DE2003221B2 - Verfahren zur Herstellung von Citronensäure - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Citronensäure

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DE2003221B2
DE2003221B2 DE2003221A DE2003221A DE2003221B2 DE 2003221 B2 DE2003221 B2 DE 2003221B2 DE 2003221 A DE2003221 A DE 2003221A DE 2003221 A DE2003221 A DE 2003221A DE 2003221 B2 DE2003221 B2 DE 2003221B2
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corynebacterium
ifo
citric acid
bacterium
culture
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Citronensäure anreichernde und Kohlenwasserstoffe assimilierende Bakterien der Gattung Corynebacterium in ein wäßriges Kulturmedium impft, das als hauptsächliche Kohlenstoffquelle wenigstens ein Normalparaffin mit 9 bis 20 C-Atomen im Molekül enthält, die Kultur bei einem pH-Wert von etwa 5 bis 8 bebrütet, bis sich Citronensäure in der Kulturbrühe stark angereichert hat, und die so angereicherte Citronensäure aus der Kulturbrühe gewinnt.
Für Citronensäure besteht ein großer Bedarf. Sie wird beispielsweise als Säuerungsmitlei in Getränken und in pharmazeutischen Sirupen verwendet. Für die Herstellung von Citronensäure durch Fermentation sind Verfahren, bei denen Mikroorganismen, wie Pilze der Gattungen Penicillium, Aspergillus usw., verwendet werden, bekannt und in zahlreichen Veröffentlichungen und Patenten beschrieben. Bei diesen Verfahren ist man jedoch stets auf die Verwendung von Zuckern und anderen teuren Kohlenstoffquellen angewiesen, und die Fermentationsdauer ist sehr lang und beträgt 5 bis 12
ίο Tage. Kürzlich wurden Verfahren beschrieben, bei denen Hefen und Bakterien verwendet werden, aber die auf die verwendeten Kohlenstoffquellen bezogenen Ausbeuten an Citronensäure waren nie so gut, wie dies wünschenswert wäre.
Die BE-PS 7 18 133 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Citronensäure mit Hilfe von Pilzen der Gattungen Penicillium und Aspergillus, bei dem sehr lange Bebrütungszeiten von 10 bis 14 Tagen nötig sind und Citronensäure in einer Konzentration von 1,0 bis 6,8 aus 10% Kohlenwasserstoffen, die als Kohlenstoffquelle verwendet werden, gebildet wird.
Dagegen beträgt die Bebrütungsdauer gemäß vorliegender Erfindung nur 2-3 Tage, wobei Citronensäure in einer Konzentration von 2,4 bis 4,6% aus 4% Kohlenwasserstoffen, die als Kohlenstoffquelle verwendet werden, gebildet wird.
Es wurde nun gefunden, daß der Gattung Corynebacterium Citronensäure aus η-Paraffinen unter aeroben Bedingungen in ungewöhnlich hohen Ausbeuten bilden.
Der Erfindung liegt diese Feststellung zugrunde.
Für die Großherstellung und vom wirtschaftlichen Standpunkt ist da«: Verfahren den üblichen Verfahren weit überlegen, da
1. Kohlenwasserstoffe aus der Reihe der Normalparaffine, die als Kohlenstoffquelle verwendet werden, in großen Mengen zu niedrigen Preisen verfügbar sind,
2. die erforderliche Fermentationsdauer nur 2 bis 3 Tage, d. h. weniger als die Hälfte der bei bekannten Verfahren erforderlichen Zeit beträgt,
3. die geringeren Mengen an Verunreinigungen in der Kultur die Reinigung vereinfachen und
4. Citronensäure in Ausbeuten angereichert wird, die nicht geringer sind als das Gewichtsäquivalent des als Kohlenstoffquelle verwendeten n-Paraffins.
Die Erfindung ermöglicht somit die Herstellung von Citronensäure in guter Ausbeute bei verkürzter Fermentationsdauer und vereinfachter Reinigung und macht somit ein vorteilhaftes, großtechnisch durchführbares Verfahren zur Herstellung von Citronensäure verfügbar.
Beim Verfahren gemäß der Erfindung impft man ein Citronensäure anreicherndes und Kohlenwasserstoffe assimilierendes Bakterium der Gattung Corynebacterium in ein wäßriges Kulturmedium, das als hauptsächliche Kohlenstoffquelle wenigstens ein n-Paraffin mit 9 bis 20 C-Atomen im Molekül enthält, bebrütet die Kultur bei einem pH-Wert von etwa 5 bis 8, bis Citronensäure sich in der Kulturbrühe stark angereichert hat, und isoliert die angereicherte Citronensäure aus der Kulturbrühe.
Als Bakterien der Gattung Corynebacterium eignen sich für die Zwecke der Erfindung alle Stämme, solange sie den obengenannten Kohlenwasserstoff zu verwerten vermögen und ihn in Citronensäure umwandeln. Einige typische Stämme, die vorteilhaft für die Zwecke der Erfindung verwendet werden können, sind nachstehend geniinnt:
Corynebacteriumsp.Nr. 1304(IFO 12731)
Corynebacterium sp. Nr. 177 (IFO 12728)
Corynebacterium sp. N r. 416 (I FO 12729)
Corynebacterium sp. Nr. 803 (I FO 12730)
Corynebacterium sp. Nr. 981 (IFO 13114)
Corynebacterium sp. N r. 218 (I FO 13113)
Corynebacterium sp. Nr. 117 (IFO 13115)
Corynebacterium sp. N r. 279 (I FO 13112)
Corynebacterium sp. Nr. 384 (1FO 13117)
Corynebacterium sp. Nr.628(IFO 13116)
In der vorstehenden Aufzählung sind die Zahlen hinter der Abkürzung »IFO« die Hinterlegungsnummern beim Institute for Fermentation, Osaka.
Die mikrobiologischen Eigenschaften der obengenannten typischen Bakterien sind nachstehend in Tabelle 1 und 2 angegeben.
Die Bakterien sind stets keulenförmige Stäbchen, asporogen, unbeweglich, grampositiv, uerob und von unregelmäßiger Größe. Nach den Angaben in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, gehören die Bakterien zur Familie Corynebacteriacea.
Die Familie Corynebacteriacea umfaßt die Gattungen Corynebacterium, Lysteria, Erysipelothrix, Microbacterium, Cellulomonas und Arthrobacter. Bakterien der Gattung Lysteria sind jedoch beweglich, während Bakterien der Gattung Erysipelothrix längliche fadenförmige Zellen und schwach aerob sind. Während Bakterien der Gattung Microbacterium Milchsäure bilden und Lackmusmiich säuern, vermögen Mikroorganismen der Gattung Cellulomonas Cellulose zu zersetzen. Alle nachstehend genannten Bakterien sind somit von den gemäß der Erfindung verwendeten Bakterien verschieden.
Das nachstehende Ergebnis läßt den Schluß zu, daß die erfindungsgemäß verwendeten Bakterien entweder zur Gattung Arthrobacter oder zur Gattung Coryne bacterium gehören. Es gibt jedoch Unterschiede zwischen diesen beiden Gattungen. Erstens sind junge Zellen von Bakterien der Gattung Arthrobacter gramnega tiv und ihre reifen Zelle grampositiv. Mit anderen Worten, sie sind Gramvarianten. Zweitens bilden Bakterien der Gattung Arthrobacter charakteristische kugelförmige Zellen im Gegensatz zu den gemäß der Erfindung verwendeten Bakterien, die diese Eigenschaften nicht zeigen.
Es ist somit offensichtlich, daß die erfindungsgemäß verwendeten Bakterien zu der Gattung Corynebacterium gehören.
Mikroorganismen unterliegen natürlich der Mutation, die entweder spontan oder induziert ist, und die erfindungsgemäß verwendeten Bakterien sind keine Ausnahme von dieser Regel. Es ist jedoch zu bemerken, daß auch diese Varianten und Mutanten für das Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden können, solange sie Kohlenwasserstoffe unter Bildung von Citronensäure zu verwerten vermögen.
Das beim Verfahren gemäß der Erfindung verwendete Kulturmedium ist in Abhängigkeit von den verwendeten Stämmen verschieden, jedoch werden als Kohlenstoffquellen η-Paraffine mit 9 bis 20 C-Atomen im Molekül oder verschiedene Rohstoffe, die diese η-Paraffine enthalten, z. B. Gasöl und schweres Gasöl, verwendet. Kohlenwasserstoffe mit 9 bis 20 C-Atomen im Molekül sind z.B. n-Nonan, n-Decan, n-Undecan, n-Dodecan, n-Tridecan, n-Tetradecan, n-Pentadecan, n-Hexadecan, n-Heptedecan, n-Octadecan, n-Nonadecan und n-Eicosan, und Gemische dieser Kohlenwasserstoffe.
Diese Kohlenwasserstoffe werden im allgemeinen in einer solchen Menge verwendet, daß die Normalparaffine mit 9 bis 20 C-Atomen im Molekül insgesamt etwa 3 bis 20 Vol.-% des Kulturmediums ausmachen.
Da diese Kohlenwasserstoffe in Wasser schwer löslich sind, erfolgt die Zugabe zu einem wäßrigen Kulturmedium unter Rühren oder Schütteln, wobei eine Suspension gebildet wird, die sehr feine Teilchen enthält. Gegebenenfalls kann ein Suspendiermittel, z. B.
ίο ein oberflächenaktives Mittel vom Typ des Polyoxyäthylensorbitanmonostearats, verwendet werden.
Diese Kohlenwasserstoffe sind als solche als Kohlenstoffquellen geeignet, jedoch können gegebenenfalls gebräuchliche Kohlenstoffquellen, z. B. Kohlehydrate
(z. B. Glucose) zusammen mit den Kohlenwasserstoffen verwendet werden.
Als notwendige Stickstoffquellen können verschiedene anorganische Ammoniumsalze, z.B. NH4CI, (NH4J2SO4, (NH4J2HPO4, NH4OH und NH4NO3, Harn-
stoff, die Ammoniumsalze von organischen Säuren, z. B. Ammoniumacetat, und verschiedene organische stickstoffhaltige Materialien, z. B. Trockenhefe, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Fischmehl, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Pepton und Brennereirückstände verwendet werden. Diese Stickstcffquellen können allein oder in Kombination verwendet werden.
Gegebenenfalls können die üblicherweise verwendeten anorganischen Salze, z. B. solche von Eisen, Mangan, Calcium, Magnesium, Kalium und Natrium, sowie
jo verschiedene Nährstoffe dem Medium zugesetzt werden.
Der pH-Wert des Mediums liegt im Bereich von 5 bis 8, wobei ein Wert von 6 bis 8 besonders bevorzugt wird. Wenn im Laufe der Kultivierung der pH-Wert durch die Bildung von Citronensäure fällt, ist es zweckmäßig, den pH-Wert des Mediums von Zeit zu Zeit unter Fortsetzung der Kultivierung zu korrigieren. Zu diesem Zweck kann die Kultivierung unter gelegentlicher Zugabe eines Neutralisationsmittels, z. B. CaC03, Ca(OH)2, NH4OH, NaOH oder Na2COj, durchgeführt werden. Es ist auch möglich, dem Medium eine ausreichende Pufferwirkung zu verleihen, indem beispielsweise CaCO3 vorher in einer Menge zugesetzt wird, die dem möglichen Abfall des pH-Wertes entspricht.
Die Bebrütungstemperatur kann in Abhängigkeit von dem jeweils verwendeten Bakterium innerhalb gewisser Grenzen variieren. Sie liegt im allgemeinen [m Bereich von 20 bis 400C.
so Für das Verfahren gemäß der Erfindung wird ein flüssiges Kulturmedium verwendet, wobei die Bebrütung aerob, d. h. unter Belüftung und unter statischen Bedingungen oder Submersbedingungen durchgeführt wird. Während der Kultivierung kann nach Bedarf eine Schaumverhütung vorgenommen werden, wozu die üblichen Schaumverhütungsmittel wie Polyoxypropylenderivate, Sojabohnenöl, Siliconöl und Schmalzöl verwendet werden.
Die im Medium angereicherte Citronensäure kann nach beliebigen üblichen Verfahren isoliert und gewonnen werden. Geeignet sind beispielsweise Neutralisation, Erhitzen, Kühlung, Ausfällung, Filtration, Zentrifugieren, Einengen, Entfärbung, Kristallisation und Trocknung sowie gegebenenfalls Behandlungen mit
b5 Ionenaustauscherharzen. Diese Verfahren können allein oder in Kombination durchgeführt werden und ermöglichen die leichte Gewinnung der Citronensäure in kristalliner Form.
Tabelle
Corynebacterium
sp. Nr. 177 IFO 12728
Corynebacterium
sp. Nr. 416 IFO 12729
Corynebacterium
sp. Nr. 981 IFO 13114
Corynebacterium
sp. Nr. 218 IFO 13113
Corynebacterium
sp. Nr. 117 IFO 13115
Form und Größe
Stäbchenförmig, unterschiedliche Größe; verhältnismäßig lange Zellen
sind keulenförmig.
0,7-0,9x1,2-1,8 μ
Stäbchenförmig, unterschiedliche Größe; verhältnismäßig lange Zellen sind keulenförmig. 03-0,9 χ U-1,8 μ
Stäbchenförmig, unterschiedliche Größe; verhältnismäßig lange Zellen sind keulenförmig.
Stäbchenförmig, unterschiedliche Größe; verhältnismäßig lange Zellen sind keulenförmig, einige gekrümmt.
Stäbchenförmig, unterschiedliche Größe; verhältnismäßig lange Zellen sind keulenförmig.
Beweglichkeit unbeweglich unbeweglich unbeweglich unbeweglich unbeweglich K)
Sporulation asporogen asporogen asporogen asporogen asporogen 0 03 22
Färbung nach Gram positiv positiv positiv positiv positiv
Kultureigenschaften;
Bouillonagar-Platte		 Mittleres Wachstum;
unregelmäßiger Rand,
in der Mitte konvex;
undurchsichtig, stumpf;
grau mit gelblichem Stich.		 Mittleres Wachstum;
unregelmäßiger Rand;
flach, undurchsichtig,
stumpf; grau mit gelb
lichem Stich.		 Gutes Wach" aim; unregel
mäßiger Rand und konvex;
trocken, undurchsichtig,
stumpf; grau mit gelblichem
Stich.		 Gutes Wachstum; unregel
mäßiger Rand und konvex;
trocken, undurchsichtig,
stumpf; grau mit gelblichem
Stich.		 Gutes Wachstum; unregel
mäßiger Rand und konvex;
trocken, undurchsichtig,
stumpf; grau mit gelblichem
Stich.
Bouillonagar-Schrägkultur
Bouillon-Flüssigkultur
Mittleres Wachstum;
wulstförmig (beaded or
echinulate); undurchsichtig,
stumpf, grau· mit gelblichem
Stich, trocken.
Dicke Pellicula gebildet,
transparent, mit leichtem
Sediment
Optimale lemperatui 37° C
Optimaler pH-Wert 6-8
Mittleres Wachstum; wulstförmig (beaded or echinulate); undurchsichtig, stumpf, grau mit gelblichem Stich, trocken.
Dicke Pellicula gebildet, transparent, mit Sediment.
320C
5-8
Gutes Wachstum; wulstförmig (beaded or echinulate); grau mit gelblichem Stich.
Dicke Pellicula gebildet, transparent, mit Sediment.
28-37°C
6-8
Gutes Wachstum; wulstförmig (beaded or echinulate); grau mit gelblichem Stich.
Dicke Pellicula gebildet, transparent, mit Sediment.
28-37°C
6-8
Gutes Wachstum; wulstförmig (beaded or echinulate); gelbbraun.
Dicke Pellicula gebildet, transparent, mit Sediment.
28-37= C 6-8
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Corynebacterium
sp. Nr. 279 IFO 13112		 Corynebacterium
sp. Nr. 384 IFO 13117		 Corynebacterium
sp. IFO 13116		 Corynebacterium
sp, Nr. 803 IFO 12730		 Corynebacterium
sp. Nr. 1304 IFO 12731		 NJ
O
Form und Größe Stäbchenförmig, unter
schiedliche Größe; ver
hältnismäßig lange Zellen
sind keulenförmig, einige
gekrümmt.		 Stäbchenförmig, unter
schiedliche Größe; ver
hältnismäßig lange Zellen
haben eine Größe von
0,8-0,9 μ χ 1,8-2,3 μ.		 Stäbchenförmig, unter
schiedliche Größe; ver
hältnismäßig lange Zellen
sind keulenförmig.		 Stäbchenförmig, unter
schiedliche Größe. Längere
Zellen sind keulenförmig,
0,9-11,1 χ 2-3 μ		 Stäbchenförmig, unter
schiedliche Größe. Längere
Zellen sind keulenförmig.
0,9-11,1 χ 2-3 μ		 03 221
Beweglichkeit unbeweglich unbeweglich unbeweglich unbeweglich unbeweglich
Sporulation asporogen asporogen asporogen asporogen asporogen 30 I
Färbung nach Gram positiv positiv positiv positiv positiv
SCuItureigenschaften;
Bouillonagar-Platte		 Gutes Wachstum; unregel
mäßiger Rand und flach;
trocken, undurchsichtig,
stumpf; grau mit gelblichem
Stich.		 Gutes Wachstum; unregel
mäßiger Rand und flach;
trocken, undurchsichtig,
stumpf; grau mit gelblichem
Stich.		 Gutes Wachstum; unregel
mäßiger Rand und flach;
trocken, undurchsichtig,
stumpf; grau mit gelblichem
Stich.		 Gutes Wachstum! unregel-
mäßiger Rand, trocken,
undurchsichtig, matt, hell·
gelblichbraun.		 Gutes Wachstum; unregel
mäßiger Rand; nabeiförmig,
trocken, undurchsichtig,
stumpf, grau mit gelblichem
Stich.
Bouillonagar-
Schrägkultur		 Gutes Wachstum;
wulstförmig (echinulate);
grau mit gelblichem Stich.		 Gutes Wachstum;
wulstförmig (echinulate);
grau mit gelblichem Stich.		 Gutes Wachstum;
wulstförmig (beaded or
echinulate); grau mit
gelblichem Stich.		 Gutes Wachstum;
wulstförmig (beaded or
echinulate); undurchsichtig,
stumpf, hellgelblichbraun,		 Gutes Wachstum;
wulstförmig (beaded or
ephjpuiate); undurchsichtig,
stumpf, grau mit gelblichem
Stich-
Bouillon-
Flüssigkultur		 Dicke Pellicula gebildet,
transparent, mit Sediment.		 Dicke Pellicula gebildet,
transparent, mit Sedimen*		 Dicke Pellicula gebildet,
transparent, mit Sediment.		 Dicke Pellicula gebildet,
transparent, mit leichtem
Sediment,		 Dicke Pellicula gebildet,
transparent, mit leichtem
Sediment.
Optimale Temperatur 28-37°C 28-37° C 28 -37* C 28-32° C 33°C
Optimaler pH-Wert 6-8 6-8 6-8 6-7 5-9
9 20 03 221 10 Corynebacterium
sp. Nr. 1304
Tabelle 2 Corynebacterium Corynebacterium aerob
sp. Nr. 177 Corynebacterium sp. Nr. 803 alkalisiert
aerob sp. Nr. 416 aerob nicht verflüssigt
Sauerstoffbedarf unverändert aerob alkalisiert gebildet
Lackmusmilch nicht verflüssigt unverändert nicht verflüssigt nicht gebildet
Gelatine gebildet nicht verflüssigt gebildet nicht hydrolysiert
Schwefelwasserstoff nicht gebildet gebildet nicht gebildet reduziert
Indol nicht hydrolysiert nicht gebildet nicht hydrolysiert positiv
Stärke nicht reduziert nicht hydrolysiert reduziert positiv
Nitrate positiv rächt reduziert positiv Säure anaerob
Katalasetest positiv positiv positiv gebildet
Urease-Test Säure anaerob negativ unverändert
Zuckerstoffwechsel gebildet Säure anaerob
(Leifsoo-Methode) gebildet
Fermentation von Säurebildung ohne sichtbare Gasbildung
Zuckern
In den folgenden Beispielen sind die Prozentsätze auf Basis von Gewicht/Volumen berechnet Die Ausbeuten sind in Gewichtseinheiten dtr erzeugten Citronensäure pro Gewichtseinheit des verbrauchten n-Paraffins angegeben. GewichtsteHe verhalten sich zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter.
B e i s ρ i e! 1
Eine Kultur von Corynebacterium sp. Nr. 416 (!FO 12729) wird in 120 Raumteile eines Mediums (pH 7,0) geimpft, das eine Erdölfraktion (4%), die 92% η-Paraffine mit 10 bis 12 C-Atomen enthält, 0,2% KH2PO4, 0,05% MgSO4 · 7 H2O, 0,02% FeSO4 · 7 H2O, 0,4% NH4CI, 0,1% Hefeextrakt und 3% CaCO3 enthält, worauf 64 Stunden bei 32°C bebrütet wird. Hierbei werden 41,4 mgCitronensäure/ml erhalten.
Die Kultur wird durch Zusatz von 3 n-NaOH auf pH 6,8 eingestellt. Die Brühe wird etwa 15 Minuten auf 95°C erhitzt und dann auf Raumtemperatur gekühlt. Das erhaltene Sediment wird abfiltriert. Das Produkt wird in 50 Raumteilen Wasser suspendiert. Der pH-Wert der Suspension wird durch Zusatz von 5 n-HjSO4 auf 2,0 eingestellt. Das hierbei gebildete Sediment wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck auf die Konsistenz eines Sirups eingeengt. Der Sirup wird in einem kalten Raum stehengelassen, wobei sich Kristalle von Citronensäure abscheiden. Die Ausbeute beträgt 3,4 Gew.-Teile als Citronensäureanhydrid.
Beispiel 2
Eine Kultur von Corynebacterium sp. Nr. 8OJ (If-X) 12730) wird in 40 Raumteile eines Mediums (pH 7,0) geimpft, das eine Erdölfraktion (4%), die 87% n-Paraffin mit 16 bis 20 C-Atomen enthält, 0,2% KH2PO4, 0,05% MgSO4 · 7 H2O, 0,002% MnSO4 ■ 7 H2O, 0,01% FcSO4 · 7 H2O, 0,5% NH4NO,, 0,1% Harnstoff, 0,05% Trockenhefe und 3% CaCOi enthält, worauf 3 Tage bei 28°C bebrütet wird. Hierbei werden 36 mg Citroncnsiuirc/ml Brühe erhalten. 100 Raumleile der Brühe werden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt, wobei 3,24 Gew.-Teile Citronensäure in Kristallform erhalten werden.
Beispiel 3
Eine Kultur von Corynebacterium sp.'Nr. 1304 (IFO (2731) wird in das Medium der in Beispiel 2 genannten Zusammensetzung geimpft und 2 Tage bei 32°C bebrütet. Hierbei werden 32 mg Citronensäure pro ml ίο Brühe angereichert 100 Raumteile der Kulturbrühe werden auf die in Beispiel I beschriebene Weise behandelt. Hierbei werden 2,8 Gew.-Teile Citronensäure in Kristallform erhalten.
Beispiel 4
Eine Kultur von Corynebacterium sp. Nr. 803 (IFO 12730) wird in 120 Raumteile eines Mediums (pH 7,0)
w geimpft, das 4% n-Octadccan, 0,2% KH2PO4, 0,05% MgSO4 ■ 7 H20,0,001% MnSO4 · 7 H2O, 0,01% FeSO4, 0,5% NH4NO1, 0.1% Harnstoff. 0,05% Maisquellwasser und 3% CaCOj enthält, und 2 Tage bei 28°C bebrütet. Hierbei werden 44,2 mg Citronensäure pro ml der
4r> Kulturbrühe gebildet. 100 Raumteile der Kulturbrühc werden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt, wobei 3,6b Gew.-Teile Citronensäure in Kristallform erhalten werden.
Beispiel 5
Eine Kultur von Corynebacterium sp. Nr. 177 (IFO 12728) wird in das in Beispiel I beschriebene Medium geimpft und 3 Tage bei 34UC bebrütet. Hierbei wird eine Kulturbrühc erhalten, die 24 mg Citronensäure pro ml enthält. 100 Raumteile der Kulturbrülle werden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt, wobei 1,7 Gew.-Teile Citronensäure in Krislallform erhallen werden.
Beispiel b
Die nachstehend genannten Kulturen werden in da; in Beispiel 2 beschriebene Medium geimpft und S Tagi bei 28"C bebrütet. Die Kulliirbrühc wird auf die ir Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt. Die Ergebnis se sind in tier folgenden Tabelle genannt.
Hinterlegung- Citronen- Ausbeute, Ausbeute
nummer säure, bezogen auf aus 100 ml
η-Paraffin, Kulturbrühe,
mg/ml Brühe Vo g
Corynebacterium
sp. Nr. 981		 !FO 13114 33 92 2,7
Corynebacterium
sp. Nr. 218		 IFO 13113 44 110 3,1
Corynebacterium
sp. Nr. 117		 IFO 13115 41 102,5 2,9
Corynebacterium
sp. Nr. 279		 IFO 13112 46 115 3,35
Corynebacterium
sp. Nr. 384		 IFO 13117 43 107,5 3,05
Corynebacterium
sp. Nr. 628		 IFO 13116 38 95 2,7

Claims (13)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellunp von Citronensäure, dadurch gekennzeichnet, daß man ein wäßriges Kulturmedium, das als hauptsächliche Kohlenstoffqueüe wenigstens ein Normalparaffin mit 9 bis 20 Kohlenstoffatomen enthält, mit einem Citronensäure ansammelnden und Kohlenstoffwasserstoffe verbrauchenden Bakterienstamm der Gattung Corynebacterium impft, die Kultur bei einem pH-Wert von etwa 5 bis 8 bis zu einer wesentlichen Anreicherung von Citronensäure in der Kulturbrüche bebrütet und die Zitronensäure aus dem Kulturmedium abtrennt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Temperaturen zwischen 20 und 400C bebrütet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kulturmedium bei pH-Werten zwischen 6 und 8 hält.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium Corynebacterium sp.Nr. 177(= IFO 12728) verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium Corynebacterium sp. Nr.416(= IFO 12729)verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium Corynebacterium sp. Nr.803(= IFO 12730) verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium Corynebacterium sp. Nr. 1304 (= IFO 12731) verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium Corynebacterium sp.Nr. 981 (= IFO 13114) verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium Corynebacterium sp. Nr.218(= 13113) verwendet.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium Corynebacterium sp.Nr. 117(== IFO 13115)verwendet.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium Corynebacterium sp.Nr.279(= IFO 13112) verwendet.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium Corynebacterium sp. Nr.384(= IFO 13117) verwendet.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterium Corynebacterium sp. Nr.628(= IFO 13116) verwendet.
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