DE2901542A1

DE2901542A1 - Verfahren zur herabsetzung der thermischen stabilitaet von mikrobiellem rennin

Info

Publication number: DE2901542A1
Application number: DE19792901542
Authority: DE
Inventors: Dennis Alfred Cornelius
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer CropScience Inc USA
Priority date: 1978-05-22
Filing date: 1979-01-16
Publication date: 1979-11-29
Also published as: AU515019B2; IT7948342A0; JPS557092A; GB2024828A; NL176478C; NL7900315A; NL176478B; DK146513C; IT1114500B; MX6268E; DK146513B; FR2426696A1; FR2426696B1; DK95379A; DE2901542C2; DE2901542B1; GB2024828B; AR216570A1; AU4723679A; JPS5712598B2

Description

PATHNTAKWÄLTJ3 Ä 5? U I 0 *»

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-19/6) · DIPU-I NG. W. EITLE ■ DR. RER. NAT. Κ.ΉΟ FFMAN N · DIPL.-ING: W. LEH N

DIPL.-ING. K. FDCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN
ARABELLASTRASSE 4 (STERN HAUS) · D-80C0 MD N C H EN 81 · TELEFO N (059) 911007 ■ TELEX 05-2?äl? (PATH F.)

31 610 m/v/a

MILES LABORATORIES INC., ELKHART, INDIANA / USA

Verfahren zur Herabsetzung der thermischen Stabilität von mikrobiellem Rennin

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herabsetzung der
Wärmestabilität von mikrobiellem Mucor-Rennin, sowie die Verwendung des auf diese Weise behandelten mikrobiellen Rennins bei der Käsebereitung.

Seit Jahrhunderten wird Kälber-Rennin als milchkoagulierendes Mittel bei der Herstellung von sämtlichen Käsearten verwendet. In der Tat bilden Käse, die mit diesem Enzym hergestellt worden sind, einen Standard hinsichtlich Geschmack,

Aussehen und Textur beim Vergleich" mit Käseprodukten, die mit Hilfe anderer koagulierender Mittel hergestellt worden sind. In letzter Zeit haben die dramatische Zunahme der Käseproduktion in der Welt und die Abnahme an verfügbarem Kälber-Rennin die Verwendung alternativer milchkoagulierender Enzyme stimu- . liert.

Unter den für diesen Zweck geeigneten Enzymen werden die mikrobiellen Rennine bevorzugt, da diese in grosser Menge produziert werden können und eine Vielzahl von Eigenschaften aufweisen, die es erlauben, die am meisten für die Käseproduktion geeigneten auszuwählen. Die erhöhte Wärmestabilität der mikrobiellen Rennine, wie z.B. der mikrobiellen Mucor-Rennine, insbesondere im Vergleich zu Kälber-Rennin wurde als wenig erwünschte Eigenschaft dieser Enzyme angesehen.

Bei der Käseherstellung wird die Molke, die sich von dem renninkoagulierten Milchklumpen (curd) trennt, als eine wertvolle Quelle für Molkeproteine gesammelt. In der Regel wird diese gesammelte Molke bei einer Temperatur von etwa 60 C bis 71⁰C solange pasteurisiert, bis sämtliche Mikroorganismen zerstört und mindestens etwa 80 bis 90 % des restlichen Renninkoagulierungsmittels thermisch inaktiviert sind. Es wurde gefunden, dass ein Restgehalt an koaguiierendem Enzym, der wesentlich mehr als etwa 20 % der ursprünglichen milchgerinnendon Aktivität nach dor normalen Par.teurisiorung aufweist, in unerwünschter Weise die wertvollen Molkeproteine hydrolysiert und die Verwendung der Molke als ein Bestandteil in verschiedenen Nahrungsprodukten begrenzt. Die normalen Pasteurisierungsbedingungen, die so mild gewählt werden, dass sie die Molkeproteine nicht nachteilig beeinflussen, die jedoch hart genug sind, um das Kälber-Rennin thermisch zu inaktivieren, inaktivieren das mikrobielle Renninkoagulanz auf das

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gewünschte Mass nur langsam. Dieses Problem wird im weiteren dadurch noch kompliziert, dass sich mehr mikrobielles Rennin in der Molke ansammelt als Kälber-rennin. Daraus ergab sich der ständige Versuch, die Wärmelabilität der mikrobiellen Rennine zu verstärken.

Es wurden mehrere mikrobiologische Versuche unternommen, um mikrobielle Koagulierungsmittel mit grösserer Wärmelabilität zu erhalten. Diese Versuche umfassen die ausgedehnte Untersuchung und Auswertung neuer Mikroorganismen und Mutationen bekannter renninproduzierender Mikroorganismen. Bis heute führte jedoch keiner dieser Versuche zum Erhalt eines annehmbaren Koagulierungsmittels mit den gewünschten Wärmeeigenschaften zum Erfolg.

Äusserdem wurden chemische Versuche zur Modifizierung verschiedener Enzymeigenschaften durchgeführt, doch sind diese in der Regel stark begrenzt, da sie einen gleichzeitigen Verlust der milchgerinnonden Aktivität des Enzymes mit sich führen. Neuere Untersuchungen bei der Bestimmung der strukturellen und funktioneIlen Determinanten eines mikrobiellen Mucorrennins haben jedoch gezeigt, dass einige chemische Modifikationen von mikrobiellem Rennin möglicherweise nicht zu einem totalen Verlust der milchgerinnenden Wirkung führen. Derartige Modifikationen umfassen die Nitrierung (Biochemica et Biophysica Acta, 371 (1974), Seite 368), Carbamylierung (ibid., 271 (1972), Seite 93) und Perjodat-induzierte Deglycosylierung (ibid., 328 (1973), Seite 52) des Glycoenzyms von mikrobiellem Mucor-Rennin.' Diese Modifikationen weisen darauf hin. dass eine durch Carbamylierung und Perjodat induzierte Deglycosylierung eine in gewissem Masse erhöhte thermische Labilität verleihen kann. Diese chemischen Versiiche zeigten sich jedoch bei der Herstellung eines mikrobiellen

Rennins mit dem gewünschten Grad an thermischer Labilität nicht in vollem Masse erfolgreich.

Es besteht daher ein grosser Bedarf nach einem mikrobiellen Rennin mit den gewünschten milchkoagulierenden Eigenschaften, jedoch mit einer im wesentliehen herabgesetzten thermischen Labilität.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herabsetzung der thermischen Stabilität von mikrobiellem Mucor-Rennin zur Verfügung zu stellen.

Die vorstehende Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass mikrobielles Mucor-Rennin in wässriger Lösung mit Wasserstoffperoxid unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die geeignet sind, die Wärmestabilität des Enzyms weitgehend herabzusetzen.

Die wärmestabilen mikrobiellen Renniiie, die nach dem erfindungsgemässen Verfahren am wirksamsten behandelt werden können, werden nach bekannten Verfahren aus'Mucor-Mikroorganismen hergestellt und sind in wässriger Lösung im Handel erhältlich. Diese Rennine umfassen diejenigen, die aus Mucormiehei, Mucor-pusillus und dergleichen hergestellt werden. Die nativen koagulierenden Enzyme, die aus diesen Quellen isoliert werden, sind dafür bekannt, dass sie in grösserem Masse wärmestabil sind als Kälber-Rennin. Das erfindungsgemasse Verfahren kann auf reine, teilweise reine oder sogar auf sehr rohe Fermentationsflüssigkeiten von mikrobiellem Rennin angewandt werden.

Das bei dem Verfahren gemäss der Erfindung verwendete Wasserstoffperoxid ist im Handel erhältlich oder kann nach bekannten

Methoden in situ gebildet werden. Zum Beispiel ist es bekannt, dass anorganische und organische Peroxide in Kontakt mit Wasser Wasserstoffperoxid bilden. Es kann jedes geeignete wasserstoffbildende Mittel, welches das behandelte Rennin nicht nachteilig inaktiviert, gewählt werden, einschliesslich Natriumperoxid, Kalziumperoxid, Benzoylhydroperoxid, ein Gemisch aus Cumolhydroperoxid und Peroxidase, Harnstoffhydrogenperoxid und dergleichen. Die anorganischen Peroxide sind dabei bevorzugt.

Nach einer praktischen Ausführungsform gemäss der Erfindung wird eine wässrige Lösung des oben genannten thermisch stabilen mikrobiellen Rennins mit Wasserstoffperoxid unter.Bedingungen in Kontakt gebracht, welche zu einer merklichen Abnahme der Wärmestabilität des Rennins (d.h. zu einer Zunahme der Wärmelabilität) führen _e vorzugsweise auf mindestens 20 % seiner ursprünglichen Stabilität, ausgedrückt als restliche miIchgerinnende Aktivität nach der Wärmebehandlung; besonders bevorzugt ist es, die Wärmestabilität auf mindestens den Wert zu reduzieren, den Kälber-Rennin aufweist» Die auf diese Weise behandelte Lösung von mikrobiellem Rennin kann in der vorliegenden Porra verwendet werden, sie kann konzentriert, oder weiter gereinigt werden, wie dies bei dem spezieilen Käseherstellungsverfahren erforderlich ist.

Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass das im vorstehenden genannte Verfahren in Chargen oder als kontinuierliches Verfahren durchgeführt werden kann und dass die Bedingungen des Wasserstoffperoxidkontaktes, d.h. die Konzentration der Materialien, der pH-Wert, die Temperatur und die Kontaktzeit, je nach der Wärmestabilität des nativen mikrobiellen Rennins, der Art des Verfahrens und der'gewählten Ausrüstung in einem weiten Bereich variieren kann. Es sollten jedoch die Bedingungen

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so gewählt v/erden, dass diese die ursprüngliche milchgerinnen.-de Aktivität des mikrobiellen Rennins nicht nachteilig beeinflussen.

Die Konzentration des mikrobiellen Rennins in der wässrigen Lösung wird auf einfache Weise in Form ihrer milchgerinnenden enzymatischen Aktivität, d.h. in Soxhlet--Einheiten (SU) pro Milliliter, wie dies in dem Verfahren in J. of Dairy Science, Band 54, Nr. 2, Seiten 159 bis 167 (1971) beschrieben und auf das hier Bezug genommen wird. Die milchgerinnende Aktivität wird in" einer 10 %-igen Lösung von Magermilch bei pH 6,45 bis 6,50, welche 0,01M CaCl₂ enthält, bestimmt. 5 ml der Milch werden bei 37°C + 0,5 mit 0,5 ml Enzymlösung inkubiert. Es wird die Zeit bestimmt, die bis zum Erscheinen des Milchklumpen (clot)erforderlich ist. Eine Soxhlet-Einheit ist als diejenige Enzymaktivität definiert, eiche 1 ml eines Milchsubstrates in 40 Minuten unter den Bedingungen des Testverfahrens zum Gerinnen bringt. In der Praxis wird die milchgerinnende Aktivität der wässrigen Lösung von mikrobiellem Rennin vorteilhafterweise von etwa 10.000 SU/ml bis etwa 100.000 SU/ml variieren.

Die für die Behandlung der wässrigen Lösung von mikrobiellem Rennin erforderlichen Mengen an Wasserstoffperoxid richten sich nach der Aktivität des Enzyms, der ursprünglichen Wärme-Stabilität und der Reinheit. Die Konzentration des Wasserstoffperoxids in der wässrigen Lösung variiert zwischen etwa 1 % und 25 % VJasserstoffperoxid auf einer Volumen/Volumen-Basis (V/V), bezogen auf das ursprüngliche Volumen der wässrigen Lösung. Vorzugsweise liegt die Menge zwischen 3 % und 10 % (V/V), bezogen auf das ursprüngliche Volumen. Bei Konzentrationen, die wesentlich über 25 %(V/V) liegen, wird der Vorteil asymptotisch, während bei Konzentrationen, die wesentlich unter

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etwa 1 % (V/V) liegen, die Reaktionsgeschwindigkeit in ungebührendem Masse langsam wird.

Die Temperatur für den Wasserstoffperoxidkontakt variiert zwischen etwa 4 und 30 C. Vorzugsweise liegt die Temperatur zwischen etwa 4 und 20°C Bei Temperaturen, die wesentlich über 30⁰C liegen, verliert das Enzym an Aktivität, was nicht gewünscht wird, und bei Temperaturen, die wesentlich unter etv/a 4 C liegen, wird di<
bührendem Masse langsam.

etv/a 4 C liegen, wird die Reaktionsgeschwindigkeit in unge-

Der pH-Wert für die Wasserstoffperoxidbehandlung liegt vorteilhafterweise zwischen etv/a 4,0 und 8,0. Bei pH-Werten, die wesentlich über etwa pH 8,0 liegen, wird das Enzym inaktiviert, was unerwünscht ist, und bei pH-Werten, die wesentlich unter pH 4 liegen, nimmt die Löslichkeit des Enzymes ab und die Reaktionszeit zu.

Die Kontaktzeit ist eine Punktion der speziell gewählten Kontaktbedingur ^ren; sie sollte jedoch ausreichend lange sein, um die Wärraestabilitüt des mikrobiellen Rennins auf das gewünschte Mass merklich zu reduzieren. Unter bevorzugten Bedingungen haben sich Kontaktzeiten zwischen etwa 15 und 72 Stunden als besonders günstig erwiesen.

Nach einem bevorzugten Ausführungsbeispiel gemäss der Erfindung wird die wasserstoffperoxidbehandelte Lösung weiter behandelt, um im wesentlichen das restliche oder überschüssige Wasserstoffperoxid in der Lösung zu zerstören, wobei geeignete Mittel angewandt werden, welche das mikrobielle Rennin nicht inaktivieren. Das restliche Wasserstoffperoxid kann mit Hilfe von Catalase, wie Catalase-aus Rinderleber, Peroxidase, wie Peroxidase aus Meerrettich, Ascorbinsäure und dergleichen

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zersetzt werden. Diese Mittel zum Zersetzen des Wasserstoff peroxides können unter den für die Wasserstoffperoxidbehandlung vorliegenden Bedingungen angewandt werden. In der Praxis wird die Menge des restlichen Wasserstoffperoxides in der Lösung nach der Behandlung durch irgendeinen geeigneten Nachw.eis, wie sie dem Fachmann in der Käseherstellung bekannt sind, bestimmt, z.B. durch Natriumjodidtitration. Daraufhin wird eine geeignete Menge des Mittels zum Zersetzen des Wasserstoffperoxids zu der mikrobiellen Renninlösung zugegeben und die restlichen Mengen an Wasserstoffperoxid werden mit Hilfe, eines Nachweises kontrolliert, bis das Wasserstoffperoxid im wesentlichen zersetzt ist. Catalase aus Rinderleber ist ein bevorzugtes Mittel und eignet sich besonders dazu, das Wasserstoffperoxid auf das gewünschte Niveau herabzusetzen, wobei die vorstehend genannten bevorzugten Bedingungen und eine Zeitdauer von etwa 1 bis 3 Stunden angewandt werden.

Die Wärmestabilität des mit Wasserstoffperoxid behandelten mikrobiellen Rennins wird unter Bedingungen bestimmt, die normalerweise angewandt werden, um Käsemolkelösungen zu pasteurisieren. Das folgende Modell ist dazu geeignet, diese Pasteuerisierungsbedingungen zu reproduzieren. Ein aliquoter Teil von 1 ml der renninhaltigen Lösung wird mit Natriamphosphatpuffer (pH 5,5 bis 6,0) auf 100 ml verdünnt. Aliquote Teile von 2 bis 3 ml dieser verdünnten Lösung werden dann in ein versiegeltes Reagenzglas gegeben und in einem Wasserbad auf eine Temperatur von 60°C bis 71 C für eine Zeitdauer von ü bis 2ü Minuten erwärmt. Die erwärmten proben werden abgekühlt und dann auf ihre milchgerinnende Aktivität untersucht. Unter diesen Modell-Pasteurisierungsbcdingungen nahm die restliche Aktivität des in der Käsemolke gefundenen Rennins nach der Wärmebehandlung auf die gewünschte restliche

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milchgerinnende Aktivität von mindestens unter etwa 20 % der ursprünglichen milchgerinnenden Aktivität vor der Wärmebehandlung ab. Bei Anwendung der bevorzugten Bedingungen gemäss der Erfindung wurde festgestellt, dass die mit Wasserstoffperoxid behandelten mikrobiellen Rennine ebenso wärmelabil sind wie Kälber-Rennin, wenn dieses den gleichen Bedingungen unterworfen wird.

Das gemäss der Erfindung behandelte mikrobielle Rennin eignet sich für alle traditionellen Käseherstellungsverfahren, welche nun mikrobielles Rennin als Milchkoagulierungsmittel verwenden. Da das neue, mit Wasserstoffperoxid behandelte mikrobielle Rennin in drastischer Weise weniger wärmestabil ist als das unbehandelte mikrobielle Rennin, kann ersteres als geeigneter Ersatz selbst für Kälber-Rennin dienen. Bei Verwendung im Käseherstellungsverfahren wird das behandelte mikrobielle Rennin gemäss der Erfindung unter normalen Bedingungen, wie sie zum Pasteurisieren von Käsemolke angewandt werden, in gewünschter Weise inaktiviert und die sich ergebende Molk'-' kann in vollem Umfang zur Gewinnung bzw. Ausnutzung der wertvollen Molkeproteine verwendet v/erden.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne den Umfang derselben zu beschränken.

Beispiel 1

Dieses Beispiel zeigt eine typische Behandlungsmethode verschiedener mikrobieller Mucor-Rennine unter Verwendung von Wasserstoffperoxid.

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Es wurden wässrige Fermentations-Kulturlösungen von mikrobiellem Rennin aus'Mucor-miehei (pH 4,5) mit 49.800 SU/ml und Mucor-pusillus (pH 5,5) mit 49.800 SU/ml^hergestellt. Proben von wässrigen Kulturflüssigkeiten (1000ml) wurden auf 4°C abgekühlt und der pH-Wert durch Zugabe von 20 % (W/V) wässrigem Natriumhydroxid auf pH 7,0 eingestellt. Zu jeder Probe wurden dann 100 ml 30 %-iges (V/V) Wasserstoffperoxid (analytisch rein) zugegeben. Dies entspricht einer Konzentration von etwa 3 % (V/V) Wasserstoffperoxid, bezogen auf das ursprüngliche Volumen der wässrigen Kulturflüscigkeit. Diese Proben wurden 24 Stunden bei 4°C im Kontakt mit Wasserstoffperoxid stehen gelassen. Dann wurde zu diesen Lösungen Catalase aus Rinderleber (0,3 ml), 100 Keil-Ein heiten (KU) pro 1 ml, 1 KU zersetzt 1,0 g H₂O₂/1O min be.i. 25°C und pH 7,0; zugegeben, um das überschüssige Wasserstoff peroxid zu zerstören und das Gemisch wurde (etwa 2 bis 3 Stunden) bei Raumtemperatur stehen gelassen, bis ein negativer Peroxidtest erhalten wurde. Die pH-Werte der Lösungen wurden wieder auf ihre ursprünglichen pH-Werte mit 12N HCl eingestellt und auf ihr ursprüngliches Volumen von 1000ml mittels Entspannungsverdampfung konzentriert.

s*-- Die milchgerinnende Wirkung des mikrobiellen Rennins wurde in 10 %-igen Lösungen von entrahmter Milch, welche 0,01M

enthielt, bestimmt und welche mit Milchsäure auf etwa

pH 6,5 eingestellt wurden. 5 ml Milch wurden bei 37 C mit 0,5 ml einer Probe der Enzymlösung inkubiert. Die bis zum Erscheinen des Gerinnungsproduktes bzw. Klumpens (clot) erforderliche Zeit wurde gemessen. Die Enzymaktivität wurde in Soxhlet-Gerinnungseinheiten (SU) ausgedrückt. Die Behandlung von mikrobiellem Rennin aus Mucor-miehei mit Wasserstoffperoxid ergab eine vollständige Beibehaltung der milchgerinnenden Aktivität, während die Behandlung von mikrobiellem

+'aus im Handel erhältlichen Materialien

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_. 15 —

Rennin aus Muoor-pusillus eine 80 bis 90 %-ige Erhaltung der milchgerirmenden Wirkung ergab.

Zur Bestimmung der Wärmestabilität der mit Wasserstoffperoxid behandelten'Enzyme wurden aliquote Teile (1 ml) der nativen und der behandelten Rennine mit 0,2M Natriumphosphatpuffer (pH 5,5) auf 100 ml verdünnt. Aliquote Teile (2 ml) dieser verdünnten Lösungen, welche einen überschüssigen Renningehalt, wie er in Käsemolke vorliegt, aufweisen, wurden in Reagenzgläser mit Schraubverschluss gegeben und in einem Wasserbad von 60 bis 70°C verschiedene Zeiten erwärmt. Nach der Wärmebehandlung wurden die Proben durch Eintauchen in ein Eis-Wasser-Bad gekühlt und auf ihre restliche milchgerinnende Wirkung nach der oben beschriebenen Methode untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der nachfolgenden Tabelle A zusammengefasst.

Tabelle A

Probe	Pasteurisierungs- beäingungen T⁰C Zei.t(min)	% restliche milchgerinnende j Aktivität nach der Pasteuri sierung
M. pusillus (nativ)	60 0	100
	4	95
	8	90
	12	89
	16	87
	20	82

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Fortsetzung Tabelle A

M. pusillus (H₃O₂- behandelt)	60 0 4	100 34
	8	'18
	12	11
	16	6,9
	20
M. miehei (nativ)	70 0	100
	4	94
	8	79
	12	72
	16	66
	20	61
M. miehei (H₉O₉- behandelt)	70 0 4	100 19
	8	5,2
	12	2,0
	16
	20	___

Die obigen Daten zeigen deutlich, dass die Behandlung mit Wasserstoffperoxid die Wärmestabilität der Enzyme drastisch reduziert, wie dies durch deren milchgerxnnende Wirkung im Vergleich zum nativen (unbehandeiten) Enzym ausgedrückt wird..

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Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt die Wirkung des pH-Wertes auf die milchgerinnendc Aktivität und die Wärmestabilität von mikrobiellem Rennin, welches nach dem genannten Verfahren behandelt wurde.

Aliquote Teile von 10 ml einer wässrigen Kulturflüssigkeit von mikrobiellem Rennin aus Mucor miehei (pH 4,5), welche 49.800 SU/ml enthielt, wurden auf verschiedene pH-Werte zwischen 4,5 und 7,5 unter Verwendung von 20 %-igem (W/V) wässrigem Natriumhydroxid eingestellt. Jede Probe wurde mit 0,6 ml 30 %-igem (V/V) Wasserstoffperoxid (entsprechend 1,8 % (V/V) H₂O₂, bezogen auf das Ausgangsvolumen) behandelt. Eine nicht-behandelte Probe diente als Kontrolle. Sämtliche Proben wurden 24 Stunden lang bei 4°C gelagert und dann mit 5 ml einer 20 %-igen (W/V) wässrigen Ascorbinsäure (zur Zersetzung von H-O₂) behandelt und 48 Stunden lang bei 4°C gelagert. Jedes Gemisch wurde mit 0,2M Natriumphosphatpuffer (pH 5,5) 100-fach verdünnt. Die milchgerinnende Wirkung wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle B zusammengestellt.

Tabelle B

Behandelt bei pH	% der urspri Aktivität
4,5 (Kontrolle
4,5
5,1
5,8
6,3
6,9
7,5	109848/US¹

ing"¹ ichen irn ι chger i nnend^n
100
94
89
92
94
97
100 1«

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Die in Tabelle B aufgeführten Daten zeigen deutlich, dass das gegenwärtige Verfahren die milchgerinnende Wirkung des behandelten mikrobiellen Rennins sogar über den breiten pH-Bereich von 4,5 bis 7,5 nicht nachteilig beeinflusst.

Die Wärmestabilität des behandelten mikrobiellen Rennins wurde mit Hilfe des Pasteurisierungsverfahrens, wie es in Beispiel 1 beschrieben wird, bestimmt. Die milchgerinnende Wirkung wurde nach dem Pasteurisieren bestimmt und in % der ursprünglichen Aktivität vor dem Pasteurisieren ausgedrückt. Die Daten sind in der nachfolgenden Tabelle C zusammengefasst.

Tabelle C

Behandlung bei pH ·	Pasteurisierungszeit Minuten bei 7O°C	% restliche milchgerinnen de Wirkung
4,5 (Kontrolle)	O	100
	4	93
	8	84
	12	72
4,5	O	100
	4	39
	8	12,4
	12	5,6

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Fortsetzung Tabelle C

6,3	O	100
	4	37,6
	8	13
	12	4,4
7,5	O	100
	4	10,7
	8	2,6
	12

Die Ergebnisse in Tabelle C zeigen, dass die mit Wasserstoffperoxid über einen pH-Bereich von 4,5 bis 7,5 behandelten Proben in drastischer Weise hitzelabiler sind als die unbehandelte Kontrollprobe.

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt den Einfluss der Kontaktzeit auf die milchgerinnende Aktivität und die Wärmestabilität von mikrobiellem Rennin, welches nach dem erfindungsgemässen Verfahren behandelt wurde. .

200 ml einer wässrigen Lösung von Mucor miebei mikrobiel lern Rennin, welche 49.800 SU/ml enthielt, wurde mit 20 %-igem (W/V) wässrigem Natriumhydroxid bei 4°C auf pH 7,0 eingestellt und 20 ml 30 %-iges (V/V) Wasserstoffperoxid (entsprechend 3 % (V/V) H2O₂, bezogen auf das Ausgangsvolumen) zu dieser Lösung zugegeben. Dieses Gemisch wurde mehrere Tage

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BAD ORIGfNAL

auf 4 C gehalten, wobei während dieser Zeit aliquote Teile . ( 1ml) entnommen wurden, welche mit Catalase aus Rinderleber (0,01 ml, 100 KU/itil) behandelt und weiter mit 0,2M Natriumphosphatpuffer (pH 5,5) 100-fach verdünnt wurden. Die milchgerinnende Wirkung wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle D aufgeführt.

Tabelle D

Kontaktzeit (Std.)	% der ursprünglichen milchgerinnenden Aktivität .
0	100
17 .	103
26	108
41	105
50	113
65	101
73	113
136	111

Die Ergebnisse in Tabelle D zeigen, dass durch dieses Verfahren die milchgerinnende Wirkung des behandelten mikrobiellen Rennins sogar über ausgedehnte Kontaktzeiten hinweg verbessert und nicht nachteilig beeinflusst wird.

Die Wärmestabilität von ausgewählten Proben des behandelten mikrobiellen Rennins wurde nachdem inBeispiel 1 beschriebe-

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nen Pasteurisierungsverfahren bestimmt. Die milchgerinnende Wirkung ,wurde nach dem Pasteurisieren bestimmt und wird ausgedrückt in % der ursprünglichen milchgerinnenden Aktivität der Probe vor dem Pasteurisieren. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle E zusammengefasst.

Tabelle E

Kontaktzeit (Stunden)	Pasteurisierungs- zeit (Min bei 7O°C)	% restliche milchgerin nende Aktivität
O	O	100
	4	94
	8	79
	12	72
26	O	100
	4	19
	8	5,2
	12	2
73	O	100
	4	9,6
	8	3,2
	12
136	O	100
	4	6,6
	8	1,6
	12	—————

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.Die Ergebnisse in Tabelle E zeigen, dass die mit Wasserstoffperoxid behandelten Proben über einen weiten Bereich von Kontaktzeiten wesentlich hitzelabiler sind als die unbehandelte Kontrollprobe.

Beispiel 4

Dieses Beispiel zeigt den Einfluss der Wasserstoffperoxidkonzentration auf die milchgerinnende Aktivität und die Wärmestabilität von mikrobiellem Rennin, welches nach dem erfindungsgemäs sen Verfahren behandelt wurde.

250 ml einer wässrigen Lösung von Mucor miehei mikrobiellem Rennin, welche 99.600 SU/ml enthielt, wurde mit 20 %-igem . (W/V) wässrigem Natriumhydroxid auf pH 7,0 eingestellt. Aliquote Teile von 1O ml wurden entnommen und verschiedene Mengen an Wasserstoffperoxid (30 % V/V) im Bereich von 3 % (V/V) bis 9 % (V/V) H^O₂, bezogen auf das Ausgangsvolumen, zugegeben. Jede Probe wurde dann 77 Stunden lang bei 4°C gelagert. Daraufhin wurde genügend Catalase aus Rinderleber zugegeben (0,1 ml, 100 KU/ml), um das Wasserstoffperoxid in der Probe zu zerstören. Jede Probe wurde dann mit 0,2M Phosphatpuffer (pH 5,5) 100-fach verdünnt. Die milchgerinnende Wirkung wurde mit Hilfe des Verfahrens, wie es in Beispiel 1 beschrieben wird, bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle P aufgeführt.

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Tabelle F

H₉O₉-Konzentration ^Δ % ν/ν	% milchgerinnende Aktivität, bezo gen auf die ursprüngliche Aktivität
O	100
3,0	91
4,2	91
5,4	96
6,0	97
7,2	97
8,4	93
9,0	93 .

Die Daten in Tabelle F zeigen, dass durch dieses Verfahren die milchgerinnende Aktivität des behandelten mikrobiellen Rennins über einen Bereich an H₃O₀-Konzentrationen nicht nachteilig beeinflusst wird.

Die Wärmestabilität von ausgewählten Proben der behandelten Proben wurde mit Hilfe des Pasteurisierungsverfahrens (bei 65°C), wie es in Beispiel 1 beschrieben wird, bestimmt. Die milchgerinnende Aktivität wurde nach dem Pasteurisieren gemessen und wird ausgedrückt in %, bezogen auf die ursprüngliche milchgerinnende Wirkung in der Probe vor dem Pasteurisieren. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle G zusammengefasst.

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Tabelle G

HoO₂-Konzentration % V/V	Pasteurisierungs- zeit/ Minuten bei 65°C	% restliche milch gerinnende Aktivi tät
O	O	100
	8	100
3·	O	100
	8	21
6	O	100
	8	10
9	O	100
	8	4

Die Ergebnisse in Tabelle G zeigen, dass die mit Wasserstoffperoxid über einen Bereich von H₂0₂-Konzentrationen behandelten Proben in deutlicher Weise hitzlabiler sind, als die unbehandelte Kontrollprobe.

.Beispiel 5

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung von Wasserstoffperoxid, welches in situ erzeugt wird, und dessen Einfluss auf die Warmestabilität des mikrobieiien Kennins, welches mittels des genannten Verfahrens behandelt wurde.

Gereinigtes mikrobielles Rennin (500 mg) aus Mucor miehei wurde in 100 ml 1,ON Natriumacetatpuffer (pH 4,5) aufgelöst*

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Diese wässrige Enzymlösung enthielt etwa 9.960 SU/ml. Ein aliquoter Teil von 10 ml dieser Lösung wurden entnommen und 500 mg Kalziumperoxid zu diesem zugegeben. Diese Menge an Kalziumperoxid war, in Kontakt mit dem vorliegenden Wasser, ausreichend, um Wasserstoffperoxid in situ in einer äquivalenten Menge von etwa 2,35 % ^H2°2 (^v/^v) ' bezogen auf das Ausgangsvolumen, zu bilden. Die Probe wurde bei etwa 20°C ca. 15 bis 18 Stunden lang bei pH 4,5 gelagert. Um überschüssiges Wasser- · stoffperoxid zu zerstören, wurde dann Catalase aus Rinderleber (0,1 ml; 100 KU/ml) zugegeben. Die Probe wurde mit 0,2M Natriumphosphatpuffer (pH 5,5) 20-fach verdünnt und die Wärmestabilität der behandelten Probe und der nicht-behandelten Kontrollprobe mittels des Pasteurisierungsverfahrens (bei 60°C), wie es in· Beispiel 1 beschrieben wird, bestimmt. Die milchgerinnende Aktivität wurde vor und nach dem Pasteuerisieren gemessen und die Werte ausgedrückt in %, bezogen auf die ursprüngliche milchgerinnende Aktivität. Die Daten werden in der nachfolgenden Tabelle H wiedergegeben.

Tabelle H

CaO₂ (mgT	% H₂O₂ (V/V)	Pasteurisierungs- zeit, Min bei 60⁰C	% restliche milchge rinnende Aktivität
0	0	0	100
		8	97
		16	97
		20	94
500	2,35	0	100
		8	37
		16	23
		20	21

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Die Daten in Tabelle H zeigen deutlich, dass in situ gebildetes Wasserstoffperoxid bei dem erfindungsgemässen Verfahren dazu führt, die Wärmestabilität des behandelten mikrobiellen Rennins im Vergleich zu der unbehandelten Kontrollprobe in drastischer Weise zu reduzieren.

Beispiel 6

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung von mikrobiellem Rennin, welches nach dem erfindungsgemässen Verfahren behandelt wurde, bei der Käseherstellung.

Es wurden Chargen von Cheddar-Käse unter Anwendung eines üblichen Verfahrens aus 196 kg pasteurisierter Vollmilch und 1 % handelsüblicher Kultur zum Starten hergestellt. In einem Kontrollbottich wurde die Milch mit 22,5 ml unbehandeltem mikrobiellen Rennin aus Mucor miehei, welches etwa 93.000 SU/ml enthielt, behandelt.' In einem Testbottich wurde die Milch mit 26,5 ml Mucor miehei mikrobiellem Rennin, welches v/ie in Beispiel 4 mit 3 % (V/V) Wasserstoffperoxid behandelt worden war und etwa 79.000 SU/ml enthielt, koaguliert. Es wurden die jeweiligen Zeiten zur Bildung der geronnenen Milch gemessen und es zeigte sich, dass diese äquivalent waren. Nach der Käsebereitung wurden die Molkeflüssigkeiten gesammelt, mit Natriumhydroxid auf pH 6,1 eingestellt und .auf ihre restliche Enzymaktivität analysiert, und zwar vor und nach einer Momentan-(flash) PasteuriK"ie>ri.ing, Die Enzymaktivitäten werden in der nachfolgenden Tabelle I in %, bezogen auf die ursprüngliche milchgerinnende Wirkung der Molke aufgeführt.

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Tabelle I

Probe	Pasteurisierungs- bedingungen	% der ursprünglichen milchgerinnenden Akti vität der Molke
nicht-behandelte Kontrolle	keine 63°C, 20 Sek.	100 99.
	63°C, 30 Sek.-	100
H₂O„-behandelt	keine	100
	63°C, 5 Sek.	30
	63°C, 10 Sek.	30
	63°C, 15 Sek.	26
	63°C, 20 Sek.	23

Die obigen Daten 2eigen deutlich, dass das H₂O--behandelte mikrobielle Rp^.nin bei der Käseherstellung ebenso v/irksam ist wie das native mirkobielle Rennin, dass jedoch das H-O₂ ^-behandelte Rennin wesentlich hitzelabiler ist als das native Rennin.

Die im vorstehenden hergestellten Käse wurden 30 Tage lang bei 7 C gereift und durch eine Gruppe geübter Geschmacksprüfer miteinander verglichen. Der mit dem HpO_? behandelten Rennin hergestellte Käse kam gut an und es wurde festgestellt, dass diPRer in wünschenswerter Weise im Geschmack und in der Struktur dem mit nicht-behandeltem, nativen Rennin hergestellten Käse ähnlich war.

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Beispiel 7

In diesem Beispiel wird die Hitzestabilität von Kälber-Rennin und mikrobiellem Rennin verglichen, welches nach dem beanspruchten Verfahren behandelt wurde.

Mucor miehei mikrobielles Rennin, welches 99.600 SU/ml enthielt, wurde, wie in Beispiel 4 beschrieben, mit"3 % (V/V) HpO^ behandelt und dessen WärmeStabilität mit nativem mikrobiellen Rennin vor der Behandlung und mit Kälber-Rennin, welches etwa 49.800 SU/ml enthielt, verglichen, wobei das in Beispiel 1 beschriebene Pasteurisierungsverfahren (bei 60°C) angewandt wurde. Die milchgerinnende Wirkung wurde nach dem Pasteurisieren gemessen und wird ausgedrückt in %, bezogen auf die ursprüngliche m.i Ichger innonde Aktivität der Probe vor dem Pasteurisieren. Die Daten sind in der nachstehenden Tabelle J zusammengefasst.

Tabelle J

Probe	Pasteurisierungs- zeit, min bei 6O⁰C	% restliche milchge rinnende Aktivität
mikrobielles Rennin (nicht-be- handelt) mikrobielles Rennin (H₂O₃- behandeltf	0 8 20 O 8 20	100 98 98 100 60 38

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Fortsetzung Tabelle J

Kälber-rennin

0
8
20

100
72
55

Die Daten in Tabelle J zeigen deutlich, dass das vorliegende Verfahren dazu geeignet ist, die Wärmestabilität von mikrobiellem Rennin bis auf einen Wert zu reduzieren, der etwa der Wärmestabilität von Kälber-Rennin entspricht.

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Claims

HOFFMANN · ΕΙΤ5Λ2 &T P/iRTIOSIt ": NK(ISSO-I?;1.)) · 01PL.-I NG. W. '-ΊΤί.Ε · DR. RER. NAT. K. HOFFMAN N · Dl PL.-I MG. W. LEH H DIPL. -ING. K. Γ U Cf! S LC- ■ DR. RER. NAT1B. HANSEN ARABELLASTRASSEZi(STERHHAUS) . D-JOOO MONCH EN 81 · TELEFO N (089) 9H0ß7 · TELEX 05-2?ί19 (PATH E) 31 610 m/wa MILES LABORATORIES INC. , ELKHART, INDIANA/ USA Verfahren zur Herabsetzung der thermischen Stabilität von mikrobiellein Rennin PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herabsetzung der thermischen Stabilität von mikrobiellem Mucor-Rennin, dadurch g e k e η η ~ zeichnet , dass eine wässrige Lösung von mirkobiellem Rennin mit Wasserstoffperoxid unter Bedingungen in Kontakt gebracht wi.rd, die dazu geeignet sind, die Wärme Stabilität des mikrobi. eilen Renn ins wesentlich herabzusetzen.

2. VerTahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich η et, däSG das mikrobielle Rennin aus Mucor -miehei

ORIGINAL INSPECTED

hergestellt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das mikrobielle Rennin aus Mucor pusillus hergestellt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Wärmestabilität des mikrobiellen Rennins, ausgedrückt als restliche milchgerinnende Aktivität nach der Wärmebehandlung, mindestens auf unter ca. 20 % der ursprünglichen Aktivität herabgesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet., dass die Wärmestabilität des mikrobiellen Rennins etwa auf die WärmeStabilität von Kälber-Rennin, wenn dieses den gleichen Wärmebedxngungen ausgesetzt wird, herabgesetzt wird.

• 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das mikrobielle Rennin in der wässrigen Lösung in einer Konzentration vorliegt, die ausgedrückt in Werten der milchgerinnenden Aktivität zwischen etwa 10.000 bis 100.000 Soxhlet-Einheiten pro Milliliter beträgt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration von Wasserstoffperoxid zwischen etwa 1 % und 25 % auf einer Volumen/Volumen-Basis, bezogen auf das ursprüngliche Volumen der wässrigen Lösung, betray L.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Wasserstoffperoxidkonzentration zwischen 3 % und 10 % auf einer Volumen/Volumen-Basis, bezogen auf

— 3 *~

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das ursprüngliche Volumen der wässrigen Lösung, beträgt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Wasserstoffperoxidkontakt bei einer Temperatur zwischen etwa 4 und 3O°C ausgeführt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Wasserstoffperoxidkontakt bei einem pH zwischen etwa 4,0 und 8,0 durchgeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Wasserstoffperoxidkontakt für eine Zeitdauer zwischen etwa 15 und 72 Stunden durchgeführt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Wasserstoffperoxid in situ gebildet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Wasserstoffperoxid in situ aus einer Verbindung der Gruppe Natriumperoxid, Kalziumperoxid, Benzoylhydroperoxid, einem Gemisch von Cumolhydroperoxid und Peroxidase, und Harnstoffhydrogenperoxid gebildet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung Kalziumperoxid darstellt.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das restliche Wasserstoffperoxid in der Lösung im wesentlichen zerstört wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Wasserstoffperoxid im wesentlichen mit

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Catalase, Peroxidase und/oder Ascorbinsäure zerstört wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Catalase eine Catalase aus Rinderleber und die Peroxidase eine Peroxidase aus Meerrettich darstellt.

18. Mikrobielles Mucor-Rennin mit stark herabgesetzter Wärmestabilität, dadurch gekennzeichnet , dass es nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 hergestellt wird.

19. Verfahren zur Käsebereitung, dadurch gekennzeichnet , dass man Milch der gerinnenden Wirkung von mikrobiellem Rennin gemäss Anspruch 18 unterwirft.

20. Käseprodukt, dadurch gekennzeichnet , dass es nach dem Verfahren gemäss Anspruch 19 hergestellt wurde.

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