DE2515021A1 - Lipolytisches enzymsystem - Google Patents

Lipolytisches enzymsystem

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DE2515021A1 DE19752515021 DE2515021A DE2515021A1 DE 2515021 A1 DE2515021 A1 DE 2515021A1 DE 19752515021 DE19752515021 DE 19752515021 DE 2515021 A DE2515021 A DE 2515021A DE 2515021 A1 DE2515021 A1 DE 2515021A1
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Description

PATENTANWÄLTE
Dipl-ing. P." WIRTH · Dr. V. SCHMIED-KOWARZIK OipL-lng. G. DANNENBERG · Dr. P. WEINHOLD · Dr. D. GUDEL
281134 β FRANKFURTAM MAIN
TELEFON CCOIl)
237014 GR. ESCHENHEIMER STRA33E
Ref.: ¥-434;SJMigk 2515021
wd/sch
BAXTER LABORATORIES, INC Morton Grove, Illinois 60033
U.S.A.
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein enzymatisch hergestelltes Geschmacks- bzw. Aromaverleihungssystem auf der Basis bestimmter Arten der Pilzgattung Mucor, und insbesondere auf die Herstellung eines verbesserten lipolysierten Fettes unter Verwendung einer von Mucor iniehei erhaltenen Enzymzusammensetzung.
Viele Arten von Nahrungsmitteln, besonders solche, die durch Fermentation hergestellt worden sind, enthalten enzymatisch hergestellte Geschmacksstoffe. Bei der Herstellung von Nahrungsmitteln, wie Backwaren, Kaffeeweißmachern, Milchschokolade, Margarine und dergleichen, ist es wünschenswert, daß das Endprodukt einen milch- oder butterähnlichen Geschmack* besitzt. Bei bestimmten Käsearten und Käseprodukten, insbesondere bei den sogenannten Weichkäsesorten und stark schmekkenden Käsesorten, wie den italienischen Sorten, hängen die ausgeprägten Geschmacksnoten von verschiedenen Enzyrasystemen ab, die während der Käseherstellung verwendet wurden.
Im Falle von fetthaltigen Nahrungsmitteln besteht die hauptsächliche enzymatische Wirkung in einer Lipolyse oder einer durch Enzyme katalysierten hydrolytischen Spaltung von Triglyceriden. Obwohl gleichzeitig mit der Lipolyse auch andere enzymatiüche Geschmacksstoffentwicklungen stattfinden können, bezieht sich die vorliegende Erfindung hauptsächlich auf die letztere Wirkungsweise.
Seit vielen Jahren hat eine spontane und nicht steuerbare Lipolyse der Nahrungsmittelindustrie Schwierigkeiten bereitet, da dadurch unerwünschte Geschmacksnoten oder eine starke Ranzigkeit entstehen können. In neuerer Zeit hat jedoch die Entwicklung einer gesteuerten Lipolyse zu vielen verbesserten Nahrungsmittelprodukten geführt. In der Molkereiindustrie ist es zum Beispiel üblich, Milchfette mit lipolytischen Enzymen zu behandeln, um einen gewünschten Geschmack zu erzeugen. Das lipolytische Enzym wirkt auf die Triglyceride, um freie Fettsäuren zu erzeugen, die in einigen Fällen wiederum
* bzw. Aroma, was durch den Begriff »Geschmack" mit umfaßt werden soll.
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in andere Verbindungen, wie Ketone, umgewandelt werden können. Die Menge und Art der erzeugten Fettsäuren hängt von der Menge und Art des in dem Nahrungsmittelprodukt enthaltenen Fettes, der Menge und Art des lipolytischen Enzymprodukts und der Dauer und Temperatur der mit dem lipolytischen Enzym durchgeführten Behandlung ab. V/eitere Einzelheiten über herkömmliche gesteuerte Lipolyseverfahren können dem J. Amer. Oil ^hem. Soc. 49, 559-62 (1971) und den darin genannten Literaturstellen entnommen werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines verbesserten Geschmackverleihungssystems* für Triglyceridfette und -fetthaltige Nahrungsmittel, insbesondere eines verbesserten lipolysierten Milchfettes, durch Verwendung einer aus Mucor miehei gewonnenen Enzymzusammensetzung.
Es sind verschiedene lipolytische Enzyme bekannt, beispielsweise pankreatische Lipase, prägastrische Esterase, Milchlipase und Pilzlipase. Insbesondere die Pilzlipasen werden zum Beispiel gemäß der U.S.-Patentschrift 2 480 090 vom Aspergillus, gemäß der U.S.-Patentschrift 3 262 863 vom Rhizopus und gemäß der U.S.-Patentschrift 3 616 233 vom . Mucorpilz erhalten.Die Wirkung dieser Pilzlipasen hinsichtlich der Entwicklung von Ranzigkeit in Fetten wird in Bezug auf Aspergillus in J. Gen. Appl. Microbiol. I1O, 13-22 (1964); in Bezug auf Rhizopus in Agr. Biol. Chem. ^2, 729-38 (1969) und in Bezug auf Mucof in Appl. Microbiol. IjS, 617-19 (1968) und T7» 606-10 (1969) beschrieben. Bisher verwendete typische koirjaerziell erhältliche Esterasen und Lipasen sind prägastrische Esterasen, wie die von der Firma Dairyland Food Laboratory unter den Handelsnamen "Italase" und "Capalase" vertriebenen; die pankreatische Lipase, die von der Firma Fermco Laboratories unter dem Handelsnamen "Fermlipase PL" vertrieben wird; und die Pilzlipase, die von der Firma Röhm und Haas unter dem Handelsnamen "Lipase B" vertrieben wird.
* "flavoring system"
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Die infolge der Knappheit an von Tieren gewonnenen lipolytischen Enzymen entwickelte Herstellung von lipolytischen Enzymsystemen von einer mikrobiologischen Quelle bietet den Vorteil von leichterer Verfügbarkeit und außerdem die Wahrscheinlichkeit, ein Produkt von größerer Gleichmäßigkeit durch gesteuerte Fermentation des Organismus zu erhalten. Nicht von allen mikrobiologischen lipolytischen Enzymen erhält man -jedoch ain erwünschtes Geschmackverleihungssystem.
Es wurde nun gefunden, daß von dem mikrobiologischen Organismus des Mucor miehei ein enzymatisch hergestelltes Geschmackverleihungssystem für Triglyceridfette von ausgezeichneter Qualität gewonnen werden kann. Dieses enzymatische Geschmackverleihungssystem wird hier durch das Verhältnis der Esterasewirksamkeit (EA) zur Lipasewirksainkeit (LA) oder als EArLA näher charakterisiert.
Die Esterasewirksamkeit ist die Wirksamkeit des Enzyms auf die wasserlöslichen Fette, nämlich auf diejenigen Fette, die eine Länge der Kohlenstoffketten von etwa 4 bis 10 Atomen haben. Dagegen ist die Lipasewirksamkeit die Wirksamkeit des Enzyms auf die wasserunlöslichen Fette, nämlich auf diejenigen Fette, die eine Länge der Kohlenstoff kette von etwa 12 und mehr, insbesondere von 12 bis 22, Atomen haben,
Erfindungsgemäß wurde überraschenderweise gefunden, daß das lipolytische Enzymsystem, das von bestimmten Arten der Schimmelpilzgattung Mucor, insbesondere von der Art Mucor miehei, erhalten wird, im Gegensatz zu demjenigen von anderen Pilzen (Fungi) wie Aspergillus oder Rhizopus, die wünschenswerte Eigenschaft besitzt, eine größere Esterasewirksainkeit als Lipasewirksamkeit zu zeigen, und zwar in ähnlicher Weise wie die kommerziell verwendeten prägastrischen Esterasen vom Kalb, Zicklein und Lamm. D.h., es zeigt ein EA:LA-Verhältnis von mehr als 1. Zum Vergleich sei erwähnt, daß von Aspergillus und Rhizopus hergestellte lipolytische Systeme EA:LA-Verhältnisse von weniger als 1 aufweisen und deshalb für die erfindungsgemäßen Zwecke ungeeignet sind. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis EAtLA
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mehr als 2, und Verhältnisse von etwa 2 bis 10 sind für die erfindungsgemäßen Zwecke hervorragend geeignet.
Die Esterasewirksamkeit wird vorzugsweise durch einen Test mit Tributyrin gemessen, während die Lipasewirksamkeit vorzugsweise durch einen Test auf einem Olivenölsubstrat ermittelt wird. Diese Tests können wie folgt durchgeführt werden:
Esterase-Verfahren
Dieses Verfahren wird zur Bestimmung der Esterase, durch welche Tributyrin hydrolysiert wird, verwendet. Die Esterase wird mit einer Tributyrinlösung mit einem pH-Wert von 6 bei einer Temperatur von 37°C inkubiert. Die Säure, die innerhalb von 10 Minuten in der Reaktionsmischung freigesetzt wird, wird auf einem pH-Wert von 8,7 titriert. Die Ergebnisse zeigen ein praktisch lineares Verhältnis zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und der Enzymkonzentration innerhalb des empfohlenen Bereichs.
Lösungen
1. Substratlösung·
13 g Gummi-arabicum U.S.P. werden zu 114 ml einer O,O5m Natriumacetatlösung (6,8 g NaC2H^O2*3H2O zu 1 1) gegeben, dann werden etwa 50 mg Thymol dazugegeben und 25 Minuten gerührt, um alles zu lösen. Zu der gepufferten Gummilösung werden 22,7 g Tributyrin (75 m-Mol) gegeben und das Ganze 5 Minuten lang in einer "Waring"-Mischvorrichtung emulgiert· Dann wird die Emulsion mit 0,5n NaOH auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Es werden weniger als 1 ml an Alkali benötigt. Die Lösung kann wenigstens 3 Tage lang verwendet werden, wenn sie in einem Kühlschrank aufbewahrt wird. Sie soll jeweils vor Gebrauch gut geschüttelt und der pH-Wert gegebenenfalls erneut auf 6,0 eingestellt werden.
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Für die enzymfreie Vergleichslösung (siehe unten) wird eine Lösung von 13 g Gummi-arabicum. in 114 ml 0,05m Natriumacetat verwendet. Die Gummi/Acetatlo sung wird auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, wozu 3 bis 4 ml 0,1n HaOH benötigt werden.
2. 0,Q2n NaOH.
3. Acetatpuffer, pH-Wert 5,9 bis 6,2, 0,05m.
6,8 g Natriumacetat·3H2O werden in etwa 500 ml Wasser gelöst, dann wird 1 ml 1n HCl dazugegeben und das Ganze mit destilliertem Wasser auf 1 Liter aufgefüllt.
4. Enzymlösungen.
Alle Lösungen und Verdünnungen werden mit Acetatpuffer (siehe Nr. 3 oben) zubereitet. Die benötigten Konzentrationen sind unten unter "Bereich" beschrieben.
Verfahren
Die Substratlösung wird geschüttelt, und dann werden 50,0 ml in einen 125-ml-Erlenmeyer-Kolben getropft. Nun werden 10 ml Enzymlösung dazugegeben, das Ganze schnell gemischt und eine Probe von 10,C ml entnommen, die in. 40 ml Wasser gegeben und sofort mit 0,02n NaOH auf einen pH-Wert von 8,7 titriert wird. Sofort nach Entfernen der Probe wird die restliche Mischung in ein Bad, das eine Temperatur von 37° hat, gegeben (dies wird als Zeitpunkt Null betrachtet) ,wo sie 40 Minuten lang unter ständigem Rühren (mit einem eingetauchten magnetischen Rührer) gehalten wird. Nach genau 40 Minuten ab dem Zeitpunkt Null wird eine weitere Probe von 10 ml entfernt, in 40 ml Wasser gegeben und auf einen pH-Wert von 8,7 titriert. Der Unterschied zwischen den zwei Titrationen drückt den Grad aus, in welchem das Tributyrin durch das Enzym hydrolysiert worden ist·
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Vergleichslösungen
Ein Nullsubstrat ist nicht notwendig, aber bei rohen Enzymzusammensetzungen kann eine Nullenzymzusammensetzung notwendig sein. Es wird wie oben beschrieben vorgegangen, jedoch wird die eingestellte Gummi-arabicum-Lösung ohne Tributyrin anstelle der regulären Substratlösung verwendet. Das Hauptergebnis wird korrigiert, indem die bei der Vergleichslösung festgestellte Titrationserhöhung abgezogen wird.
Einheiten
Eine Esteraseeinheit erzeugt unter den Versuchsbedingungen 1 Säuremikroäquivalent pro Minute.
Die Esterasewirksamkeit (EA) ergibt sich aus der Anzahl der Einheiten pro Gramm der Zusammensetzung.
Berechnung
ml NaOH χ η NaOH χ 1000 χ ml aufgeschlossene Mischung (1) Minuten χ g Zusammensetzung in aufgeschl.Misch, χ ml Probe"
worin ml NaOH die Titriationserhöhung bei einer Probe von 10 ial und η NaOH die Normalität des für die Titrierung verwendeten NaOH bedeutet.
ml NaOH χ 0,02 χ 1000 χ 60 » 40 χ g Zusammensetzung χ 10
_ ml NaOH χ 3 ,
g Zusammensetzung in aufgeschlossener Mischung
Bereich
Die Probenverdünnuig sollte so sein, daß man Titrationserhöhungen zwischen 0,5 und 1,5 ml erhält. Nötigenfalls sollten Wiederholungsversuche durchgeführt werden, um Ergebnisse innerhalb dieses Bereichs zu erhalten.
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Das Voranschreiten der Tributyrinliydrolyse verläuft linear mit der Zeit, und es ist möglich, Versuche mit kürzeren als mit 40-Minuten-AufSchlußzeiten durchzuführen. Die Gleichung (3) muß dann natürlich dem entsprechenden Zeitfaktor angepaßt werden.
Lipaseverfahren
Dieses Verfahren wird verwendet, um die Lipase zu bestimmen, durch welche Olivenöl hydrolysiert wird. Die Lipase wird mit einer Olivenöl emulsion, die einen pH-Wert von 6,5 hat, bei 3O0C inkubiert. Die Säure, die im Verlauf von 5 Minuten in der Reaktionsmischung freigesetzt wird, wird auf einen pH-Wert von 8,0 titriert. Die Ergebnisse zeigen ein praktisch lineares Verhältnis zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und der Enzymkonzentration innerhalb des empfohlenen Bereichs.
Chemikalien
1. Olivenöl, U.S.P.
2. Amerchol L-101 (von Lanolin herrührende - freie Sterole.)., der Firma American Cholesterol Products, Edison, New Jersey.
3. Natriumbarbital, N.F.
4. Gummi-arabicum, U.S.P.
5. Natriumac etat · 3HpO, CP.
6. Natriumchlorid, CP.
7. 0,5n NaOH
8. 0,02n NaOH
9. 0,1n HCl
10.Äthylalkohol (der denaturierte Äthylalkohol Nr. 23A ist geeignet).
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Geräte und Vorrichtungen
1. "Waring"-Mischvorrichtung.
2. 2 magnetische Rührer, von denen einer zum Eintauchen in das Wasserbad geeignet ist (Modell MS-7, Tri-R Instruments, Jamaica, New York).
3. pH-Messer für Titrationen, ausgestattet mit einer kleinen Kombinationselektrode (wie die Nr. 4858-L15 der Firma A.H. Thomas).
4. Mikrobürette, 10 ml, mit 0,02-ml-Unterteilungen (Fabrikat Kimble Nr. 17107F mit einer Spritzen-Nadel des Typs Luer, 20G, 38,1 mm).
Lösungen
1· Substratemulsion
30 g Gummi-arabicum und 270 ml destilliertes Wasser werden 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur magnetisch gerührt. Gegebenenfalls anwesende Klumpen werden mit einem Glasstab zerkleinerte Die Mischung wird auf 5°C abgekühlt. Dann werden 6 g Amerchol in ein 400-ml-Becherglas gegeben, 72 g Olivenöl und 222 g der gekühlten Gummi-arabicum-Lösung dazugegeben, und die Mischung mit einem Glasstab gerührt und in eine "Waring"-Mischvorrichtung gegossen. Sie wird 5 Minuten lang gemischt, dann wird der pH-Wert mit 0,5n NaOH auf 6,3 eingestellt, die Mischung auf 5°C abgekühlt und nochmals 7 Minuten lang gemischt. Die Temperatur kann auf höchstens 47°C und der pH-Wert auf 6,5 angestiegen sein. Falls dies nicht der Fall ist, wird der pH-Wert auf 6,5 eingestellt. Die Emulsion ist für wenigstens 8 Tage beständig, falls sie in einem Kühlschrank aufbewahrt wird. Es sollte vermieden werden, daß die Temperatur auf unter 1°C absinkt.
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2o Puffer. 2b 15021
a. Grundlösungo 9,7 g Natriumacetat.3H2O und 14,7 g Natriumbarbital werden in destilliertem Wasser gelöst und auf 500 ml aufgefüllt. Diese Lösung hat die folgenden Werte: 0,i4n Barbital, 0,14n Acetat, pH-Wert 9,9. Sie wird im Kühlschrank aufbewahrt.
b. Arbeitslösung,, 40 ml der Grundlösung, 16 ml 8,5#ige NaCl-Lösung und 53 ml 0,1n HCl werden in destilliertem Wasser gelöst und auf 200 ml aufgefüllt. Der pH-Wert beträgt 6,5. Für geringfügige Einstellungen des pH-Werts werden 0,1n HCl oder 0,1n NaOH verwendet. Die Lösung wird im Kühlschrank aufbewahrt. Falls sich während der Lagerung Kristalle bilden, wird die Lösung verworfen.
3. Enzymlösungen.
Für Versuche mit Feststoffzusammensetzungen wird zunächst eine Grundlösung hergestellt,indem die Probe in einer geeigneten Menge V/asser etwa 30 Minuten lang magnetisch gerührt wird, bevor die endgültige verdünnte Lösung durch weitere Verdünnung mit Wasser zubereitet wird. Die Grundlösung ist bei 5°C mehrere Stunden lang beständig; dagegen sollte die stark verdünnte endgültige Lösung innerhalb von 5 Minuten verwendet werden» Bei Versuchen mit unbekannten Zusammensetzungen ist es notwendig, den geeigneten Verdünnungsgrad durch Versuche zu ermitteln. Zusammensetzungen, deren Wirksamkeit in etwa bekannt ist, sollten auf etwa 1 bis 3,6 Lipaseeinheiten/ml verdünnt werden. Der Begriff "Lipaseeinheiten" ist nachfolgend definiert.
Verfahren.
Emulsion und Puffer werden in einem Gewichtsverhältnis von 3:1 vorgemischt, um ein Substrat zu ergeben. Substratmengen von 8,0 ml werden in 100-ml-Bechergläser gegeben, die mit magnetischen Rührstäben ausgestattet sind. Die Substratlösung wird magnetisch gerührt. Jede das Substrat enthaltende Probe wird
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zweimal (Nullprobe und Probe) wie folgt behandelt: Nullprobe:
1. Es werden 40 ml Äthylalkohol zugegeben.
2. Es werden 2,0 ml einer Probe der Enzymlösung zugegeben« Probe:
1. Das Substrat wird in einem Wasserbad'von 300C equilibriert·
2. Es werden 2,0 ml einer Probe der Enzymlösung zugegeben· 3β Das Substrat wird 5 Minuten lang bei 30°C inkubiert.
4, Es werden 40 ml Äthylalkohol zugegeben.
Sowohl die Nullprobe als auch die Probe werden mit 0,02n NaOH auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt.
Berechnungen.
1 Lipaseeinheit (LU) = die Lipasemenge, die für.
1 Mikromol H+/Minute notwendig ist·
Lipasewirksamkeit (LA) = Anzahl an LU/Gramm der Zusammensetzung.
LA = ml NaOH χ η NaOH χ 10 /mg zugegebene Enzymzusammensetzung χ 10 χ Minuten.
Wenn 0,02n NaOH und eine Reaktionszeit von 5 Minuten verwendet werden, ist die Lipasewirksamkeit (LA) = ml NaOH χ 4000/mg Enzym·
Die Abkürzungen haben die folgende Bedeutung:
U.S,P. = United States Pharmacopoeia N.F. = National Formulary
CgP. = chemisch rein.
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ZS1S011
Die Herstellung des gewünschten lipolytischen Enzymgeschmack«- gebungssystems kann nach jedem herkömmlichen Fermentationsverfahren, gefolgt von geeigneten Gewinnungsverfahren, durchgeführt werden. Beispielsweise kann ein Nährmedium, das assimilierbaren Kohlenstoff, Stickstoff und Spurenmineral stoff e enthält, mit einer Kultur einer Mucor-Ärt, insbesondere mit Mucor miehei, inkubiert und dann bei einem pH-Wert von etwa 3 bis 8 und einer Temperatur von etwa 20 bis 500C etwa 2 bis Tage lang unter aeroben Bedingungen, von Flüssigkeit bedeckt, fermentiert werden. Bestimmte ausgewählte Stämme des Mucor miehei, die auf diese Weise fermentiert werden können, um das gewünschte Enzymgeschmackgebungssystem herzustellen, sind unter den Bezeichnungen NRRL A 13,131 und A 13.042 bei den Northern Regional Research Laboratories, Peoriet, Illinois, für die Öffentlichkeit ohne Beschränkungen erhältlich. Andere geeignete Stämme des Mucor miehei sind für den Fachmann aufgrund der vorliegenden Beschreibung leicht erkennbar.
Nach bisheriger Praxis wurden die Esterasen und Lipasen -bei der Gewinnung des gewünschten Labprodukts entweder entfernt oder inaktiviert j wie es beispielsweise in den U«Se J-Patentschriften 3 616 233 und 3 763 011, der OLS 2 232 996 und der britischen Patentschrift 1 207 892 beschrieben wird.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das gewünschte Enzymgeschmackgebungssystem durch Abtrennen von der Fermentationsmaische gewonnen, um ein geeignetes EA:LA~Verhältnis zu erhalten. Dieses Abtrennen kann durch Filtrieren der Maische bei einem niedrigen pH-Wert von etwa 4-5» durch Extrahieren des Filterkuchens bei einem hohen pH-Wert von etwa 10 - 12, durch Ansäuern des Extrakts auf einen pH-Wert von etwa 7 und anschließendes Gewinnen durch Filtrieren oder Konzentrieren des angesäuerten Extrakts durch Abdampfen oder Ultrafiltrieren und schließlich Trocknen des Konzentrats, beispielsweise durch Sprühtrocknen oder dergleichen* durchgeführt werden.
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Für bestimmte Verwendungszwecke ist es wünschenswert, ein lipolytisches Enzymsystem zu verwenden, das praktisch frei von einer Labenzymwirksamkeit ist. Dies kann erreicht werden, indem das oben beschriebene Gewinnungsverfahren oder andere Reinigungsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, angewendet werden.
Das gewonnene lipolytische Enzymgeschmackgebungssysteni kann Milch, Milchfett, Butteröl, Käse, Milchschokolade, Margarineöl, Kaffeweißmachern und anderen Triglyceridfett-haltigen Nahrungsmitteln und Nahrungsmittelkomponenten zugegeben und bei Temperaturen von etwa 10 bis 50°C während einer Dauer von etwa 2 Stunden bis 20 Tagen inkubiert werden, um erwünschte milch- und butterähnliche Geschmacksnoten zu erhalten. Es kann auch zur Beschleunigung oder Intensivierung des in diesen Nahrungsmitteln oder Nahrungsmittelkomponenten natürlich entwickelten Geschmacks verwendet und mit bekannten Geschmackaentwicklungsmitteln gemischt werden, um eine Vielfalt an Geschmacksrichtungen zu erhalten. Beispielsweise kann es mit prägastrischen Esteraseenzymzusammensetzungen gemäß der U.S.Patentschrift 2 531 329 (unter dem Handelsnamen "Itala3e" von der Firma Dairyland Food Laboratory erhältlich) gemischt oder zusammen mit den aus Penicillium roquefort! gewonnenen Geschmackgebungszusammensetzungen gemäß der Ü.S.Patentschrift 3 100 153 verwendet werden. Im allgemeinen wird das gewonnene lipolytische Enzym in Mengen von etwa 0,001 bis 0,1 Gew.-#, bezogen auf das Triglyceridfett-haltige Substrat, und im Fall von Milch vorzugsweise in Mengen von etwa 3,5 bis 56,7 g pro 453,59 kg Milch zugegeben.
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509341/1013
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird zur Herstellung von Käse das lipolytische Enzymsystem in einer Menge von etwa 0,01 bis 0,1 Gew. -% zugegeben. Wird als Nahrungsmittelkomponente Butteröl verwendet so beträgt die zugegebene Menge an dem Enzymsystem vorzugsweise etwa 0,005 bis 0,05 Gew.-% (bezogen auf das Butterfett) und die Inkubationsbehandlung wird bevorzugt bei etwa 22 bis 37° C während einer Dauer von etwa 1 bis 3 Tagen durchgeführt. Bei Verwendung von Vollmilchpulver beträgt die zugegebene Menge an dem lipolytisehen Enzym etwa 0,001 bis 0,01 Gew.-% (bezogen auf die Vollmilchfett-Feststoff-e )und die Inkubierung findet vorzugsweise bei etwa 22 bis 33° C während einer Dauer von etwa 4 bis 8 Stunden statt.
Beispiele für Triglyceridfette, die mit dem erfindungsgemäßen lipolytischen Enzymgeschmackgebungssystem behandelt werden können, sind tierische Fette, wie Milchfett, Schweinefett und Talg,sowie pflanzliche Fette, wie Leinöl, Sojaöl, Maisöl, Erdnußöl, Safranöl, Palmöl, Kokosöl und Margarine- und Backölmischungen.
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Beispiele für Käsesorten, für welche das erfindungsgemäße lipolytische Enzymgeschmackgebungssystem zur Entwicklung eines gewünschten Geschmacks verwendet werden kann, sind: Provolone, Romano, Feta, Pizza, Mozzarella, Cheddar, Schweizerkäse, Blauschimmelkäse, Parmesan, Colby, Gouda und Edamer.
Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der vorliegenden Erfindung, ohne diese jedoch zu beschränken.
Beispiel 1
Mucor-miehei-Schimmelpilz (NRRL 13.042) wird unter aseptischen Bedingungen von einer Agar-Fläche entfernt und in einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben gegeben, der 200 ml des folgenden Mediums enthält:
Sojamehl (Nutrisoy 300 C) 1,5 %
getrocknete Molke 3»0 %
enzymatisch aufgeschlossene Maisstärke 12,0 56
V/asser 83,5 %
insgesamt 100,0 %
Der Kolben wird 114 Stunden lang bei 37°C auf einer Drehschüttelvorrichtung inkubiert, wobei von einem pH-Wert von etwa 6 ausgegangen wird. Das gewünschte lipolytische Enzymsystem wird wie folgt gewonnen: Die Fermentationsbrühe wird auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und dann filtriert. Das Filtrat wird mit einer verdünnten NaOH-Lösung, die einen pH-Wert von 10-11 aufweist, extrahiert, und der Extrakt wird auf einen pH-Wert von 7 angesäuert. Der angesäuerte Extrakt wird dann in einem Gewinnungsansatz (A) filtriert und zu einem Konzentrat mit einem EA-V/ert von 25,8 und einem EA:LA-Verhältnis von 2,6 eingedampft und anschließend in einem weiteren Gewinnungsansatz (B) nochmals filtriert, eingedampft und zu einem Feststoff mit einem EAsLA-Verhältnis von 3,5 sprühgetrocknet.
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Das von Mucor miehei hergestellte lipolytische Enzym, das in dem oben beschriebenen Gewinnungsverfahren A mit dem angegebenen EA:LA-Verhältnis von 2,6 erhalten worden ist, wird zur Entwicklung eines gewünschten Käsegeschmacks verwendet,und zwar wie folgt:
454 g-schwere Proben von Cheddar-Käse (Current A) (2-4 Wochen alter Käse mit einem leeren Geschmack) werden mit einer elektrischen Mühle (Fabrikat "Sunbeam", Tischmodell) gemahlen, und das lipolytische Enzym wird damit gemischt, bis es gleichmäßig in einem Verhältnis von 440 mg pro 454 g Käse verteilt ist. Die Enzym-Käse-Mischungen werden dann in sterile Kunststoff-Petrischalen gefüllt. Die Schalen werden in einen anaeroben Behälter gegeben, um ein Schimmelwachstum zu verhindern, und mehrere Proben werden 4 Tage lang bei 20°C inkubiert, während andere Proben 11 Tage lang bei 200C inkubiert werden. Nach den genannten Inkubationszeiten wurde der Käse auf seine organoleptischen Eigenschaften untersucht,und es wurde gefunden, daß er ein sauberes Geschraacksprofil hatte, das demjenigen, das man mit der im Handel erhältlichen prägastrischen Esterase C (Dairyland Foods Laboratory) erhält, die in der gleichen Weise getestet wurde, glich. Beide Käsesorten entwickelten eine erwünschte leichte bis mittlere Ranzigkeit. Zu Vergleichszwecken wurde eine Esterasezuaammensetzung verwendet, die von der Schimmelpilzart Aspergillus flavus erhalten worden war, und es wurde gefunden, daß sie ein EA:LA-Verhältnis von 0,08 aufwies und in dem oben beschriebenen Versuch ein unerwünschtes strenges Geschmacksprofil, das an Buttersäure, Kapronsäure und Kaprinsäure erinnerte, hervorrief und einen leichten metallischen Nachgeschmack erzeugte.
Beispiel 2
Mucor miehei (NRPlL 13.042) wurde zur Herstellung eines lipolytischen Enzymsystems gemäß Beispiel 1 verwendet, wobei die Fermentation jedoch in einem Herstellungstank durchgeführt wurde, der mit einem wässrigen Nährmedium gefüllt war, welches 16 %
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-VS-
Maisstärke, die mit bakteriellerdv-Amylase verflüssigt war, 4 % entfettetes Sojamehl ("Kaysoy") und 2 % sprühgetrocknete süße Molke enthielt. Beim Gewinnen nach 77 Stunden Fermentation wurden in der Maische die folgenden EA- und LA-Werte gefunden:
EA = 24,9
LA = 2,8
EA:LA = 8,9.
Das lipolytische Enzymprodukt wurde gewonnen und dazu verwendet, wie in Beispiel 1 einen wünschenswerten Käsegeschmack zu entwickeln, und man erhielt praktisch äquivalente, gute Ergebnisse.
Das in den folgenden Beispielen verwendete lipolytische Mucor-miehei-Enzym ist das gemäß Beispiel 1 und 2 hergestellte Enzymsystem mit EA-Werten zwischen 10 und 100.
Beispiel 3
Ein von Mucor miehei gewonnenes lipolytisches Enzym wird vor der Zugabe der Startkultur* in einer Menge von 3,5 - 56,7 g pro 453,69 kg Milch zu Käsemilch gegeben, um eine gesteuerte Lipolyse zu entwickeln und bei der Herstellung von italienischen Käsesorten, nämlich Asiago-Mozzarella, Provolone bzw. Romano, Geschmacksnoten von zart und butterartig bis pfefferartig und scharf-pikant zu erzeugen, wobei diejenigen Käsemilchmengen, die für die Herstellung von Romano und anderen scharf schmekkenden Käsesorten bestimmt waren, mit höheren Vierton dss lipolytischen Enzyms behandelt wurden.
Beispiel 4
Das von Mucor miehei gewonnene lipolytische Enzym wird vor Zugabe der Startkultur in einer Menge von 3,5 bis 7 g pro 453,69 kg Milch zu Käsemilch gegeben, um eine gesteuerte Lipolyse zu entwickeln und eine größere Menge an kurzkattigen
* "starter culture"
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251bü21
Fettsäuren im Verhältnis zu den langkettigen Fettsäuren zu erzeugen, die mit den Endprodukten der Sporen Penicillium roquefort! metabolismert werden, um einen gewünschten Geschmack und den gewünschten Gehalt an Methylketonen und CO2 in Blauschimmelkäse("Blue Cheese") zu erhalten.
Beispiel 5
Das von Mucor miehei gewonnene lipolytische Enzym wird zu Cheddar, Colby, Romano, Schweizerkäse, Mozzarella, Blauschimmelkäse, Gouda, Edamer,Provolone und Parmesan in mazerierter Form gegeben, und zwar in Mengen von 0,01 bis 0,1 Gew.-% des gemahlenen Käses oder der Käsefeststoffe und teilweise zusammen mit anderen Enzymen, um durch das Enzym modifizierte Käsearten mit einem ausgeprägten Geschmack zu erhalten, die anstelle der bei der Herstellung von pasteurisierten Käsearten, käsehaltigen Nahrungsmitteln, Streichkäse, Streukäse, Käsegebäck, Käsesaucen, Käsetunken und Salatsaucen verwendeten Käsefeststoffe geeignet waren. Um eine Geschmacksbeständigkeit zu erhalten, wird das lipolytische Enzym in dem Enzym-modifizierten Käse durch eine Behandlung des Produkts bei 70°C von 15 Minuten Dauer bei einem pH-Wert von 5,0 inaktiviert.
Beispiel 6
Butter, die aus gebuttertem Rahm hergestellt und mit Wasser gewaschen worden ist, wird durch Erwärmen auf 39 C und Zentrifugieren, um das restliche Butterserum zu entfernen, in Butteröl umgewandelt. Dieses Butteröl wird mit dem von Mucor miehei gewonnenen lipolytischen Enzym in einer Menge von 0,005 bis 0,05 Gew.-$ des Butterfettes in dem sterilisierten Butteröl behandelt. Das mit dem lipolytischen Enzym behandelte Butteröl wird 1 bis 3 Tage lang bei 22°C bis 37°C inkubiert, um eine geeignete Geschmacksentwicklung zu erreichen, bevor das Enzym durch eine 15 Minuten dauernde Behandlung bei 700C und einem pH-Wert von 5,0 inaktiviert wird. Das mit dem
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lipolytischen Enzym behandelte Butteröl wird sowohl allein als auch zusammen mit anderen Geschmackssäuren, nämlich Essigsäure und Buttersäure, und/oder zusammen mit anderen Geschmacksstoffen, wie Diacetyl, als Geschmacksstoff und Strukturmittel* in Butter, Margarine, Milchimitationsprodukten, milchschokoladeartigen Süßigkeiten und butterartigen Brotaufstrichen und -saucen verwendet.
Beispiel 7
Das von Mucor miehei gewonnene lipolytische Enzym wird zu der 200-fachen Gewichtsmenge an sterilisierter Sahne mit einem Butterfettgehalt von 35 % gegeben. Nachdem die Sahne mit Milchsäure oder einer Milchkultur auf einen Säure-pH-Wert eingestellt worden ist, wird die Mischung 4 Stunden lang bei 37 C gerührt. Die erhaltene Mischung wird einem herkömmlichen Butterherstellungsverfahren unterworfen, und man erhält Butter mit einem ausgezeichneten, verbesserten Geschmack,
Beispiel 8
Das von Mucor miehei gewonnene lipolytische Enzym wird in einer Menge von 0,001 bis 0,01 % einmal mit und einmal ohne anderes Enzymsystem zu einer wiederhergestellten Aufschlämmung von 9 - I4%igen Vollmilchfeststoffen gegeben, bevor eine Inkubation von 4-8 Stunden Dauer bei 22 bis 330C erfolgt. Die gesteuerte Lipolyse wird wie in Beispiel 6 inaktiviert. Das durch das lipolytische Enzym modifizierte Vollrailchpulver wird verwendet, um Nahrungsmittelprodukten, wie Milchschokoladesüßigkeiten, Kaffeeweißmachern, Käseimitationen und Molkereiprodukten, einen milchartigen Geschmack zu verleihen.
Beispiel 9
Mit dem von Mucor miehei gewonnen lipolytischen Enzym modifizierte Käsefeststoffe, die gemäß Beispiel 5 hergestellt worden sind, werden in Mengen von 1,0 bis 10,0 % der gesamten Zusammensetzung in Tiernahrungszusammensetzungen, nämlich Hundefutter- * "texturizing agent"
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zusammensetzungen, verwendet, um den Tierfutterzusammensetzungen einen nahrhaften, verbesserten Geschmack zu verleihen.
Beispiel 10
Das von Mucor miehei gewonnene lipolytische Enzym wird dazu verwendet,um wieder verwertbaren Altkäse nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren zu behandeln, worauf dann eine Hitzebehandlung bei 770C von 15 Sekunden Dauer folgt, um den unerwünschten Schimmel und die Bakterien in dem Altkäse zu vernichten und das lipolytische Enzym in dem Produkt wirksam zu inaktivieren. Der mit dem lipolytischen Enzym behandelte Altkäse ist für Tierfutterzusammensetzungen verwendbar.
Beispiel 11
Vollmilchpulver, das gemäß Beispiel 8 mit dem von Mucor miehei gewonnenen lipolytischen Enzym behandelt (modifiziert) worden · ist, wird in einer Menge von 5,0 bis 15,0 % zur Herstellung eines verbesserten-Kaffeeweißmachers mit einem volleren Geschmack verwendet.
Beispiel 12
Vollmilchpulver, das gemäß Beispiel 8 mit dem von Mucor miehei gewonnenen lipolytischen Enzym behandelt (modifiziert) worden ist, wird in einer Menge von 2,0 bis 10,0 % zur Herstellung einer verbesserten imitierten sauren Saline mit einem reicheren, volleren Geschmack verwendet. "
Beispiel 13
Ein Blauschimmelkäse wird aus roher Milch hergestellt, die bei 32,2°C homogenisiert und mit Benzoylperoxyd gebleicht worden ist. Die Milch wird auf 300C erhitzt und mit 1 % eines Streptococcuslactis-Startmittels geimpft. Nach einer kurzen Verweilzeit
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wird die Milch mit einem mikrobiologischen "Rennin"-Produkt von der Züchtung des Stamms Mucor miehei (NRRL A 13.042)in einer Menge von 85 g pro 453,69 kg Milch und mit 3,54 bis 7.09 g des von Mucor miehei gewonnenen lipolytischen Enzyms pro 453,69 kg Milch geimpft. Die Mischung wird gerührt,bis ein Gerinnungsprodukt von ausreichender Festigkeit erhalten wird. Dieses wird dann mit Sporen von Penicillium roquefort! geimpft, von der Molke abgetrennt und in Reifen gegeben.Der in den Reifen befindliche Käse wird gesalzen, indem er 3 Tage lang in Salzwasser getaucht wird, und dann in einen luftleeren Kunststoffbeutel (aus "Cryovac") verpackt.In den Käse werden überall kleine Löcher gemacht, um den Zugang von Luft zu ermöglichen und das Schimmelwachstum zu erleichtern. Dann läßt man den Käse reifen, indem man ihn 2 Monate lang bei 100C und 90 % Luftfeuchtigkeit in einem Reiferaum lagert, und man erhält einen Blauschimmelkäse von ausgezeichneter Qualität, der im Vergleich zu dem ohne die Zugabe des lipolytischen Enzyms hergestellten Käse einen verbesserten Geschmack aufweist.
Beispiel 14
Aus teilweise entrahmter Milch, die etwa 2 % Fett enthält, wird ein Käse der Sorte Romano hergestellt. Die Milch wird auf 31,1 bis 32,20C erwärmt, und es wird 1 % an Kulturen, die zu gleichen Teilen aus Streptococcus thermophilus und Lactobacillus bulgaricus bestehen, dazugegebene Dann wird in ausreichender Menge Lab zugegeben, um die Milch in 15 - 17 Minuten zu koagulieren (etwa 85 g pro 453, 69kg). Danach wird das aus Mucor miehei gewonnene lipolytische Enzym in einer Menge von 28,3 bis 56,7 g pro 453,69 kg Milch dazugegeben.Das ausgeflockte Gerinnmgsprodukt wird mit Messern von 9,5 mm zerkleinert.Nach der Zerkleinerung wird das Produkt bei 46,7 bis 47,80C 30 Minuten lang gekocht und dann von der Molke abgetrennt.Der Käse wird in Reifen gegeben,gepreßt ,.in einem Gestell 2 bis 4 Tage getrocknet und dann auf einen Salzgehalt von 4 - 5 % gesalzen. Dann läßt man den Käse bei 10 bis 15,60C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 70 # reifen und erhält einen Käse der Sorte Romano von ausgezeichr neter Qualität, der gegenüber einem gleichen Käse, der ohne das lipolytische Enzym hergestellt worden ist, einen ver-
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besserten Geschmack aufweist.
Beispiel 15 ,
Ein flüssiges . Fett* gemäß der U.S.-Patentschrift 2 815 286 und ein weiches .Fett*' gemäß der U.S.-Patentschrift 2 132 393 werden beide mit 1 bis 15 Gew.-96 des von Mucor miehei gewonnenen lipolytischen Enzyms bei 32,20C 1 bis 24 Stunden lang inkubiert, um den gewünschten Geschmack zu entwickeln, wonach das Enzym dann 15 Minuten lang bei 21,10C und bei einem pH-Wert von 5,0 inaktiviert wird.
"Shortening»
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Claims (1)

  1. Patentansprüche : ^ O 1 O O 2 1
    ο Verfahren zur Herstellung einer ein lipolysiertes Triglyceridfett enthaltenden Nahrungsmittelkomponente von verbessertem Geschmack, dadurch gekennzeichnet, daß die das Triglyceridfett enthaltende Nahrungsmittelkomponente mit einem lipolytischen Enzymsystem aus dem fermentierten Wachstumsprodukt des Mucor-miehei-Schimmelpilzes in einer ausreichenden Menge in Kontakt gebracht wird, wobei das 1-ipolytische Enzymsystem ein Esterasewirksamkeit: Liposewirksamkeit-Verhältnis (EA:LA) von mehr als etwa 1 aufweist,
    2« Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Triglyceridfett ein tierisches oder ein pflanzliches Fett umfaßt·
    3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die das Triglyceridfett enthaltende Nahrungsmittelkomponente ein Milchfettmedium umfaßt.
    4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als die das Triglyceridfett enthaltende Nahrungsmittelkomponente Milch verwendet wird und das lipolytische Enzym in einer Menge von etwa 3,5 bis 56,7 g pro 453f69 kg der Milch zugegeben wird.. . .
    5. Lipolytische, Triglyceridfett enthaltende Nahrungsmittelkomponente, hergestellt nach dem Verfahren gemäß-Anspruch 1 - 4. . -' .
    6. Verbesserte, enzymatische, geschmacksentwickelnde Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein lipolytisches geschmackgebendes Enzymsystem mit einem EA:LA-Verhältnis von mehr als etwa 1 umfaßt,das aus dem fermentierten Wachstumsprodukt von Mucor miehei gewonnen worden ist.
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