CH628216A5 - Verfahren zur herstellung eines ein lipolysiertes triglyceridfett enthaltenden nahrungsmittelbestandteils. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren eines ein lipolysiertes Triglyceridfett enthaltenden Nahrungsmittelbestandteils mit verstärktem Aroma.

Enzymatisch hergestellte Geschmacksstoffe sind üblicherweise in vielen Arten von Nahrungsmitteln enthalten, insbesondere in solchen, die durch Gärprozesse hergestellt ' worden sind. Es ist beispielsweise erwünscht, bei der Her-5 Stellung von Nahrungsmittelprodukten, wie beispielsweise Backwaren, Kaffeebleichmitteln, Milchschokolade, Margarine und dergleichen, ein milch- oder butterähnliches Aroma im Endprodukt zu haben. Bei bestimmten Arten von Käsen und Käseprodukten, beispielsweise bei den sogenannten io Weichkäsen und Starkkäsen, wie beispielsweise den italienischartigen Varianten, hängen bestimmte Geschmacksnoten von verschiedenen Enzymsystemen ab, die während der Käseherstellung verwendet wurden.

Im Falle von fetthaltigen Nahrungsmitteln ist die Haupt-15 enzymwirkung eine Fettspaltung (Lipolyse) oder eine enzymatisch katalysierte, hydrolytische Spaltung von Triglyceriden. Obwohl andere enzymatische Geschmacksbildungen zusammen mit der Lipolyse auftreten können, betrifft die Vorliegende Erfindung hauptsächlich die zuletztgenannte 20 Art von Enzymaktivität. .

Es ist bekannt, das spontane oder unkontrollierte Fettspaltung der Nahrungsmittelindustrie jahrelang grosse Schwierigkeiten bereitet hat, da unerwünschte Geschmacksstoffe odër unangenehme Ranzigkeit dadurch entstehen können. 25 Kürzlich hat jedoch die Entwicklung kontrollierter Fettspaltung viele verbesserte Nahrungsmittelprodukte ergeben. Daher ist es in der Milchwirtschaft allgemein üblich, zur Ausbildung bestimmter Geschmacksstoffe die Milchfette mit fettspaltenden (lipolytischen) Enzymen zu behandeln. Das 30 lipolytische Enzym wirkt auf die Triglyceride und bildet aus diesen freie Fettsäuren, die ihrerseits in andere Verbindungenumgewandelt werden können, wie beispielsweise in manchen Fällen in Ketone. Die Menge und die Art der so hergestellten Fettsäuren hängt von der Menge und der 35 Art des Fetts indem Nahrungsmittelprodukt, der Menge und der Art des fettspaltenden Enzyms und der Temperatur und der Dauer der Einwirkung des lipoly tischen Enzyms ab. Weitere Einzelheiten über herkömmlich gesteuerte Lipolyse kann in J. Amer. Oil Chem. Soc.49, 559-62 (1971) und den 40 darin zitierten Literaturstellen gefunden werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung eines ein lipolysiertes Triglyceridfett enthaltenden Nahrungsmittelbestandteils mit verstärktem Aroma ist im Patentanspruch 1 charakterisiert.

45 Die Vorliegende Erfindung liefert also ein verbessertes Aromatisierungssystem für Triglyceridfette und Fett enthaltende Nahrungsmittel und insbesondere ein verbessertes, lipolysiertes Milchfett, durch ein aus Mucor miehei gewonnenes Enzympräparat. Es sind verschiedene lipolytische so Enzyme bekannt, beispielsweise Pancreaslipase, pregastri-sche Esterase, Milchlipase und Pilzlipase. Die Pilzlipasen werden insbesondere beispielsweise aus Aspergillus gewonnen, wie es in der US-PS Nr. 2 480 090, aus Rhizopus, wie es in der US-PS 3 262 863 beschrieben ist und aus Mucor, 55 wie es in der US-PS 3 616 233 beschrieben ist, gewonnen. Die Wirkung dieser Pilzlipasen zur Bildung der Ranzigkeit von Fetten ist hinsichtlich Aspergillus in J-Gen. Appi. Microbio!. 70, 13-22 (1964); hinsichtlich Rhizopus in Agr.

Biol. Chem. 33, 729-38 (1969) und hinsichtlich Mucor in 60 Appi. Microbio!. 16, 617-19 (1968) und 17, 606-10 (1969) beschrieben. Typische im Handel erhältliche Esterasen und Lipasen, die bisher benutzt worden sind, sind pregastrische Esterasen, beispielsweise die unter den Warenzeichen «Ita-lase» und «Cepalase» von dem «Dairyland Food Laboratory» 65 erhältlich sind; die Pancreaslipase, die unter dem Warenzeichen «Fermlipase PL» von den Permeo Laboratories erhältlich sind und die Pilzlipase, die unter dem Warenzeichen«Lipase B» von Rohm und Haas erhältlich sind.

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Wegen der Knappheit an lipolytischen Enzymen tierischer Herkunft liefert die Zugänglichkeit von lipolytischen Enzymsystemen mikrobieller Herkunft den potentiellen Vorteil leichterer Zugänglichkeit und darüber hinaus die Möglichkeit, durch gesteuerte Fermentation des Organismus ein Produkt mit gleichmässigerer Qualität zu erhalten. Nicht alle mikrobiologischen fettspaltenden Enzyme liefern jedoch ein wünschenswertes Aromasystem.

Überraschenderweise wurde nunmehr gefunden, dass es möglich ist, aus dem Mikroorganismus Mu vor miehei ein enzymatisch hergestelltes Triglyceridfettaromasystem zu erhalten. Dieses enzymatische Aromasystem wird für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis der Esterase-Aktivität (EA) zur Lipaseaktivität (LA), d.h. EA/ LA definiert.

Wie in dieser Beschreibung definiert, ist die Esterase-Aktivität die Aktivität des Enzyms auf wasserlösliche Fette, nämlich solche Fette, die eine Kohlenstoffkettenlänge von 4 bis 10 haben. Umgekehrt ist die Lipase-Aktivität die Aktivität des Enzyms auf wasserunlösliche Fette, nämlich solche Fette, die eine Kohlenstoffkettenlänge von 12 und mehr haben, insbesondere 12 bis 22.

Überraschenderweise wurde festgestellt, dass das durch bestimmte Arten der Gattung Mucor und insbesondere Mucor miehei produzierte fettspaltende Enzymsystem im Gegensatz zu demjenigen anderer Pilze, wie Aspergillus und Rhizopus, die erwünschte Eigenschaft hat, dass es eine grössere Esteraseaktivität als Lipaseaktivität aufweist, in ähnlicher Weise wie die im Handel erhältlichen pregastri-schen Esterasen aus Kälbern, Zicklein und Lämmern. Das heisst, es zeigt ein EA/LA-Verhältnis, das grösser als 1 ist. Im Vergleich dazu wurde es festgestellt, dass fettspaltende Systeme aus Aspergillus und Rhizopus EA/LA-Verhältnisse von weniger als 1 aufweisen und folglich für die erfindungs-gemässen Zwecke ungeeignet sind. Vorzugsweise ist das EA/LA-Verhältnis grösser als 2 und Verhältnisse von etwa 2 bis 10 sind für die erfindungsgemässen Zwecke hervorragend geeignet.

Die Esteraseaktivität wird vorzugsweise durch einen Test mit Tributyrin gemessen, während die Lipaseaktivität vorzugsweise durch einen Test mit Olivenölsubstrat gemessen wird. Diese Tests können wie folgt ausgeführt werden:

Esterasemethode

Diese Methode wird zur Bestimmung der Esterase, die Tributyrin hydrolysiert, angewendet. Esterase wird bei einem pH-Wert von 6 und bei einer Temperatur von 37°C mit einer Tributyrinlösung inkubiert. Die Säure, die innerhalb Von 10 Minuten in der Reaktionsmischung freigesetzt wird, wird bis zu einem pH-Wert von 8,7 titriert. Innerhalb des empfohlenen Bereichs spiegeln die Ergebnisse einen praktisch linearen Zusammenhang zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und der Enzymkonzentration wieder.

Lösungen 1. Substratlösung

13 g Gummi arabicum U.S.P. werden zu 114 ml 0,05 m Natriumacetatlösung (6,8 g NaC2H302 • 3HaO auf 1 Liter) gegeben, dann werden etwa 50 mg Thymol zugegeben, und die Mischung wird 25 Minuten bis zur Auflösung der SubBerechnung stanzen gerührt. Zu der gepufferten Gummilösung werden 22,7 g Tributyrin (75 mMol) gegeben, und die Mischung wird 5 Minuten lang in einem Waring-Mischer emulgiert. Die Emulsion wird mit 0,5 n Natronlauge auf einen pH-5 Wert von 6,0 eingestellt, wozu weniger als 1 ml Lauge erforderlich ist. Wenn die Lösung in einem Kühlschrank aufbewahrt wird, kann sie mindestens 3 Tage lang verwendet werden. Sie ist vor jedem Gebrauch gut umzuschüttein, und — falls erforderlich — ist der pH-Wert erneut auf 6,0 ein-io zustellen.

Für den «Enzymblindwert» (vgl. «Vergleichswerte» weiter unten) wird eine Lösung von 13 g Gummi arabicum in 114 ml 0,05 m Natriumacetat verwendet. Der pH-Wert der Gummi-Acetat-Lösung wird auf 6,0 eingestellt, was 3 bis 15 4 ml 0,1 n Natronlauge erfordert.

2. 0,02 n Natronlauge.

3. Acetatpuffer, pH-Wert 5,9 bis 6,2, 0,05 m.

20 6,8 g Natriumacetat ■ 3 H20 werden in etwa 500 ml Wasser gelöst, 1,0 ml 1 n Salzsäure werden zugesetzt und dann wird mit destilliertem Wasser auf 1 Liter aufgefüllt.

4. Enzymlösungen

25 Alle Lösungen und Reihenverdünnungen werden mit Acetatpuffer (Nr. 3 oben) hergestellt. Die erforderlichen Konzentrationen sind unten unter «Bereich» beschrieben.

Verfahren

30 Die Substratlösung wird geschüttelt, und 50,0 ml werden in einen 125-ml-ErIenmeyer-Kolben pipettiert. Es werden 10.0 ml Enzymlösung zugegeben, rasch vermischt, und dann wird eine aliquote Menge von 10,0 ml abgenommen, . die zu 40 ml Wasser gegeben wird und unmittelbar mit 35 0,02 n Natronlauge bis zu einem pH-Wert von 8,7 titriert wird. Unmittelbar nach der Entnahme der aliquoten Menge wird die restliche Mischung in ein 37° warmes Bad gegeben (was als Nullzeitpunkt betrachtet wird), wo sie unter ständigem Rühren (Magnetrührer) 40 Minuten lang gehalten 40 wird. Genau 40 Minuten nach dem Nullzeitpunkt wird eine weitere aliquote Menge von 10,0 ml entnommen und nach Zugabe zu 40 ml Wasser bis zu einem pH-Wert von 8,7 titriert. Der Unterschied zwischen den beiden Titrationen drückt den Grad aus, bis zu dem das Tributyrin durch das 45 Enzym hydrolysiert worden ist.

Vergleichswerte

Eine Substratblindprobe ist nicht erforderlich, jedoch können rohe Enzympräparate eine Enzymblindprobe erfor-50 derlich machen. Es wird wie oben beschrieben vorgegangen, jedoch wird eine eingestellte Gummi arabicum-Lösung ohne Tributyrinzusatz anstelle der beschriebenen Substratlösung verwendet. Das Hauptergebnis wird durch Subtraktion der für den Vergleichsversuch erforderlichen Laugenmenge kor-55 rigiert.

Einheiten

Eine Esteraseeinheit erzeugt unter den Testbedingungen ein Mikroäquivalentsäure pro Minute. 60 Die Esteraseaktivität (EA) ist die Anzahl Einheiten pro Gramm des Präparats.

ml NaOH X n NaOH X 1000 X ml digerierter Mischung

EA = ■

Minuten X g Präparat in digerierter Mischung X ml aliquote Menge

(1)

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worin ml NaOH die titrierte Menge Natronlauge für eine 10 ml aliquote Menge und n NaOH die Normalität der für die Titration verwendete Natronlauge bedeuten.

ml NaOH X 0,02 X 1000 X 60

Also: E A = (2)

40 X g Präparat X 10

ml NaOH X 3

EA = : (3)

g Präparat in digerierter Mischung

Bereich

Die Probenverdünnung sollte so sein, dass die bei der Titration verbrauchte Menge zwischen 0,5 und 1,5 ml liegt. Falls erforderlich, sollten die Tests wiederholt werden, bis Ergebnisse innerhalb dieses Bereichs erzielt werden.

Das Fortschreiten der Tributyrin-Hydrolyse ist linear mit der Zeit, und es ist möglich, die Messung in einer kürzeren Zeit als 40 Minuten lange Digerierungszeiträume durchzuführen. Selbstverständlich muss dann Gleichung (3) auf den entsprechenden Zeitfaktor umgerechnet werden.

Ltpasemethode

Diese Methode wird zur Bestimmung der Lipase, die Olivenöl hydrolysiert, angewendet. Lipase wird bei einem pH-Wert von 6,5 und einer Temperatur von 30°C mit einer Olivenölemulsion inkubiert. Die Säure, die innerhalb von 5 Minuten in der Reaktionsmischung freigesetzt wird, wird bis zu einem pH-Wert von 8,0 titriert. Innerhalb des empfohlenen Bereichs spiegeln die Ergebnisse einen praktisch linearen Zusammenhang zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und der Enzymkonzentration wieder.

Chemikalien

1. Olivenöl U.S.P.

2. «Amerchol L-101» (lanolinabgeleitete freie Sterine), American Cholesterol Products, Edison, New Jersey.

3. Natriumbarbital, N.F. (Nationalformelsammlung)

4. Gummi arabicum U.S.P.

5. Natriumacetat • 3H20 (chemisch rein)

6. Natriumchlorid (chemisch rein)

7. 0,5 n Natronlauge

8. 0,02 n Natronlauge

9. 0,1 n Salzsäure

10. Äthylalkohol (denaturiert; Nr. 23A ist geeignet).

Geräte ' 1. Waring-Mischer

2. 2 Magnetrührer, von denen der eine zum Eintauchen in ein Wasserbad geeignet ist (Modell MS-7, Tri-R-Instru-mente, Jamaica, New York)

3. pH-Messgerät für Titrationen, das mit einer kleinen Kombinationselektrode ausgerüstet ist (wie beispielsweise Nr. 4858-L15, A.H. Thomas)

4. 10-ml-Mikrobürette mit 0,02-ml-Teilung (Kimble Nr. 17107 F mit einer Injektionsnadel 20 G; 38,1 mm [1-1/2"] vom Luer-Typ).

Lösungen

1. Substratemulsion

30 g Gummi arabicum und 270 ml destilliertes Wasser werden 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur mit einem Magnetrührer gerührt. Gegebenenfalls vorhandene Klumpen werden mit einem Glasstab zerdrückt. Die Mischung wird auf 5°C abgekühlt. 6 g «Amerchol» werden in einen 400 ml Becher eingewogen, 70 g Olivenöl und 222 g der gekühlten

Gummi arabicum-Lösung werden zugegeben. Mit einem Glasstab wird umgerührt, und die Mischung wird in einen Waring-Mischer gegossen und 5 Minuten lang gemixt. Der pH-Wert wird mit 0,5 n Natronlauge auf 6,3 eingestellt, 5 und die Mischung wird auf 5°C abgekühlt und erneut 7 Minuten lang vermischt. Die Temperatur kann bis zu einem Höchstwert von 37°C angestiegen sein, und der pH-Wert auf 6,5. Falls nicht, wird der pH-Wert auf 6,5 eingestellt. Die Emulsion ist mindestens 8 Tage lang stabil, wenn sie io in einem Kühlschrank aufbewahrt wird. Die Temperatur sollte jedoch nicht unter 1°C sinken.

2. Puffer a) Stammlösung. 9,7 g Natriumacetat X 3HaO und 14,7 g 15 Natriumbarbital werden mit destilliertem Wasser zu 500 ml gelöst. Diese Lösung ist 0,14 normal mit Bezug auf Barbital und 0,14 normal mit Bezug auf Acetat; der pH-Wert ist 9,9. Die Aufbewahrung erfolgt im Kühlschrank,

20 b) Arbeitslösung. 40 ml Stammlösung, 16 ml 8,5%ige Kochsalzlösung und 53 ml 0,1 n Salzsäure werden mit destilliertem Wasser zu 200 ml verdünnt; der pH-Wert ist 6,5. Für kleinere Korrekturen wird 0,1 n Salzsäure oder 0,1 n Natronlauge verwendet. Die Aufbewahrung 25 erfolgt im Kühlschrank. Falls während der Aufbewahrung Kristalle auftreten, ist die Lösung zu verwerfen.

3. Enzymlösungen

Für die Bestimmung fester Präparate wird zuerst durch 30 etwa 30 Minuten dauerndes, magnetisches Rühren der Probe in einer geeigneten Menge Wasser eine Stammlösung hergestellt, bevor durch weitere Verdünnung mit Wasser die Endverdünnung hergestellt wird. Die Stammlösung ist bei 5°C mehrere Stunden lang stabil, die hochverdünnte End-35 lösung sollte jedoch innerhalb von 5 Minuten verwendet werden. Für die Bestimmung unbekannter Präparate ist es erforderlich, durch Vorversuche die geeignete Verdünnung zu finden. Präparate, deren Aktivität annähernd bekannt ist, 'sollten auf eine Konzentration von einer bis 3,6 Lipaseein-40 heiten pro ml verdünnt werden. Der Ausdruck «Lipase-einheiten» wird weiter unten definiert.

Verfahren

Emulsion und Puffer werden in einem 3 : 1-Gewichts-45 Verhältnis vorgemischt, um das Substrat zu liefern. 8,0-ml-Mengen des Substrats werden in 100-ml-Becher, die Magnetrührstäbchen enthalten, gegeben. Die Substratlösung wird magnetisch gerührt. Jede Bestimmung wird doppelt durchgeführt (Bestimmung und Blindprobe), wobei folgendes Sub-50 strat verwendet wird:

Blindprobe .

1. Zusatz von 40 ml Äthylalkohol

2. Zusatz von 2,0 ml Probe der Enzymlösung

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Bestimmung

1. Gleichgewichtseinstellung des Substrats in einem 30°C warmem Wasserbad

2. Zusatz von 2,0 ml Probe der Enzymlösung 60 3. 5,0 Minuten langes Inkubieren bei 30°C

4. Zusatz von 40 ml Äthylalkohol.

Blindprobe und Bestimmung werden mit 0,02 n Natronlauge bis zu einem pH-Wert von 8,0 titriert.

6S Berechnungen

Eine Lipaseeinheit (LU) = Menge an Lipase, die erforderlich ist, um ein Mikromol HVMinute zu erzeugen. Lipaseaktivität (LA) = Anzahl von LU/Gramm Präparat

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LA = ml NaOH X N NaOH X 103/mg zugesetztes Enzympräparat X IO-3 X Minuten.

Wenn 0,02 n NaOH und eine Reaktionszeit von 5 Minuten angewendet werden, LA = ml NaOH X 4000/mg Enzym.

Es versteht sich, dass die vorliegenden Erfindung nicht auf die vorstehend beschriebenen Verfahren zur Bestimmung der Esteraseaktivität und Lipaseaktivität beschränkt ist, da es nach dem Lesen der vorliegenden Beschreibung für jeden Fachmann klar ist, dass auch andere Methoden und Modifikationen der voranstehend beschriebenen Methoden angewendet werden können.

Die Herstellung des gewünschten Lipolaseenzymaroma-stoffsystems kann durch herkömmliche Fermentierungsver-fahren mit anschliessenden geeigneten Isolierungsmethoden durchgeführt werden. So kann beispielsweise ein Nährmedium, das assimilierbaren Kohlenstoff, Stickstoff und Spurenmineralien enthält, bei einem pH-Wert von etwa 3 bis 8 und einer Temperatur von etwa 20 bis 50° etwa 2 bis 14 Tage lang mit einer Kultur einer Art von Mucor, insbesondere Mucor miehei, unter submersen aeroben Bedingungen fermentiert werden. Beispiele für ausgewählte Linien von Mucor miehei, die zur Herstellung des gewünschten Enzymaromasystems fermentiert werden können, sind ohne Einschränkung der Öffentlichkeit unter den Codebezeichnungen NRRL A 13 131 und A 13 042 bei den Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, zugänglich. Dem Fachmann sind nach dem Lesen der vorliegenden Beschreibung andere geeignete Linien von Mucor miehei offensichtlich.

Nach der bisher bekannten Praxis wurden Esterasen und Lipasen im allgemeinen als ein Zusatzstoff bei der Isolierung des gewünschten Labprodukts entweder inaktiviert oder entfernt, wie es in den US-PS 3 616 233 und 3 763 011, DT-OS 2 232 996 und GB-PS 1 207 892 beschrieben ist.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird das gewünschte Enzymaromasystem durch Abtrennung von der Fermentationsmaische gewonnen, um auf diese Weise ein geeignetes EA/LA-Verhältnis zu erhalten. Dies kann durch Filtrieren der Maische bei einem niedrigen pH-Wert von etwa 4 bis 5, Extraktion des Filterkuchens bei hohem pH Von etwa 10 bis 12, Ansäuerung des Extraktes auf einen pH-Wert von etwa 7 und anschliessende Isolierung durch Filtration oder Konzentration des angesäuerten Extraktes durch Eindampfen oder Ultrafiltration und anschliessendem Trocknen des Konzentrats, beispielsweise durch Sprühtrocknen oder dergleichen, erreicht werden. Es ist klar, dass es für bestimmte Anwendungen wünschenswert ist, ein fettspaltendes Enzymsystem zu verwenden, das auch im wesentlichen frei von Labfermentwirkung ist. Dies kann durch Anwendung des vorstehend beschriebenen Gewinnungsver-fahrens oder durch andere Reinigungstechniken, wie sie dem Fachmann klar sind, erreicht werden.

Das gewonnene Lipaseenzymaromasystem kann Milch, Milchfett, Butterfett, Käse, Milchschokolade, Margarinefett, Kaffeebleichmitteln und anderen Triglyceridfett enthaltenden Nahrungsmitteln und Nahrungsmittelbestandteilen zugesetzt werden und kann bei Temperaturen im Bereich von etwa 10 bis etwa 50°C etwa 2 Stunden bis 20 Tage lang inkubiert werden, um gewünschte, milch- und butterähnliche Geschmacksstoffe zu bilden. Es kann dazu verwendet werden, in natürlicher Weise in diesen Nahrungsmitteln und Nahrungsmittelbestandteilen entwickelte Aromastoffe zu beschleunigen oder zu intensivieren, und es kann mit bekannten Aroma entwickelnden Mitteln gemischt werden, um Veränderungen in den Geschmacksprofilen zu erzielen. Beispielsweise kann es mit Enzymzusammensetzungen, die prägastrische Esterase enthalten, gemäss US-PS 2 531 329

(als «Italase» vom Dairyland Food Laboratory erhältlich) gemischt werden, oder es kann zusammen mit den Aroma-tisierungszusammensetzungen, die mit Pénicillium roque-forti-entwickelt sind, gemäss US-PS 3 100 153 verwendet werden. Im allgemeinen wird das gewonnene fettspaltende Enzym in Mengen von etwa 0,001 % bis 0,1 Gew.-%, bezogen auf das Triglyceridfett enthaltende Substrat, zugesetzt, und im Falle von Milch wird es vorzugsweise in Mengen von etwa 7,7 g bis 123 g pro Tonne Milch (3,5 bis 56 g pro 454 kg; 1/8 bis 2 Unzen pro 1000 Pfund) zugesetzt.

Beispiele für Triglyceridfette, die nach dem erfindungsgemässen Verfahren mit dem Lipaseenzymaromasystem behandelt werden können, um erwünschte Geschmacksstoffe zu entwickeln, sind tierische Fette, wie beispielsweise Milchfett, Schweineschmalz und Rindertalg, sowie pflanzliche Fette, wie beispielsweise Baumwollsamenöl, Sojabohnenöl, Maisöl, Erdnussöl, Safloröl, Palmöl, Kokosnussöl und Margarine und Backfettmischungen.

Beispiele für Käsesorten, bei denen das Lipaseenzymaromasystem verwendet werden kann, um gewünschte Aromastoffe zu entwickeln, sind Provolone, Romano, Feta, Pizza, Mozzarella, Cheddar, Schweizer, Blau, Parmesan, Colby, Gouda und Edamer.

Im folgenden werden anhand von Beispielen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert.

Beispiel 1

Unter aseptischen Bedingungen wird Mucor miehei NRRL 13 042 von einer Agar-Schrägkultur in einen 1-Liter-Erlenmeyer-Kolben, der 200 ml des folgenden Mediums enthält, überführt:

Sojabohnenmehl («Nutrisoy 300 C») 1,5%

Getrocknete Molke 3,0

Enzymatisch abgebaute Maisstärke 12,0

Wasser 83,5

Summe 100,0%

Der Kolben wird 114 Stunden lang bei 37°C auf einer Drehschüttelvorrichtung inkubiert, wobei von einem Aus-gangs-pH-Wert von etwa 6 ausgegangen wird. Das gewünschte Lipaseenzymsystem wird wie folgt gewonnen: Die Wasserstoffionenkonzentration der Fermentationsbrühe wird auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und dann filtriert. Das Filtrat wird mit verdünnter Natronlauge bei einem pH-Wert von 10 bis 11 extrahiert, und der Extrakt wird mit Säure auf einen pH-Wert von 7 gebracht. Der so behandelte Extrakt wird dann filtriert und zu einem Konzentrat eingedampft, der einen EA-Wert von 25,8 und ein EA/LA-Verhältnis von 2,6 hat (dies ist Charge A); und wird filtriert, eingedampft und zu einem Feststoff sprühgetrocknet, der ein EA/ LA-Verhältnis von 3,5 aufweist (dies ist Charge B).

Das nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren als Charge A mit einem EA/LA-Verhältnis von 2,6 aus Mucor miehei erhaltene fettspaltende Enzym wird auf folgende Weise zur Entwicklung eines gewünschten Käsearomas verwendet:

454-g-Proben von Current-A-Cheddar-Käse (2 bis 4 Wochen alter Käse mit mildem Aroma) werden mit einer elektrischen Sunbeam-Tafelmühle gemahlen, und das fettspaltende Enzym wird daruntergemischt, indem 440 mg Enzym pro 454 g Käse daruntergemischt werden, bis sie gleichmässig verteilt sind. Die vermischten Enzym-Käse-Kombinationen werden dann in sterile Plastikpetrischalen gefüllt. Die Schalen werden in einen anaeroben Behälter

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gestellt, um Pilzvvachstum zu verhindern, und mehrere Proben werden 4 Tage lang bei 20°C inkubiert, während andere Proben 11 Tage lang bei 20°C inkubiert werden. Nach den vorstehend genannten Inkubationszeiträumen wurde der Käse auf seine organoleptischen Eigenschaften getestet, und es wurde festgestellt, dass er ein sauberes Geschmacksprofil zeigte, ähnlich dem, das durch im Handel erhältliche pregastrische Esterase C (Dairyland Food Laboratory) erhältlich ist, wenn der Käse in gleicher Weise geprüft wird. Beide Käse entwickelten eine erwünschte leichte bis mittlere Ranzigkeit. Im Vergleich dazu wurde festgestellt, dass ein Esterasepräparat aus Aspergillus flavus ein EA/LA-Verhältnis von 0,08 hat und im vorstehend beschriebenen Test ein unerwünschtes, starkes Buttersäure-Capronsäure-Caprin-säure-Aromaprofil entwickelt und einen schwachen metallischen Nachgeschmack zeigt.

Beispiel 2

Mucor miehei, NRRL 13 042, wurde dazu verwendet, um ein Lipaseenzymsystem wie in Beispiel 1 herzustellen, ausser dass die Fermentation in einem Produktionstank mit einem wässrigen Nährmedium, das 16% Maisstärke, die mit Bakterien-a-amylase verflüssigt worden war, 4% «Kay soy» entfettetem Sojabohnenmehl und 2% sprühgetrockneter Süssmolke durchgeführt wurde. Bei der Ernte nach 77 Stunden Fermentation wurde die Maische auf ihre EA- und LA-Werte untersucht, wobei folgende Werte gefunden wurden:

EA = 24,9 LA = 2,8 EA/LA =8,9

Das Lipase-Enzym-Produkt wird aus der Maische gewonnen und dazu verwendet, um wie in Beispiel 1 ein erwünschtes Käsearoma zu entwickeln, wobei im wesentlichen gleich gute Ergebnisse erzielt wurden.

In den folgenden Beispielen ist das Mucor-miehei-Lipase-Enzym das Enzymsystem, das nach den Verfahren gemäss Beispielen 1 und 2 hergestellt worden ist, und EA-Werte im Bereich von 10 bis 100 aufweist.

Beispiel 3

Fettspaltendes Enzym aus Mucor miehei wird vor der Zugabe der Starterkultur in einer Menge von 7,7 g bis 123 g pro Tonne Milch bei der Käseherstellung zugesetzt, um eine gesteuerte Fettspaltung zu bewirken und Geschmacksrichtungen im Bereich von delikat und butterartig bis zu pfefferartig und scharf «pikant» bei der Herstellung von Käsesorten des italienischen Typs zu erzeugen, beispielsweise von Asiago-Mozzarella, Provolone und Romano, wobei die Milch für Romano und andere scharf aromatisierte Sorten einen höheren Zusatz an fettspaltendem Enzym erhielten.

Beispiel 4

Mucor-miehei-Lipase-Enzym wird in einer Menge von 7,7 bis 15,4 g pro Tonne Milch vor der Zugabe der Starterkultur bei der Käseherstellung zugesetzt, um eine gesteuerte Fettspaltung zu bewirken, wodurch grössere Mengen kurz-kettiger Fettsäuren gegenüber langkettigen Fettsäuren erhalten werden, die mit den Endprodukten der Pénicillium roqueforti Sporen metabolisiert werden, um einen gewünschten Geschmack zu produzieren und die Menge an Methyl-ketonen und Kohlendioxyd in Blaukäse und Blaukäsearoma zu produzieren.

- Beispiel 5

Mucor-miehei-Lipaseenzym wird der aufgeschlossenen Form von Cheddar, Colby, Romano, Schweizer, Mozzarella, Blau, Gouda, Edamer, Provolone und Parmesan in einer 5 Menge von 0,01 % bis 0,1%, bezogen auf das gemahlene Käsegewicht oder Käsefeststoffe mit oder ohne Zusatz anderer Enzyme zugesetzt, um enzymmodifizierte Käsesorten von hohem Aroma zu erhalten, die anstelle: von Käsefeststoffen zur Herstellung von pasteurisiertem Käse, Käseriah-io rung, Käsepulver, Käsesnacks, Käsesaucen, Käsetunken und Salatsaucen zu dienen. Um Aromastabilität zu erzielen, wird das fettspaltende Enzym in dem enzymmodifizierten Käse durch 15 Minuten langes Behandeln, des Produktes bei 70°C und einem pH-Wert von 5,0 inaktiviert.

IS

Beispiel 6

Butter, die aus gebuttertem Rahm hergestellt und mit Wasser gewaschen ist, wird durch Erwärmen auf 39°C in 2o Butterfett umgewandelt und zur Entfernung der restlichen Buttermilch zentrifugiert. Butterfett dieses allgemeinen Typs wird mit Mucor miehei Lipaseenzym in einer Menge von 0,005 % bis 0,05%, bezogen auf das Gewicht des Butterfetts des sterilisierten Butterfetts behandelt. Das mit fett-25 spaltendem Enzym behandelte Butterfett wird 1 bis 2 Tage lang bei einer Temperatur von 22 bis 37°C inkubiert und zur Inaktivierung der Enzyme 15 Minuten lang bei einem pH-Wert von 5,0 auf 70°C erhitzt.

Das mit Lipaseenzym behandelte Butterfett wird ent-30 weder allein oder zusammen mit anderen Aromasäuren, nämlich Essigsäure und Buttersäure und/oder anderen Aromasubstanzen, nämlich Diacetyl, als geschmacksbildendes und gefügebildendes Mittel in Butteraroma, Margarine, Kunstmilchpfodukten, Süssigkeiten vom Milchsehokolade-35 typ und Butteraufstrichen und -saucen verwendet.

Beispiel 7

Mucor-miehei-Lipaseenzym wird zu der 200fache Ge-40 wichtsmenge sterilisiertem Rahm mit einem Gehalt von 35% Butterfett gegeben. Nachdem der Rahm mit Milchsäure oder einer Milchkultur auf einen sauren pH-Wert eingestellt worden ist, wird die Mischung 4 Stunden lang bei 37°G gerührt. Die erhaltene Mischung wird einem herkömmlichen Ver-45 fahren zur Herstellung von Butter unterworfen, wobei eine Butter mit einem ausgezeichneten, verbesserten Aroma erhalten wird.

Beispiel 8

50 Mucor-miehei-Lipaseenzym wird in einer Menge von 0,001 % bis 0,01 % sowohl mit und ohne Zusatz von anderen Enzymsystemen zu einem rückverdünnten Schlicker von 9 bis 14% Gesamtfettmilchfettstoffen gegeben und dann 4 bis 8 Stunden auf 22 bis 33°G erhitzt. Die gesteuerte Fett-55 Spaltung wird in ähnlicher Weise wie in Beispiel 6 beschrieben inaktiviert. Das durch das fettspältende Enzym modifizierte Vollmilchpulver wird dazu verwendet, Nahrungsmittel, wie Milchschokoladesüssigkeiten, Kaffeebleichmitteln, Kunstkäse und Milchprodukten Milchgeschmack zu 60 verleihen.

Beispiel 9

Mit Mucor-miehei-Lipaseenzym modifizierte Käsefeststoffe, hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben ist, werden 65 in Haustiernahrangsmitteln, nämlich Hundefutter, in Mengen von 1,0% bis 10,0% der Gesamtfeststoffe des Futter-: mittels verwendet, um diesen Haustierfuttermitteln einen nahrhaften, verbesserten Geschmack zu verleihen;

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Beispiel 10

Mucor-miehei-Lipaseenzym wird dazu verwendet, Wiedergewinnungskäse nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren zu behandeln, wobei der Käse anschliessend zur Zerstörung von unerwünschtem Schimmel und von Bakterien in den Käse und zur wirksamen Inaktivierung des fettspaltenden Enzyms in dem Produkt 15 Sekunden lang auf 77°C erhitzt wird. Der mit Lipaseenzym behandelte Wiedergewinnungskäse ist für Haustierfutter geeignet.

Beispiel 11

Durch Behandlung mit Mucor miehei Lipaseenzym modifiziertes Vollmilchpulver, hergestellt wie in Beispiel 8 beschrieben, wird in einer Menge von 5,0% bis 15,0% zur Herstellung eines verbesserten, vollmundigeren Kaffeebleichmittels verwendet.

Beispiel 12

Durch Behandlung mit Mucor miehei Lipaseenzym modifiziertes Vollmilchpulver, hergestellt wie in Beispiel 8 beschrieben ist, wird in einer Menge von 2,0% bis 10,0% zur Herstellung eines verbesserten, reicheren, ein volleres Aroma habenden Kunstsauerrahms verwendet.

Beispiel 13

Ein Blaukäse wird aus roher Milch bereitet, bei 32,2°C (90°F) homogenisiert und mit Benzoylperoxyd gebleicht. Die Milch wird auf 30,0°C (86°F) erhitzt und mit einem Prozent eines Streptococcus-lactis-Starters beimpft. Nach einer kurzen Haltezeit wird die Milch in einer Menge von 184 g pro Tonne (3 Unzen pro 1000 Pfund) Milch mit einem durch Züchtung des mit NRRL A 13 042 bezeichneten Stammes von Mucor miehei erhaltenen mikrobiellen Labproduktes beimpft und in einer Menge von 7,7 bis 15,4 g pro Tonne (1/8 bis 1/4 Unzen pro 1000 Pfund) Milch mit Mucor-miehei-Lipaseenzym. Die Mischung wird gerührt, bis ein Quark von genügender Festigkeit erhalten wird. Der Quark wird dann mit Penicillium-roqueforti-Sporen beimpft, aus der Molke abgetrennt und in Fässer überführt. Der in Fässer überführte Quark wird durch 3 Tage langes Eintauchen in Salzbrühe gesalzen und in evakuierte Plastiktüten («Cryovac») überführt. Durch den Käse werden Nadellöcher gestochen, um den Zutritt von Luft zu ermöglichen und das Wachstum von Pilzen zu erleichtern. Der Käse wird dann durch zwei Monate langes Einlagern bei 10°C (50°F) und 90% Luftfeuchtigkeit in einen Reiferaum gereift und ergibt einen Blaukäse von ausgezeichneter Qualität mit 5 verbessertem Aroma gegenüber demjenigen, das ohne den Zusatz von fettspaltendem Enzym erhalten wird.

Beispiel 14

Ein Käse vom Romano-Typ wird aus teilweise entrahm-10 ter Milch, die etwa 2% Fett enthält, hergestellt. Die Milch wird auf 31,1 bis 32,2°C (88 bis 90°F) erwärmt, und mit einem Prozent gleicher Mengen von Kulturen von Streptococcus thermophilus und Lactobacillus bulgaricus versetzt. Lab wird in ausreichender Menge, um die Milch in 15 bis 17 15 Minuten zu koagulieren, zugesetzt (etwa 184 g pro Tonne [3 Unzen pro 1000 Pfund]). In einer Menge von 62 bis 123 g pro Tonne (1 bis 2 Unzen pro 1000 Pfund) Milch wird fettspaltendes Enzym aus Mucor miehei zugesetzt. Der erhaltene Quark wird mit 9,5 mm (3/8-Zoll) Messern geschnit-20 ten. Nach dem Schneiden wird der Quark 30 Minuten lang bei 46,7 bis 47,8°C (116 bis 118°F) gekocht, und dann von der Molke abgetrennt. Der Quark wird in Fässer gebracht, gepresst, 2 bis 4 Tage lagergetrocknet und dann bis zu einem Salzgehalt von 4 bis 5 % gesalzen. Der Käse wird dann bei 25 10,0 bis 15,6°C (50 bis 60°F) und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 70% gereift, wobei ein Romano-Käse von ausgezeichneter Qualität und mit einem gegenüber einem hohen Zusatz von fettspaltendem Enzym erhaltenen Käse verbesserten Aroma erhalten wird.

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Beispiel 15

Ein flüssiges Backfett, wie es in der US-PS 2 815 286 beschrieben ist, und ein plastisches Backfett, wie es in der US-PS 2 132 393 beschrieben ist, werden jeweils mit 1% 35 bis 15 Gew.-% an Mucor-miehei-Lipaseenzym 1 bis 24 Stunden lang bei 32,2°C (90°F) inkubiert, um gewünschte Geschmacksstoffe zu entwickeln; anschliessend wird das Enzym durch 15 Minuten langes Erhitzen bei einem pH-Wert von 5,0 auf 21,1°C (70°F) inaktiviert.

4o Aus der vorstehenden Spezialbeschreibung ergeben sich für den Fachmann viele andere Beispiele und Abwandlungen, die alle unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallen.

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Claims (11)

1. 628216

   2

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Verfahren zur Herstellung eines ein lipolysiertes Tri-glyceridfett enthaltenden Nahrungsmittelbestandteils mit verstärktem Aroma, dadurch gekennzeichnet, dass der Tri-glyceridfett enthaltende Nahrungsmittelbestandteil mit einer zur Fettspaltung ausreichenden Menge eines fettspaltenden Enzymsystems aus dem fermentierten Wachstumsprodukt von Mucor miehei, mit einem Verhältnis Esterase-Aktivität zu Lipase-Aktivität von > 1, in Kontakt gebracht wird,

   wobei die Esterase-Aktivität die Aktivität des Enzyms auf wasserlösliche Fette, die eine Kohlenstoffkettenlänge von 4 bis 10 haben und die Lipase-Aktivität die Aktivität des Enzyms auf wasserunlösliche Fette, die eine Kohlenstoffkettenlänge von 12 und mehr haben, bedeutet.
2. 2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Triglyceridfett ein tierisches Fett wie Milchfett, Schweineschmalz oder Rindertalg enthält.
3. 3. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Triglyceridfett ein pflanzliches Fett wie Baumwollsamenöl, Sojabohnenöl, Maisöl, Erdnussöl, Saflor-öl, Palmöl, Kokosnussöl, Margarine und Backfettmischun-gen enthält.
4. 4. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Triglyceridfett enthaltende Nahrungsmittelbestandteil ein Milchfettmedium enthält.
5. 5. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Triglyceridfett enthaltende Nahrungsmittelbestandteil Milch ist und dass das fettspaltende Enzym in einer Menge von 3,5 g bis 56 g auf 454 kg Milch zugesetzt wird, um ein verstärktes käseähnliches Aroma zu erhalten.
6. 6. Nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1 erhaltener Nahrungsmittelbestandteil.
7. 7. Enzymsystem aus dem Fermentationsprodukt von Mucor miehei mit einem Esterase-Aktivität zu Lipase-Akti-vität Verhältnis grösser als Eins als Mittel zur Ausführung des Verfahrens gemäss Patentanspruch 1.
8. 8. Anwendung des Verfahrens gemäss Patentanspruch 1 zur Herstellung eines tierisches Fett enthaltenden Nahrungsmittels mit verstärktem Aroma, dadurch gekennzeichnet,

   dass dem Nahrungsmittel während der Herstellung das fettspaltende Enzymsystem mit einem Verhältnis Esterase-Aktivität zu Lipase-Aktivität von grösser als Eins zugesetzt wird.
9. 9. Anwendung gemäss Patentanspruch 8 zur Herstellung eines enzymmodifizierten Käses mit verstärktem Aroma, dadurch gekennzeichnet, dass dem Käse während der Herstellung 0,01 bis 0,1 Gew.-% des Enzymsystems zugesetzt werden.
10. 10. Anwendung gemäss Patentanspruch 8 zur Herstellung eines enzymmodifizierten Butterfetts mit verstärktem Aroma, dadurch gekennzeichnet, dass dem Butterfett 0,005 % bis 0,05 % Enzymsystem, bezogen auf das Gewicht des Butterfetts, zugesetzt werden, und dass das Butterfett 1 bis 3 Tage lang bei einer Temperatur von 22°C bis 37°C inkubiert wird.
11. 11. Anwendung gemäss Patentanspruch 8 zur Herstellung eines enzymmodifizierten Vollmilchpulvers mit verstärktem Aroma, dadurch gekennzeichnet, dass dem Völl-milchpulver 0,001 % bis 0,01 Gew.-% Enzymsystem, bezogen auf die Vollmilchfettfeststoffe, zugesetzt werden und dass das Vollmilchpulver 4 bis 8 Stunden bei einer Temperatur von 22°C bis 33°C inkubiert wird.