NO771842L - Fremgangsm}te til fremstilling av polysakkarid - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av polysakkarid. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen fremstilling av et alginattype-polysakkarid ved kultivering av bakterier av arten Azotobacter vinelandii.

Alginsyre, en hydrofil, kolloidal karbohydratsyre, er en varierende blokkopolymer som består av D-mannuronsyre- og L-guluronsyreenheter. Selv om alginsyre selv er praktisk talt uløselig i vann kan den lettvint løses ved nøytralisering med et egnet alkali. En av de utmerkete egenskaper hos alginatløs-ninger er deres høye viskositet i meget lave konsentrasjoner,

og dersom visse divalente ioner, såsom kalsium eller magnesium, tilsettes til alginatløsninger, frembringes det gelatinering. Alginsyres og alginaters enestående egenskaper gir dem et vidt industrielt anvendelsesområde som emulgeringsmidler, stabilisa-n torer og tykningsmidler. F.eks. kan i næringsmiddelindustrien anvendes som emulsjonsstabilisatorer i iskrem, som gelatinerings-middel i melkepudding, som tykningsmiddel i saus, samt som skum-stabilisatorer i øl. I farmasøytiske produkter kan de anvendes som emulgeringsmiddel og tykningsmiddel for kirurgiske seper og vaskemidler, som oppløsnings- og granuleringsmiddel i tabletter, som suspenderingsmiddel i salve, samt som absorberbar gel i kirurgisk bandasje. Ved papir- og tekstilfremstilling kan de anvendes til liming, belegging, appretering, farging og betrykking av komposisjoner. I landbruket kan de anvendes som jordkondisjon-eringsmiddel.

Alginater og alginsyre er blitt fremstilt i kommersiell målestokk ved ekstraksjon av visse arter brun tang, f.eks. Laminaria digitata og Ascophyllum nodosum, hvori de utgjør en

stor del av celleveggene. Denne konvensjonelle tangekstraksjons-prosess har den ulempe at den er avhengig av tilførsel av alginat-inneholdende tang som råstoff. Den er ubekvem å utføre på grunn

av de involverte tangmengder, og en betydelig ytterligere rensing kan være nødvendig, særlig dersom det kreves et produkt for nær-ingsmidler eller farmasøytiske produkter. På grunn av disse van-skeligheter er alginatliknende polysakkarider blitt fremstilt ved kultivering av atskillige arter av Azotobacter, særlig Azotobacter vinelandii. Alginsyren som fremstilles med denne mikroorganisme er strukturelt lik den som oppnås av tang, med unntagelse av at den er delvis acetylert.

Det er kjent at fremstillingen av polysakkarid under anvendelse av en stamme av Azotobacter vinelandii er kritisk avhengig av flere faktorer, særlig mediets pH,'og også fosfatnivået i mediet.

Fra britisk patentskrift 1.331.771 er det kjent en fremgangsmåte ,til fremstilling av et polysakkarid som består av en delvis acetylert, varierende blokkopolymer av 1,4-sammenbundete-D-mannuronsyre- og L-guluronsyrerester, hvorved en mikroorganisme av arten Azotobacter vinelandii dyrkes under aerobe betingelser i et .vandig næringsmedium som inneholde r.-minst et monosakkarid og/eller disakkarid som karbonkilde og som inneholder som vesentlig bestanddeler kilder for molybden, jern, fosfat, magnesium, kalium, natrium, kalsium samt sulfat under kontrollerte pH-betingelser slik at pH holdes i området 6,5-8,5 i det minste i den første halvdel av fermenteringsperioden og i området 4,5-8,5 i en eventuell resterende fermenteringsperiode, inntil en vesentlig dannelse av polysakkarid har foregått, og hvor det dannete polysakkarid isoleres. Dyrkingsmetoden som benyttes ved denne fremgangsmåte kan være satsvis eller kontinuerlig.

Det fremheves i patentskriftet at fosfatnivået i vekst-mediet spiller en viktig rolle når det gjelder oppnåelse av polysakkaridutbyttet. Det antydes at lave fosfatnivåer bedrer utbyttet, idet en fosfatkonsentrasjon på 0,015-1,4 millimol, fortrinnsvis 0,2-0,7 millimol pr. liter antydes. Under disse betingelser oppnås det polysakkaridkonsentrasjoner på ca 2,5-3,0 g/l.

I britisk patentskrift 1.394.413 er det beskrevet et spesielt valg av disse betingelser som gir særlig gode polysakkarid-utbytter. Fra dette patentskrift er det kjent en fremgangsmåte som likner fremgangsmåten ifølge det ovennevnte patentskrift, men er begrenset ved at fosfatkonsentrasjonen i mediet er fra 0,1 til 0,8 millimol pr. liter og ved at mediets pH under dyrk-ingen holdes i området 7,0-8,2. Ved å benytte disse betingelser

oppnås det polysakkaridkonsentrasjoner på 3-3,5 g/l.

Også i nevnte patentskrift 1.394.413 fremheves det at best resultater oppnås med lav fosfatkonsentrasjon.

Det har ifølge den foreliggende oppfinnelse vist seg at

i kontinuerlige fermenteringsprosesser av denne type kan den aktuelle fosfatkonsentrasjon i mediet under visse betingelser

være betydelig høyere enn de konsentrasjoner som fremheves i ovennevnte patentskrifter.

Under kontinuerlige fermenteringsbetingelser er det vesentlige krav at kulturen dyrkes under fosfatbegrensete betingelser, dvs. at det er fosfatnivået i mediet som blir den bestemmende faktor i konsentrasjonen av mikroorganismen.

Det vil forstås at konsentrasjonen av celler av mikroorganismen i fermenteringsvekkeren er en funksjon av fosfatkonsentrasjonen som gir begrensete betingelser under kontinuerlig dyrking. Jo høyere fosfatkonsentrasjonen er desto høyere er konsentrasjonen av de nærværende celler, under begrensete betingelser. Forutsatt at dette prinsipp følges er det mulig å fremstille fosfatbegrensete betingelser under kontinuerlig dyrking ved fosfatnivåer som er betydelig høyere enn de som er angitt i ovennevnte patentskrifter og å oppnå meget høyere polysakkarid-konsentras joner, f.eks. opptil 27 g/l polysakkarid, særlig når det anvendes lavere fortynningshastigheter.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kjennetegnes ved at fosfatkonsentrasjonen i mediet er begrensende for konsentrasjonen av bakterien'og er minst 1,0 millimol/1.

En vilkårlig stamme av Azotobacter vinelandii kan anvendes ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse. Imidlertid er særlig verdifulle stammer som gir særlig høye utbytter av polysakkarid de som er særlig nevnt i ovennevnte to britiske patentskrifter og som har kultursamlingsnumrene NCIB 9068 og NCIB 8789, og den som har kultursamlingsnummeret NCIB 8660. Disse stammer er tilgjengelige fra National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, P.O.Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen, Scotland, og er beskrevet i samlingens katalog.

Fosfatnivået som anvendes i mediet vil som antydet variere avhengig av cellekonsentrasjonen i fermenteringsvekkeren, jo høyere cellekonsentrasjon desto høyere fosfatkonsentrasjon som er begrensende. Det har f.eks. vist seg at under anvendelse av et kjemisk definert medium av den type som er nevnt i eksempel 1 i ovennevnte britiske patentskrift 1.331.771 er en fosfatkonsen-tras jon på 1,0 millimol/1 ved en fortynningshastighet på 0,15 l/h effektivt begrensende med en cellekonsentrasjon på ca 2,3 ,g/l. En fosfatkonsentrasjon på 2,0 millimol/1 er effektivt begrensende ved en cellekonsentrasjon på ca 4 g/l, mens en fosfat-konsentras jon så høy som 3,0 millimol/1 er effektivt begrensende ved en cellekonsentrasjon på ca 4,7 g/l. Ved lavere fortynningshastigheter øker cellekonsentrasjonen, dvs. den totale cellemasse ved en spesiell, begrensende fosfatkonsentrasjon, særlig ved en økning av den enkelte cellevekt. Ved en fortynningshastighet på 0,05 l/h er således 3,0 mM fosfat begrensende ved en cellekon-sentras jon på ca 14 g/l.

I ethvert spesielt tilfelle kan en antydning av om fosfatkonsentrasjonen virkelig er begrensende oppnås ved å øke fosfat-' konsentrasjonen og iaktta virkningen på cellekonsentrasjonen. Dersom konsentrasjonen av.en ikke begrensende bestanddél i medietøkes iakttas det ingen vesentlig forandring av cellekonsentrasjonen, men dersom konsentrasjonen av den begrensende bestanddeløkes reagerer cellekonsentrasjonen hurtig med økning. F.eks.har en økning av en begrensende fosfatkonsentrasjon til det dobbelte vist seg å bevirke minst 10% økning av cellekonsentrasjonen i løpet av 5 timer.

Det har vist seg at under konvensjonelle, kontinuerlige kulturbetingelser, f. eks. de som foreligger ved anvendelse av en kjemostat (se Herbert, Eleworth og Telling, Journal of General Microbiology, L4 , 601, 1956) , er særlig fordelaktige fosfatnivåer på fra 2,0 til 3,0 millimol/1, noe som gir en cellekonsentrasjon på ca 4-4,7 g/l ved en fortynningshastighet på 0,15 h , eller ca 14 g/l ved 0,05 h ^. Bruk av disse nivå har vist seg å gi en polysakkaridkonsentrasjon på opptil 27 g/l. Det kan ikke settes noen øvre grense for fosfatkonsentrasjonen, bortsett fra den som bestemmes av de praktiske betraktninger som bestemmer den kontinuerlige fermenteringsprosess.

I de ovennevnte britiske patentskrifter er det antydet at en annen faktor som er viktig ved fremstillingen av polysakkarid under anvendelse av Azotobacter vinelandii er mengden oksygen som tilføres til fermenteringssystemet. Oksygenoppløsningshastigheter på 5-50, fortrinnsvis ca 8-20 millimol oksygen pr. liter medium pr. time er nevnt.

Det har vist seg at virkningsgraden for omdannelse av mono- sakkaridet eller disakkaridet som anvendes i mediet, til polysakkarid er avhengig av hastigheten for oksygentilførselen. Under kontinuerlige kulturbetingelser gjelder det samme for oksygen

■som for fosfat, ved at det er forholdet mellom oksygennivå og cellekonsentrasjon som er relevant og ikke oksygenkonsentrasjonen i mediet som sådan. Det er påvist mens en oksygentilførsel på ca 50 millimol pr. g celle pr. time under fosfatbegrensete betingelser gir en sukroseomdannelse på ca 9%, kan en oksygentilførsel på

7-22 millimol/g celle pr. time gi en sukroseomdannelse på over 40%. En oksygentilførsel på 20,5 millimol/g celle pr. time har spesielt vist seg å gi en sukroseomdannelse på ca 4 9%.

Det aktuelle opptak av oksygen i millimol/1 pr. time som svarer til disse tall vil selvfølgelig avhenge av cellekonsen-tras jonen i fermenteringsvekkeren. Opptaket pr. liter pr. time ligger generelt i de områder som er angitt i ovennevnte patentskrifter, men det må fremheves at det er forholdet mellom oksygen-tilførselen og cellekonsentrasjonen som er viktig.

Forandring av oksygentilførselen til kulturen kan foretas

på forskjellig måte. For det første kan konsentrasjonen av oksygen i gassen, vanligvis luft, som føres inn i kulturen under fermenteringen, forandres ved fortynning av luften med nitrogen eller en inert gass, eller ved å anrike luften med ekstra oksygen. For det andre kan trykket av gassen som føres inn i kulturen forandres slik at oppløsningshastigheten varieres. For det tredje kan efféktiviteten hvormed oksygenet i gassfasen overføres til

fase

den vandige forandres ved forandring av gass-væskeblandekarakteri-stikkene, hensiktsmessig ved forandring av hastigheten og effek-tiviteten av omrøreren. En kombinasjon av to eller flere av disse fremgangsmåter kan også benyttes for å frembringe den riktige balanse mellom nitrogen og oksygen.

For å fremstille polysakkarid med høye hastigheter og med

en god omdannelsesvirkningsgrad av mono- eller disakkaridet, er det nødvendig å kontrollere bakteriens veksthastighet og å kontrollere separat respirasjonshastigheten slik at tilførselen av oksygen til bakterien på den ene side ikke er begrensende og på den annen side ikke er unødvendig høy. Det må fremheves at oksygentilførselen ikke må være begrensende idet dette minsker produksjonen av polysakkarid. På den annen side resulterer unød-vendig høye respirasjonshastigheter, frembrakt av høye oksygen-nivåer, i at en stor del av karbohydratkilden oksyderes til kar-

bondioksyd og således gir lave omdannelsesvirkningsgrader.

Oppfinnelsen vil bli nærmere forklart i det etterfølgende ved hjelp av eksempler.

Eksempler 1- 4.

Fire forskjellige medier som angitt i tabell 1 ble anvendt: Mediene ble fremstilt og tilsatt til kulturene i to satser: Sats 1 ble behandlet i en autoklav ved 1 kg/cm 2 i 1 time i to deler som ble kombinert aseptisk etter avkjøling. Den ene del inneholdt sukrose, KH„PO. og K-HPO, i 14 1 mens den annen del 2 4^3 4 inneholdt MgSO^, NaCl, og andre sporelementer enn kalsium og jern 14 1. Sats 2 inneholdt CaCl2 og. FeCl2 12 1. CaCl2 ble behandlet i autoklav i 1,9 1, og FeCl2ble filterstérilisert i 100 ml og deretter tilsatt til hovedmassen av sats 2. Satsen 1 og 2 ble tilsatt til kulturmediet gjennom separate ledninger, idet sats 1 ble tilsatt med en hastighet som var ni ganger større enn tilsetningshastigheten for sats 2, hvorved det ble oppnådd konsentrasjoner i kulturen slik som angitt i tabell 1.

Fire kontinuerlige kulturer av kjemostattype (Herbert et. al, ibid.) under anvendelse av Azotobacter vinelandii NCIB 9068 i et kontinuerlig kulturapparat med et kulturvolum på 1,0 1, ble hver 'tilført et av de sterile medier ifølge tabell 1 med de angitte fosfatkonsentrasjoner. Satsene 1 og 2 ble pumpet inn i kulturen med en kombinert hastighet slik at den fortynningshastighet som er angitt i tabell 2 ble oppnådd, og kulturmassen strømmet via en stigerørsdemning over i en mottaksbeholder. Temperaturen ble regulert slik som angitt i tabell 2.

pH ble regulert til 7,4 ved automatisk tilsetning av IM NaOH. Luft ble sprøytet inn i fermenteringsvekkeren med 1 l/min., og omrørerhastigheten ble regulert slik at oksygenopptakshastigheter i området 10-3 0 m mol/g celle/time ble oppnådd. Prøver ble tatt av fermenteringsvekkeren med dagsintervaller og undersøkt angående cellemasse og polysakkaridkonsentrasjon. Til hver prøve på 4 0 ml ble det tilsatt 0,8 ml og 0,5 m etylendiamintetraeddiksyre pluss 0,8 ml 5 m NaCl. Prøvene ble deretter sentrifugert1 ved 25 000 g i 40 min. Den oppnådde cellepellet ble suspendert igjen i des-tillert vann, sentrifugert ved 25 000 g i 40 min. og den oppå-liggende væske dekantert. Røret som var veiet på forhånd og som inneholdt elementet ble tørket ved 105°C i 12 timer og veiet. Polysakkaridet ble utfelt av væsken fra den første sentrifugering ved tilsetning av 3 volumdeler propan-2-ol. Utfellingen ble opp-samlet ved filtrering og tørket under vakuum ved 4 5°C i 24 timer.

Fosfatbegrensning ble oppnådd ved fosfatkonsentrasjoner på 1,0-3,0 mmol. Særlig nyttige konsentrasjoner av polysakkarid ble oppnådd under anvendelse av media som inneholdt 2,0-3,0 mmol tilsatt - fosfat.

I hvert tilfelle ble det påvist at fosfatkonsentrasjonen var begrensende for cellekonsentrasjonen ved økning av fosfatkonsentrasjonen til det dobbelte: Innen fem timer ble det iakt-tatt at cellekonsentrasjonen hadde økt minst 10%.

Eksempel 5

Virkning på polysakkaridutbytte av forskjellige luftnings-hastigheter i dyrkingsbeholderen under fosfatbegrensete betingelser.

Azotobacter vinelandii NCIB 9068 ble dyrket i en kontinuerlig kultur under anvendelse av et vandig kulturmedium som hadde den i tabell 1 angitte sammensetning i en fermenteringsvekker i en beholder under omrøring.

Til mediet i fermenteringsvekkeren ble det tilsatt et pode-stoff som var dyrket på agar-agar-substrat, ble fermentering ut-ført i en sats i 24 timer ved 3 0°C og pH 7,5. En kontinuerlig mediumtilførsel ble deretter foretatt med en fortynningshastighet på 0,15 h<-1>(dvs. 150 ml/h). Luft ble tilført til kulturen med hastighet på 1,7 l/min. Organismenes respirasjonshastighet ble variert ved regulering av omrøringshastighet og la kulturen nå en stabil tilstand. Ved hver stabile tilstand ble polysakka-ridproduksjonen målt ved hjelp av propan-2-ol-utfelling etter-fulgt av tørrvektsbestemmelse, idet celleprodukt ble målt ved tørrvektsbestemmelse og resterende sukrose målt ved hjelp av gass-væskekromatografibestemmelse. Oksygenopptaket ble målt under anvendelse av et paramagnetisk oksygenahalyseapparat, og C02~utviklingen under anvendelse av et infrarødt C02_analyse-apparat.

Etter at hver stabil tilstand var nådd ble det tilsatt

2 ml. steril f osf atoppløsning (0,12 5 molar) til dyrkingsbeholderen. I hvert tilfelle økte konsentrasjonen av bakterier, noe som viste at cellekonsentrasjonen var blitt begrenset av fosfatkonsentrasjonen. Resultatene er angitt i tabell 3.

Av tabell 3 fremgår det at utbyttet av polysakkarid fra sukrose kan økes fra 9% med høyere luftingshastigheter (og der-ved respirasjonshastigheter) til 47-4 9% ved oksygenopptakshastigheter på mellom 12 og 20 mmol/g celle/time.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et polysakkarid som består av en delvis acetylert, varierende blokkopolymer av 1,4-sammenbundete-D-mannuronsyre- og L-guluronsyrerester, ved kontinuerlig dyrking av en bakterie av arten Azotobacter vinelandii under aerobe betingelser i et vandig dyrkingsmedium som inneholder som vesentlige bestanddeler i det minste ét : mono sakkarid eller disakkarid som karbonkilde og kilder for fosfat, molybden, jern, magnesium, kalium, natrium, kalsium og sulfat, samt en bundet nitrogenkilde og/eller en luftingsgass som inneholder nitrogen, idet mediets pH holdes i område 6,0-8,2, karakterisert ved at fosfatkonsentrasjonen i mediet er begrensende på konsentrasjonen av bakterien og er minst 1,0 mmol/1.

2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at det anvendes Azotobacter vinelandii av stammen NCIB 9068, 8789 eller 8660.

3. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at fosfatkonsentrasjonen i mediet er 2,0-3,0 mmol/1.

4. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at kulturens oksygenopptak er begrenset til et nivå som gir optimal omdannelse av monosakkarid eller disakkarid til polysakkarid.

5. Fremgangsmåte i samsvar med krav 4, karakterisert ved at oksygenopptaket er begrenset til et nivå på ca 7-22 mmol/g celle/time.