DE1442140C3

DE1442140C3 - Mild proteolytisches Milchgerinnungsenzym, biotechnisches Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung

Info

Publication number: DE1442140C3
Application number: DE19641442140
Authority: DE
Inventors: Joseph Louis Gales Ferry Conn. Sardinas (V.St.A.)
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1963-05-03
Filing date: 1964-05-02
Publication date: 1976-05-26

Description

Die Erfindung betrifft ein mild proteolytisches Milchgerinnungsenzym, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es durch Züchten von Endothia parasitica ATCC 14 729 oder Endothia parasitica CMI 59 815 in einem Kohlenhydrate, Stickstoffquellen und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen und Abtrennung des so erhaltenen Enzyms aus der Fermentationsflüssigkeit erhalten worden ist, ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung dieses mild proteolytischen Milchgerinnungsenzyms, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Endothia parasitica ATCC 14 729 oder Endothia parasitica CMI 59 815 in einem Kohlenhydrate, Stickstoffquellen und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet und daß man das so erhaltene Enzym aus der Fermentationsflüssigkeit abtrennt, sowie die Verwendung dieses Enzyms allein oder zusammen mit tierischem Labferment zur Herstellung von Käse.

Das nach diesen Verfahren erhaltene erfindungsgemäße Milchgerinnungsenzym eignet sich besonders zur Herstellung von Käse, der durch ausgezeichnete Struktur-, Geschmacks- sowie Aromabeständigkeitseigenschaften gekennzeichnet ist.

Bei der klassischen Käseherstellung wurde viele Jahre lang Lab, ein enzymhaltiges Präparat, verwendet. Lab wird der Milch zugesetzt, und das Labferment übt eine milde proteolytische Wirkung auf das Casein und andere anwesende Proteine aus. Diese Proteinspaltung führt zu einer Koagulierung der Feststoffe in der Milch, und die Milch gerinnt. Die geronnenen Feststoffe werden dann von der Molke, einer vorwiegend wäßrigen Suspension mit geringem Feststoffgehalt, befreit und daraufhin mit Salz gemischt, zu Blöcken oder Rundlingen geformt und schließlich einem Reifungsprozeß unter Käsebildung unterworfen.

Lab wird aus dem vierten Magen von milchgefütterten Kälbern erhalten und ist daher je nach der Saison und der Gesamtzahl der Kälber in unterschiedlicher Menge erhältlich und großen Preis-Schwankungen unterworfen. Da Lab zwar außerordentlich gut zur Käseherstellung geeignet ist, jedoch Preis und Erhältlichkeit Schwankungen unterworfen sind, wurden viele Versuche unternommen, um einen Ersatz zu finden.

ίο Es wurden daher sowohl pflanzliche als auch mikrobiologische Enzympräparate (französische Patentschrift 13 20 231) beschrieben. Einige dieser Präparate sind für die Milchgewinnung genau so wirksam wie das in Labpräparaten vorhandene Enzym. Es wurde jedoch beobachtet, daß bis jetzt alle mit diesen Präparaten hergestellten Käse während der erforderlichen natürlichen Alterung, die gewöhnlich etwa einen Monat bis ein Jahr dauern muß, einen schlechten, d. h. gewöhnlich bitteren Geschmack entwickeln. Wahrscheinlich entwickelt sich dieser Geschmack durch die etwas stark proteolytische Einwirkung der restlichen Enzyme, die an Stelle des Labferments verwendet wurden.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, den Käsehersteller von dieser Abhängigkeit von einer tierischen Versorgungsquelle zu befreien und ihm ein Enzym zur Verfügung zu stellen, das die Milch so schnell wie Labferment zum Gerinnen bringt, im wesentlichen den gleichen Grad an Proteaseaktivität wie Labferment aufweist und nicht zur Entwicklung eines bitteren Geschmacks im Käse nach Alterungszeiten bis zu etwa einem Jahr beiträgt.

Diese Aufgabe wurde durch das erfindungsgemäße mild proteolytische Milchgerinnungsenzym gelöst, das durch Züchten von Endothia parasitica ATCC 14 729 oder Endothia parasitica CMI 59 815 in einem Kohlenhydrate, Stickstoffquellen und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen und Abtrennung des so erhaltenen Enzyms aus der Fermentationsflüssigkeit erhalten worden ist. Dieses Enzym kann bei der herkömmlichen Käseherstellung an Stelle des gesamten oder eines Teils des tierischen Labferments verwendet werden und ist dem Labferment hinsichtlich Gerinnungszeit, erwünschter Proteaseaktivität und fehlender Entwicklung eines schlechten und bitteren Geschmacks im Käse während der Lagerung vollkommen gleichwertig.

Es wird besonders auf die überraschende Tatsache hingewiesen, daß das erfindungsgemäße Enzym im Vergleich zum Labferment die Alterung von Cheddar-Käse beschleunigt. Beispielsweise haben einige der Cheddar-Käse, die mit dem erfindungsgemäßen Enzym hergestellt wurden, einen durchdringenden, jedoch reinen und milden Geschmack von anhaltender Wirkung nach lediglich 9monatiger Alterung; im Gegensatz dazu ist normalerweise eine 18monatige Alterung erforderlich, um die gleiche Reifungsstufe zu erreichen, wenn Labferment verwendet wird. Das erfindungsgemäße Enzym kann gegebenenfalls auch mit Vorteil mit Labferment zusammen verwendet werden, wobei das Labferment die Gerinnung und das erfindungsgemäße Enzym die beschleunigte Alterung bewirken.

Ein Vorteil der Erfindung besteht daher darin, daß ein Enzym für die Milchgerinnung bereitgestellt wird, das nicht von einer unterschiedlich erhältlichen tierischen Quelle abhängt. Ein weiterer Vorteil besteht

darin, daß man mit diesem Enzym Käse von gleichmäßiger Qualität, ausgezeichnetem Geschmack und ohne Entwicklung eines Beigeschmacks während der Reifung herstellen kann. Darüberhinaus ermöglicht das Enzym die Herstellung eines gut gereiften Käses innerhalb eines kürzeren Zeitraums, als dies bisher allgemein möglich war.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein mild proteolytisches Milchgerinnungsenzym hergestellt, das a) wasserlöslich ist, b) nicht dialysierbar ist, c) dessen Milchgerinnungseigenschaften durch 5 min dauerndes Erhitzen auf etwa 60° C zerstört wird, d) dessen maximale Beständigkeit bei einem pH-Wert von etwa 4,5 liegt, e) das aus einer wäßrigen Lösung durch Ammoniumsulfat ausgefällt werden kann und f) das einen isoelektrischen Punkt von etwa 5,5 hat.

Der Stamm ATCC 14 729 von Endothia parasitica weist nach 7tägigem Wachstum auf einem Kartoffel-Dextrose-Agar-Medium eine Oberflächenfarbe auf, die im wesentlichen Ridgeway's Cadmiumgelb ähnlich ist; Rückseite: Ridgeway's Orange-Chrom. Nach 40tägigem Wachstum wiesen sowohl Oberfläche als auch Rückseite die gleiche Farbe auf, nämlich zwischen Orange-Chrom und Orange-Rufus nach der Standardskala von Ridgeway.

Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Mikroorganismus auf Kartoffel-Dextrose-Agar gehalten und kann in einem eine Kohlenhydratquelle, Stickstoff und anorganische Salze enthaltenden Medium wachsen. In einem besonders bevorzugten Impfmedium, das in den Beispielen beschrieben wird, sind außer anderen Bestandteilen ein hydrolysiertes Caseinderivat, Hefeextrakt, Stärke, Eisen, Zink, Mangan, Kupfer, Kobalt sowie Bor in bestimmten Mengen zugegen.

Das Impfmaterial wird hergestellt, indem man es im Medium auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 28° C in Gegenwart von Luft etwa 3 bis 5 Tage wachsen läßt, während welcher Zeit ein gutes Wachstum beobachtet wird. Für den Fachmann liegt es jedoch auf der Hand, daß auch andere, herkömmlich angewandte Verfahren und Medien zur Herstellung derartiger Impfmaterialien angewendet werden können.

Das Milchgerinnungsenzym wird sodann erhalten, indem man das Impfmaterial auf ein steriles Medium überträgt, das nachfolgend eingehender beschrieben wird. Dieses Medium enthält Kohlenhydrat- und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze. Es kann außer anderen Bestandteilen Sojabohnenmehl, Glukose, Nitrate, Phosphate, Sulfate, Natrium, Kalium und Magnesium enthalten. Es enthält außerdem Milch, vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 10 g/l.

In einer bevorzugten Ausführungsform, die jedoch nicht. kritisch ist, verwendet man 5% des Impfmaterials, bezogen auf das Wachstumsmedium, und führt die Fermentation bei 28° C mit einem Luftstrom von etwa 0,5 Volumen Luft pro Volumen Medium pro min durch, wobei die Suspension schnell mit etwa 1700 U/min gerührt wird. Nach etwa 48 h kann festgestellt werden, daß der pH-Wert, der ursprünglich etwa 6,8 beträgt, auf etwa 6,0 bis 6,5 abgefallen ist und daß etwa 0,5 cm³ der Brühe innerhalb etwa 2 bis 3 min etwa 5,0 cm³ Milch zum Gerinnen bringen.

Bei der Gewinnung des Milchgerinnungsenzyms können die Fermentationsbedingungen, wie Zeit, Temperatur und Wasserstoffionenkonzentration, weitgehend variiert werden.

Um das Enzym zu isolieren, werden die Fermentationsbrühen filtriert und der Filterkuchen mit kleinen Mengen entionisierten Wassers gewaschen. Das Filtrat und die vereinigten Waschflüssigkeiten werden gekühlt und gefriergetrocknet; es wurde gefunden, daß die Feststoffe eine Aktivität von 1:7500 bis 1:9700 haben (die Bedeutung dieser Aktivitäten wird

ίο nachstehend beschrieben).

Eine weitere Reinigung des Enzympräparats kann erreicht werden, indem man die gefriergetrockneten Feststoffe wieder in entionisiertem Wasser aufnimmt, wonach das Enzym durch Zugabe von etwa 2 VoIumen Aceton, das vorher auf etwa — 25° C gekühlt wurde, ausgefällt wird. Die Aceton-Wasser-Lösung wird dann dekantiert, und es bleibt ein viskoser, fester Niederschlag zurück. Der Niederschlag wird dann erneut in einer kleinen Menge Wasser suspendiert und schnell gefriergetrocknet. Die Arbeitsweise wird wiederholt, und der Rückstand hat nach dem Gefriertrocknen eine Aktivität von etwa 1:45 000.

Eine weitere Reinigung kann dadurch erzielt werden, daß man das Enzympräparat in Wasser löst und gegen Wasser dialysiert. Dies wird mindestens etwa 4 Tage lang in einer Kühlvorrichtung mit kaltem Wasser durchgeführt. Die nicht dialysierbaren Stoffe werden dann gefriergetrocknet, und es wurde gefunden, daß sie dann über 80% der ursprünglichen Aktivität enthalten; dies stellt eine wenigstens etwa zweifache Reinigung dar. Das Endprodukt hat eine Aktivität, die etwa 1:100 000 Einheiten entspricht.

Natürlich können auch andere Gewinnungsverfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, angewendet werden; beispielsweise kann das wasserlösliche Enzym durch Aussalzen unter Zugabe eines anorganischen Salzes zu der Flüssigkeit, beispielsweise Ammoniumsulfat, wie nachfolgend erläutert, oder durch Zugabe eines Nichtlösungsmittels, z. B. Äthanol an Stelle von Aceton in einer zur Ausfällung des Enzyms ausreichend hohen Konzentration, aus der Lösung oder dem Filtrat abgetrennt werden.

Die Aktivitäten der erfindungsgemäßen erhältlichen Enzympräparate werden so angegeben, daß die Aktivitätseinheiten auf die Stärke von standardisierten Labfermentpulvern bezogen sind, und man bestimmt sie durch Prüfverfahren, beispielsweise Milchgerinnungszeit-Tests. Die Testverfahren werden vom Fachmann üblicherweise angewandt, um die Stärke von Labpräparaten zu bestimmen. Wird beispielsweise die Aktivität eines handelsüblichen Labpräparats mit 1:10 000 angegeben, so bedeutet dies, daß 1 g des Präparats 10 1 Süßmilch bei 35° C innerhalb 40 min zum Gerinnen bringt. Labpräparate sind normalerweise mit Aktivitäten von 1:100 000 und 1:7 600 000 erhältlich.

Elektrophoretische Daten für das erfindungsgemäß erhältliche Enzym zeigen an, daß das Enzym einen isoelektrischen Punkt von etwa 5,5 aufweist.

Das bedeutet, daß es in 0,25 molarer Natriumacetatlösung keine Beweglichkeit bei einem pH-Wert von 5,5 zeigt; bei einem pH-Wert oberhalb von 5,5 wandert es in Anodenrichtung. Außerdem wandert das erfindungsgemäße Enzym bei einem pH-Wert von

4,5 in 0,025 folarer Natriumacetatlösung auf einem horizontal angeordneten Papier bei einem konstanten Strom von 250 V und 8 mA in Richtung auf die negative Elektrode, und zwar in 5 h über eine Di-

stanz von etwa 2,5 cm. Im Gegensatz dazu wandert kristallines, tierisches Labferment lediglich 0,55 cm unter den gleichen Bedingungen.

Bei der Verwendung des erfindungsgemäß erhältlichen Enzyms zur Herstellung von Cheddar-Käse können die Standardverfahren zur Käseherstellung angewendet werden, wobei an Stelle des normalerweise verwendeten Labextrakts tierischen Ursprungs eine nahezu äquivalente Menge des erfindungsgemäßen Enzympräparats eingesetzt wird. Dabei ist es nicht erforderlich, irgendeine der anderen, zur Käseherstellung notwendigen Bedingungen zu ändern. Der erhaltene Käse ist in seinen Eigenschaften dem unter Verwendung von Labextrakt erhaltenen Käse vollkommen gleichwertig.

Die Verwendung des Enzympräparats zur Herstellung von Cheddar-Käse wird nachfolgend näher er-. läutert. Die Arbeitsweise beruht auf normalerweise bei der amerikanischen Käseherstellung zur Anwendung kommenden Methoden (z. B. Prescott und Dunn, Industrial Microbiology, 3. Auflage, New York, McGraw-Hill Book Co., Inc., 1959, Kapitel 21 »Käse« und dort zitierte Angaben). Das erfindungsgemäß erhältliche Enzym verbessert jedoch die Milchgerinnung für jegliche Käseherstellung, bei der bisher Labpräparate verwendet wurden. Zu den auf diese Weise hergestellten Käsesorten gehören sogenannte »harte« und »milde« Käsesorten sowie Bauernkäse.

Die Qualität des mit dem erfindungsgemäßen Enzym hergestellten Käses wird leicht dadurch bestimmt, daß man während der Reifung von Zeit zu Zeit Proben entnimmt und sie hinsichtlich Struktur, Festigkeit, Gasbildung und Geschmacksentwicklung auswertet. Bei den mit dem erfindungsgemäß erhältlichen Enzym hergestellten Käsesorten zeigt sich keine unerwünschte Proteaseaktivität. Bei Cheddar-Käse beibt der Bruch fest, zeigt keine Tendenz, sich erneut in Molke zu lösen, und der Käse entspricht vollkommen dem unter Verwendung von tierischem Lab hergestellten Käse. Es wird weder ein schlechter Geruch noch bitterer Geschmack während der Reifung des Käses beobachtet. Wenn im Gegensatz dazu Enzympräparate von anderen Mikroorganismen oder pflanzlichen Ursprungs verwendet werden, so wird festgestellt, daß Festigkeit und Struktur der damit hergestellten Käse schlechter werden und daß, normalerweise innerhalb eines Monats, sich unangenehmer Geruch sowie unerwünscht bitterer Geschmack entwickeln, die für die weiterhin vorhandene proteolytische Aktivität charakteristisch sind.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.

Beispiel 1

Endothia parasitica ATCC 14 729 wurde von einem Kartoffel-Dextrose-Agar-Schrägnährboden unter sterilen Bedingungen in einen 2,81 fassenden Fernbach-Kolben gegeben, der 1 1 des nachstehend angegebenen wäßrigen Impfmediums enthielt (das Medium war vorher in einem Autoklav 45 min bei 121° C sterilisiert worden):

pro Liter
Handelsübliches hydrolysiertes

Caseinpräparat 5,0 g

Soja-Protein-Präparat* 2,0 g

Hefeextrakt 2,0 g

Lösliche Stärke 10,0 «

D-Mannit 5,0 g

FeSO₄ · 7H₂O 15,0 mg

Mikroelementlösung** 1,0 cm³

* Handelsübliches Präparat:

Enzymatisches Abbauprodukt von Sojabohnenprotein.
** Mikroelementlösung:

Fe [als Fe(NH₄)₂(SO₄)₂], 1,0 mg/ml;

Zn (als ZnSO₄), 1,0 mg/ml;
Mn (als MnSO₄), 0,50 mg/ml;

Cu (als CuSO₄), 0,08 mg/ml;

Co (als CoSO₄), 0,10 mg/ml;

B (als H3BO3), 0,10 mg/ml.

Die Kolben wurden in einer rotierenden Schüttelvorrichtung 96 h bei 28° C inkubiert. Während dieser Zeit fand ein beachtliches Wachstum statt.

Ein Enzymproduktionsmedium wurde hergesetllt und in 2 1 großen Mengen in 4 1 fassenden Fermentationsgefäßen durch 1 stündiges Erhitzen auf 121° C in einem Autoklav sterilisiert. Das Medium wies die folgende Zusammensetzung auf:

pro Liter

Sojabohnenmehl 30,0 g

Glukose 10,0 g

NaNO₃ 3,0 g

Magermilch 10,0 g

KH₂PO₄ 0,50 g

MgSO₄ · 7H2O 0,25 g

Das Medium hatte einen pH-Wert von etwa 6,8. Nach Abkühlen des Wachstumsmediums auf 28° C wurden 100 cm³ des Inoculums in das 2000 cm³ steriles Wachstumsmedium enthaltende Gefäß gegeben, und die Fermentation wurde bei 28° C durchgeführt, während Luft in einer Geschwindigkeit von 0,5 Volumen Luft pro Volumen Brühe pro min eingeführt und das Medium mit einer Geschwindigkeit von 1700 U/min gerührt wurde. Nach 48 h wurde gefunden, daß das Enzym in solcher Menge vorhanden war, daß 0,5 cm³ der Brühe 5,0 cm³ Süßmilch innerhalb von 3 min zum Gerinnen brachten. Der endgültige pH-Wert betrug etwa 6,0 bis 6,5.

Das Enzym wurde isoliert, indem man die" Brühe durch einen Büchner-Trichter filtrierte, der mit einer Diatomeenerde-Filterhilfe versehen war, und den Filterkuchen mit 100 cm³ entionisiertem Wasser wusch. Die vereinigten Waschwasser und das Filtrat wurden gefriergetrocknet, und die gefriergetrockneten Feststoffe wiesen eine Aktivität von etwa 1:8000 auf. Sie wurden dann in entionisiertem Wasser wieder auf das 5fache der ursprünglichen Brühenkonzentration aktiviert, und die Lösung wurde auf 1° C gekühlt. Während der Abkühlung und bei allen nachfolgenden Verfahrensstufen wurde Stickstoff über die Lösungen und Feststoffe geleitet, um den Zutritt von Sauerstoff zu verhindern. Dann wurde die Enzymlösung langsam unter Rühren bei —25° C mit der doppelten Menge, bezogen auf das Anfangsvolumen,

an Aceton versetzt. Gegen Ende der Zugabe von Aceton wurde das gefällte Enzym vollständig fest. Die oben schwimmende Schicht aus Aceton und Wasser wird aus dem Gefäß dekantiert, so daß die viskose feste Fällung zurückbleibt. Überschüssige Flüssigkeit wurde aus dem kalten Feststoff durch Pressen mit einem Spachtel abgepreßt, und das Enzym wurde weiter in einem schnellen Stickstoffstrom getrocknet. Der Niederschlag wurde dann in einem gleichen Vo-

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lumen Wasser suspendiert und schnell gefriergetrocknet. Diese Feststoffe enthalten 85% der ursprünglichen Aktivität. Es wurde dann eine 15%ige (Gewicht/Volumen) wäßrige Lösung des gereinigten gefriergtrockneten Feststoffs hergestellt, die auf 1° C gekühlt und so lange langsam unter Rühren mit auf — 25° C gekühltem Aceton versetzt wurde, bis die Fällung gerade anfing festzuwerden. Es war eine Acetonmenge erforderlich, die etwa das l,5fache Volumen der ursprünglichen Lösung ausmachte. Man ließ den Niederschlag absitzen, dekantierte die überstehende Flüssigkeit und gab dann langsam unter Rühren kaltes Aceton von — 25° C in einer Menge zu, die 0,75 Volumen der ursprünglich verwendeten Lösung entsprach. Man ließ den sich bildenden Niederschlag absitzen, dekantierte die überstehende Flüssigkeit, entfernte das überschüssige Aceton, wie oben beschrieben, löste die Feststoffe in einem gleichen Volumen entionisierten Wassers und gewann sie durch Gefriertrocknen. Die gefriergetrockneten Feststoffe enthielten 40% der ursprünglichen Aktivität und hatten einen Wirkungsgrad von etwa 1:45 000. Dieser Niederschlag wurde in einem gleichen Volumen Wasser gelöst und 5 Tage in kaltem Leitungswasser dialysiert. Die Dialysevorrichtung wurde während dieser Zeit gekühlt. Die nicht dialysierbaren Stoffe wurden dann gefriergetrocknet. Das feste Produkt hatte eine Aktivität von 1:100.000.

Ein Cheddar-Käse wurde dadurch erhalten, daß man an Stelle des normalerweise bei seiner Herstellung verwendeten tierischen Labpräparats eine äquivalente Menge des oben erhaltenen Enzympräparats verwendete. Die Temperatur von 454 1 pasteurisierter Süßmilch wurde auf 30 bis 31,1° C eingestellt, und die Milch wurde mit 1 Gewichtsprozent einer handelsüblichen Milchsäurestarterlösung für Käsehersteller versetzt. Das Gemisch wurde 1 h gerührt, dann auf 31,1° C gebracht und mit 85 g des Enzympräparats, die in 120 cm³ entionisiertem Wasser gelöst waren, versetzt, die gründlich eingerührt wurden. Das Rühren wurde eingestellt, und nach 30 min wurde die Festigkeit der geronnenen Masse dadurch getestet, daß man einen Schaber einführte und ihn langsam anhob, woraufhin die geronnene Masse von dem Instrument absplitterte. Die geronnene Masse wurde mit Käsemessern in 6 mm große Würfel geschnitten, dann gerührt und nach 15 min dadurch verfestigt, daß man sie im Verlauf von 30 min von 31,1 auf 38° C erhitzte. Die geronnene Masse wurde während des Erhitzens langsam gerührt. Die Molke, die sich aus der geronnenen Masse abtrennte, wurde 2,25 h nach dem Zusatz des Enzympräparats abgezogen. Nachdem die Molke abgezogen war, wurde der Bruch ausgeschöpft und abgepackt und zu Streifen mit einer Breite von etwa 12 bis 15 cm geschichtet. Die Streifen wurden 5mal in Zeitabständen von 10 min gewendet, dann wieder aufeinander gepackt, und der Bruch wurde gemahlen. Die Temperatur des Bruchs beim Mahlen betrug 36,7° C. Die gemahlene Masse wurde gleichmäßig verteilt und mit 1360 kg eines flockigen Salzes für Käsehersteller an der Oberfläche bestreut. Nachdem sich das Salz in dem Bruch gelöst hatte, wozu etwa 30 min erforderlich waren, wurde der Bruch in Formen gegeben, und die gefüllten Formen wurden 30 min gepreßt. Das Tuch, das die Außenseite der Form abdeckt, wurde nachgestellt, und dann wurde der Käse erneut in die Presse gegeben und ein letztes Mal gepreßt. Dieses letzte Pressen, durch das die Rinde von Öffnungen und Oberflächenfehlern befreit wurde, erforderte etwa 24 h. Der Käse wurde dann 4 Tage bei 13° C getrocknet, mit Paraffin überzogen, verpackt und bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 75% und 7° C gereift. Eine Probe, die entnommen wurde, als der Käse 3 Wochen alt war, zeigte keine mechanischen Öffnungen, und der Käse war frei von saurem und bitterem Geschmack. Nachdem der Käse einen Monat alt war, hatte er eine feste, ίο glatte, wachsige Struktur und war frei von mechanischen Öffnungen, hatte keinen unreinen Geschmack und behielt diese Eigenschaften, bis er ausgereift war, wozu 6 Monate bis 1 Jahr erforderlich waren.

»5 Beispiel 2

Die Arbeitsweise des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei an Stelle des Endothia parasitica ATCC14 729 der von dem Commonwealth Mycological Institute, Kew, England, mit »CMI Nr. 59 815« bezeichnete Stamm von Endothia parasitica verwendet wurde. Es wurde ein zufriedenstellender Käse erhalten.

Beispiel 3

Bei einer abgewandelten Arbeitsweise wurde das Enzym aus der nach Beispiel 1 erhaltenen Brühe wie folgt abgetrennt: Die Brühe wurde durch einen Büchner-Trichter filtriert, der vorher mit einer Diatomeenerde-Filterhilfe überzogen worden war, und der FiI-terkuchen wurde mit 100 cm³ entionisiertem Wasser gewaschen. Waschwasser und Filtrat wurden nach Vereinigung mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,5 gebracht, und die Lösung wurde in einem Vakuum bei 35 bis 40° C 15fach konzentriert.

Zu der gerührten konzentrierten Lösung wurden 40 Gewichtsprozent wasserfreies kristallines Ammoniumsulfat gegeben. Das ausgefällte Enzym wurde durch Filtrieren gesammelt. Zu diesem Zeitpunkt war es für die Käseherstellung außerordentlich gut geeignet. Es wurde dann weiter durch Dialysieren während eines Tages und Gefriertrocknen des nicht dialysierbaren Materials gereinigt. Die gefriergetrockneten Feststoffe wurden zu einer 15%igen wäßrigen Lösung verarbeitet und dann auf 0° C gekühlt. Dann wurden 2 Volumen Aceton, bezogen auf die ursprüngliche Lösung, zugegeben, die vorher auf —15° C gekühlt worden waren. Das Enzym setzte sich als klebriges Material ab, und die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert. Das Enzym wurde dann in kaltem Wasser zu einer 15%igen Lösung gelöst und 5% Aktivkohle, bezogen auf das Gesamtvolumen, wurden eingerührt und dann nach 45 min abfiltriert. Das das Enzym enthaltende Filtrat wurde gefriergetrocknet. Die Feststoffe wurden bis zu einer 15%igen Konzentration in Wasser aufgenommen und auf 0° C gekühlt. Kaltes Isopropanol (0° C) wurde langsam unter Rühren zugesetzt, bis die Lösung opaleszierte. Die Suspension wurde aus dem Kühlschrank entnommen und so lange abgestellt, bis sich das kristalline Enzym im wesentlichen vollständig abgesetzt hatte.

Dieses kristalline Enzym, das eine sehr hohe Milchgerinnungsaktivität hatte, war anscheinend ein Polypeptid. Nach der Hydrolyse und erneuten Lö-

sung wurden die folgenden Aminosäuren identifiziert: Cystein, Asparagin, Threonin, Serin, Prolin, Glutamin, Glykokoll, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Histidin, Arginin, Cystin und Tyrosin.

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Claims

Patentansprüche:

1. Mild proteolytisches Milchgerinnungsenzym, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Züchten von Endothia parasitica ATCC 14 729 oder Endothia parasitica CMI 59 815 in einem Kohlenhydrate, Stickstoffquellen und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen und Abtrennung des so erhaltenen Enzyms aus der Fermentationsflüssigkeit erhalten worden ist.

2. Biotechnisches Verfahren zur Herstellung eines mild proteolytischen Milchgerinnungsenzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man Endothia parasitica ATCC 14 729 oder Endothia parasitica CMI 59 815 in einem Kohlenhydrate, Stickstoffquellen und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet und"daß man das so erhaltene Enzym aus der Fermentationsflüssigkeit abtrennt.

3. Verwendung des Enzyms nach Anspruch 1 allein oder zusammen mit tierischem Labferment zur Herstellung von Käse.