DK146513B

DK146513B - Fremgangsmaade til nedsaettelse af den termiske stabilitet af mikrobiel osteloebe

Info

Publication number: DK146513B
Application number: DK095379AA
Authority: DK
Inventors: Dennis Alfred Cornelius
Original assignee: Miles Lab
Priority date: 1978-05-22
Filing date: 1979-03-07
Publication date: 1983-10-24
Also published as: DK146513C; NL176478C; IT7948342A0; GB2024828B; IT1114500B; NL7900315A; FR2426696B1; AU515019B2; NL176478B; MX6268E; DK95379A; FR2426696A1; DE2901542C2; DE2901542B1; AU4723679A; JPS557092A; AR216570A1; DE2901542A1; GB2024828A; JPS5712598B2

Description

146513

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til nedsættelse af den termiske stabilitet af mikrobiel Mucor-osteløbe.

I århundreder har kalveosteløbe været anvendt som mælkekoagulator ved fremstillingen af alle slags oste. Faktisk angiver oste fremstillet 5 med dette enzym standarderne for aroma, udseende og konsistens, i forhold til hvilke oste fremstillet med andre koagulatorer sammenlignes.

På det seneste har den voldsomme stigning i verdensosteproduktionen og nedgangen i kalveosteløbeudbudet stimuleret anvendelsen af alternative mæl kekoagulationsenzymer.

10 Blandt de til rådighed værende enzymer til dette formål foretræk kes mikrobielle osteløbere, fordi disse kan masseproduceres og frembyder mange forskellige egenskaber, hvilket muliggør udvælgelse af de, der er mest egnede i osteproduktion. Desværre har den større termiske stabilitet af de mikrobielle osteløbere, såsom de mikrobielle Mucor-osteløbere, 15 været anset for at være en mindre ønskelig egenskab ved disse enzymer.

I ostefremstillingsprocessen samles den valle, der separerer fra den osteløbekoagulerede ostemasse, som en værdifuld valleproteinkilde. Almindeligvis pasteuriseres den samlede valle ved en temperatur fra ca.

60°C til 71°C i et tilstrækkeligt tidsrum til at ødelægge eventuelle 20 mikroorganismer og til at inaktivere mindst ca. 80 til 90% af eventuelt resterende osteløbekoagulator termisk. Resterende omfang af koagulerende enzym, som har bevaret meget mere end ca. 20% af sin oprindelige mælkesammenløbningsaktivitet efter normal pasteurisering, har vist sig at hydrolysere de værdifulde valleproteiner uønskeligt og begrænse 25 anvendelsen af vallen som bestanddel i forskellige fødevareprodukter.

De almindelige pasteuriseringsbetingelser, der er tilstrækkeligt milde til at lade valleproteiner upåvirkede, men tilstrækkeligt hårde til termisk at inaktivere kalveosteløbe, er meget langsommere til at inaktivere mikrobielle osteløbekoagulatorer til det ønskede niveau. Dette problem kompliceres 30 yderligere af det forhold, at der udskilles mere mikrobiel osteløbe end kalveosteløbe i vallen. Følgelig har der vedvarende været gjort en indsats for at forbedre den termiske labilitet af de mikrobielle osteløbere.

Der har været prøvet adskillige mikrobiologiske fremgangsmåder til opnåelse af mere varmelabile mikrobielle koagulatorer. Disse fremgangsmå-35 der indbefatter omfattende screenings for nye mikroorganismer og mutationer af kendte osteløbeproducerende mikroorganismer. Til dato har ingen fremgangsmåde været vellykket til opnåelse af en acceptabel koagu-lator med de ønskede termiske egenskaber.

2 146513

Kemiske fremgangsmåder til modificering af forskellige egenskaber ved enzymerne har ligeledes været forsøgt men er i almindelighed stærkt begrænset af et ledsagende svind i enzymets mælkesammenløbningsaktivi- tet. Nyere studier til bestemmelse af de strukturelle og funktionelle 5 determinanter hos en mikrobiel Mucor-osteløbe tyder dog pi, at en vis kemisk modifikation af mikrobiel osteløbe måske ikke resulterer i det fuldstændige tab af mælkekoagulationsaktivitet. Disse modifikationer omfatter nitrering (Biochemica et Biophysica Acta, 371, 368 [1974]), carbamylering (ibid., 27I, 93 [1972]) og periodat-inducerede deglycos-10 ylering (ibid., 328, 52 [ 1973]) af glycoenzymet fra mikrobiel Mucor- osteløbe. Der er en hvis antydning af, at blandt disse modifikationer kan carbamylering og periodatinduceret deglycosylering tilvejebringe en i nogen grad øget termisk labilitet. Desværre har disse kemiske fremgangsmåder ikke været tilstrækkeligt vellykkede til at kunne tilvejebringe 15 en mikrobiel osteløbe med den ønskede grad af termisk labilitet.

Det er derfor meget ønskeligt at tilvejebringe en mikrobiel osteløbe med ønskede mælkekoagulationsegenskaber men med væsentligt øgede termolabile egenskaber.

Ifølge den foreliggende opfindelse er der tilvejebragt en fremgangs-20 måde til nedsættelse af mikrobiel Mucor-osteløbes termiske stabilitet.

Denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en vandig opløsning af den mikrobielle osteløbe kontaktes med hydrogenperoxid ved en temperatur på mellem ca. 4°C og 30°C, ved et pH på mellem ca. 4,0 og 8,0 og i et tidsrum på mellem ca. 15 og 72 timer, hvorefter eventuel 25 tilbageværende hydrogenperoxid i den mikrobielle osteløbe-opløsning destrueres i et efterfølgende reaktionstrin.

En udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at den mikrobielle osteløbe forekommer i den vandige opløsning i en koncentration, der udtrykt i mæfkesammenløbningsaktivitets-30 værdier ligger i området på fra 10.000 til 100.000 Soxhlet-enheder pr. ml.

En anden udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at koncentrationen af hydrogenperoxid ligger mellem ca. 1% og 25% på volumen/volumen-basis baseret på det oprindelige vo-35 lumen af den vandige opløsning.

De termisk stabile mikrobielle osteløbere, der mest effektivt behandles ved fremgangsmåden, fremstilles af Mucor-mikroorganismer ved velkendte fremgangsmåder og er kommercielt tilgængelige i vandig opløsning. Disse osteløbere omfatter osteløbere fremstillet af Mucor miehei, 146513 3

Mucor pusillus og lignende. De naturlige koagulationsenzymer fra disse kilder vides at være mere varmestabile end kalveosteløbe. Fremgangsmåden kan anvendes til rene, delvis rene eller endog meget rå gæringsvæsker af den mikrobielle osteløbe.

5 Det hydrogenperoxid, der anvendes i forbindelse med udøvelse af opfindelsen, er kommercielt tilgængeligt eller kan fremstilles in situ ved velkendte midler. F.eks. er det kendt at uorganiske og organiske peroxider tilvejebringer hydrogenperoxid ved kontakt med vand. Alle egnede hydrogenperoxidfrembringende midler, der ikke inaktiverer den 10 behandlede osteløbe ugunstigt, kan vælges, inklusive brug af natrium-peroxid, calciumperoxid, benzoylhydroperoxid, en blanding af cumen-hydroperoxid og peroxidase, urinstofhydrogenperoxid og lignende. De uorganiske peroxider foretrækkes.

Ved udøvelsen af opfindelsen kontaktes en vandig opløsning af den 15 ovenfor nævnte termisk stabile mikrobielle osteløbe med hydrogenperoxidet under de ovenfor angivne forhold, som er effektive til væsentligt at nedsætte den termiske stabilitet (d.v.s. at øge den termiske labilitet), fortrinsvis mindst til 20% af den oprindelige stabilitet udtrykt ved den resterende mælkesammenløbningsaktivitet efter varmebehandling og 20 fortrinsvist i det mindste ca. til kalveosteløbes termiske stabilitet. Den således behandlede opløsning af mikrobiel osteløbe kan anvendes som den er, koncentreres eller renses yderligere, således som det måtte være påkrævet ved den specielle ostefremstillingsproces.

Fagfolk vil forstå, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan udøves 25 som en batchproces eller som en kontinuerlig proces, og at betingelserne ved kontaktning med hydrogenperoxid, d.v.s. stofkoncentrationer, pH, temperatur og kontakttid, vil variere i afhængighed af den naturlige mikrobielle osteløbes termiske stabilitet, procestypen og det valgte udstyr. Imidlertid skal der vælges forhold, som ikke påvirker den 30 mikrobielle osteløbes oprindelige mælkesammenløbningsaktivitet ugunstigt.

Koncentrationen af mikrobiel osteløbe i den vandige opløsning udtrykkes mest bekvemt i mælkesammenløbningsenzymaktivitet, d.v.s. Soxhlet-enheder (SU: Soxhlet Units) pr. ml bestemt ved den fremgangsmåde, som er beskrevet i J. of Dairy Science, Vol. 54, No. 2, 159-167 35 (1971), som inkorporeres heri ved reference. Mælkesammenløbningsakti- viteten bestemmes i en 10% skummetmælksopløsning ved pH 6,45 til 6,50 indeholdende 0,01 M CaCIg. Fem ml mælk inkuberes ved 37°C ± 0,5°C med 0,5 ml enzymopløsning. Det tidsrum, der er påkrævet til at frembringe mælkesammenløbningen, måles. En Soxhlet-enhed er defineret som 4 146513 den enzymaktivitet, der får én (1) ml af et mælkesubstrat til at løbe sammen på 40 minutter ved prøveprocedurens betingelser. I praksis vil mælkesammen løbningsaktiviteten for den vandige opløsning af mikrobiel osteløbe fortrinsvis variere fra ca. 10.000 SU/ml til ca. 100.000 SU/ml.

5 De mængder hydrogenperoxid, der anvendes til behandling af den vandige opløsning af mikrobiel osteløbe vil afhænge af enzymets aktivitet, oprindelige varmestabilitet og renhed. Hydrogenperoxidkoncentra-tionen i den vandige opløsning varierer mellem ca. 1% og 25% hydrogenperoxid på volumen/volumen-basis (V/V) baseret på den vandige opløs-10 nings oprindelige volumen. Mængden er fortrinsvis mellem 3% og 10% (V/V) baseret på det oprindelige volumen. Ved koncentrationer meget over ca. 25% (V/V) forbedres fordelene kun asymptotisk, og ved koncentrationer meget under ca. 1% (V/V) bliver reaktionshastigheden ... uhensigtsmæssig langsom.

15 Temperaturen ved hydrogenperoxidkontakt varierer mellem ca. 4°C

og 30°C. Temperaturen er fortrinsvis mellem ca. 4°C og 20°C. Ved temperaturer meget over 30° mister enzymet uønskeligt aktivitet, og ved temperaturer meget under ca. 4°C bliver reaktionshastighederne uhensigtsmæssigt lave.

20 pH-Værdien ved hydrogenperoxidbehandlingen vil ligge mellem ca. pH 4,0 og 8,0. Ved pH-værdier meget over ca. pH 8,0 bliver enzymet uønskeligt inaktiveret, og ved pH-værdier meget under pH 4,0 falder enzymets opløselighed og reaktionstiden stiger.

Kontakttiden er en funktion af de valgte specielle kontaktbetingel-25 ser, men skal være tilstrækkelig til i alt væsentligt at nedsætte den mikrobielle osteløbes termiske stabilitet til et ønsket niveau. Ved de foretrukne forhold har kontakttider på mellem ca. 15 og 72 timer været anvendt med størst succes.

Ved en foretrukken form for opfindelsen behandles den hydrogen-30 peroxidbehandjede opløsning yderligere til praktisk taget fuldstændig ødelæggelse af eventuelt resterende eller overskydende hydrogenperoxid i opløsningen, idet der anvendes et passende middel, der ikke inaktive-rer den mikrobielle osteløbe. Resterende hydrogenperoxid kan nedbrydes ved brug af et materiale udvalgt fra en gruppe bestående af katalase, 35 såsom okseleverkatafase, peroxidase såsom peberrodperoxidase, ascorbin-syre og lignende. Disse hydrogenperoxidnedbrydende midler kan anvendes effektivt under de forhold, der almindeligvis anvendes til hydrogenperoxidbehandlingen. I praksis bestemmes den mængde hydrogenperoxid, der resterer i opløsningen efter behandling, med et passende detektions- 146513 5 middel, således som det er velkendt i osteindustrien, f.eks. natrium-iodidtitrering. En passende mængde af det hydrogenperoxidnedbrydende middel tilsættes derpå til opløsningen af mikrobiel osteløbe, og restmængder af hydrogenperoxidet kontrolleres med detektionsmidlet, indtil 5 hydrogenperoxidet er i alt væsentligt nedbrudt. Okseleverkatalase er et foretrukket middel og er effektivt til i alt væsentligt at nedsætte hydrogenperoxidet til det ønskede niveau under de ovennævnte foretrukne forhold i løbet af et tidsrum på fra ca. 1 til 3 timer.

Den termiske stabilitet af den hydrogenperoxidbehandlede mikrobielle 10 osteløbe bestemmes ved de forhold, der normalt anvendes til pasteurisering af osteval leopløsninger. Følgende model er egnet til reproducering af disse pasteuriseringsbetingelser. En én (1) ml prøve af den osteløbe-holdige opløsning fortyndes til 100 ml med en natriumphosphatpuffer (pH 5,5 til 6,0). Prøver (2 til 3 ml) af denne fortyndede opløsning 15 anbringes derpå i forseglede glasrør og opvarmes i vandbad til en temperatur på fra 60°C til 71°C i tidsrum på fra 0 til 20 minutter. De opvarmede prøver afkøles og prøves derpå for mælkesammenløbnings-aktivitet. Ved disse modelpasteuriseringsbetingelser er restaktiviteten af den osteløbe, der findes i ostevalle efter varmebehandlingen, nedsat til 20 et ønsket restmælkesammenløbningsaktivitetsniveau på i det mindste under ca. 20% af den oprindelige mælkesammenløbninsaktivitet inden varmebehandlingen. Under anvendelse af de foretrukne betingelser ifølge opfindelsen er de hydrogenperoxidbehandlede mikrobielle osteløbere fundet at være lige så termisk labile som kalveosteløbe, når osteløberne 25 udsættes for ens termiske betingelser.

Den mikrobielle osteløbe tilvejebragt ifølge denne fremgangsmåde er egnet ved alle traditionelle ostefremstillingsprocesser, til hvilke der nu anvendes mikrobiel osteløbe som mælkekoagulator. Eftersom den hidtil ukendte peroxidbehandlede mikrobielle osteløbe er væsentligt mindre 30 termisk stabil end den ubehandlede mikrobielle osteløbe, kan den fungere som en rimelig erstatning for selv kalveosteløbe. Anvendt ved disse ostefremstiilingsprocesser inaktiveres den behandlede mikrobielle osteløbe ifølge opfindelsen fortrinsvis ved de almindelige betingelser, der anvendes til pasteurisering af ostevallen, og i den resulterende valle 35 kan det værdifulde valleprotein til fulde udnyttes.

De følgende eksempler er illustrative for det opfindelsesmæssige begreb.

146513 6 EKSEMPEL 1

Dette eksempel belyser en typisk behandling af forskellige mikrobielle Mucor-osteløbere under anvendelse af hydrogenperoxid.

Vandige gæringssupper af mikrobiel osteløbe fra Mucor mlehei (pH 5 4,5) indeholdende 49.800 SU/ml og Mucor pusillus (pH 5,5) indeholden de 49.800 SU/ml tilvejebragtes fra kommercielle kilder. Prøver (1.000 ml) af de vandige supper afkøledes til 4°C, og pH-værdien blev indstillet på pH 7,0 ved tilsætning af 20% (W/V) vandig natriumhydroxid. Til hver prøve tilsattes derpå 100 ml 30% (V/V) hydrogenperoxid (analyserea-10 genskvalitet). Dette svarer til en koncentration pi ca. 3% (V/V) hydrogenperoxid baseret på det oprindelige volumen af den vandige suppe.

Disse prøver fik lov til at stå i 24 timer ved 4°C i kontakt med hydro-genperoxidet. Okseleverkatalase [0,3 ml, 100 Keil-enheder (KU: Keil Units) pr. 1 ml. 1 KU dekomponerer 1,0 g Η,^/ΙΟ min. ved 25°C ved 15 pH 7,0] tilsattes derpå til opløsningerne til nedbrydning af eventuelt overskydende hydrogenperoxid, og blandingen fik lov til at stå (ca. 2 til 3 timer) ved stuetemperatur indtil en negativ peroxidtest opnåedes. Opløsningernes pH-værdier tilbagejusteredes til de oprindelige pH-vær-dier med 12N HCI og opløsningerne koncentreredes til det oprindelige 20 volumen på 1.000 ml ved lyn-fordampning.

Den mikrobielle osteløbes mælkesammenløbningsaktivitet bestemtes på 10% skummetmælksopløsninger indeholdende 0,01 M CaClg indstillet på ca. pH 6,5 med mælkesyre. Fem ml mælk blev inkuberet ved 37°C med 0,5 ml enzymopløsningsprøve. Det til fremkomsten af sammenløbningen 25 nødvendige tidsrum måltes. Enzymaktiviteten udtryktes i Soxhlet-sammen-løbningsenheder (SU). Hydrogenperoxidbehandlingen af mikrobiel Mucor miehei-osteløbe resulterede i den fuldstændige bevarelse af mælkesammen-løbningsaktiviteten, mens hydrogenperoxidbehandlingen af mikrobiel Mucor pusillus-osteløbe resulterede i bevarelse af 80 til 90% af mælke-30 sammenløbningsaktiviteten.

Til bestemmelse af de hydrogenperoxidbehandlede enzymers termiske stabilitet blev prøver (1 ml) af de ubehandlede og de behandlede osteløber fortyndet til 100 ml med 0,2 M natriumphosphatpuffer (pH 5,5).

Prøver (2 ml) af disse fortyndede opløsninger, som repræsenterer en 35 overskydende mængde osteløbe tilstede i ostevalle, anbragtes i skruelågs-reagensglas og opvarmédes i vandbad ved 60° til 70°C i forskellige tidsrum. Efter varmebehandlingen afkøledes prøverne ved neddykning i et is-vand-bad og prøvedes for resterende mælkesammenløbningsaktivite-ter (milk clotting (MC) activities) ved den fremgangsmåde, der er 146513 7 beskrevet i det foregående. Resul taterne af disse undersøgelser er angivet i tabel A nedenfor.

TABEL A

% RESTERENDE

5 PASTEURISERINGS- MC-AKTIVITET

BETINGELSER EFTER

PRØVE T°C TID (MIN.) PASTEURISERING

M. pusillus (naturlig) 60 0 100 4 95 10 8 90 lu 12 89 16 87 20 82 M. pusillus (H?0?- 60 0 100 behandlet) d 4 34 8 18 15 12 11 16 6,9 20 M. miehei (naturlig) 70 0 100 4 94 8 79 20 12 72 dU 16 66 20 61 M. miehei (H_0_- 70 0 100 behandlet/ 4 19 8 5,2 12 2,0 25 16 20

Ovenstående data viser klart, at hydrogenperoxidbehandlingen er effektiv til at nedsætte enzymets varmestabilitet udtrykt ved dets mælke-sammenløbningsaktivitet i sammenligning med det naturlige (ubehandlede) 30 enzym drastisk.

EKSEMPEL 2

Dette eksempel belyser effekterne af pH på mælkesammenløbningsakti-viteten og den termiske stabilitet af mikrobioel osteløbe behandlet ved denne proces.

35 Ti ml prøver af en vandig suppe af mikrobiel osteløbe fra Mucor miehei (pH 4,5) indeholdende 49.800 SU/ml blev indstillet på forskellige pH-værdier mellem pH 4,5 og 7,5 under anvendelse af 20% (W/V) vandig natriumhydroxid. Hver prøve blev behandlet med 0,6 ml 30% (V/V) hy-drogenperoxid (svarende til 1,8% (V/V) HgOg baseret på det oprindelige 146513 8 volumen). En ubehandlet prøve fungerede som kontrol. Alle prøver blev opbevaret ved 4°C f 24 timer og derpå behandlet med 5 ml 20% (W/V) vandig ascorbinsyre (til dekomponering af eventuelt H^C^) og opbevaret ved 4°C i 48 timer. Hver blanding blev fortyndet 100 gange med 0,2 M 5 natriumphosphatpuffer (pH 5,5). IVIælkesammenløbningsaktiviteterne (MC-aktiviteterne) blev bestemt under anvendelse af den fremgangsmåde, der er beskrevet i eksempel 1. Disse resultater er anført i tabel B nedenfor.

TABEL B

10

BEHANDLINGS-pH % AF OPRINDELIG MC-AKTIVITET

4.5 (kontrol) 100 4,5 5,1 89 5.8 92 15 6,3 94 6.9 97 7.5 100

Tallene i tabel B viser klart, at den foreliggende proces ikke pi-20 virker mælkesammenløbningsaktiviteten af den behandlede mikrobielle osteløbe ugunstigt selv over det brede pH-interval fra 4,5 til 7,5.

Den termiske stabilitet af den behandlede mikrobielle osteløbe blev bestemt under anvendelse af den pasteuriseringsprocedure, der er beskrevet i eksempel 1. Mælkesammenløbningsaktiviteterne blev milt efter 25 pasteurisering og opgivet som en procentdel af den oprindelige aktivitet inden pasteurisering. Resultaterne er refereret i tabel C nedenfor.

TABEL C

146513 9

PASTEURISERINGSTID % RESTERENDE BEHANDLINGS-pH MINUTTER VED 70 C MC-AKTIVITET

5 “ — 4.5 (kontrol) 0 100 4 93 8 84 12 72 4.5 0 100 10 4 39 10 8 12,4 12 5,6 6,3 0 100 4 37,6 8 13 12 4,4 15 7.5 0 100 4 10,7 8 2,6 12 20 Resultaterne i tabel C viser, at prøverne behandlet med hydrogen- peroxid over pH-intervallet fra 4,5 til 7,5 er væsentligt mere varmela-bile end den ubehandlede kontrolprøve.

EKSEMPEL 3 25 Dette eksempel belyser kontakttidens effekter på mælkesammenløb' ningsaktiviteten og den termiske stabilitet af mikrobiel osteløbe behan-diet ved denne proces.

En 200 ml portion af en vandig opløsning af mikrobiel Mucor miehei-osteløbe indeholdende 49.800 SU/ml blev indstillet på pH 7,0 med 20% 30 (W/V) vandig natriumhydroxid afkølet til 4°C og 20 ml 30% (V/V) hydro- genperoxid (svarende til 3% (V/V) H202 baseret på det oprindelige volumen) blev tilsat til opløsningen. Denne blanding blev holdt ved 4°C i adskillige dage, i løbet af hvilket tidsrum der fjernedes prøver (1 ml), derpå behandlet med okseleverkatalase (0,01 ml, 100 KU/ml) og yderli-35 gere fortyndet 100 gange med 0,2 M natriumphosphatpuffer (pH 5,5). Mælkesammenløbningsaktiviterne (MC-aktiviteterne) blev bestemt under anvendelse af den fremgangsmåde, der er beskrevet i eksempel 1. Disse resultater er angivet i tabel D nedenfor.

146513

TABEL D

ίο

KONTAKTTID (TIMER) % AF OPRINDELIG MC-AKTIVITET

0 100 5 17 103 26 108 41 105 50 113 65 101 73 113 136 111 10

Tallene i tabel D viser, at denne proces snarere forbedrer end påvirker den behandlede mikrobielle osteløbes mælkesammenløbningsaktivi-tet ugunstigt, endog over længere kontakttider.

Den termiske stabilitet af udvalgte prøver af den behandlede 15 mikrobielle osteløbe blev bestemt under anvendelse af den pasturiserings-procedure, der er beskrevet i eksempel 1. Mælkesammenløbningsaktiviteterne (MC-aktiviteterne) blev målt efter pasteurisering og rapporteret som en procentdel af den oprindelige MC-aktivitet i prøven inden pasteurisering. Resultaterne er anført i tabel E nedenfor.

20

TABEL E

KONTAKTTID PASTEURISERINGSTID % RESTERENDE

25 TIMER MINUTTER VED 70°C MC-AKTIVITET

0 0 100 4 94 8 79 12 72 30 26 0 100 4 19 8 5,2 12 2 73 0 100 4 9,6 35 8 3,2 12 136 0 100 4 6,6 8 1,6 12 146513 11

Tallene i tabel E viser, at de prøver, som er behandlet med hydro-genperoxid over et bredt interval af kontakttider er væsentligt mere var-melabile end en ubehandlet kontrol.

5 EKSEMPEL 4

Dette eksempel belyser hydrogenperoxidkoncentrationens effekter pi mælkesammenløbningsaktiviteten og på den termiske stabilitet af mikrobiel osteløbe behandlet ved denne proces.

En 250 ml portion af en vandig opløsning af mikrobiel Mucor miehei-10 osteløbe indeholdende 99.600 SU/ml blev indstillet på pH 7,0 med 20% (W/V) vandig natriumhydroxid. Ti ml prøver fjernedes, og der tilsattes forskellige mængder hydrogenperoxid (30% V/V) liggende fra 3% (V/V) til 9% (V/V) baseret P® det oprindelige volumen. Hver prøve blev derpå opbevaret ved 4°C i 77 timer. Der tilsattes tilstrækkelig okselever--)5 katalase (0,1 ml, 100 KU/ml) til at nedbryde hydrogenperoxidet i prøven.

Derpå blev hver prøve fortyndet 100 gange med 0,2 M phosphatpuffer (pH 5,5). Mælkesammenløbningsaktiviteterne (MC-aktiviteterne) blev bestemt under anvendelse af den fremgangsmåde, der er beskrevet i eksempel 1. Disse resultater er rapporteret i tabel F nedenfor.

20

TABEL F

H O -KONCENTRATION % AF OPRINDELIG

ά ά % V/V MC-AKTIVITET

25 0 100 3.0 91 4.2 91 5.4 96 6.0 97 7.2 97 8.4 93 9.0 93 30

Tallene i tabel F viser, at denne proces ikke påvirker den behandlede mikrobielle osteløbes mælkesammenløbningsaktivitet ugunstigt, selv over et interval af HgO^-koncentrationer.

Den termiske stabilitet af udvalgte prøver af de behandlede prøver 35 blev bestemt under anvendelse af den pastauriseringsprocedure (ved 65°C), som er beskrevet i eksempel 1. Mælkesammenløbningsaktiviterne blev målt efter pasteurisering og rapporteret som en procentdel af den oprindelige MC-aktivitet i prøven inden pasteurisering. Resultaterne er rapporteret i tabel G nedenfor.

TABEL G

146513 12

H O -KONCENTRATION PASTEURISERINGSTID % RESTERENDE

% V/V MINUTTER VED 65°C MC-AKTIVITET

5 - 0 0 100 8 100 3 0 100 8 21 6 0 100 8 10 10 9 0 100 8 4

Tallene i tabel G viser, at de prøver, der er behandlet med hydro-genperoxid over et interval af HgOg-koncentrationer, er væsentligt mere 15 varmelabile end en ubehandlet kontrol.

EKSEMPEL 5

Dette eksempel belyser anvendelsen af hydrogenperoxid tilvejebragt in situ på den termiske stabilitet af mikrobiel osteløbe behandlet ved 20 denne proces.

Renset mikrobiel osteløbe (500 mg) fra Mucor miehei blev opløst i 100 ml 1,0 N natriumacetatpuffer (pH 4,5). Denne vandige opløsning af enzymet indeholdt ca. 9.960 SU/ml. En ti ml prøve af denne opløsning blev fjernet og 500 mg calciumperoxid tilsattes dertil. Denne mængde 25 calciumperoxid var ved kontakt med tilstedeværende vand tilstrækkelig til at tilvejebringe hydrogenperoxid in situ svarende til ca. 2,35% H^O^ (V/V) baseret på det oprindelige volumen. Prøven blev opbevaret ved ca. 20°C i ca. 15 til 18 timer ved pH 4,5. For at nedbryde overskydende hydrogenperoxid blev der derpå tilsat okseleverkatalase (0,1 ml; 100 30 KU/ ml). Prøven fortyndedes 20 gange med 0,2 M natriumphosphatpuffer (pH 5,5), og de termiske stabiliteter af den behandlede prøve og den ubehandlede kontrol blev bestemt under anvendelse af den pasteuriseringsprocedure (ved 60°C), som er beskrevet i eksempel 1. Mælkesammen-løbningsaktiviteterne (MC-aktiviteterne) blev målt inden og efter pasteuri-35 sering, og værdierne rapporteret som en procentdel af den oprindelige MC-aktivitet. Resultaterne er anført i tabel H nedenfor.

TABEL Η 146513 13

Ca02 %H2°2 PASTEURISERING % RESTERENDE

(mg) (V/V) TID (MIN) VED 60°C MC-AKTIVITET

5_____ 00 0 100 8 97 16 97 20 94 500 2,35 0 100 8 37 10 16 23 20 21

Tallene i tabel H viser klart, at det hydrogeperoxid, der er tilvejebragt in situ ved denne proces, er effektivt til væsentligt at nedsætte 18 den termiske stabilitet af den behandlede mikrobielle osteiøbe sammenlignet med den ubehandlede kontrol.

EKSEMPEL 6

Dette eksempel belyser anvendelsen af den mikrobielle osteløbe be- ?0 handlet ved denne proces til fremstilling af ost.

Cheddar-ostecharger blev fremstillet under anvendelse af en konventionel fremgangsmåde ud fra 196 kg pasteuriseret sødmælk og 1% kommerciel starter-kultur. En kontrolbeholder blev koaguleret med 22,5 ml ubehandlet mikrobiel Mucor miehei-osteløbe indeholdende ca. 93.000 SU/ pc ml. En testbeholder blev koaguleret med 26,5 ml mikrobiel Mucor miehei-osteløbe, som var behandlet som beskrevet i eksempel 4 med 3% (V/V) hydrogenperoxid og som indeholdt ca. 79.000 SU/ml. De respektive tider for mælkesammenløbningsdannelse blev målt og blev bestemt til at være ækvivalente. Efter ostefremstillingen blev vallevæskerne samlet, indstillet til pH 6,1 med natriumhydroxid og analyseret for resterende enzymaktivitet inden og efter flash-pasteurisering. Enzymaktiviterne er sammenlignet i tabel I nedenfor som en procentdel af de oprindelige MC-aktiviteter i vallen.

TABEL I

146513 14

% AF OPRINDELIG

5 PASTEURISERINGS- MC-AKTIVITET

PRØVE BETINGELSER I VALLEN

Ubehandlet kontrol Ingen 100 63°C i 20 sek. 99 63°C i 30 sek. 100

HgO^-behandlet Ingen 100 63°C i 5 sek. 30 63°C i 10 sek. 30 63°C i 15 sek. 26 15 63°C i 20 sek. 23

Tallene ovenfor viser klart, at den HgOg-behandlede mikrobielle osteløbe er lige si effektiv som den naturlige mikrobielle osteløbe til at tilvejebringe ost, men at den H00„-behandlede osteløbe er meget mere 20 2 2 varmelabil end den naturlige osteløbe.

De oste, der fremstilledes ovenfor, lagredes ved 7°C i 30 dage og blev sammenlignet med hinanden af et øvet smagspanel. Den ost, der var fremstillet med H.,02-behandlet osteløbe, blev godt modtaget og fundet at være ønskeligt lig den ost, som var fremstillet med ubehandlet 25 naturlig osteløbe, med hensyn til aroma og konsistens.

EKSEMPEL 7

Dette eksempel sammenligner varmestabiliteterne af kalveosteløbe og mikrobiel osteløbe behandlet ved denne proces.

30

Mikrobiel Mucor miehei-osteløbe indeholdende 99.600 SU/ml blev behandlet med 3% (V/V) som beskrevet i eksempel 4, og dens termis ke stabilitet blev sammenlignet med den naturlige mikrobielle osteløbe inden behandling og med kalveosteløbe indeholdende ca. 49.800 SU/ml under anvendelse af den pasteuriseringsprocedure (ved 60°C), som er be-35 skrevet i eksempel 1. Mælkesammenløbningsaktiviteterne (MC-aktiviteterne) måltes efter pasteurisering og rapporteredes som en procentdel af den oprindelige MC-aktivitet i prøven inden pasteurisering. Resultaterne er anført i tabel J nedenfor.

TABEL J

146513 15

PASTEURISERINGSTID % RESTERENDE

PRØVE MINUTTER VED 60°C MC-AKTIVITET

5

Mikrobiel osteløbe (ubehandlet) 0 100 8 98 20 98

Mikrobiel osteløbe 10 (H O -behandlet) 0 100 8 60 20 38

Kalveosteløbe 0 100 8 72 20 55 15 Tallene i tabel J viser klart, at den foreliggende proces er effektiv til at reducere mikrobiel osteløbes varmestabilitet til ca. varmestabiliteten af kalveosteløbe.