DE2901542B1

DE2901542B1 - Verfahren zur Herabsetzung der thermischen Stabilität von mikrobiellem Mucor-Rennin und dessen Verwendung zur Kasebereitung

Info

Publication number: DE2901542B1
Application number: DE2901542A
Authority: DE
Inventors: Dennis Alfred Elkhart Ind. Cornelius (V.St.A.)
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer CropScience Inc USA
Priority date: 1978-05-22
Filing date: 1979-01-16
Publication date: 1980-02-07
Also published as: AU515019B2; IT7948342A0; JPS557092A; GB2024828A; NL176478C; NL7900315A; NL176478B; DK146513C; IT1114500B; MX6268E; DK146513B; FR2426696A1; FR2426696B1; DK95379A; DE2901542C2; GB2024828B; AR216570A1; AU4723679A; JPS5712598B2; DE2901542A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herabset-

zung der Wärrnestabiiität von mikrobieüem Mucor-Rennin sowie die Verwendung des auf diese Weise behandelten mikrowellen Rennins zur Käsebereitung. Seit Jahrhunderten wird Kälber-Rennin als milchkoagulierendes Mittel bei der Herstellung von sämtli- chen Käsearten verwendet. In der Tat bilden Käse, die mit diesem Enzym hergestellt worden sind, einen Standard hinsichtlich Geschmack, Aussehen und Textur beim Vergleich mit Käseprodukten, die mit Hilfe anderer koagulierender Mittel hergestellt worden

ίο sind. Durch die erhebliche Zunahme der Käseproduktion und die Abnahme an verfügbarem Kälber-Rennin wurde die Verwendung alternativer milchkoagulierender Enzyme von Interesse.

Unter den für diesen Zweck geeigneten Enzymen

r> werden die mikr ibiellen Rennine bevorzugt, da diese in großer Meng*; produziert werden können und eine Vielzahl von Eigenschaften aufweisen, die es erlauben, die am meisten für die Käseproduktion geeigneten auszuwählen. Die erhöhte Wärmestabilität der mikrowellen Rennine, wie z. B. der mikrowellen Mucor-Rennine, insbesondere im Vergleich zu Kälber-Rennin wurde als wenig erwünschte Eigenschaft dieser Enzyme angesehen.

Bei der Käseherstellung wird die Molke, die sich

4~> von der renninkoagulierten Milch abtrennt, als eine wertvolle Quelle für Molkeproteine gesammelt. In der Regel wird diese gesammelte Molke bei einer Temperatur von etwa 60° C bis 71 ° C so !ange pasteurisiert, bis sämtlich Mikroorganismen zerstört und minde stens etwa 80 bis 90% des restlichen Renninkoagulie- rungsmittels 'hermisch inaktiviert sind. Es wurde gefunden, daß ein Restgehalt an koagulierendem Enzym, der wesentlich mehr als etwa 20% der ursprünglichen milchgerinnenden Aktivität nach der

r, normalen Pasteurisierung aufweist, in unerwünschter Weise die wertvollen Molkeproteine hydrolysiert und die Verwendung der Molke als ein Bestandteil in verschiedenen Nahrungsprodukten begrenzt. Die normalen Pasteurisierungsbedingungen, die so mild ge- wählt werden, daß sie die Molkeproteine nicht nachteilig beeinflussen, die jedoch ausreichen, um das Kälber-Rennin thermisch zu inaktivieren, inaktivieren das mikrobielle Renninkoagulanz nur langsam auf das gewünschte Maß. Dieses Problem wird im weite-

b5 ren dadurch noch kompliziert, daß sich mehr mikrobielles Rennin in der Molke ansammelt als Kälber-Rennin. Daraus stammen die Bemühungen, die Wärmelabilität der mikrowellen Rennine zu verstär-

ken.

Es wurden mehrere mikrobiologische Versuche unternommen, um mikrobielle Koagulierungsmittel mit größerer Wärmelabilität zu erhalten. Diese Versuche umfassen die ausgedehnte Untersuchung und Auswertung neuer Mikroorganismen und Mutationen bekannter renninproduzierender Mikroorganismen. Bis heute führte jedoch keiner dieser Versuche zum Erhalt eines annehmbaren Koagulierungsmittels mit den gewünschten Wärmeeigenschaften zum Erfolg. Außerdem wurden chemische Versuche zur Modifizierung verschiedener Enzymeigenschaften durchgeführt, doch sind diese in der Regel stark begrenzt, da sie einen gleichzeitigen Verlust der milchgerinnenden Aktivität des Enzymes mit sich führen. Neuere Untersuchungen bei der Bestimmung der strukturellen und funktioneilen Determinaten eines mikrobiellen Mucor-Rennins haben jedoch gezeigt, daß einige ^ chemische Modifikationen von mikrobiellem Rennin

W, möglicherweise nicht zu einem totalen Verlust der

;^vf milchgerinnenden Wirkung führen. Derartige Modif i-

ύ kationen umfassen die Nitrierung (Biochemica et Bio-

physica Acta, 371 [1974], Seite 368), Carbamylierung

II (ibid., 271 [1972], Seite 93) und Perjodat-induzierte * Deglycosylierung (ibid., 328 [1P73], Seite 52) des y; Glycoenzyms von mikrobiellem Mocur-Rennin. Diese If Modifikationen weisen darauf hin, daß eine durch [| Carbamylierung und Perjodat induzierte Deglycosy-Il lierung eine in gewissem Maße erhöhte thermische tt Labilität verleihe: kann. Diese chemischen Versuche % zeigten sich jedoch bei der Herstellung eines mikro- !·■ biellen Rennins mit dem gewünschten Grad an ther- ^ mischer Labilität nicht in vcüem -'laße erfolgreich. i| Es besteht daher ein großer Bedarf nach einem mi-A krobiellen Rennin mit den gewünschten milchkoagu-■. lierenden Eigenschaften, jedoch mit einer im wesent- ::, liehen herabgesetzten thermischen Labilität.

§ Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein

% Verfahren zur Herabsetzung der thermischen Stabilität von mikrobiellem Mucor-Rennin zur Verfügung zu stellen.

Die vorstehende Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß mikrobielles Mucor-Rennin in wäßriger Lösung mit Wasserstoffperoxid unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die geeignet sind, die Wärmestabilität des Enzyms weitgehend herabzusetzen, worauf anschließend restliches Peroxid in der Lösung im wesentlichen zerstört wird.

Die wärmestabilen mikrowellen Rennine, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren am wirksamsten behandelt werden können, werden nach bekannten Verfahren aus Mucor-Mikroorganismen hergestellt und sind in wäßriger Lösung im Handel erhältlich. Diese Rennine umfassen diejenigen, die aus Mucormiehei, Mucor-pusillus und dergleichen hergestellt werden. Die nativen koagulierenden Enzyme, die aus diesen Quellen isoliert werden, sind dafür bekannt, daß sie in größerem Maße wärmestabil sind als Kälber-Rennin. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf reine, teilweise reine oder sogar auf sehr rohe FermentationsflUssigkeiten von mikrobiellem Rennin angewandt werden.

Das bei dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendete Wasserstoffperoxid ist im Handel erhältlich oder kann nach bekannten Methoden in situ gebildet werden. Zum Beispiel ist es bekannt, daß anorganische und organische Peroxide in Kontakt mit Wasser Wasserstoffperoxid bilden. Es kann jedes geeignete wasserstoffbildende Mittel, welches das behandelte Rennin nicht nachteilig inaktiviert, gewählt werden, einschließlich Natriumperoxid, Kalziumperoxid, Benzoylhydroperoxid, ein Gemisch aus Cumolhydro peroxid und Peroxidase, Hamstoffhydrogenperoxid und dergleichen. Die anorganischen Peroxide sind dabei bevorzugt.

Nach einer praktischen Ausführunsform gemäß der Erfindung wird eine wäßrige Lösung des oben ge nannten thermisch stabilen mikrobiellen Rennins mit Wasserstoffperoxid unter Bedingungen in Kontakt gebracht, welche zu einer merklichen Abnahme der Wärmestabilität des Rennins (d. h. zu einer Zunahme der Wärmelabilität) führen, vorzugsweise auf minde stens 20% seiner ursprünglichen Stabilität, ausge drückt als restliche milchgerinnende Aktivität nach der Wärmbehandlung; besonders bevorzugt ist es, die Wärmestabilität auf mindestens den Wert zu reduzieren, den Kälber-Rennin aufweist. Die auf diese Weise

->" behandelte Lösung von mikrobieüem Rennin kann in der vorliegenden Form verwendet werden, sie kann konzentriert oder weiter gereinigt werden, wie dies bei dem speziellen Käseherstellungsverfahren erforderlich ist.

Für den Fachmann ist es offensichtlich, daß das im vorstehenden genannte Verfahren in Chargen oder als kontinuierliches Verfahren durchgeführt werden kann und daß die Bedingungen des Wasserstoffperoxidkontaktes, d. h. die Konzentration der Materialien,

JO der pH-Wert, die Temperatur und die Kontaktzeit, je nach der Wärmestabilität des nativen mikrobiellen Mucor-Rennins, der Art des Verfahrens und der gewählten Ausrüstung in einem weiten Bereich variieren kann. Es sollten jedoch die Bedingungen so gewählt

J5 werden, daß diese die ursprüngliche milchgerinnende Aktivität des mikrobiellen Rennins nicht nachteilig beeinflussen.

Die Konzentration des mikrobieiie;; Rennins in der wäßrigen Lösung wird auf einfache Weise in Form ihrer milchgerinnenden enzymatischen Aktivität, d. h. in Soxhlet-Einheiten (SU) pro Milliliter, wie dies in dem Verfahren in J. of Dairy Science, Band 54, Nr. 2, Seiten 159 bis 167 (1971) beschrieben und auf das hier Bezug genommen wird. Die milchgerinnende Aktivität wird in einer 10%igen Lösung von Magermilch bei pH 6,45 bis 6,50, welche 0,01 M CaCl₂ enthält, bestimmt. 5 ml der Milch werden bei 37 ° C ± 0,5 mit 0,5 ml Enzymlösung inkubiert. Es wird die Zeit bestimmt, die bis zum Erscheinen von Milchklumpen erforderlich ist. Eine Soxhlet-Einheit ist als diejenige Enzymaktivität definiert, welche 1 ml eines Milchsubstrates in 40 Minuten unter den Bedingungen des Testverfahrens zum Gerinnen bringt. In der Praxis wird die milchgerinnende Aktivität der wäßrigen Lö sung von mikrobiellem Rennin vorteilhafterweise von etwa 10000 SU/ml bis etwa 100000 SU/ml variieren. Die für die Behandlung der wäßrigen Lösung von mikrobiellem Rennin erforderlichen Mengen an Wasserstoffperoxid richten sich nach der Aktivität des En- zyms, der ursprünglichen Wärmestabilität und der Reinheit. Die Konzentration des Wasserstoffperoxids in der wäßrigen Lösung variiert zwischen etwa 1 % und 25% Wasserstoffperoxid auf einer Volumen/Volumen-Basis (V/V), bezogen auf das ursprüngliche Volumen der wäßrigen Lösung. Vorzugsweise liegt die Menge zwischen 3% und 10% (V/V), bezogen auf das ursprüngliche Volumen. Bei Konzentrationen, die wesentlich über 25% (V/V) liegen, wird der Vorteil

asymptotisch, während bei Konzentrationen, die wesentlich unter etwa 1 % (V/V) liegen, die Reaktionsgeschwindigkeit in ungebührendem Maße langsam wird.

Die Temperatur für den Wasserstoffperoxidkontakt variiert zwischen etwa 4 und 30⁰C, Vorzugsweise liegt die Temperatur zwischen 4 und 20° C. Bei Temperaturen, die wesentlich über 30° C Hegen, verliert das Enzym an Aktivität, was nicht gewünscht wird, und bei Temperaturen, die wesentlich unter etwa 4° C Jiegen, wird die Reaktionsgeschwindigkeit in ungebührendem Maße langsam.

Der pH-Wert für die Wasserstoffperoxidbehandlung liegt vorteilhafterweise zwischen etwa 4,0 und 8,0. Bei pH-Weiten, die wesentlich über etwa pH 8,0 liegen, wird das Enzym inaktiviert, was unerwünscht ist, und bei pH-Werten, die wesentlich uner pH 4 liegen, nimmt die Löslichkeit des Enzymes ab und die Reaktionszeit zu.

Die Kontaktzeit ist eine Funktion der speziell gewählten Kontaktbedingungen; sie sc'lte jedoch ausreichend lange sein, um die Wärmestabilität des mikrobiellen Rennins auf das gewünschte Maß merklich zu reduzieren. Unter bevorzugten Bedingungen haben sich Kontaktzeiten zwischen etwa 15 und 72 Stunden als besonders günstig erwiesen.

Die wasserstoffperoxidbehandelte Lösung wird weiter behandelt, um im wesentlichen das restliche oder überschüssige Wasserstoffperoxid in der Lösung zu zerstören, wobei geeignete Mittel angewandt werden, welche das mikrobielle Rennin nicht inaktivieren. Das restliche Wasserstoffperoxid kann mit Hilfe von Catalase, wie Catalase aus Rinderleber, Peroxidase, wie Peroxidase aus Meerrettich, Ascorbinsäure und dergleichen zersetzt werden. Diese Mittel zum Zersetzen des Wasserstoffperoxides können unter den für die Wasserstoffperoxidbehandlung vorliegenden Bedingungen angewandt werden. In der Praxis wird die Menge des restlichen Wasserstoffperoxides in der Lösung nach der Behandlung durch irgendeinen geeigneten Nachweis, wie sie dem Fachmann in der Käseherstellung bekannt sind, bestimmt, z. B. durch Natriumjodidtitration. Daraufhin wird eine geeignete Menge des Mittels zum Zersetzen des Wasserstoffperoxid? zu der mikrowellen Penninlösung zugegeben und die restlichen Mengen an Wasserstoffperoxid werden mit Hilfe eines Nachweises kontrolliert, bis das Wasserstoffperoxid im wesentlichen zersetzt ist. Catalase aus Rinderleber ist ein bevorzugtes Mittel und eignet sich besonders dazu, Wasserstoffperoxid auf das gewünschte Niveau herabzusetzen, wobei die vorstehend genannten bevorzugten Bedingungen und eine Zeitdauer von etwa 1 bis 3 Stunden angewandt werden.

Die Wärmestabilität des mit Wasserstoffperoxid behandelten mikrowellen Rennins wird unter Bedingungen bestimmt, die normalerweise angewandt werden, um Käsemolkelösungen zu pasteurisieren. Das folgende Modell ist dazu geeignet, diese Pasteurisierungsbedingungen zu reproduzieren. Ein aliquoter Teil von 1 ml der renninhaltigen Lösung wird mit Natriumphosphatpuffer (pH 5,5 bis 6,0) auf 100 ml verdünnt. Aliquote Teile von 2 bis 3 ml dieser verdünnten Lösung werden dann in ein versiegeltes Reagenzglas gegeben und ir. einem Wasserbad auf eine Temperatur von 60° C bis 71° C für eine Zeitdauer von 0 bis 20 Minuten erwärmt. Die erwärmten Proben werden abgekühlt und dann auf ihre milchgerinnende Aktivität untersucht. Unter diesen Modell-Pasteurisierungsbedingungen nahm die restliche Aktivität des in der Käsemolke gefundenen Rennins nach der Wärmebehandlung auf die gewünschte restliche milchge- rinnende Aktivität von mindestens unter etwa 20% der ursprünglichen milchgerinnenden Aktivität vor der Wärmebehandlung ab. Bei Anwendung der bevorzugten Bedingungen gemäß der Erfindung wurde festgestellt, daß die mit Wasserstoffperoxid behandel ten mikrowellen Rennine ebenso wärmelabil sind wie Kälber-Rennin, wenn dieses den gleichen Bedingungen unterworfen wird.

Das gemäß der Erfindung behandelte mikrobielle Rennin eignet sich für alle traditionellen Käseherstel lungsverfahren, welche nun mikrobielles Rennin als Milchkoagulierungsmitiel verwenden. Da das neue, mit Wasserstoffperoxid behandelte mikrobielle Rennin in drastischer Weise weniger wärmestabil ist als das unbehandelte mikrobielle Rennin, kann erstercs als geeigneter Ersatz selbst für Kälber-Rennin dienen. Bei Verwendung im Käseherstehungsverfahren wird das behandelte mikrobielle Rennin gemäß der Erfindung unter normalen Bedingungen, wie sie zum Pasteurisieren von Käsemolke angewandt werden, in ge- v.ünschter Weise inaktiviert und die sich ergebende Molke kann in vollem Umfang zur Gewinnung bzw. Ausnutzung der wertvollen Molkeproteine verwendet werden.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der

jo Erfindung, ohne den Umfang derselben z'i beschränken.

Beispiel 1 Dieses Beispiel zeigt eine typische Behandlungs-

j5 methode verschiedener mikrobieller Mucor-Rennine unter Verwendung von Wasserstoffperoxid.

Es wurden wäßrige Fermentations-Kulturlösungen von mikrobiellem Rennin aus Mucor-mietiei (pH 4,5) mit 49800SLVmI und Mucor-pusillus (pH 5,5) mit

'<\ 49800 SU/ml aus im Handel erhältlichen Materialien hergestellt. Proben von wäßrigen Kulturflüssigkeiten (1000 ml) wurden auf 4° C abgekühlt und der pH-Wert durch Zugabe von 20% (W/V) wäßrigem Natriumhydroxid auf pH 7,0 eingesteht. Zu jeder Probe wurden dann 100 ml 30%iges (V/V) Wasserstoffperoxid (analytisch rein) zugegeben. Dies entspricht einer Konzentration von etwa 3% (V/V) Wasserstoffperoxid, bezogen auf das ursprüngliche Volumen der wäßrigen Kulturflüssigkeit. Diese Proben wurden 24 Stunden bei 4° C im Kontakt mit Wasserstoffperoxid stehen gelassen. Dann wurde zu diesen Lesungen Catalase aus Rinderleber (0,3 ml), 100 Keil-Einhei- £en (KU) pro 1 ml, 1 KU zersetzt 1,0 g H₂O₂/10 min bei 25° C und pH 7,0; zugegeben, um das überschüs sige Wasserstoffperoxid zu zerstören und das Gemisch wurde (etwa 2 bis 3 Stunden) bei Raumtemperatur stehen gelassen, bis ein negativer Peroxidtest erhalten wurde. Die "Η-Werte der Lösungen wurden wieder auf ihre ursprünglichen pH-Werte mit 12 N HCl ein-

bo gestellt und auf ihr ursprüngliches Volumen von 1000 ml mittels Entspannungsverdarapiung konzentriert.

Die milchgerinnende Wirkung des mikrowellen Rennins wurd" in 10%igen Lösungen von entrahmter

_b5 Milch, welche 0,01 M CaCl₂ enthielt, bestimmt und welche mit Milchsäure auf etwa pH 6,5 eingestellt wurden. 5 ml Milch wurden bei 37° C mit 0,5 ml einer Probe der Enzymlösung inkubiert. Die bis zum Er-

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scheinen des Gerinnungsproduktes bzw. Klumpens (clot) erforderliche Zeit wurde gemessen. Die Enzymaktivität wurde in Soxhlet-Gerinnungseinheiten (SU) ausgedrückt. Die Behandlung von mikrobiellem Rennin aus Mucor-miehei mit Wasserstoffperoxid ergab eine vollständige Beibehaltung der milchgerinnenden Aktivität, während die Behandlung von mikrobiellem Rennin aus Mucor-pusillus eine KO- bis C/0%ige Erhaltung der milchgerinnenden Wirkung ergab.

Zur Bestimmung der Wärmestabilität der mit Wasserstoffperoxid behandelten Einzyme wurden aliquote Teile (1 ml) der nativen und der behandelten Rennine mit 0,2 IvI Natriumphosphatpuffer (pH 5,5) auf 100 ml verdünnt. Aliquote Teile (2 ml) dieser verdünnten Lösungen, welche einen überschüssigen Renningehalt, wie er in Knsrmnlltr vnrljpgt. aijfuieisen, wurden in Reagenzgläser mit Schraubverschluß gegeben und in einem Wasserbad von 60 bis 70' C verschiedene Zeiten erwärmt. Nach der Wärmebehandlung wurden die Proben durch Eintauchen in ein Eis-Wasser-Bad gekühlt und auf ihre restliche milchgerinnende Wirkung nach der oben beschriebenen Methode untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der nachfolgenden Tabelle A zusammengefaßt.

Tabelle A

Probe	Pasteurisierungs-	Zeit (min)	Cf restliche
	bedingungen	0	milchgerinnende
		4	Aktivität nach
		8	der Pasteurisie
	T" C	12	rung
M. pusillus	60	16	100
(nativ)		20	95
		0	9(1
		4	89
		8	87
		12	82
M. pusillus	60	16	100
(H₂O₂-		20	34
behandelt)		0	18
		4	11
		8	6.9
		12
M. miehei	70	16	100
(nativ)		20	94
		0	79
		4	72
		8	66
		12	61
M. miehei	70	16	100
(H₂O₂-		20	19
behandelt)		5,2
		2,0

		—

Die obigen Daten zeigen deutlich, daß die Behandlung mit Wasserstoffperoxid die Wärmestabilität der Enzyme drastisch reduziert, wie dies durch deren milchgerinnende Wirkung im Vergleich zum nativen (unbehandeiten) Enzym ausgedrückt wird.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt die Wirkung des pH-Wertes auf die milchgerinnende Aktivität und die Wärmesta-

bilität von mikrobiellem Rennin, welches nach dem genannten Verfahren behandelt wurde.

Aliquote Teile von 10 ml einer wäßrigen Kulturflüssigkeit von mikrobiellem Rennin aus Mucor miehei (pH 4,5), welche 49800 SU/ml enthielt, wurden auf verschiedene pH-Werte zwischen 4,5 und 7,5 unter Verwendung von 20%igem (W/V) wäßrigem Natriumhydroxid eingestellt. Jede Probe wurde mit 0.6 ml 3()%igem (V/V) Wasserstoffperoxid (entsprechend l,H^r/r (V/V] H₂O₂. bezogen auf das Ausgangsvolumen) behandelt. Eine nicht behandelte Probe diente als Kontrolle. Sämtliche Proben wurden 24 Stunden lang bei 4 C gelagert und dann mit 5 ml einer 20^ igen (W/V) wäßrigen Ascorbinsäure (zur Zersetzung von H₂O₂) behandelt und 48 Stunden lang bei 4" C gelagert. Jedes Gemisch wurde mit 0.2 M Natrinmnhrxinhatniiffrr InH S S> WHIfarh

ι f r·- ■ yr ' ' - '- t -

ι f r·- ■ ir'- - ·- / - -· Die milchgerinnende Wirkung wurde, wie in Bei	bestimmt. Die Ergebnisse sind in
spiel 1 beschrieben.	Tabelle B zusammengestellt.
der nachfolgenden	Tabelle B
	^r/c der ursprünglichen
Behandelt bei pH	milchgerinnenden Aktivität
	100
4.5 (Kontrolle)	94
4.5	89
5,1	92
5.8	94
6.3	97
6.9	100
7.5

Die in Tabelle B aufgeführten Daten zeigen deutlich, daß das gegenwärtige Verfahren die milchgerin-'"' nende Wirkung des behandelten mikrobiellen Rennins sogar über den breiten pH-Bereich von 4.5 bis 7.5 nicht nachteilig beeinflußt.

Die Wärmestabilität des behandelten mikrobiellen Rennins wurde mit Hilfe des Pasteurisierungsverfah-⁴⁽¹ rens, wie es in Beispiel 1 beschrieben wird, bestimmt. Die milchgerinnende Wirkung wurde nach dem Pasteurisieren bestimmt und in % der ursprünglichen Aktivität vor dem Pasteurisieren ausgedrücKt. Die Daten sind in der nachfolgenden Tabelle C zusam-"*■"' mengefaßt.

Tabelle C

Behandlung	Pasteurisie-	^r'c restliche
bei pH	rungszeit	milchgerin
	Minuten bei	nende Wirkung
	70 ^CC
4.5 (Kontrolle)	0	100
	4	93
	8	84
	12	72
4.5	0	100
	4	39
	8	12,4
	12	5,6
6,3	0	100
	4	37,6
	8	13
	12	4.4
7,5	0	100
	4	10,7
	8	2,6
	12	—

29 Ol 542

Die Ergebnisse in Tabelle C zeigen, daß die mil Wasserstoffperoxid über einen pH-Bereich von 4.5 bis 7,5 behandelten Proben in drastischer Weise hitzelabiler sind als die unbehandelte Kontrollprobe.

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt den Einfluß der Kontaktzeit auf die milchgerinnende Aktivität und die Wärmesta bilität von mikrobiellem Rennin, welches nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wurde.

200 ml einer wäßrigen Lösung von Mueor miehei mikrobiellem Rennin, welche 49 800 SU/ml enthielt, wurde mit 2OC4 igem (W/V) wäßrigem Nateriumhydroxid bei 4 C auf pH 7,0 eingestellt und 20 ml 3()^r/figes (V/V) Wasserstoffperoxid (entsprechend 3^r'r [V/V| H₁O,, bezogen auf das Ausgangsvolumen) zu dieser Losung zugegeben. Dieses Gemisch wurde mehrere Tape auf 4" Γ gehalten, wnbi'i wahrend dieser Zeit aliquote Teile (I ml) entnommen wurden, welche mit Calalase aus Rinderleber (0,01 ml, 100 KU/ml) behandelt und weiter mit 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH 5,5) lOOfach verdünnt wurden. Die milchgerinnende Wirkung wurde, wie in Beispiel I beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle D aufgeführt.

Tabelle D

Kontaktzeit (Std.)	Vr der ursprünglichen
	milchgerinnenden Aktivität
0	100
17	103
26	108
41	105
50	113
65	101
73	113
136	111

Die Ergebnisse in Tabelle D zeigen, daß durch dieses Verfahren die milchgerinnende Wirkung des behandelten mikrobiellen Rennins sogar über ausgedehnte Kontaktzeiten hinweg verbessert und nicht nachteilig beeinflußt wird.

Die Wärmestabilität von ausgewählten Proben des behandelten mikrobiellen Rennins wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Pasteurtsierungsverfahren bestimmt. Die milchgerinnende Wirkung wurde nach dem Pasteurisieren bestimmt und wird ausgedrückt in ^r/r de* ursprünglichen milchgerinnenden Aktivität der Probe vor dem Pasteurisieren. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle E zusammengefaßt.

Tabelle E

Kontaktzeit	Pasteurisie-	% restliche
(Stunden)	rungszeit	milchgerin
	(Min. bei 70°C)	nende Aktivität
0	0	100
	4	94
	8	79
	12	72
26	0	100
	4	19
	8	5,2
	12	2

Kontaktzeit Pasteurisie- % restliche

(Stunden) rungszeit milchgerin-

(Min. bei 70°C) nende Aktivität

73

136

0
4

12

100
9,6

3,2

100
6,6

Die Ergebnisse in Tabelle E zeigen, daß die mit Wasserstoffperoxid behandelten Proben über einen weiten Bereich von Kontaktzeiten wesentlich hitzelabiler sind als die unbehandelte Kontrollprobe.

Beispiel 4

Dieses Beispiel zeigt den Einfluß der Wasserstoffperoxidkonzentration auf die niilchgerinnende Aktivität und die Wärmestabilität von mikrobiellem Rennin, welches nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wurde.

250 ml einer wäßrigen Lösung von Mucor miehei mikrobiellem Rennin, welche 99600 SU/ml enthielt, wurde mit 20%igem (W/V) wäßrigem Natriumhydroxid auf pH 7,0 eingestellt. Aliquote Teile von 10 ml wurden entnommen und verschiedene Mengen an Wasserstoffperoxid (30% V/V) im Bereich von 3% (V/V) bis 9% (V/V) H.O₂, bezogen auf das Ausgangsvolumen, zugegeben. Jede Probe wurde dann 77 Stunden lang bei 4° C gelagert. Daraufhin wurde genügend Catalase aus Rinderleber zugegeben (0,1 ml, 100 KU/ml), um das Wasserstoffperoxid in der Probe zu zerstören. Jede Probe wurde dann mit 0,2 M Phosphatpuffer (pH 5,5) lOOfach verdünnt. Die milchgerinnende Wirkung wurde mit Hilfe des Verfahrens, wie es in Beispiel 1 beschrieben wird, bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der naenstehenden Tabelle F aufgeführt.

Tabelle F

4-, H,O,-Konzentration	% milchgerinnende Aktivität.
%'v/v	bezogen auf die ursprüng
	liche Aktivität
O	100
3,0	91
⁵⁰ 4,2	91
5,4	96
6,0	97
7,2	97
8,4	93
" 9,0	93

Die Daten in Tabelle F zeigen, daß durch dieses Verfahren die milchgerinnende Aktivität des behandelten mikrobiellen Rennins über einen Bereich an H₂O₂-Konzentrationen nicht nachteilig beeinflußt wird.

Die Wärmestabilität von ausgewählten Proben der behandelten Proben wurde mit Hilfe des Pasteurisierungsverfahrens (bei 65° C), wie es in Beispiel 1 beschrieben wird, bestimmt. Die miichgerinnende Aktivität wurde nach dem Pasteurisieren gemessen und wird ausgedrückt in %, bezogen auf die ursprüngliche milchgerinnende Wirkung in der Probe vor dem Pa-

29 Ol

steurisieren. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle G zusammengefaßt.

Tabelle G

H₂O,-Konzen	Pasteurisie-	% restliche
tration % V/V	rungszeit,	milchgerinnende
	Min. bei 65°C	Aktivität
0	O	100
	8	100
	O	100
	8	21
6	O	100
	8	10
9	O	100
	8	4

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Sä	CaO₂	% H₂O₂	Tabelle H	% restliche
i	(mg)	(V/V)	Pasteurisie-	milchgerinnende
i			rungszeit,	Aktivität
1	0	0	Min. bei 60 "C	100
			0	97
I			8	97
			16	94
i	500	2,35	20	100
i			0	37
I			8	23
I			16	21
I		20

ΙΊ

40

Wasserstoffperoxid über einen Bereich von H₂O₂-Konzentrationen behandelten Proben in deutlicher -" Weise hitzelabiler sind, als die unbehandelte Kontrollprobe.

Beispiel 5

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung von Wasser- -^ stoffperoxid, welches in situ erzeugt wird, und dessen Einfluß auf die Wärmestabilität des mikrobiellen Rennins, welches mittels des genannten Verfahrens behandelt wurde.

Gereinigtes mikrobielles Rennin (500 mg) aus Mu- "' cor miehei wurde in 100 ml 1,0 N Natriumacetatpuffer (pH 4,5) aufgelöst. Diese wäßrige Enzymlösung enthielt etwa 9960 SU/ml. Ein aliquoter Teil von 10 ml dieser Lösung wurden entnommen und 500 mg Kalziumperoxid zu diesem zugegeben. Diese Menge ^r> an Kalziumperoxid war, in Kontakt mit dem vorliegenden Wasser, ausreichend, um Wasserstoffperoxid in situ in einer äquivalenten Menge von etwa 2,35% H₂O, (V/V), bezogen auf das Ausgangsvolumen, zu bilden. Die Probe wurde bei etwa 20° C ca. 15 bis 18 Stunden lang bei pH ί',5 gelagert. Um überschüssiges Wasserstoffperoxid zu zerstören, wurde dann Catalase aus Rinderleber (0,1 ml; 100 KU/ml) zugegeben. Die Probe wurde mit 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH 5,5) 20fach verdünnt und die Wärmestabilität der behandelten Probe und der nicht behandelten Kontrollprobe mittels des Pasteurisierungsverfahrens (bei 60° C), wie es in Beispiel 1 beschrieben wird, bestimmt. Die milchgerinnende Aktivität wurde vor und nach dem Pasteurisieren gemessen und die Werte ausgedrückt in %, bezogen auf die ursprüngliche milchgerinnende Aktivität. Die Daten werden in der nachfolgenden Tabelle H wiedergeben.

55

60

65 Die Daten in iabelle H zeigen deutlich, daß in situ gebildetes Wasserstoffperoxid bei dem erfindungsgemäßen Verfahren dazu führt, die Wärmestabilität des behandelten mikrowellen Rennins im Vergleich zu der unbehandelten Kontrollprobr in drastischer Weise zu reduzieren.

Beispiel 6

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung von mikrobiellem Rennin, welches nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt wurde, bei der Käseherstellung.

Es wurden Chargen von Cheddar-Käse unter Anwendung eines üblichen Verfahrens aus 196 kg pasteurisierter Vollmilch und \% handelsüblicher Kultur zum Starten hergestellt. In einem Kontrollbottich wurde die Milch mit 22,5 ml unbehandeltem mikrobiellem Rennin aus Mucor miehei, welches etwa 93000 SU/ml enthielt, behandelt. In einem Testbottich wurde die Milch mit 26,5 ml Mucor miehei mikrobiellem Rennin, welches wie in Beispiel 4 mit 3% (V/V) Wasserstoffperoxid behandelt worden war und etwa 79 000 SU/ml enthielt, koaguliert. Es wurden die jeweiligen Zeiten zur Bildung der geronnenen Milch gemessen und es zeigte sich, daß diese äquivalent waren. Nach der Käsebereitung wurden die Molkeflüssigkeiten gesammelt, mit Natriumhydroxid auf pH 6,1 eingestellt und auf ihre restliche Enzymaktivität analysiert, und zwar vor und nach einer Momentan-(flash)-Pasteurisierung. Die Enzymaktivitäten werden in der nachfolgenden Tabelle I in %, bezogen auf die ursprüngliche milchgerinnende Wirkung der Molke aufgeführt.

Tabelle I

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Probe	Pasteurisie-	% der ursprüng
	rungs-	lichen milch
	bedingungen	gerinnenden
		Aktivität der
		Molke
nicht-	keine	100
behandelte	63° C, 20 Sek.	99
Kontrolle	63°C, 30 Sek.	100
H₂O₂-	keine	100
behandelt	63° C, 5 Sek.	30
	63°C, 10 Sek.	30
	63⁰C, 15 Sek.	26
	63° C, 20 Sek.	23

Die obigen Daten zeigen deutlich, daß das H₂O,-behandelte mikrobielle Rennin bei der Käseherstellung ebenso wirksam ist wie das native mikrobielle Rennin, daß jedoch das H₂O₂-behandelte Rennin wesentlich hitzelabiler ist als das native Rennin.

Die im vorstehenden hergestellten Käse wurden 30 Tage lang bei 7° C gereift und durch eine Gruppe geübter Geschmacksprüfer miteinander verglichen. Der mit dem H₂O₂ behandelten Rennin hergestellte Käse kam gut an und es wurde festgestellt, daß dieser in wünschenswerter Weise im Geschmack und in der Struktur dem mit nicht behandeltem, nativen Rennin hergestellten Käse ähnlich war.

Beispiel 7

In diesem Beispiel wird die Hitzestabilität von Kälber-Rennin und mikrobiellem Rennin verglichen, welches nach dem beanspruchten Verfahren behandelt wurde.

Mucor miehei mikrobielles Rennin, welches 99600 SU/ml enthielt, wurde, wie in Beispiel 4 beschrieben, mit 3% (V/V) H₂O₂ behandelt und dessen Wärmestabilität mit nativem mikrobiellem Rennin vor der Behandlung und mit Kälber-Rennin, welches etwa 49800 SU/ml enthielt, verglichen, wobei das in Beispiel 1 beschriebene Pasteurisierungsverfahren (bei 60° C) angewandt wurde. Die milchgerinnende Wirkung wurde nach dem Pasteurisieren gemessen und wird ausgedrückt in %, bezogen auf die ursprüngliche milchgerinnende Aktivität der Probe vor dem Pasteurisieren. Die Daten sind in der nachstehenden Tabelle .1 zusammengefaßt.

Die Daten in Tabelle J zeigen deutlich, daß das vorliegende Verfahren dazu geeignet ist, die Würmestabilität von mikrobiellem Rennin bis auf einen Wert zu reduzieren, der etwa der Wärmestabilität von KaI-ber-Rcnnin entspricht.

	Tabelle J	'.<· restliche milchgerinneiide Aktivität
Probe	Pasteurisie- rungszeit, Min. bei 60° C	100 98 98
mikrobielles Rennin (nicht- bchandclt)	0 8 20	100 M) 38
mikrobielles Rennin (H,O,- bchandclt)	0 8 20	KKI 72 C C
Kälber-Rennin	0 8

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herabsetzung der thermischen Stabilität von mikrobiellem Mucor-Rennin, dadurch gekennzeichnet, daß eine wäßrige Lösung von mikrobiellem Rennin mit Wasserstoffperoxid unter Bedingungen, bei denen die Wärmestabilität des mikrowellen Rennins wesentlich herabgesetzt wird, behandelt und anschließend das restliche Wasserstoffperoxid in der Lösung im wesentlichen zerstört wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das mikrobielle Rennin aus Mucor miehei hergestellt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das mikrobielle Rennin aus Mucor pusillus hergestellt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wärmestabilität des mikrobiellen Rennins, ausgedrückt als restliche milchgerinnende Aktivität nach der Wärmbehandlung, mindestens auf unter ca. 20% der ursprünglichen Aktivität herabgesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wärmestabilität des mikrobiellen Rennins etwa auf die Wärmestabilität von Kälber-Rennin, wenn dieses den gleichen Wärmebedingungen ausgesetzt wird, herabgesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das mikrobielle Rennin in der wäßrigen Lösung in einer Konzentration vorliegt, die, ausgedrückt in Werten der milchgerinnenden Aktivität, zwischen etwa 10000 bis 100000 Soxhlet-Einheiten pro Milliliter beträgt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration von Wasserstoffperoxid zwischen etwa 1 % und 25 % auf einer Volumen/Volumen-Basis, bezogen auf das ursprüngliche Volumen der wäßrigen Lösung, beträgt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Wasserstoffperoxidkonzentration zwischen 3% und 10% auf einer Volumen/Volumen-Basis, bezogen auf das ursprüngliche Volumen der wäßrigen Lösung, beträgt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wasserstoffperoxidkontakt bei einer Temperatur zwischen etwa 4 und 30° C ausgeführt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wasserstoffperoxidkontakt bei einem pH zwischen etwa 4,0 und 8,0 durchgeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wasserstoffperoxidkontakt für eine Zeitdauer zwischen etwa 15 und 72 Stunden durchgeführt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Wasserstoffperoxid in situ gebildet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Wasserstoffperoxid in situ aus einer Verbindung der Gruppe Natriumperoxid, Kalziumperoxid, Benzoylhydroperoxid, einem Gemisch von Cumolhydroperoxid und Peroxidase, und Harnstoffhydrogenperoxid gebildet

wird.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Wasserstoffperoxid im wesentlichen mit Catalse, Peroxidase und/oder Ascorbinsäure zerstört wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Catalase eine Catalase aus Rinderleber und Peroxidase eine Peroxidase aus Meerrettich ist.

16. Verwendung von Mucor-Rennin mit stark herabgesetzter Wärmestabilität, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Käsebereitung.