DK163526B

DK163526B - Fremgangsmaade til foroegelse af den maelkekoagulerende aktivitet af mikrobiel loebe fra mucor pusillus-mikroorganismer

Info

Publication number: DK163526B
Application number: DK154883A
Authority: DK
Inventors: Toshihiko Higashi; Yoshinori Kobayashi; Shinjiro Iwasaki
Original assignee: Meito Sangyo Kk
Priority date: 1982-04-08
Filing date: 1983-04-07
Publication date: 1992-03-09
Also published as: EP0091664B1; DK154883A; EP0091664A2; JPH0218834B2; DK163526C; DK154883D0; EP0091664A3; JPS58175487A; DE3375158D1; US4530906A; CA1201325A; AR231547A1

Description

DK 163526 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til forøgelse af den mælkekoagulerende aktivitet af mikrobiel løbe fra Mucor pusillus-mikroorganismer.

I nærværende beskrivelse betegner "PA" proteolytisk 5 aktivitet, og "MCA" betegner mælkekoagulerende aktivitet. "PA/MCA"-indekset betegner PA/MCA-indekset fra den acylere-de mikrobielle løbe, når PA/MCA-forholdet for den ubehandlede mikrobielle løbe inden acylering sættes til 100. MCA-indekset betegner MCA-indekset for den acylerede mikrobiel-10 le løbe, når MCA for den ubehandlede løbe inden acylering sættes til 100.

Ved den klassiske metode til fremstilling af ost anvendes der løbe (mælkekoagulerende enzym) fra kalvens fjerde mave. I de senere år er der blevet udviklet mælkekoagule-15 rende enzymer, der tjener som erstatning for kalveløbe, og disse enzymer er kommet til anvendelse i praksis i forbindelse med opfyldelsen af det stigende forbrug af ost og kød.

Disse mælkekoagulerende enzymer kendes som "mikrobielle løber" og er kommercielt tilgængelige.

20 Løbe er en art proteolytisk enzym, og det er karakte ristisk ved at have specifik proteolytisk aktivitet repræsenteret ved mælkekoagulerende aktivitet (MCA), der spalter et specificeret sted i K-casein til inducering af et mælkekoagulerende fænomen, samt ikke-specifik proteolytisk aktivitet 25 (PA). Et eksempel på mikrobiel løbe med høj mælkekoagulerende aktivitet og lav proteolytisk aktivitet er beskrevet i US patentskrift nr. 4.136.201. Den vigtigste egenskab for løbe, der anvendes til ostefremstilling, er, at løben bør have en høj MCA og en lav PA, dvs. et lille PA/MCA-forhold. Høje 30 værdier for PA/MCA-forholdet fører til den defekt, at udbyttet af ostemassen formindskes, ligesom der forekommer vanskeligheder med hensyn til kvaliteten af den resulterende ost, f.eks. bitter smag og dårlig tekstur.

Udviklingen af mikrobielle løber var innovativ, efter-35 som denne udvikling fjernede flaskehalsen i forbindelse med tilførslen af kalveløbe. Ved praktiske anvendelser har de mi-

DK 163526 B

2 krobielle løber imidlertid den ulempe, at de har et større PA/MCA-forhold end kalveløbe. Der er tidligere blevet gjort forsøg på at screene mikroorganismer, der er i stand til at producere mikrobiel løbe, der har et lavere PA/MCA-forhold.

5 Den mikrobielle løbe fra Mucor pusillus-mikroorganismer, der er ét af resultaterne af disse forsøg, har stadig et større PA/MCA-forhold end kalveløbe, og det er ønskeligt at tilvejebringe mikrobiel løbe med et mindre PA/MCA-forhold.

Der er også fortsat blevet udført forsøg på at scree-10 ne mikroorganismer, der er i stand til at producere mikrobiel løbe, der opfylder det ovennævnte krav, men der er endnu ikke blevet opnået noget tilfredsstillende resultat.

Der har foreligget et yderligere teknisk problem på den mikrobielle løbe-teknologis område. Den valle, der ad-15 skilles fra ostemassen ved fremstillingen af ost under anvendelse af mikrobiel løbe, varme-steriliseres og anvendes derpå som et additiv til mælke-baseret konfekture og forskellige tilvirkede næringsmidler. Eftersom imidlertid kendte mikrobielle løbepræparater, f.eks. de, der fås fra Mucor 20 miehei-mikroorganismer, har høj varmestabilitet, kan de ikke fuldt ud deaktiveres ved varmesterilisation. Som et resultat heraf foregår der mælkekoagulation, og udnyttelsen af vallen begrænses i uønsket grad.

I et forsøg på at løse det ovennævnte, yderligere 25 tekniske problem er der blevet foreslået en række metoder til formindskelse af varmestabiliteten af mikrobiel løbe således, at vallen kan udnyttes.

Eksempelvis er der blevet foreslået en metode, der indebærer behandling af mikrobiel løbe med hydrogenperoxid 30 eller et stof, der er i stand til at danne hydrogenperoxid (japansk patentpublikation nr. 7092/1980 svarende til DE offentliggørelsesskrift nr. 2.901.542), en metode, der indebærer oxiderende behandling af mikrobiel løbe med perchlor-syre, -perborsyre, perbromsyre, periodsyre, et peroxid, per-35 eddikesyre, natriumhypochlorit etc. (japansk patentpublikation nr. 85286/1981 svarende til EP ansøgning nr. 27.834 og

DK 163526 B

3 japansk patentpublikation nr. 500520/1981 svarende til den offentliggjorte internationale ansøgning nr. WO 80/02225) og en metode indebærende farvestof-sensitiveret fotooxidation af mikrobiel løbe (japansk patentpublikation nr. 45192/1981 5 svarende til DE offentliggørelsesskrift nr. 3.016.548).

Som et andet forsøg på at formindske varmestabiliteten af mikrobiel løbe er der i GB patentansøgning nr. 2.038.339 A (DE offentliggørelsesskrift nr. 2.951.793 svarende til US patentansøgning nr. 973.937 i Chem. Abstr., vol. 93, p.

10 277, 127.992a) foreslået en metode til formindskelse af varmestabiliteten af mikrobiel løbe ved acylering deraf med et C^-Cg-monocarboxylsyreanhydrid.

De ovennævnte patentpublikationer og andre dokumenter omhandler overhovedet ikke nogen intentioner med hensyn til 15 at tilvejebringe modificeret mikrobiel løbe med et formindsket PA/MCA-forhold under bibeholdelse af MCA for den ubehandlede mikrobielle løbe (nemlig en høj grad af udbytte af MCA) , og der omtales ej heller nogen intentioner med hensyn til formindskelse af PA/MCA-forholdet.

20 Med henblik på at forøge den mælkekoagulerende akti vitet (MCA) af mikrobiel løbe, der fås fra Mucor pusillus--mikroorganismer, er der i US patentskrift nr. 4.362.818, der er udstedt den 7. december 1982, dvs. efter nærværende ansøgnings prioritetsdato, foreslået en fremgangsmåde, der 25 omfatter acylering af mikrobiel løbe med et acyleringsmiddel udvalgt fra gruppen bestående af maleinsyre-, citraconsyre-, phthalsyre-, cis-l,2-cyclohexandicarboxylsyre-, 1,2,4-ben-zentricarboxylsyre-, homophthalsyre-, 3-nitrophthalsyre-, broramaleinsyre- og dichlormaleinsyreanhydrid. Dette US pa-30 tentskrift viser, at acylering med maleinsyreanhydrid giver et enzym med formindsket proteolytisk aktivitet.

Det ovennævnte US patentskrift beskriver imidlertid kun en metode til forøgelse af den mælkekoagulerende aktivitet af- mikrobiel løbe fremstillet ud fra Mucor pusillus-mi-35 kroorganismer, ved hvilken anvendelsen af det ovenfor specificerede anhydrid af en di- eller tricarboxylsyre er essen-

DK 163526 B

4 tiel. Patentskriftet refererer ikke til ravsyreanhydrid, som foreskrives ifølge nærværende opfindelse. I US patentskriftet påvises det, at den mælkekoagulerende aktivitet af mikrobiel løbe, der fås fra Mucor pusillus, går tabt, når der an-5 vendes andre, lignende carboxylsyreanhydrider såsom isaton-syreanhydrid, trans-1,2-cyclohexandicarboxylsyreanhydrid, itaconsyreanhydrid, dl-camphersyreanhydrid og 2,3-dimethyl-maleinsyreanhydrid, og det anføres, at acylering af mikrobiel løbe fra Mucor pusillus har en stærkt selektiv og ufor-10 udsigelig virkning på enzymets mælkekoagulerende aktivitet.

I forbindelse med nærværende opfindelse er der. blevet gennemført undersøgelser til løsning af de tekniske problemer i forbindelse med udbyttet og kvaliteten af ost, f.eks. formindskelsen i udbyttet af ostemasse og den bitre smag og 15 ringe tekstur af ost ved ostefremstilling under anvendelse af mikrobiel løbe. Disse undersøgelser har ført til den erkendelse, at man ved acylering af mikrobiel løbe opnået ud fra Mucor pusillus-mikroorganismer med ravsyreanhydrid, der ikke er beskrevet i den kendte teknik og heller ikke i US 20 patentskrift nr. 4.362.818, kan tilvejebringe forbedret mikrobiel løbe, der har forøget MCA i forhold til ubehandlet Mucor pusillus-mikrobiel løbe inden acylering, og samtidig overvinde ulempen ved et højere PA/MCA-forhold end for kalveløbe, hvilket forhold forårsager vanskeligheder ved anven-25 delsen af mikrobiel løbe til fremstilling af ost.

• Denne erkendelse er helt uventet på baggrund af den kendsgerning, at det i det ovennævnte US patentskrift nr. 4.362.818 konkluderes på basis af resultaterne af forsøg med andre lignende carboxylsyreanhydrider, at anvendelsen af 30 de ovenfor nærmere omtalte anhydrider af di- eller tricar-boxylsyrer er essentiel, og at den virkning, der opnås ved acylering af mikrobiel løbe fra Mucor pusillus, er i høj grad uforudsigelig.

.Som det er velkendt, bliver aminogrupperne i protei-35 net hovedsageligt acyleret, når et protein behandles med maleinsyreanhydrid eller ravsyreanhydrid, jfr. f.eks. P.J.G.

DK 163526 B

5

O

Butler et al., Methods in Enzymol. 25, 191 (1972), I.M. Klotz, Methods in Enzymol. 11, 576 (1967) og M.A. Quasim et al., Biochim. Biophys. Acta 536, 50 (1978). Maleylaminogruppen er imidlertid ustabil under sure betingelser og er ·tilbøje-5 lig til at blive fraspaltet. P.J.G. Butler et al. har f.eks. vist i Biochem. J. 112, 679 (1969), at maleylaminogruppen let hydrolyseres ved surt pH, og at hydrolysehastigheden er direkte proportional med H -koncentrationen mellem pH=6 og pH=4,5, og at gruppen har en halveringslevetid på 11 til 10 12 timer ved en temperatur på 37°C og en pH-værdi på 3,5.

MCA for mikrobiel løbe fra Mucor pusillus er stabil ved en pH-værdi på fra ca. 5,0 til ca. 5,5, og løbepræpara-tet opbevares derfor almindeligvis ved disse pH-niveauer.

Ved fremstillingen af ost under anvendelse af en sådan mi-15 krobiel løbe er det sædvanlig praksis at danne en ostemasse ved tilsætning af løben til mælk og, inden fraskillelse af vallen, foretage opvarmning ved en temperatur, der f.eks. ligger fra ca. 38 til ca. 55°C, og en pH-værdi, der f.eks. ligger fra ca. 6,4 til ca. 6,0, i et tidsrum på f.eks. fra 20 ca. 30 til ca. 60 minutter, omend disse opvarmningsbetingelser varieres i overensstemmelse med den type ost, der skal fremstilles. Endvidere udføres der til tider en modning af osten ved en pH-værdi på fra ca. 5,0 til ca. 5,5 i et tidsrum så langt som op til 2 år.

25 I betragtning af de ovennævnte omstændigheder er det sandsynligt, at maleylgruppen under opbevaring og ostefremstilling vil blive spaltet fra den mikrobielle løbe fra Mucor pusillus, der behandles med maleinsyreanhydrid, og at den eliminerede maleylgruppe dernæst hydrolyseres til maleinsy- 30 re. Det er velkendt, at maleinsyre forårsager problemer, såsom renal dysfunktion, nefron beskadigelse og tubulær nekrose og inducerer et symptom, der minder meget om Fanconi's syndrom (jfr. f.eks. R.W. Berliner et al., Proc. Soc. Exp.

Biol. Med. 75, 791 (1950), H.E. Harrison et al., Science 120, 606 (1954), L.E. Rosenberg et al., Biochem. J. 92^, 345 (1964), H.J. Kramer et al.,J. Lab. Clin. Med. 799 (1970), P. Gmaj 35

DK 163526B

6 et al, Am. J. Physiol. 22, 1182 (1972), H .J. Kramer et al., Nephron 10, 306 (1973), M. Bergeron et al., J. Clin. Invest.

57, 1181 (1976), D.E. Brewer et al., Kidney Int. 12, 244 (1977), A. Gougoux et al., Am. J. Physiol. 231, 1010-(1976), 5 M. Silverman et al., Am. J. Physiol. 231, 1024 (1976), E.I. Christensen et al., Kidney Int. YT_, 771 (1980), M. Szczepanska et al., Am. J. Physiol. 239, F 50 (1980), V.J. Rosen et al.. Lab. Invest. 28^, 446 (1973), S.F. Wen, Am. J. Physiol. 231, 468 (1976) og R.R. Verani et al., Lab. Invest.

10 46, 79 (1982)).

Ifølge den foreliggende opfindelse succinyleres mikrobiel løbe med ravsyreanhydrid. Den succinylgruppe, der er bundet til aminogruppen, er meget mere stabil under sure betingelser end den maleylgruppe, der er bundet til amino-15 gruppen, jfr. f.eks. M.H. Klapper et al., Methods in En-zymol. 25, 531 (1972). Succinater forekommer i vid udstrækning i dyr og planter og har længe været kendt som krydderier. Eksempelvis omtaler Japanese Standards of Food Additives IV (19789 og Food Chemicals Codex, 3rd Ed. (1981) 20 fra National Research Council, USA, ravsyre og dens derivater som næringsmiddeladditiver. Succinater forårsager således ingen ulemper med hensyn til sikkerhed for mennesker.

Det har således vist sig, at mikrobiel løbe fra Mucor pusillus, acyleret med ravsyreanhydrid ved fremgangsmåden 25 ifølge opfindelsen, har meget højere stabilitet og sikkerhed under opbevaring og osteproduktion end mikrobiel løbe fra Mucor pusillus, acyleret med maleinsyreanhydrid.

Det er formålet med opfindelsen at tilvejebringe en fremgangsmåde til forøgelse af MCA af mikrobiel løbe fra 30 Mucor pusillus-mikroorganismer.

Ifølge opfindelsen opnås dette formål ved en fremgangsmåde, der er ejendommelig ved, at man acylerer den mikrobielle løbe fra Mucor pus il lus-mikroorganismer i et vandigt medium ved at bringe den mikrobielle løbe i kontakt 35 med ravsyreanhydrid ved en temperatur på fra 0 til 40“C og en pH-værdi på fra 4 til 10, indstiller systemets pH-værdi

DK 163526B

7 på fra 5 til 6,5 efter acyleringen og holder systemet med den indstillede pH-værdi ved en temperatur på fra 0 til 50*C i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til opnåelse af den ønskede forøgelse af den mælkekoagulerende aktivitet.

5 Den mikrobielle udgangsløbe fra Mucor pusillus-mikro organismer, der anvendes ved fremstillingen af den her omhandlede løbe med forøget MCA, samt fremgangsmåder til fremstilling deraf er velkendt, og udgangsløben er kommercielt tilgængelig.

10 Acyleringen udføres som nævnt ved at bringe løben fra Mucor pusillus i kontakt med ravsyreanhydrid i et vandigt medium. Kontakten tilvejebringes fortrinsvis i nærværelse af en egnet puffer.

Ved den praktiske gennemførelse af acyleringsbehand-15 lingen kan betingelserne for tilsætningen af ravsyreanhydrid, typen og koncentrationen af pufferen samt koncentrationen af den mikrobielle udgangsløbe fra Mucor pusillus vælges passende. Disse betingelser kan let fastlægges eksperimentelt i overensstemmelse med det ønskede forhold for nedsættelse 20 af PA/MCA (idet resten, udtrykt i procent, fås ved subtraktion fra 100 af PA/MCA-indekset for den acylerede mikrobielle løbe baseret på det 100%'s PA/MCA-forhold for ubehandlet mikrobiel løbe). Fortrinsvis udføres den acylerende behandling under sådanne betingelser, at nedsættelsen af forholdet 25 mellem den proteolytiske aktivitet (PA) og den mælkekoagulerende aktivitet (MCA) for den resulterende acylerede mikrobielle løbe fra PA/MCA-forholdet for ubehandlet mikrobiel løbe inden acylering er mindst ca. 10%, især mindst ca. 20%.

Reaktionsblandingens pH-værdi under acyleringen er 30 som nævnt fra 4 til 10, fortrinsvis fra ca. 7 til ca. 9.

Baser eller syrer, f.eks. 0,1-4 N saltsyre, 5-50%'s (v/v) eddikesyre, 0,1-4 N natriumhydroxid og 0,1-2 M natriumcar-bonat, kan anvendes som pH-regulerende midler. Acylerings-temperaturen ligger som nævnt fra 0 til 40"C, fortrinsvis 35 fra ca. 0 til ca. 25*C.

DK 163526B

8

Koncentrationen af den mikrobielle udgangsløbe med hensyn til koncentrationen af protein er f.eks. fra ca. 0,1 til ca. 10% (w/v), fortrinsvis fra ca. 0,5 til ca. 3% (w/v). Acyleringsmidlet kan f.eks. tilsættes kontinuerligt' eller 5 batchvis i opdelte portioner til proteinopløsningen, der omrøres hurtigt. Den mængde acyleringsmiddel (ravsyrean-hydrid), der tilsættes, er f.eks. fra 0,1 til 2% (w/v) i forhold til vægten af det protein, der er til stede i den mikrobielle løbe i det vandige medium.

10 Eksempler på den puffer, der kan anvendes ved frem gangsmåden ifølge opfindelsen, er 0,05-0,2 M natriumacetatpuffer, 0,05-0,2 M dinatriumphosphat/citratpuffer 0,05-0,2 M phosphatpuffer, 0,1-0,5 M natriumbicarbonat/natriumhydroxid-puffer, 0,1-0,5 M natriumbicarbonat/natriumcarbonatpuffer 15 og natriumpyrophosphatpuffer.

Efter den ønskede acylering indstilles reaktionsblandingens pH-værdi på en neutral værdi, dvs. en pH-værdi på fra 5,0 til 6,5, under anvendelse af et neutralisationsmiddel såsom 0,1-4 N natriumhydroxid, 0,1-2 M natriumcarbonat, 20 0,1-4 N saltsyre eller 5-50%'s (v/v) eddikesyre.

Om ønsket underkastes reaktionsblandingen en afsalt-ningsbehandling, f.eks. en dialyse, ultrafiltrering eller gelfiltrering, til opnåelse af den ønskede forbedrede mikrobielle løbe fra Mucor pusillus.

25 Ved den praktiske gennemførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen til forøgelse af MCA for mikrobiel løbe fra Mucor pusillus udføres der en bevarende behandling efter den acylerende behandling, og acyleringsbehandlingen fuldstændiggøres på denne måde, idet man indstiller pH-værdien 30 af reaktionsblandingen efter acylering med ravsyreanhydrid til 5 til 6,5, og denne reaktionsblanding med den regulerede pH-værdi holdes ved en temperatur fra 0 til 50°C i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til opnåelse af den ønskede forøgelse' af MCA.

35 Fortrinsvis har den mikrobielle løbe, der fås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, et PA/MCA-indeks på ikke

DK 163526B

9 over 90, især ikke over 80, f.eks. fra 50 til 90, navnlig fra 50 til 80, når PA/MCA-forholdet for ubehandlet mikrobiel løbe fra Mucor pusillus-mikroorganismer inden acyleringen sættes til 100, og den forbedrede løbe har et MCA-indeks på 5 over 100, f.eks. fra mere end 100 til 150, når MCA for den ubehandlede mikrobielle løbe sættes til 100.

Sædvanligvis indeholder den forbedrede mikrobielle løbe fra Mucor pusillus fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen mindst 4 mol af succinylgruppen pr. mol af løben.

10 Mængden af succinylgruppen kan variere afhængigt af acyle-ringsbetingelserne etc. Mængden kan f.eks. ligge fra ca. 4 til ca. 20 mol.

Når f.eks. succinylgruppen fraspaltes fra den rensede, modificerede mikrobielle løbe ved den samme metode som 15 beskrevet af M.H. Klapper et al. i Methods in Enzymology, vol. 25, p. 531 (1972) , med den undtagelse, at hydrolyse udføres med 6 N HCl ved 100°C i 48 timer, og den resulterende frie ravsyre måles ved den metode, der er beskrevet af J.R. Williamson i Methods of Enzymatic Analysis, vol. 3, 20 p. 1616, Academic Press, New York, 2nd English Edition (1974), detekteres der mindst 8 mol, f.eks. fra 8 til 15 mol, fortrinsvis fra 8 til 12 mol af succinylgruppen pr. mol af løben.

På grund af dens lave PA/MCA-forhold og høje MCA kan den forbedrede mikrobielle løbe fra Mucor pusillus anvendes 25 til at overvinde de forskellige ulemper, der optræder ved fremstillingen af ost med konventionelle mikrobielle løbe-præparater, f.eks. det formindskede udbytte af ostemassen, den bitre smag og ringe tekstur. Den forbedrede løbe har udmærket stabilitet og er forbundet med fortrinlig sikkerhed un-30 der opbevaring deraf eller ved dens anvendelse ved ostefremstillingsprocessen. Disse fordele bevirker, at den forbedrede mikrobielle løbe fra Mucor pusillus opnået ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er særdeles anvendelig.

De følgende eksempler illustrerer nærmere den her 35 omhandlede fremgangsmåde til forøgelse af den mælkekoagulerende aktivitet af mikrobiel løbe opnået fra Mucor pusillus--mikroorganismer.

DK 163526 B

10 PA (ikke-specifik proteolytisk aktivitet) og MCA (mælkekoagulerende aktivitet, dvs. specifik proteolytisk aktivitet) måles ved anvendelse af følgende metoder:

MCA

5 Måles i overensstemmelse med den metode, der er be skrevet af S. Iwasaki et al. i Agr. Biol. Chem. 3jL, 546 (1967).

PA

Måles ved anvendelse af en modificeret version af 10 den metode, der er beskrevet af R. Fields i Biochem J. 124, 581 (1971), hvilken metode involverer bestemmelse af den aminogruppe, der netop fremkommer som et resultat af spaltningen af et protein med protease under anvendelse af TNBS (2,4,6-trinitro-benzen-sulfonat-natriumsalt). Denne modifice-15 rede metode udføres som følger: 0,1 ml af en testopløsning sættes til 0,4 ml af et dimethylkasein-substrat (indeholdende 0,125% w/v dimethyl-kasein i en 50 mM dinatriumphosphat/citrat-puffer ved en pH-værdi på 5,5), der er forvarmet til 35°C. Efter reaktion 20 ved 35°C i 60 minutter tilsættes der 2 ml 0,1 M natriumte-traborat/natriumhydroxid (pH 9,5) . Derpå tilsættes der 1 ml TNBS-reagens (en blanding af lige store rumfang 0,10 w/v-% TNBS-opløsning og 10 mM natriumbisulfit) til forårsagelse af farveudvikling ved 40°C i 60 minutter. Absorbansen 25 ved 420 nm måles under anvendelse af en blindprøve som kontrol.

Blindforsøget udføres ved at sætte 2 ml 0,1 M natrium-tetraborat/natriumhydroxid (pH 9,5) til 0,4 ml af substratet, hvorpå der tilsættes 0,1 ml af testopløsningen og gen-30 nemføres samme operation som ovenfor.

Den målte værdi for A42Q er porportional med mængden af frie aminogrupper dannet ved spaltning af proteinet ved hjælp af proteolytisk aktivitet (PA) .

Testopløsningen anvendes efter nøjagtig fortynding 25 deraf til 100 enheder pr. ml.

Værdien for A^q repræsenterer således PA/MCA-forholdet.

DK 163526 B

11 o

Eksempel 1

Dette er et eksempel på succinylering af mikrobiel løbe fra Mucor pusillus med ravsyreanhydrid. pH-værdien varieres, og dens virkning på MCA-indekset (forholdet for op-5 nået MCA-aktivitet) for den succinylerede løbe, beregnet på 100 MCA af den ubehandlede, mikrobielle løbe, og PA/MCA-in-dekset, beregnet på 100 PA/MCA for den ubehandlede mikrobielle løbe, undersøges.

Mucor pusillus dyrkes på et hvedeklidmedium, og den 10 dyrkede masse ekstraheres med ledningsvand. Der sættes ethanol til ekstrakten, og de fældninger, der fås ved en etha-nolkoncentration på fra 30 til 70 v/v-%, tørres under formindsket tryk til dannelse af et løbepulver.

10 ml af en 0,4 M opløsning af NaHCOg sættes til 10 ml 15 af en vandig opløsning af det mikrobielle løbepulver fra Mucor pusillus (indeholdende 290 mg protein og med en MCA på 9,65 x 105 enheder) (Proteinkoncentrationen bliver 1,45 w/v-%, og NaHCOg-koncentrationen bliver 0,2 M). Derefter sættes der 2 N NaOH til opløsningen til indstilling deraf til hver af 20 de pH-værdier, der er vist i tabel I. Under omrøring ved 15°C tilsættes der 145 mg ravsyreanhydrid (0,5 w/w-%, beregnet på proteinet) i fem portioner med intervaller på 5 minutter. Efter tilsætning af den sidste portion fortsættes reaktionen i 1 time. Under reaktionen holdes pH-værdien i reaktions-25 blandingen konstant som vist i tabel I under anvendelse af en pH-stat. Efter reaktionen indstilles reaktionsblandingen på en pH-værdi på 5,5 og henstilles ved 15°C. Prøveudtagning sker periodisk. Hver af de udtagne prøver fortyndes med destilleret vand således, at dens MCA bliver ca. 130 enheder 30 pr. ml. og dens MCA måles. Derpå fortyndes prøven med destilleret vand således, at dens MCA bliver nøjagtigt 100 enheder pr. ml, og dens PA måles. Resultaterne fremgår af tabel I.

35

O

12

DK 163526B

Tabel I

Succinyleringsbetingelser:

15°C

Anhydrid tilsat/protein 0,5 w/w-% 5 Protein-kone. 1,45 w/v-%

NaHC03-konc. 0,2 M

Succinyleret M. pusillus-løbe

PA/MCA

Procent af oprindelig MCA _ 10 Forsøg pH ved Henstandstid ved pH 5,5 og 15°C_ nr. succinylering 0,5 h 24 h 48 h 72 h 24 h

Kontrol ubehandlet 100__100 100 100 100_ 1 __6jrO__106 108 108 108 84 2 __1_j0__114 115 116 117 76 15 3__8jr_0__102 114 116 117 72 4__9jr0__78 111 114 116 72 I 5 1 9,5 55 98 112 114 72 : Eftersom PA/MCA-forholdet praktisk taget ikke ændrer sig ved henstand fra 24 til 72 timer, er der i tabellen kun vist 20 det PA/MCA-forhold, der fås efter henstand i 24 timer.

Tabel I viser, at succinylering bevirker forøget MCA og formindsket PA/MCA. Det ses også, at ved forsøgene nr. 4 og 5 overstiger forholdet for udbytte af MCA 100% ved henstand efter succinylering.

25

Eksempel 2 I dette eksempel succinyleres mikrobiel løbe fra Mucor pusillus med ravsyreanhydrid ved varierende temperaturer, og virkningen af temperaturen på MCA og PA/MCA for det succiny-30 lerede produkt undersøges.

Succinyleringen udføres på samme måde som i eksempel 1, men med den undtagelse, af pH-værdien ved succinyleringen indstilles på 7,0. Efter den afsluttende tilsætning af anhydridet fortsættes reaktionen i henholdsvis 120, 75, 50 og 30 minutter 35 ved en succinyleringstemperatur på henholdsvis 0, 10, 20 og

DK 163526 B

13 o 30°C. pH-værdien indstilles på 6,5, og reaktionsblandingen henstilles ved 5°C. Resultaterne fremgår af tabel II.

Tabel II

5 Succinyleringsbetingelser: pH 7,0

Anhydrid tilsat/protein 0,5 w/w-% Protein-kone. 1,45 w/v-%

NaHC03-konc. 0,2 M

10 - i

Succinyleret M. pusillus-løbe_

Forsøg Temperatur Procent af oprindelig MCA PA/MCA

nr. ved succi- Henstandstid ved pH 6,5 og 5°C_ 15 nylering__0,5 h 24 h 48 h 72 h 24 h

Kontrol Ubehandlet 100__100 100__100 100_ 1 __0°C__83__92 99 103 84 2 __10°C__107 110 112 114 77 3 __20°C__115 116 118 118 73 2° Γ 4 30°C 117 118 119 119 71

Eksempel 3 I dette eksempel succinyleres mikrobiel løbe fra Mucor pusillus med varierende mængder ravsyreanhydrid, og virknin-25 gen af mængden af ravsyreanhydrid på MCA og PA/MCA for det succinylerede produkt undersøges.

Succinyleringen udføres på samme måde som i eksempel 1, men med den undtagelse, at anhydridet anvendes i hver af de mængder, der er angivet i tabellerne IIIA og HIB, og at 30 succinyleringen udføres ved en pH-værdi på 8,5 og en temperatur på 15°C (tabel IIIA) eller ved en pH-værdi på 7,0 og en temperatur på 25°C (tabel HIB) . Anhydridet tilsættes i portioner på ca. 30 mg med intervaller på 5 minutter, og reaktionen fortsættes i 30 minutter efter tilsætningen af den 35 afsluttende portion. Derpå henstilles reaktionsblandingen ved

DK 163526 B

O

14 stuetemperatur (20 til 25°C) ved en pH-værdi på 5,5. Resultaterne er vist i tabellerne IIIA og HIB.

Tabel IIIA

5 Succinyleringsbetingelser:

pH 8,5, 15°C

Protein-kone. 1,45 w/v-%

NaHC03-konc. 0,2 M

10 Succinyleret M. pussilus-løbe_|

Forsøg Anhydrid Procent af oprindelig MCA__PA/MCA

nr. tilsat/ Henstandstid ved pH 5,5 og stuetemperatur protein __(w/w)__2 h__24 h__24 h_ 15 Kontrol Ubehandlet_100__100__100_j 1 __0^2__92__102__86_| 2 __0^3__104__108__80_ 3 __0^5__106__116__72_ 4 __0,75__106__116__67 20 j 5 1 1,0 1 104 113 66

Tabel HIB

Succinyleringsbetingelser:

pH 7,0, 25°C

25 Protein-kone. 1,45 w/v-%

NaHC03~konc. 0,2 M

Succinyleret M. pusillus-løbe_

Forsøg Anhydrid Procent af oprindelig MCA__PA/MCA

30 nr. tilsat/ Henstandstid ved pH 5,5 og stuetemperatur protein __(w/w)__2 h__24 h__24 h__

Kontrol Ubehandlet_100__100__100__ 1-__0,25__108__111__74__ 35 _2__OjjS__116__117__72__ 3__0,75 109 I 117_ 71__

O

DK 163526 B

15

Eksempel 4 I dette eksempel succinyleres mikrobiel løbe fra Mucor pusillus med ravsyreanhydrid under anvendelse af varierende koncentrationer af NaHCO^, og virkningen af kon-5 centrationen af NaHCO^ på MCA og PA/MCA for det succinyle-rede produkt undersøges.

Succinyleringen udføres på samme måde som i eksempel 1, men med den undtagelse, at koncentrationen af NaHCO^ varieres som vist i tabel IV, at pH ved succinyleringen ind-10 stilles på 8,5, og at mængden af anhydridet er 1,0 w/w-% til protein på vægtbasis (ti 29 mg-portioner af anhydridet tilsættes méd intervaller på 5 minutter). Efter succinylering henstilles reaktionsblandingen ved en pH-værdi på 6,0 og en temperatur på 25°C. Resultaterne fremgår af tabel IV.

15

Tabel IV

Succinyleringsbetingelser:

pH 8,5, 15°C

Anhydrid tilsat/protein 1,0 w/w 20 Protein-kone. 1,45 w/v-%

Succinyleret M. pusillus-løbe__

Forsøg NaHC03~ Procent af oprindelig MCA_PA/MCA

nr. -kone. Umiddelbart Henstandstid ved pH 6,0 og 25 efter _25°C___ ___succinylering__24 h 48 h 72 h 24 h

Kontrol Ubehandlet_100__100 100 100 100 1 __0,1 M__61__89 96 107 65 2 __0,2 M__74__114 118 121 66 30 3__0,4 M__86__119 138 144 69 4 1 0,6 Μ 1_88 119 142 1461 71

Eksempel 5 I dette eksempel succinyleres mikrobiel løbe fra Mucor 35 pusillus med ravsyreanhydrid ved forskellige koncentrationer

O

16

DK 163526 B

af proteinet, og virkningen af koncentrationen af proteinet på MCA og PA/MCA for det succinylerede produkt undersøges.

Mucor pusillus dyrkes på et hvedekl idmedium, og den dyrkede masse ekstraheres med ledningsvand. Ekstrakten for-5 tyndes eller koncentreres under formindsket tryk til opnåelse af en ekstrakt med en ønsket proteinkoncentration. MCA- 3 -værdien er ca. 1,7 x 10 enheder pr. mg af proteinet. Til 10 ml af ekstrakten sættes der NaHCO^-pulver til opnåelse af en koncentration på 0,1 K. Opløsningens pH-værdi indstilles 10 på 8,0 med 2 N NaOH. Under omrøring ved 15°C tilsættes der 50 mg ravsyreanhydrid med intervaller på 5 minutter således, at anhydrid/protein-forholdet når 0,4 w/w. Efter tilsætning af den afsluttende portion fortsættes reaktionen i 60 minutter. Efter reaktionen indstilles reaktionsblandingen på en 15 pH-værdi på 6,0 med 50%'s (v/v) eddikesyre og henstilles ved 40°C i 8 timer. Resultaterne fremgår af tabel V.

Tabel V

Succinyleringsbetingelser:

20 pH 8,0, 15°C

Anhydrid tilsat/protein 0,4 w/w NaHC03-konc. 0,1 M

Succinyleret M. pusillus-løbe_

25 Forsøg Protein- Procent af oprindelig MCA_PA/MCA

nr. -kone. Umiddelbart Efter henstand ved pH 6,0 mg/ml efter succi- og 40°C i 8 timer ___nyler ing_____

Kontrol Ubehandlet__100__100__100 30 1__12,5__74__102__80 2 __25__63__110__78 3 __50__51__108__76 4 100__44_103_75 35

DK 163526B

O

17

Eksempel 6 I dette eksempel succinyleres mikrobiel løbe fra Mucor pusillus med ravsyreanhydrid i nærværelse af NaCl, og virkningen af NaCl på MCA og PA/MCA for det succinylerede 5 produkt undersøges.

Succinyleringen udføres på følgende måde:

Til løbe-ekstrakten, der har en proteinkoncentration på 50 mg/ml, sættes der NaCl-pulver til frembringelse af hver af de koncentrationer, der er vist i tabel VI, og reak-10 tionen udføres ved 25°C og en pH-værdi på 8,5. Forholdet mellem tilsat anhydrid og protein er 0,5 w/w, og reaktionen fortsættes i 30 minutter efter tilsætning af den afsluttende portion af anhydridet. Koncentrationen af NaHC03 er 0,1 M. Efter succinylering indstilles reaktionsblandingen på en pH-værdi 15 på 5,5 og holdes ved 45°C i 4 timer. Resultaterne fremgår af tabel VI.

Tabel VI

Succinyleringsbetingelser:

20 pH 8,5, 25°C

Anhydrid tilsat/protein 0,5 w/w Protein-kone. 50 mg/ml NaHC03-konc. 0,1 M

25 f

Succinyleret M. pusillus-løbe_

Forsøg NaCl-kone. Procent af oprindelig MCA PA/MCA

nr. w/w-% Umiddelbart Efter henstand ved efter succi- pH 5,5 og 45°C i ___nylering__4 timer_ 30

Kontrol Ubehandlet_100_100__100 1 __2_i 68__100__58 2 __4_1 77__103__59 1 3 I 6 ! 84 I 101 1 58 35

DK 163526B

18

O

Eksempel 7 I dette eksempel succinyleres renset mikrobiel løbe fra Mucor pusillus med ravsyreanhydrid.

Rensningen udføres ved den metode, der er beskrevet 5 af S. Iwasaki et al. i Agr. Biol. Chem. 31, 1421 (1967). Den rensede mikrobielle løbe fra Mucor pusillus opløses i 0,4 M NaHCO^/NaOH-pufferopløsning (pH = 8,5) således, at dens koncentration når 1,0% w/v. Til 5 ml af denne opløsning, der indeholder 50 mg af den rensede løbe og har en MCA på 2,78 x 10^ 10 enheder, sættes der en forudbestemt mængde ravsyreanhydrid som angivet i tabel VII i 5 mg-portioner med intervaller på 5 minutter under omrøring ved 15°C. Efter tilsætning af den afsluttende portion fortsættes reaktionen i 30 minutter. Under reaktionen holdes pH-værdien i reaktionsblandingen på 8,5 med 0,1N 15 NaOH under anvendelse af en pH-stat. Efter reaktionen indstilles reaktionsblandingen på en pH-værdi på 5,5 med 10%'s (v/v) eddikesyre, og blandingen afsaltes derpå ved gelfiltrering på Sephadex G-25. Dernæst måles og bestemmes MCA, PA, ami-nogruppeindhold, succinylgruppeindhold og det isoelektriske 20 punkt (Pj) for produktet.

Aminogruppeindholdet bestemmes ved den metode, der er beskrevet af R. Fields i Methods in Enzymology 25_, 464 (1972) . Suecinylgruppeindholdet bestemmes ved den metode, der er beskrevet af M.H. Klapper et al. i Methods in Enzymology 25, 25 531 (1972), men med den undtagelse, at succinylgruppen spal tes ved hydrolyse med 6 N HC1 ved 100°C i 48 timer, og det frigjorte succinat bestemmes ved den metode, der er beskrevet af J.R. Williamson i Methods of Enzymatic Analyses, vol 3, p. 1616, redigeret af H.V. Bergmeyer, Academic Press, New York, 30 2nd English Edition (1974) . Resultaterne fremgår af tabel VII.

35

O

DK 163526 B

19

Tabel VII

Succinyleringsbetingelser:

pH 8,5, 15°C

Renset løbe-konc. 1,0 w/v-%

5 . i 0,4 M NaHC03-Na0H

" *1 ............... " -.......... ' ~

Succinyleret M. pusillus-løbe (renset)

Forsøg nr,_Kontrol 1__2_3_

Anhydrid tilsat/løbe Ubehandlet 0,3 0,5 1,0 10 (w/w)____

Procent af oprindelig 100 104 113 101 MCA_____ PA/MCA-forhold_100__79__73 67_

Mol amino-grupper 0 6,4 8,3 10,3 15 -reduceret pr. mol__

Mol succinyl-grupper 0 8,3 10,2 14,3 bundet pr. mol___ jisoelektrisk punkt (P^) 3,9 - j 3,0 j _ 20 Tabel VII viser, at andelen af opnået MCA-aktivitet forøges, og at PA/MCA-forholdet formindskes. Resultaterne viser også formindskelsen af mængden af aminogruppe og indførelsen af succinylgruppen. Det ses også, at indførelsen af succinylgruppen forøger en negativ ladning, og som følge 25 heraf forskydes det isoelektriske punkt (P-j.) til den sure side.

30 35

Claims

1. Fremgangsmåde til forøgelse af den mælkekoagulerende aktivitet af mikrobiel løbe fra Mucor pusillus-mikro-organismer, kendetegnet vedf at man acylerer den 5 mikrobielle løbe i et vandigt medium ved at bringe den mikrobielle løbe i kontakt med ravsyreanhydrid ved en temperatur på fra 0 til 40°C og en pH-værdi på fra 4 til 10, indstiller systemets pH-værdi på fra 5 til 6,5 efter acyleringen og holder systemet med den indstillede pH-værdi ved en tempera- 10 tur på fra 0 til 50ec i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til opnåelse af den ønskede forøgelse af den mælkekoagulerende aktivitet.

2. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendetegnet ved, at der anvendes en mængde ravsyreanhydrid, der 15 udgør fra 0,1 til 2 vægtprocent i forhold til vægten af det protein, der er til stede i den mikrobielle løbe i det vandige medium.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at acyleringsbehandlingen udføres under sådanne 20 betingelser, at den procentvise formindskelse af forholdet mellem proteolytisk aktivitet og mælkekoagulerende aktivitet for den acylerede mikrobielle løbe i forhold til forholdet for den uomsatte mikrobielle løbe inden acyleringen er mindst ca. 10%. 25 30 35