Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania srodków zywnosci zawierajacych lipolizowane trójglicery¬ dy tluszczowe i majacych polepszone wlasciwosci smakowo-zapachowe.Enzymatycznie wytwarzane uklady smakowo-zapachowe wystepuja w szeregu produktach spozywczych, szczególnie tych, które wytwarza sie metoda fermentacji. Na przyklad, podczas wytwarzania srodków spozyw¬ czych, takich jak artykuly piekarnicze, srodki do zabielania kawy, czekolada mleczna, margaryna i podobne, pozadane jest, aby produkt koncowy wykazywal smakowo-zapachowe cechy mleka lub masla. U szeregu typu serów i produktów serowych, szczególnie w tak zwanych ostrych i lagodnych odmianach serów typu wloskiego, róznice smakowo-zapachowe zaleza od róznych ukladów enzymatycznych wykorzystywanych w procesie ich wytwarzania.W przypadku srodków zywnosciowych zawierajacych tluszcze, glównym dzialaniem enzymatycznym jest lipoliza, to jest katalizowane przez enzymy hydrolityczne rozszczepianie trójglicerydów. Aczkolwiek obok enzy¬ mów lipolizujacych moga dzialac i inne uklady enzymatyczne wplywajace na cechy smakowo-zapachowe, to jednak wynalazek dotyczy glównie aktywnosci lipolitycznej.Wciagu wielu lat samorzutna i niekontrolowana lipoliza powoduje szkody w przemysle spozywczym, wywolujac powstawanie niepozadanych cech smakowo-zapachowych lub jelczenie produktów. Jednak w osta¬ tnich latach badania nad kontrola lipolizy doprowadzily do licznych ulepszen produktów zywnosciowych, totez obecnie praktykuje sie powszechnie w przemysle dzialanie enzymami lipolitycznymi na tluszcze mleka, w celu otrzymania pozadanych cech smakowo-zapachowych. Enzymy lipolityczne dzialaja na trójglicerydy uwalniajac wolne kwasy, które w pewnych przypadkach moga byc dalej przeksztalcane w inne zwiazki, jak na przyklad ketony. Ilosc i typ wytwarzanych kwasów tluszczowych zalezy od ilosci i rodzaju tluszczu w produkcie zywno¬ sciowym, ilosci i rodzaju enzymu lipolitycznego oraz czasu i temperatury jego dzialania. Dalsze zasady prowadze¬ nia kontrolowanej lipolizy opisano w J.Am.Oil.Chem.Soc. 49, 559-62/1971/ oraz odnosnikach przytoczonych w tej publikacji.2 94989 Znane sa rózne enzymy lipolityczne, na przyklad lipaza trzustkowa, esteraza z przedzoladka, lipaza z mle¬ ka i lipaza z grzybów. Szereg lipaz otrzymano z komórek grzybów, na przyklad z Aspergillus (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2480090), z Rhisobium (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3262863) i z Mucor (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3616233. Wplyw lipaz pochodzenia grzybowego na jelczenie tluszczów opisano w J.Gen.Appl.Microbiol 10, 13—22 /1964/ w odniesieniu do lipazy z Aspergillus, w Agr.Biol.Chem.33,729—38 /1969/ w odniesieniu do lipazy zRhisopus i w Appl.Microbiol. 16, 617—19 /1968/ i 17, 606-10 /1969/ w odniesieniu do lipazy z Mucor. Typowymi, dostepnymi dotychczas lipazami sa esterazy z przedzoladka, takie jak esterazy o nazwach handlowych Italasa i Capalasa, wytwarzane przez Dairyland Food Laboratory; lipaza trzustkowa o nazwie handlowej Fermlipase PL produkowana przez Fermco Laboratories oraz lipaza pochodzenia grzybowego o nazwie handlowej Lipase B, wytwarzana przez firme Rohm i Hass.Ze wzgledu na ograniczone mozliwosci otrzymania enzymów lipolitycznych pochodzenia zwierzecego, uzyskanie ukladów enzymów lipolitycznych ze zródel mikrobiologicznych zwieksza potencjalna dostepnosc preparatu, a ponadto prawdopodobienstwo uzyskiwania dzieki kontrolowanej fermentacji preparatu o ustabilizo¬ wanej jakosci. Jednak nie wszystkie enzymy pochodzenia mikrobiologicznego prowadza do powstawania ukla¬ dów o pozadanych wlasciwosciach smakowo-zapachowyeh.Wynalazek umozliwia poprawienie cech smakowo-zapachowych trójglicerydów zawartych w tluszczach i produktach spozywczych zawierajacych tluszcze, szczególnie ulepszonej lipolizy tluszczu mleka, za pomoca preparatu enzymatycznego z Mucor miehei. Stwierdzono, ze z mikroorganizmu Mucor miehei mozna otrzymac uklad enzymatyczny warunkujacy znakomite wlasciwoscia smakowo-zapachowe trójglicerydów tluszczowych.Stosowany zgodnie z wynalazkiem uklad enzymatyczny warunkujacy wlasciwosci smakowo-zapachowe jest okreslany stosunkiem aktywnosci esterazowej (EA) do aktywnosci lipazy (LA) lub EA/LA.Wedlug stosowanych tu okreslen, aktywnosc esterazowa jest to aktywnosc enzymu w stosunku do tlusz¬ czów rozpuszczalnych w wodzie, mianowicie w stosunku do tych tluszczów, których dlugosc lancucha weglo¬ wego wynosi od okolo 4 do okolo 10 atomów wegla. Aktywnosc lipazowa jest to aktywnosc enzymu w stosun¬ ku do tluszczów nierozpuszczalnych w wodzie, to jest w stosunku do tych tluszczów, w których dlugosc lancu¬ cha weglowego wynosi okolo 12 lub wiecej, zwlaszcza 12-22 atomów wegla.Zgodnie z wynalazkiem nieoczekiwanie stwierdzono, ze w przeciwienstwie do innych grzybów, takich jak Aspergillus i Rhisopus, uklad enzymów lipolitycznych wytwarzany przez szereg gatunków z rodzaju Mucor, szczególnie przez Mucor miehei, wykazuje pozadane wlasciwosci majac wyzsza aktywnosc esterazowa niz lipazo¬ wa, podobnie jak znane preparaty esteraz, otrzymywane z przedzoladków cielat, kozlat i jagniat. Wskazuje na to wyzsza od jednosci wartosc stosunku EA/LA, podczas gdy Aspergillus i Rhisopus wytwarzaja uklady lipolitycz¬ ne, których wartosc stosunku EA/LA jest nizsza od jednosci i w zwiazku z tym ich wlasciwosci sa nieodpowied¬ nie w procesie bedacym przedmiotem wynalazku. Korzystnie stosunek EA/LA powinien byc wiekszy niz 2, zwlaszcza powinien wynosic 2—10.Aktywnosc esterazowa mierzy sie korzystnie za pomoca testu z uzyciem trójbutyryny jako substratu, podczas gdy aktywnosc lipazy mierzy sie dogodnie stosujac jako substiat olej oliwkowy. Testy te przeprowadza sie w sposób opisany ponizej.Metode esterazowa stosuje sie do oznaczenia esterazy hydrolizujacej trójbutyryne. Esteraze inkubuje sie z roztworem trójbutyryny przy wartosci pH 6 i w temperaturze 37°C. Kwas wytwarzajacy sie w mieszaninie reagujacej w.ciagu 10 minut miareczkuje sie do wartosci pH 8,7. Otrzymane wyniki uwidoczniaja praktycznie liniowa zaleznosc miedzy szybkoscia reakcji i iloscia enzymu w zalecanym zakresie. 1. Roztwór substratu.Do 114 ml 0,05 M roztworu octanu sodowego (6,8 g NaC2H3 02 '¦? 3H2-0 w 1 litrze) dodaje sie 13 g gumy arabskiej, nastepnie dodaje sie okolo 50 mg tymolu i wytrzasa wciagu 25 minut w celu rozpuszczenia. Do zbuforowanego roztworu gumy dodaje sie 22,7 g trójbutyryny (75 mmoli) i emulguje w mikserze w ciagu 5 minut. Emulsje doprowadza sie do wartosci pH 6,0 za pomoca 0,5n NaOH, przy czym zuzywa sie mniej niz 1 ml roztworu wodorotlenku. Roztwór przechowywany w lodówce mozna stosowac w ciagu 3 dni. Przed kazdym uzyciem roztwór nalezy dokladnie wytrzasac i w razie potrzeby doprowadzac do wartosci pH 6,0.Do oznaczenia „próby slepej" (patrz „kontrola", ponizej) stosuje sie roztwór 13 g gumy arabskiej w 114 ml 0,05 octanu sodowego. Roztwór gumy arabskiej doprowadza sie do wartosci pH 6,0, co wymaga dodania 3 do 4mlO,lnNaOH. 2. 0,02 NaOH 3. Bufor octanowy 0,05 M, wartosc pH 5,9-6,2. 4. Rozpuszcza sie 6,8 g octanu sodowego. 3 H20 w okolo 500 ml wody, dodaje 1,0 ml In HCL i dopelnia woda destylowana do objetosci 1 litra.94989 3 . Roztwory enzymu.Wszystkie roztwory i serie rozcienczen przygotowywuje sie w buforze octanowym (nr 3 powyzej). Wyma¬ gane stezenia sa podane ponizej w punkcie „Zakres".Do kolby Erlenmeyera o pojemnosci 125 ml odmierza sie 50 ml wytrzasanego roztworu substratu, dodaje ,0 ml roztworu enzymu, miesza sie szybko i pobiera 10,0 ml. Objetosc te dodaje sie do 40 ml wody i natych¬ miast miareczkuje 0,02n NaOH do wartosci pH 8,7. natychmiast po pobraniu objetosci 10,0 ml, pozostala mieszanine wstawia sie do lazni o temperaturze 37°C (czas ten przyjmuje sie za punkt zerowy) i utrzymuje sie w tej temperaturze w ciagu 40 minut, stosujac ciagle mieszanie (zanurzone mieszadlo mechaniczne). Dokladnie po uplywie 40 minut od czasu zerowego pobiera sie nastepne 10,0 ml, dodaje do 40 ml wody i miareczkuje do wartosci pH 8,7. Róznice miedzy dwoma miareczkowaniami okreslaja stopien hydrolizy trójbutyryny przez enzym.Oznaczenie kontrolne przeprowadzono sposobem opisanym ponizej.Przy tym oznaczeniu nie jest wymagana próba kontrolna odczynnikowa, natomiast stosujac surowe prepa¬ raty enzymatyczne nalezy przeprowadzac kontrolne oznaczenia enzymu. Oznaczenie przeprowadza sie jak opisa¬ no powyzej, stosujac zamiast normalnego roztworu substratu roztwór gumy arabskiej bez trójbutyryny. Wynik glówny koryguje sie odejmujac wartosc uzyskana z róznicy miareczkowan próby kontrolnej.Jedna jednostka esterazy wytwarza w warunkach testu jeden mikrorównowaznik kwasu na minute. Aktyw¬ nosc esterazowa (EA) okresla sie iloscia jednostek na gram preparatu.Obliczenia ml NaOH X n NaOH X 1000 X ml trawionejmieszaniny .. minuty X g preparatu w trawionej mieszaninie X ml pobrane do miareczkowania gdzie ml NaOH oznaczaja przyrost objetosci potrzebnych do zmiareczkowania pobranych porcji 10 ml, a n NaOH oznacza normalnosc NaOH uzytego do miareczkowania.Stad: ml NaOH X 0,02 X 1000 X 60 40 X g preparatu X10 ( ' EA_ ml NaOH X3 . ilosc gramów preparatu w trawionej mieszaninie Rozcienczenie próby powinno byc takie, aby przyrost objetosci roztworu potrzebnego do miareczkowania wynosil 0,5—1,5 ml. W razie potrzeby test powtarza sie az do otrzymania wyników w takim samym zakresie.Hydroliza trójbutyryny przebiega liniowo w czasie i jest mozliwe przeprowadzanie oznaczenia stosujac czas trawienia krótszy niz 40 minut. W tym przypadku nalezy oczywiscie wprowadzic w równaniu (3) inna wartosc czasu.Metode lipazowa stosuje sie do oznaczania lipazy hydrolizujacej olej oliwkowy.Lipazy inkubuje sie z emul¬ sja oleju oliwkowego przy wartosci pH 6,5 i temperaturze 30°C. Kwas, uwolniony w mieszaninie reagujacej w ciagu 5 minut, miareczkuje sie do wartosci pH 8,0. W zalecanym zakresie otrzymane wyniki odzwierciedlaja praktycznie liniowa zaleznosc miedzy szybkoscia reakcji i stezeniem enzymu.Odczynniki: 1. Olej oliwkowy, U.S.P. 2. Amerchol L—101 (wolne sterole pochodzace z lanoliny), American Cholesterol Products, Edison, New Yersey. 3. Barbital sodowy, N.F. 4. Guma arabska, U.S.P.. Octan sodowy, 3 H2 O, C.P. 6. Chlorek sodowy, C.P. 7.0,5nNaOH 8. 0,02n NaOH 9. 0,lnHCl . Alkohol etylowy (odpowiedni jest denaturowany nr 23A).Wyposazenie: 1. Mikser 2. Dwa mieszadla magnetyczne, jedno z nich przystosowane do zanurzania w lazni wodnej (Model MS-7, Tri—RInstruments, Jamaica, New York).4 94989 3. Pehametr do miareczkowania, wyposazony w mala elektrode kombinowana (taki jak No 4858, A.H. Thomas). 4. Mikrobiureta, 10 ml z podzialka 0,02 ml (Kimble 17107 F z igla strzykawkowa 20G typu Lauera, 1-1/2").Roztwory: 1. Emulsja substratu. g gumy arabskiej i 270 ml wody destylowanej miesza sie za pomoca mieszadla magnetycznego w ciagu minut w temperaturze pokojowej. Odrzuca sie wszelkie brylki osadzone na mieszadelku szklanym i chlodzi do temperatury 5°C. W zlewce o pojemnosci 400 ml odwaza sie 6 g Amercholu, dodaje 72 g oleju oliwkowego i 222 g oziebionego roztworu gumy arabskiej. Zawartosc miesza sie stosujac szklane mieszadlo magnetyczne i nastepnie przenosi do miksera. Miesza sie w mikserze w ciagu 5 minut, doprowadza do wartosci pH 6,3 za pomoca 0,5n NaOH, oziebia do temperatury 5°C i ponownie miesza w mikserze w ciagu 7 minut. Temperatura moze wzrosnac najwyzej do 47°C, a wartosc pH 6,5. Gdy nie nastapi wzrost wartosci pH, to doprowadza sie ja do 6,5. Emulsja przechowywana w lodówce jest trwala co najmniej w ciagu 8 dni. Podczas przechowywania temperatura nie powinna opasc ponizej 1°C. 2. Roztwór buforowy. a) Roztwór wyjsciowy. Rozpuszcza sie 9,7 g octanu sodowego. 3H20 i 14,7 g barbitalu sodowego i uzupel¬ nia woda destylowana do objetosci 500 ml. Otrzymany roztwór ma wartosc pH 9,9 i jego normalnosc zarówno w stosunku do octanu jak i barbitalu wynosi 0,14. Roztwór ten przechowuje sie w lodówce. b) Roztwór roboczy. 40 ml roztworu wyjsciowego, 16 ml 8,5% roztworu NaCl i 53 ml 0,1n HC1 rozciencza sie do objetosci 200 ml otrzymujac roztwór o wartosci pH 6,5. Przy dokladnym nastawianiu wartosci pH stosuje sie 0,ln HCL lub 0,ln NaOH. Roztwór przechowuje sie w lodówce i odrzuca go jezeli podczas przechowywania pojawia sie krysztaly. 3. Roztwory enzymu.Przy oznaczaniu preparatów wystepujacych w postaci stalej najpierw sporzadza sie roztwór wyjsciowy.Próbke miesza sie za pomoca mieszadla magnetycznego z odpowiednia iloscia wody w ciagu 30 minut, przed dalszym rozcienczeniem woda, majacym na ceiu przygotowanie rozcienczen koncowych. Roztwór wyjsciowy jest trwaly w temperaturze 5°C w ciagu kilku godzin, natomiast rozcienczony roztwór koncowy nalezy uzyc w ciagu minut. Przy oznaczaniu preparatu o nieznanej aktywnosci, odpowiednie rozcienczenie nalezy znalezc droga prób. Preparaty, których aktywnosc jest dobrze znana nalezy rozcienczac tak, aby uzyskac aktywnosc 1—3,6 jednostek lipazy/ml. Definicja „jednostki lipazowej" podana jest ponizej.Przebieg oznaczania: Substrat przygotowuje sie mieszajac roztwór buforowy z emulsja w stosunku wagowym 3:1. Do 100 ml zlewek zawierajacych mieszadla magnetyczne dodaje sie porcje substratu po 8,0 ml i wlacza mieszadla magne¬ tyczne. Próbe badana i odpowiadajaca jej próbe kontrolna przygotowuje sie nastepujaco: Próba kontrolna 1. Dodaje sie 40 ml alkoholu etylowego. 2. Dodaje sie 2 ml próbke roztworu enzymu.Próba badana 1. Ustala sie temperature substratu w lazni wodnej o temperaturze 30°C. 2. Dodaje sie 2 ml próbke roztworu enzymu. 3. lnkubuje sie w temperaturze 30°C w ciagu 5 minut. 4. Dodaje sie 40 ml alkoholu etylowego.Obie próby, badana i kontrolna, miareczkuje sie 0,02n NaOH do wartosci pH 8,0.Obliczenia 1 jednostka lipazy /LU/ = ilosc lipazy potrzebna do uwolnienia 1 mikromola H+/minute.Aktywnosc lipazowa /LA/ = liczba LU/gram preparatu.LA = ml NaOH X n NaOH X 103/mg dodanego preparatu enzymatycznego X 10"3 X minuty Gdy stosuje sie 0,02n NaOH i czas reakcji 5 minut, to LA = ml NaOH X 4000/mg enzymu U.S.P. =Farmakopea Stanów Zjednoczonych N.F. =Receptariusz Panstwowy C.P. = Chemicznie czysty94989 5 Wynalazku nie ograniczaja podane powyzej metody oznaczania aktywnosci lipazowej i esterazowej, gdyz mozna stosowac zarówno inne metody, jak tez i modyfikacje metod podanych.Produkcje zadanego ukladu enzymatycznego warunkujacego cechy smakowo-zapachowe prowadzi sie dro¬ ga zwyklej fermantacji, a nastepnie stosuje metody odzyskiwania materialu enzymatycznego. Mianowicie, po¬ zywke zawierajaca przyswajalny wegiel,* azot i sladowe skladniki mineralne inkubuje sie kulturami gatunków Mucor, zwlaszcza Mucor miehei i poddaje wglebnej fermentacji aerobowej w ciagu okolo 2—14 dni, przy warto¬ sci pH okolo 3—8 i w temperaturze okolo 20—50°C. Przykladami wybranych szczepów Mucor miehei, które mozna fermentowac w ten sposób otrzymujac zadany uklad enzymatyczny, sa dostepne bez ograniczen szczepy zNothern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois oznaczone kodami NRRL A 13 131 i A 13 042. Inne odpowiednie szczepy Mucor miehei sa równiez latwo dostepne.Stosujac znane metody postepowania, w procesie uzyskiwania zadanych produktów podpuszczkowych, esterazy i lipazy towarzyszace tym produktom zwykle usuwano lub inaktywowano, sposobami podanymi w opi¬ sach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 3616233 i 3763011, w opisie patentowym Republiki Federalnej Niemiec nr 2232996 i brytyjskim opisie patentowym nr 1207892.Zgodnie z wynalazkiem natomiast, zadany uklad enzymatyczny warunkujacy wlasciwosci smakowo-zapa¬ chowe produktu wydziela sie z brzeczki fermentacyjnej w taki sposób, aby otrzymac odpowiedni, okreslony powyzej stosunek EA/LA. W tym celu brzeczke odsacza sie przy niskiej wartosci pH wynoszacej okolo 4—5, ekstrahuje odsaczony osad przy wysokiej wartosci pH wynoszacej okolo 10—12, zakwasza ekstrakt do wartosci pH okolo 7, a nastepnie wydziela produkt przez odsaczenie lub zatezenie zakwaszonego ekstraktu metoda odparowania lub ultrafiltracji. Otrzymany koncentrat suszy sie na przyklad metoda rozpylowa lub podobnymi metodami.Do niektórych celów pozadane jest stosowanie ukladu enzymatycznego, który faktycznie nie zawiera aktywnej podpuszczki. Preparat taki otrzymuje sie stosujac opisana wyzej metode wyosobniania lub inne znane sposoby oczyszczania.Uzyskany uklad enzymatyczny warunkujacy cechy smakowo-zapachowe dodaje sie do mleka, tluszczu mlecznego, oleju maslowego, sera, czekolady mlecznej, oleju margarynowego, srodków zabielajacych do kawy i innych produktów zywnosciowych, zawierajacych trójglicerydy lub skladników tych srodków i inkubuje sie w temperaturze okolo 10—50°C w czasie od 2 godzin do 20 dni, wywolujac zadane cechy smakowo-zapachowe mleka lub masla. Stosuje sie to w celu przyspieszenia lub nasilenia naturalnego powstawania cech smakowo-zapa- chowych w tych produktach lub skladnikach produktów zywnosciowych, jak równiez uklad enzymatyczny mozna mieszac z innymi srodkami wplywajacymi na cechy smakowo-zapachowe, w celu wytworzenia róznorod¬ nych zestawów tych cech.Na przyklad, uklad ten miesza sie z kompozycja esteraz przedzoladkowych znana z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2531329 lub tez stosuje sie lacznie z kompozycja smakowo-zapachowa pochodzacy zPenicillium roaueforti znana z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3100153.Najczesciej otrzymany enzym lipolityczny dodaje sie w ilosci stanowiacej w stosunku wagowym 0,001—0,1% substratu zawierajacego trójglicerydy tluszczu, a w przypadku mleka korzystnie w ilosci 7—130g na 1000 kg mleka.Przykladami trójglicerydów tluszczowych, które mozna poddawac dzialaniu ukladu enzymów lipolitycz- nych sposobem wedlug wynalazku, w celu uzyskania odpowiednich cech smakowo-zapachowych, sa tluszcze zwierzece, takie jak olej z nasion bawelny, olej sojowy, kukurydziany, arachidowy, krokoszowy, palmowy, kokosowy, margaryna i mieszanki olejowe stosowane do wyrobu tluszczów cukierniczych. .Przykladami serów, które mozna poddawac dzialaniu ukladu enzymów lipolitycznych sposobem wedlug wynalazku, powodujac powstawanie zadanych cech smakowo-zapachowych, sa nastepujace gatunki: provolone, romano, feta, pizza, mozzarella, cheddar, szwajcarski, blue, parmesan, kolby, gouda i edamski.Przyklad I. Komórki szczepu Mucor miehei NRRL 13,042 przenosi sie w warunkach zabezpieczaja¬ cych jalowosc ze skosu agarowego do jednolitrowej kolby Erlenmeyera zawierajacej 200 ml pozywki o nastepuja¬ cym skladzie: Maka sojowa (Nutrisoy 300C) 1,5% Suchaserwatka 3,0 Skrobia kukurydziana degradowana enzymatycznie 12,0 Woda 83,5, Razem: 100,0%6 94989 Kolbe inkubuje sie w temperaturze 37°C w ciagu 114 godzin na trzesawce obrotowej, wyjsciowa wartosc pH pozywki wynosi okolo 6,0. Zadany uklad enzymów lipolitycznych uzyskuje sie w ten sposób, ze brzeczke fermentacyjna doprowadza sie do wartosci pH 5,0 i saczy. Odsaczona pozostalosc ekstrahuje sie rozcienczonym roztworem NaOH przy wartosci pH 10-11 i otrzymany ekstrakt zakwasza do wartosci pH 7. Zakwaszony ekstrakt przesacza sie i odparowywuje, otrzymujac koncentrat o wartosci EA wynoszacej 25,8 i stosunku EA/LA 2,6. Koncentrat ten stanowiacy pierwsza uzyskana partie (A), przesacza sie i przesacz poddaje suszeniu rozpylo- wemu, otrzymujac preparat staly, w którym stosunek EA/LA wynosi 3,5. Preparat ten stanowi druga uzyskana partie (B).Enzym lipolityczny z Mucor miehei o ustalonym stosunku EA/LA wynoszacym 2,6, otrzymany wedlug powyzszej procedury jako partia A, stosuje sie do rozwiniecia zadanych cech smakowo-zapachowych sera, postepujac w sposób nizej opisany.Próbki po 453 g sera Currenta Cheddar (ser 2-4 tygodniowy o lagodnym smaku i zapachu) miele sie w stolowym mlynku elektrycznym (model Sunbeam), nastepnie dodaje sie enzym lipolityczny w ilosci 440 mg na próbke i kontynuuje mieszanie az do równomiernego rozprowadzenia skladników. Próbkami mieszaniny enzym-ser napelnia sie wyjalowione szalki Petriego z tworzywa sztucznego. Szalki wstawia sie nastepnie do pojemnika anaerobowego w celu zahamowania wzrostu plesni, czesc próbek inkubuje sie w temperaturze 20°C wciagu 4 dni, a inne w temperaturze 20°C wciagu 11 dni. Po uplywie tych okresów inkubacji okresla sie organoleptyczne wlasciwosci sera, stwierdzajac, ze wykazuje on czyste walory smakowo-zapachowe, równorze¬ dne z tymi, jakie uzyskuje sie stosujac znana esteraze C z przedzoladka (Dairyland Foods Laboratory) w iden¬ tycznych warunkach. Obie próbki sera wykazywaly slabe lub srednie zjelczenie. W próbach porównawczych, preparat esterazowy z Aspergillus flavus wykazujacy stosunek EA/LA wynoszacy 0,08; w warunkach powyzszego testu powodowal powstawanie niepozadanego zapachu kwasu maslowego, kapronowego i kaprylowego oraz lekko metalicznego smaku.Przyklad II. Szczep Mucor mieheJ NRRL 13042 stosuje sie do wytwarzania preparatu enzymów lipolitycznych jak w przykladzie I z ta róznica, ze fermentacje prowadzi sie w tanku produkcyjnym, stosujac wodna pozywke zawierajaca 16% skrobii kukurydzianej uplynnionej za pomoca bakteryjnej a-amylazy, 4% odtluszczonej maki sojowej (Kaysoy) oraz 2% slodkiej serwatki wysuszonej metoda rozpylowa. W monencie zakonczenia fermentacji trwajacej 77 godzin, w brzeczce oznaczono wartosci EA i LA, otrzymujac nastepujace wyniki: EA =24,9 LA = 2,8 EA/LA = 8,9 Wydzielony enzym lipolityczny stosuje sie do wywolania pozadanych cech smakowo-zapachowych sera metoda opisana w przykladzie I, otrzymujac podobnie dobre wyniki.W przykladach podanych ponizej, enzym lipolityczny z Mucor miehei stanowi uklad enzymatyczny, otrzy¬ many zgodnie z procedura podana w przykladach I i II i wykazujacy wartosc EA wynoszaca 10—100.Przyklad III. Do mleka poddawanego przerobowi na ser, przed wprowadzeniem kultury zaczynajacej proces, dodaje sie enzym lipolityczny z Mucor miehei w ilosci 7—130 g na 1000 kg mleka. Prowadzac kontrolo¬ wana lipolize podczas wytwarzania odmian serów typu wloskiego, otrzymuje sie wlasciwosci smakowo-zapacho¬ we od delikatnych i maslowych, jak u sera typu asiago-mozzarella do pieprzowych i silnie pikantnych dla gatun¬ ków provolone i romano. Mleko poddawane przerobowi na ser typu romano i inne gatunki ostre, traktuje sie wiekszymi ilosciami enzymu lipolitycznego.Przyklad IV. Do mleka poddawanego przerobowi na ser, przed wprowadzeniem kultury zaczynajacej proces, dodaje sie enzym lipolityczny z Mucor miehei w ilosci 7-130 g na 1000 kg mleka. Prowadzac kontrolo¬ wana lipolize zwieksza sie ilosc kwasów tluszczowych o lancuchach krótkich w stosunku do kwasów dlugolan- cuchowych. Kwasy tluszczowe o krótkich lancuchach weglowych poddaje sie przemianom metabolicznym z produktami koncowymi zarodników Penicillium reaueforti, dzieki czemu uzyskuje sie zadany poziom metylo- ketonówi C02 oraz wlasciwosci smakowo-zapachowe sera blue.Przyklad V. Do nawilzonych próbek serów cheddar, colby, romano, szwajcarskiego mozzarella, blue, gouda, edamskiego, provolone i parmezanu dodaje sie enzym lipolityczny z Mucor miehei w ilosci 0,01—0,1% w stosunku wagowym do poczatkowej ilosci sera, lacznie z innymi enzymami lub bez nich. Otrzymuje sie zmodyfikowane enzymatycznie sery o silnych wlasciwosciach smakowo-zapachowych, stosowane zamiast serów twardych do wytwarzania sera pasteryzowanego, srodków spozywczych zawierajacych ser, platków i proszku serowego, przekasek i sosów serowych, przypraw serowych oraz sosów do salatek. W celu uzyskania trwalego smaku i zapachu enzym lipolityczny w serze modyfikowanym enzymatycznie inaktywuje sie ogrzewajac produkt w temperaturze 70°C, w ciagu 15 minut przy wartosci pH 5,0.94 989 7 Przyklad VI. Maslo wytworzone ze smietany i przemyte woda przeksztalca sie w olej maslowy przez podgrzanie do temperatury 39°C i usuniecie bialka zawartego w masle droga wirowania. Otrzymany olej maslo¬ wy traktuje sie enzymem lipolitycznym z Mucor miehei w ilosci 0,005-0,05% w stosunku wagowym do ilosci tluszczu zawartego woleju. Olej maslowy poddany dzialaniu enzymu lipolitycznego inkubuje sie wciagu 1—3 dni w temperaturze 22°C—37°C, w celu uzyskania odpowiednich cech smakowo-zapachowych, a nastepnie in- aktywuje enzym przez ogrzanie w temperaturze 70°C w ciagu 15 minut przy wartosci pH 5,0.Otrzymany olej maslowy traktowany enzymem lipolitycznym stosuje sie zarówno sam jak i razem z inny¬ mi kwasami o wlasciwosciach zapachowych, takimi jak kwas octowy i maslowy i/lub z innymi zapachowymi srodkami chemicznymi, takimi jak dwuacetyl, jako skladnik zapachowy i teksturyzujacy w przyprawie maslanej, margarynie, imitacjach produktów mlecznych, slodyczach typu mlecznej czekolady, pastach i sosach maslanych.Przyklad VII. Enzym lipolityczny z Mucor miehei dodaje sie w ilosci 0,5% w stosunku wagowym do sterylizowanej smietany zawierajacej 35% tluszczu maslanego. Po doprowadzeniu smietany do odczynu kwasnego za pomoca kwasu mlekowego lub kultury bakterii powodujacych fermentacje mlekowa, mieszanine wytrzasa sie w temperaturze 37°C wciagu 4 godzin, po czym przerabia w znany sposób na maslo, otrzymujac produkt o wyjatkowo dobrych wlasciwosciach smakowo-zapachowych.Przyklad VIII. Do zawiesiny zawierajacej 9—14% stalych skladników pelnotlustego mleka dodaje sie 0,001—0,01% enzymu lipolitycznego z Mucor miehei lacznie z innymi ukladami enzymatycznymi lub bez dodat¬ ków i inkubuje w ciagu 4—8 godzin w temperaturze 22—33°C. Kontrolowana lipolize konczy sie przez dezakty¬ wacje enzymu jak w przykladzie VI. Otrzymany pelny proszek mleczny zmodyfikowany enzymem lipolitycz¬ nym stosuje sie jako srodek nadajacy zapach mleczny produktom zywnosciowym, takim jak cukierki typu mlecznego, czekolada mleczna, srodki zabielajace do kawy, imitacje serów oraz inne produkty mleczne.Przyklad IX. Sery twarde modyfikowane enzymem lipolitycznym z Mucor miehei, przygotowane sposobem opisanym w przykladzie V, stosuje sie do wytwarzania pokarmów dla zwierzat domowych, zwlaszcza psów. Modyfikowane sery dodaje sie w ilosci 1,0—10% wagowych w stosunku do masy pokarmu, co powoduje wzrost wartosci odzywczych oraz poprawe cech smakowo-zapachowych.Przyklad X. Postepujac w sposób opisany w przykladzie V, enzymem lipolitycznym z Mucor miehei dziala sie na odpadki serowe. Nastepnie, w celu zniszczenia niepozadanych plesni i bakterii oraz dezaktywacji enzymu lipolitycznego ogrzewa sie odpadki serowe w temperaturze 77°C w ciagu 15 sekund. Otrzymane odpadki serowe stosowac mozna w srodkach pokarmowych dla zwierzat domowych.Przyklad XI. Pelnowartosciowy proszek mleczny zmodyfikowany dzialaniem enzymu lipolitycznego z Mucor miehei w sposób opisany w przykladzie VIII, stosuje sie w ilosci 5,0—15,0% do produkcji ulepszonego srodka zabielajacego do kawy wykazujacego pelniejsze walory smakowo-zapachowe.Przyklad XII. Pelnowartosciowy proszek mleczny zmodyfikowany dzialaniem enzymu lipolityczne¬ go z Mucor miehei w sposób opisany w przykladzie VIII, stosuje sie w ilosci 2,0—10,0% do produkcji ulepszone¬ go srodka zastepujacego smietane, wzbogaconego i posiadajacego pelniejsze walory smakowo-zapachowe.Przyklad XIII. Ser blue sporzadza sie z mleka surowego homogenizowanego w temperaturze 32°C i wybielanego za pomoca nadtlenku benzoilu. Mleko ogrzewa sie do temperatury 30°C i zaszczepia dodajac 1% kultury Streptococcus lactis. Po krótkim okresie przechowywania, mleko zaszczepia sie mikrobiologicznymi produktami trawiennymi z hodowli szczepu Mucor miehei oznaczonego jako NRRL 13042 w ilosci 200 g na 1000 kg mleka i dodaje enzym lipolityczny z Mucor miehei w ilosci 7—14 g na 1000 kg mleka. Mieszanine wytrzasa sie az do otrzymania twarogu o odpowiedniej konsystencji. Twaróg zaszczepia sie nastepnie zarodnika¬ mi Penicillium roaueforti, która izoluje sie z serwatki i przenosi do urzadzen do wyciskania twarogu.Wycisniety twaróg soli sie zanurzajac go w solance na okres 3 dni i pakuje w prózniowe naczynia plastiko¬ we (Cryovac). Poprzez ser wykonuje sie drobne otwory, w celu wpuszczenia powietrza i umozliwienia wzrostu plesni. Ser pozostawia sie nastepnie do dojrzewania na okres 2 miesiecy w dojrzewalni o temperaturze 10°C i wilgotnosci 90%. Otrzymuje sie ser blue o znakomitej jakosci i ulepszonych cechach smakowo-zapachowych, przewyzszajacych cechy sera otrzymywanego bez dodawania enzymu lipolitycznego.Przyklad XIV. Ser typu romano wytwarza sie z mleka czesciowo odtluszczonego, zawierajacego okolo 2% tluszczu. Mleko ogrzewa sie w temperaturze 31—32°C i dodaje 1% mieszaniny kultur Streptococcus thermophilus i Lactobacillus bulgaricus w stosunku 1:1. Nastepnie dodaje sie podpuszczke w ilosci odpowiedniej do spowodowania koagulacji mleka w ciagu 15—17 minut (okolo 200 g na 1000 kg mleka). Enzym lipolityczny z Mucor miehei dodaje sie w ilosci 70 do 140 g na 1000 kg mleka.Otrzymany twaróg kraje sie, ogrzewa w temperaturze 46—47°C w ciagu 30 minut, a nastepnie oddziela go od serwatki, przenosi do wyciskaczy, wyciska, suszy na pólkach w ciagu 2—4 dni i dodaje 4—5% wagowych soli.Po dojrzewaniu temperaturze 10—15°C i przy wilgotnosci wzglednej 70% otrzymuje sie ser romano o znakomitej8 94989 jakosci i ulepszonych cechach smakowo-zapachowych, przewyzszajacych cechy sera otrzymanego bez dodawania enzymu lipolitycznego. i Przyklad XV. Tluszcz piekarski znany z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2815286 oraz plastyczny tluszcz piekarski opisany w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2132393 inkubuje sie w temperaturze 32°C z dodatkiem 1—15% wagowych enzymu lipolitycznego zMucor miehei w ciagu 20 godzin. Po uzyskaniu pozadanych cech smakowo-zapachowych enzym dezaktywuje sie przez ogrzewanie w temperaturze 70°C w ciagu 15 minut. PL PL PL