des cellules Véro d'origine. Aussi bien le jus cytoplasmique CE, que son filtrat F et concentrat C contiennent des éléments de milieu M4.

Le SDS-PAGE permet de contrôler la qualité d'ultrafiltration et notamment que le filtrat ne contient pas de protéines visualisées au moyen de la coloration de Bleu de Coomassie, ce qui est le cas. 3. Croissance de C. burnetii dans le milieu empirique acellulaire liquide. La croissance de C. burnetii a été évaluée au moyen de la coloration à l'AO sur différents milieux et en parallèle par qRT-PCR en ciblant le gène de ménage (rpoZ), c'est-à-dire le gène présent en une seule copie sur le chromosome bactérien. Les courbes de croissance sont présentées figure 2 comme décrit aux paragraphes 1.1 et 1.2 ci-dessus. Comme montré figure 2, la réplication de C. burnetii dans le milieu basé sur le jus cytoplasmique de l'extrait de cellules Vero (V) permet d'obtenir une différence de 3 log lors de 3 premiers jours. 15 Ensuite elle se stabilise en plateau avec une légère élimination de bactéries jusqu'au jour 9 (différence d'1 log). A partir du jour 9, C. burnetii est éliminé (phase de déclin). Les données de la littérature suggèrent que la synthèse de l'ADN chez C. burnetii atteint approximativement 23% après 12h [5], ce qui indique que la réplication 20 est très faible. Avec le milieu V de l'invention, la réplication est optimale durant les premiers 48h. Pour la croissance de C. burnetii dans le filtrat F du milieu empirique acellulaire liquide, on observe la réplication de la bactérie lors de 3 premiers jours de culture (2,5 log) suivie d'une persistance de 25 C. burnetii dans le filtrat tout au long de la culture (12 jours) (Figure 2). Pour la croissance de C. burnetii dans le concentrat C du milieu empirique acellulaire liquide, on observe une réplication de la bactérie lors de 3 premiers jours de culture (0,5 log), suivie d'une élimination 30 progressive de la bactérie (Figure 2).

En conclusion sur la croissance de C. burnetii dans ce système : C. burnetii était présente dans tous les systèmes : milieu empirique acellulaire, filtrat et concentrat de ce milieu. Compte tenu de la charge de bactéries viables évaluées par qRT-PCR, C. burnetii se développe de façon optimale dans le jus cytoplasmique microfiltré de l'extrait cellulaire Vero V pendant 3 jours, après fa bactérie commence à être éliminée, ce qui est en corrélation avec les observations au microscope (coloration Gimenez). La culture de C. burnetii est maintenue dans le filtrat F pendant toute la durée de croissance (12 jours) (Figure 2). Par contre, C. burnetii se réplique très peu lors de 3 premiers jours dans le concentré C et ensuite est massivement éliminée à partir du 6è" jour. 4. Pour confirmer ces résultats les inventeurs ont digéré le milieu empirique acellulaire V par la protéinase K. Cette protéase coupe les 15 liaisons peptidiques de préférence au niveau du carboxyle d'un acide aminé à chaîne latérale hydrophobe ou aromatique. Son activité est stimulée par des agents dénaturants comme le SDS. Du PMSF a été ajouté à la préparation en fin d'expérience pour inactiver l'enzyme. La croissance positive de C. burnetii dans un milieu traité par la protéinase 20 K montre que la bactérie peut se développer en absence de protéines, en privilégiant pour son métabolisme plutôt de petites molécules et les petites peptides résultant la protéolyse par la protéinase K. La quantification par qRT-PCR (Figure 3) montre que la meilleure croissance est obtenu dans le milieu complexe VE sans qu'il soit digéré 25 par la protéinase K (figure 3, courbe A), que dans le milieu V traité par la protéinase K (figure 3, courbe B). C. burnetii se développe le moins bien dans le concentre traité avec protéinase K. Le PMSF qui est inhibiteur de protéinase K ajouté à la fin de digestion pour arrêter la protéolyse n'est pas toxique pour C. burnetii. 30 5. Courbe de croissance établie au moyen de la coloration à l'AO.

Pour pouvoir corréler le nombre de bactéries viables obtenues dans le milieu (le jus cytoplasmique d'extrait de cellules Vero ou milieu V) faisant objet de l'invention, les inventeurs ont établie en parallèle la courbe de croissance basée sur le comptage de bactéries colorées à l'AO. Le fait que C. burnetii se réplique rapidement durant les 2-3 premiers jours, conduit les inventeurs à adapter les conditions d'entretien de la culture. Ainsi, la décision de changer le milieu tous les 48h a eu pour effet, une amélioration de la croissance aussi bien pour C. burnetii phase II que pour la phase I. (Figures 4A et4B). On observe une poussée de réplication durant 3 premiers jours (gain de 2 à 3 logs) puis les paliers de déclin irrégulier avec plateau à J4 où de nombreuses bactéries sont éliminées massivement. La phase II montre une meilleure croissance que la phase I et le changement du milieu a un impact beaucoup plus important sur sa croissance en comparant à la phase I. Il est intéressant à souligner que les inventeurs ont maintenu la culture jusqu'à 41 j en montrant une activité de réplication très faible jusqu'à J41 qui corresponds à la fin de l'expérience (résultats non présentés). 6. Isolats cliniques et culture de C. burnetii dans le milieu acellulaire empirique V.

L'invention a permis d'isoler C. burnetii à partir de deux valves cardiaques n°57811 et n°70160 de sujets présentant une endocardite de la fièvre Q. La culture 57811 a pu être entretenue pendant 75 jours, celle 70160 pendant 17 jours. L'examen microscopique (coloration Gimenez, IFA, AO) a montré des coccobacilles formant des groupes. Le changement du milieu a été effectué initialement tous les 6 jours pour 57811 et après modification tous les 2j pour 70160. Après 12 passages, la bactérie 57811 a été complètement éliminée. Pour la bactérie 70160 les inventeurs ont arrêté la culture et congelé la souche établie au bout de 17j. Ce premier résultat est encourageant. La réplication de C. burnetii dans ces conditions de culture et milieu n'est pas optimale, mais les conditions de culture et/ou ce milieu doit donc être amélioré afin de pouvoir justifier son usage en clinique. 7. La croissance d'une collection de 22 souches de C. burnetii de différentes origines dans le milieu acellulaire empirique V ci-dessus, obtenu à partir de milieux M4 et cellules Vero, a été effectuée dans les mêmes conditions que décrites ci-dessus.

Le tableau 2 ci-après identifie lesdites souches et présente l'ensemble des résultats de croissance pour chacune, la quantification ayant été réalisée par l'acridine orange. Un plateau est obtenu chaque fois entre 2 et 7 jours dans les courbes de croissance. En particulier, les inventeurs ont évalué la croissance de C. burnetii de phase II (mutant délété avirulent : souche NMII) et C. burnetii de phase I (souche virulente pathogène : NMI (Nine Miles I)) dans le milieu liquide ainsi que solide. La croissance de la souche avirulente NMII est meilleure que celle de la souche NMI. Tableau 2. Culture de différentes souches de C. burnetii testées Isolat Origine source Croissance AO Dugway 5J108 111 rat Utah, USA, 1958 ++ Q212 humain Nova Scotia, Canada, 1981 +++ CB109 humain Berlin, Germany, 2002 + CB114 humain Marseille, France, 2003 ++ Henzerling-r * humain Italy, 1945 / Slovakia, +++ Henzerling humain Italy/Slovakia, 1945 +++ Nine Mile I tique Montana, USA, 1935 +++ Nine Mile II tique Montana, USA, 1935 +++ Priscilla Aborted Montana, USA, 1980 +++ CB113 chèvre Albi, France, 2003 ++ CB74 valve Toulouse, France, 1998 +++ CB97 humain Marseille, France, 2000 ++ CB85 humain Tours, France, 1999 ++ CB28/1128 humain Salon de Provence, France, 1992 ++ Dyer humain USA 1938 +++ Poker cat chat Nova Scotia, Canada, 1986 +++ scurryQ217 humain Rocky Mountain, USA +++ CB 62 humain Martigues, France, 1996 ++ CB87 humain Martigues, France, 1999 +++ CB71 valve Saint-Laurent du Var, France, 1997 +++ CB91 valve Marseille, France, 2000 ++ CB96 humain Marseille, France, 2000 +++ 8. Milieux empiriques acellulaires provenant de différentes cellules utilisées pour la croissance de C. burnetii. En plus du jus cytoplasmique de l'extrait de cellules Vero dans le milieu M4 décrit ci-dessus, des jus cytoplasmiques préparés dans les mêmes conditions, avec le même milieu M4, provenant de cellules embryonnaires telles que MRC5 (poumon de foetus humain), cellules de la lignée telles que HeL (erythroleukemia cell line) [6], cellules de la 15 lignée transformée de tissu conjonctif de souris L929, ont été employés par les inventeurs comme milieu empirique acellulaire pour la croissance de C. burnetii. Les résultats de quantification par qRT-PCR montrent que C. burnetii se développe dans les milieux basés sur les jus cytoplasmique 20 issu de tous les lignées cellulaires (figure 5), en particulier MRC5 (courbe B), Vero (courbe A), L929 (courbe C). Le milieu dérivé d' HEL (courbe D) convienne moins à la culture de C. burnetii. Il est décrit que C. burnetii rentre dans le monocyte mais ne se réplique pas et en cours de temps est éliminé [11]. Les inventeurs ont 25 confirmé ces observations en quantifiant la croissance de C. burnetii par l'AO dans le milieu empirique acellulaire selon invention préparé à partir de monocytes CD14+ (Figure 8). Les monocytes circulants CD14+ sont des cellules précurseur de macrophages et de cellules dendritiques.

Le protocole de préparation à partir des différentes cellules autres que Véro est identique que pour les milieux obtenu à partir de cellules Vero. 9. Amélioration du milieu liquide et solide l'invention par ajout d'ATP (10mM), 6% L-glutamine, 3% aminoacides non essentiels et de methyl-B-cyclodextrine (M-(3C) à la place du SVF. L'ensemble est tamponné avec de l'acétate à un pH=4.5 (Figures 6 et 7). Dans le but de comparer les différentes modifications de formulation de milieu V (liquide et solide), les inventeurs ont réalisé une comparaison de croissance de C. burnetii dans les milieux modifiés par les inventeurs: - Courbes A= milieu V = le jus cytoplasmique issu de cellules Vero et milieu M4 à pH 6,8, - Courbes B= milieu AV = milieu V acidifié (milieu empirique 15 acellulaire « jus cytoplasmique » V tamponné avec de l'acétate (pH=4.5), - Courbes C= LAV = milieu AV lyophilisé, et - Courbes D=milieu AV + ATP, L-glutamine, acide aminé non essentiels (L-Glycine, L-Alanine, L-Asparagine, L- Acide Aspartique, L- 20 Acide Glutamique, L-Proline, et L-Serine) et du M-BE au lieu de SVF dans le milieu M4 à pH 4,5. La croissance de C. burnetii avec le milieu selon la présente invention a été estimée par coloration par l'AO (figure 7) et par qRTPCR (figure6) sauf pour la condition D. Par les 2 méthodes de 25 quantification, on trouve que la croissance de C. burnetii en milieu liquide est comparable dans toutes les conditions citées ci-dessus (ACCM-2, A à D). En milieu solide dans les conditions de culture D), les colonies se développent mieux (5 à 6 jours) en comparant avec les autres conditions testées. Ceci est particulièrement vrai pour la culture en milieu solide sous format de tubes. Exemple 2 : Milieu de culture empirique acellulaire pour la croissance de R. conorii, l'agent de la Fièvre Méditerranéenne 5 boutonneuse Les bactéries de genre Rickettsiales appartient à l'aproteobacteria. Ce sont des bactéries dont l'origine est mitochondriale [12]. Deux groupes de Rickettsia spp. existent : Spotted Fever Group (SFG), ainsi que le group typhus (TG), Rickettsia canadensis et R. bellii. 10 Rickettsia conorii subsp. conorii est responsable de la fièvre boutonneuse méditerranéenne (MSF), principale rickettsiose dans le bassin méditerranéen et également endémique en Afrique [13]. La MSF, décrite en 1909 par Conor et Bruch, est une zoonose, transmise par la piqûre de la tique brune du chien Rhipicephalus sanguineus. Cette 15 maladie est le plus souvent bénigne mais peut dans 6% des cas s'accompagner de complications graves [13]. Rickettsia conorii (R. conorii) subsp. conorii est une bactérie intracellulaire stricte classée dans le groupe boutonneux des rickettsies (SFG). Bien que possédant une paroi de type Gram négatif, cette bactérie prend mal la coloration 20 de Gram. Elle est colorée par la coloration de Gimenez. Dans sa cellule cible, la cellule endothéliale, R. conorii subsp. conorii est mobile par polymérisation des filaments d'actine cellulaire. Le génome de R. conorii subsp. conorii a été entièrement séquence. De petite taille (1,26 Mb), il est caractérisé par un nombre élevé de séquences répétées et de gènes 25 en voie de dégradation. La culture de R. conorii subsp. conorii est réalisée sur tapis cellulaire. Elle peut être obtenue également à partir de sang hépariné ou de la tique trouvée sur le patient. A ce jour, aucun système n'est pas disponible pour cultiver Rickettsies en milieu axénique. Toutes les 30 Rickettsies sont cultivées exclusivement sur des cellules. Les colonies de R. conorii ont été pour la première fois obtenues sur le milieu solide V (obtenu de cellules Vero et milieu M4) amélioré (c'est-à-dire contenant de l'ATP 10 mM, 7% L-glutamine et 3% aminoacides non essentiels à pH 4,5-5) par incubation dans une atmosphère 5%CO2, à 37°C faisant l'objet de cette invention. L'identité de R. conorii a été confirmée par PCR en employant des primers spécifiques 165 sur colonie dont le produit à été séquence. Exemple 3 : Milieu de culture empirique acellulaire pour la croissance de T. whipplei, l'agent de la maladie de Whipple. T. whipplei est une bactérie Gram positive, l'agent de la maladie de Whipple [14]. La maladie de Whipple est principalement connue pour donner des athrialgies associés à des troubles digestifs, notamment une diarrhée chronique [14]. C'est une maladie fatale en l'absence de traitement antibiotique. La première description de la maladie de Whipple a été rapportée en 1907, mais il a fallu attendre les années 2000 pour que T. whipplei soit cultivée pour la première fois sur des fibroblastes humaines pulmonaires [15], à partir d'une valve cardiaque d'un patient canadien prise en charge pour une endocardite à hémoculture négative. L'obtention de culture de T. whipplei a permis la caractérisation de la bactérie, le séquençage de son génome et le développement de nombreux outils de diagnostic. L'analyse de génome de la bactérie a contribué au développement de milieu axénique par l'addition des aminoacides délateurs dans les voies métaboliques de T. whipplei [16]. Cependant, ce milieu axénique ne peut être bien établi et fonctionnel, uniquement en liquide. Les tentatives de cultiver le bacille de Whipple sur un milieu solide se sont relevées infructueuses (données non publiés). Avec les repiquages successifs de la bactérie, les colonies se transforment en bio film. Ce changement de phénotype est supposé être lié à la grande variabilité génétique des glycoprotéines nommés WiSPs [17]. Comme il s'agit d'une bactérie fastidieuse, les inventeurs ont testé leur système non amélioré (jus cytoplasmique, pH=6.8, 1% L- glutamine) pour la culture de T. whipplei en milieu liquide et en milieu solide. Les colonies de T. whipplei ont pu être obtenues après 5 jours d'incubation à 37°C, 5%CO2. L'identité de T. whipp/ei a été confirmée par PCR en employant des primers spécifiques 165 sur colonie dont le produit a été séquence.

References Bibliographiques [1] Seshadri R, Paulsen IT, Eisen JA, Read TD, Nelson KE, Nelson WC, et al. Complete genome sequence of the Q-fever pathogen Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A 2003 Apr 29;100(9):5455-60. [2] Ogata H, Claverie JM. Metagrowth: a new resource for the building of metabolic hypotheses in microbiology. Nucleic Acids Res 2005 Jan 1;33(Database issue):D321-D324. [3] Omsland A, Cockrell DC, Howe D, Fischer ER, Virtaneva K, Sturdevant DE, et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A 2009 Mar 17;106(11):4430-4. [4] Omsland A, Beare PA, Hill J, Cockrell DC, Howe D, Hansen B, et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol 2011 Jun;77(11):3720-5. [5] Raoult D, Marrie T. Q fever. Clin Infect Dis 1995 Mar;20(3):489- 95. [6] Kersh GJ, Oliver LD, Self JS, Fitzpatrick KA, Massung RF. Virulence of pathogenic Coxiella burnetii strains after growth in the absence of host cells. Vector Borne Zoonotic Dis 2011 Nov;11(11):1433-8. [7] Gimenez DF. STAINING RICKETTSIAE IN YOLK-SAC CULTURES72. Stain Technol 1964 May;39:135-40. [8] Benoit M, Barbarat B, Bernard A, Olive D, Mege JL. Coxiella burnetii, the agent of Q fever, stimulates an atypical M2 activation program in human macrophages. Eur J Immunol 2008 Apr;38(4):1065-70. [9] Leroy Q, Armougom F, Barbry P, Raoult D. Genomotyping of Coxiella burnetii Using Microarrays Reveals a Conserved Genomotype for Hard Tick Isolates. PLoS One 2011;6(10):e25781. [10] Kowalczewska M, Nappez C, Vincentelli R, La SB, Raoult D. Protein candidates for Q fever serodiagnosis. FEMS Immunol Med Microbiol 2011 Nov 21. [11] Raoult D, Marrie T, Mege J. Natural history and pathophysiology of Q fever. Lancet Infect Dis 2005 Apr;5(4):219-26. [12] Merhej V, Raoult D. Rickettsial evolution in the light of comparative genomics. Biol Rev Camb Philos Soc 2010 Aug 17. [13] Raoult D, Roux V. Rickettsioses as paradigms of new or emerging infectious diseases. Clin Microbiol Rev 1997 Oct;10(4):694-719. [14] Lagier JC, Fenollar F, Raoult D. [From Whipple's disease to Tropheryma whipplei infections]. Med Mal Infect 2010 15 Jul;40(7):371-82. [15] Raoult D, Birg ML, La SB, Fournier PE, Enea M, Lepidi H, et al. Cultivation of the bacillus of Whipple's disease. N Engl J Med 2000 Mar 2;342(9):620-5. [16] Renesto P, Crapoulet N, Ogata H, La SB, Vestris G, Claverie JM, et 20 al. Genome-based design of a cell-free culture medium for Tropheryma whipplei. Lancet 2003 Aug 9;362(9382):447-9. [17] Li W, Fenollar F, Rolain JM, Fournier PE, Feurle GE, Muller C, et al. Genotyping reveals a wide heterogeneity of Tropheryma whipplei. Microbiology 2008 Feb;154(Pt 2):521-7. 25 [18] Baca OG, Akporiaye ET, Aragon AS, Martinez IL, Robles MV, Warner NL. Fate of phase I and phase II Coxiella burnetii in several macrophage-like tumor cell lines 56. Infect Immun 1981 Ju1;33(1):258-66. [19] Fiset P. Phase variation of Rickettsia (Coxiella) burneti; study of the antibody response in guinea pigs and rabbits. Can J Microbiol 1957 Apr;3(3):435-45.

Claims (15)

1. REVENDICATIONS1. Procédé de préparation d'un milieu de culture empirique acellulaire apte à permettre la culture d'une bactérie intracellulaire donnée apte à être cultivée par culture cellulaire dans un type de cellule eucaryote donné caractérisé en ce qu' on réalise les étapes successives suivantes : 1) on casse les membranes des cellules eucaryotes d'un échantillon de cellules du dit type de cellules donné, en réalisant une lyse mécanique, de préférence par broyage et/ou sonication, et
2. 2) on récupère une suspension aqueuse contenant les composants et résidus de plus petites tailles en dispersion ou solubles dans l'échantillon cellulaire déstructuré de l'étape 1, en réalisant au moins une centrifugation à basse vitesse, de préférence de 200 g à 500 g, d'un dit échantillon cellulaire déstructuré de l'étape 1), et en récupérant le surnageant. 2. Procédé de préparation selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on stérilise l'extrait cellulaire récupéré à l'étape 2), de préférence par filtration en avec un filtre de pores d'environ pas plus de 0,25 microns et on récupère le filtrat .
3. 3. Procédé de préparation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que lesdites cellules sont aptes à permettre une culture cellulaire de bactéries intracellulaires.
4. 4. Procédé de préparation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que lesdites cellules sont choisies parmi les cellules 25 VERO, L929, MCR5 et HEL.
5. 5. Procédé de préparation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'à l'étape 1), on réalise les deux sous étapes successives suivantes :la- on réalise une culture des cellules d'un dit type de cellules donné dans un premier milieu de culture apte à permettre la culture des cellules du type de cellule donné, de préférence choisi parmi les cellules Vero, MRC5, L929 et HEL, et lb- on casse les parois membranaires et membranes plasmiques des cellules d'un échantillon d'une culture du dit type de cellules donné contenant un dit milieu de culture desdites cellules données.
6. 6. Milieu de culture empirique obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il comprend une suspension aqueuse d'un lysat cellulaire constitué d'un jus cytoplasmique comprenant le contenu endoplasmique de dites cellules eucaryotes d'un type donné et des composants et résidus dudit lysat cellulaire en dispersion ou solubles dans le jus cytosolique, de préférence de tailles inférieure à lOpm, de préférence encore inférieure à 5 pm.
7. 7. Milieu de culture empirique selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les composants d'un premier milieu de culture apte à cultiver lesdites cellules eucaryotes.
8. 8. Milieu de culture selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit premier milieu de culture comprend des espèces ioniques : Na+, Ca+, K+, Mg2+, Fe2+, Cl", SO4",PO4", NO3",HCO3" et des facteurs de croissances biochimiques tels que des sucres, des acides aminés comprenant, de préférence la L glutamine.
9. 9. Milieu de culture selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que ledit premier milieu de culture est le milieu EMEM comprenant les composants suivants : KCI, KH2PO4, NaHCO3, NaCI, Na2HPO4 et D-glucose.
10. 10. Milieu de culture selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que dit milieu empirique est supplémenté en 30 composant(s) choisi(s) parmi du sérum de bovin, de préférence du SVF,du methyl-P -cyclodextrine, un nucléoside triphosphate, de préférence de l'ATP, un agent anti oxydant, de préférence de l'acide ascorbique, des acides aminés non essentiels et de la glutamine, le pH dudit milieu de culture étant de 4,5 à 7, de préférence tamponné à pH de 4,5 à 5.
11. 11. Milieu de culture selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il est supplémenté en composants comprenant une combinaison de : - du sérum de bovin, de préférence du SVF, ou du methyl-p - cyclodextrine, et - un nucléoside triphosphate, de préférence de l'ATP, et - tous les acides aminés non essentiels, et - de la glutamine, - le pH dudit milieu de culture étant tamponné à PH de 4,5 à 5.
12. 12. Procédé de culture d'une bactérie intracellulaire donnée connue pour être apte à être cultivée par culture cellulaire dans un type de cellule eucaryote donné, caractérisé en que l'on ensemence un inoculum de ladite bactérie dans un milieu de culture empirique selon l'une des revendications 6 à 11.
13. 13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'on cultive une bactérie choisie parmi les bactéries des genres Rickettsia, Leptospira, Mycobacterium, Mycoplames, Orientia, spirochètes Coxiella, et Tropheryma, de préférence Rickettsia conorii, Rickettsia africae, Coxiella burnetii et Tropheryma whipplei, Mycobacterium tuberculosis, et Orientia tsutsugamushi.
14. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'on cultive une bactérie Coxiella burnetii, de préférence de Phase I.
15. 15. Procédé selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu'on réalise la culture en atmosphère microaérophilie, de préférence contenant pas plus de 2,5% d'oxygène, et on effectue desrenouvellements périodiques de milieu de culture liquide, de préférence tous les 2 jours, et/ou on rajoute de I'ATP périodiquement, de préférence tous les 24 à 48 h.