NO135993B - - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte

til fremstilling av et polysakkarid, som består av en delvis acetylert, varierende blokkopolymer av 1,4-sammenbundete-D-mannuronsyre- og L-guluronsyrerester, ved aerob dyrking av

en bakterie av arten Azotobacter vinelandii i et vandig kulturmedium som inneholder som vesentlige bestanddeler i det minste ett monosakkarid eller disakkarid som karbonkilde og kilder for fosfat, molybden, jern, magnesium, kalium, natrium, kalsium og sulfat.

Alginsyre, en hydrofil, kolloidal karbohydratsyre, er en varierende blokkopolymer som består av D-mannuronsyre og L-guloronsyreenheter. Selv om alginsyre selv er praktisk talt uløselig i vann kan den lettvint løses ved nøytralisering med et egnet alkali. En av de utmerkete egenskaper hos alginat-løsninger er deres høye viskositet i meget lave konsentrasjoner, og dersom divalente ioner, såsom kalsium eller magnesium, tilsettes alginatløsninger, frembringes det gelatinering.

Alginsyres og alginaters enestående egenskaper gir dem et vidt industrielt anvendelsesområde som emulgeringsmidler, sta-bilisatorer og tykningsmidler. For eksempel kan de i nærings-middelindustrien anvendes som emulsjonsstabilisatorer i iskrem, som gelatineringsmiddel i melkepudding, som tykningsmiddel i saus, samt som skumstabilisatorer i øl. I farmasøytiske produkter kan de anvendes som emulgeringsmiddel og tykningsmiddel for kirurgiske seper og vaskemidler, som oppløsnings- og gran-uleringsmiddel i tabletter, som suspenderingsmiddel i salve, samt som absorberbar gel i kirurgisk bandasje. Ved papir- og tekstilfremstilling kan de anvendes til liming, belegging, appretering, farging og betrykking av komposisjoner. I land-bruket kan de anvendes som jordkondisjoneringsmiddel.

Tidligere er alginsyre og alginater frembrakt i kommersiell målestokk utelukkende ved ekstraksjon av visse tangarter, for eksempel Laminaria digitata og Ascophyllum nodosum hvori de utgjør en stor del av celleveggene. Ved den industrielle fremgangsmåte oppmales og vaskes først våt eller tørket tang, etterfulgt av behandling med natriumkarbonat til dannelse av ubehandlet natriumalginat. Deretter tilsettes kalsiumklorid-løsning, og utfelt kalsiumalginat utvaskes med syre for å

fjerne kalsiumioner. En omtrent ekvimolar mengde fast natriumkarbonat tilsettes, og den halvfaste blanding pulveriseres inntil det er oppnådd en pasta av natriumalginat. Til slutt tørkes og oppmales denne pasta til dannelse av pulverisert produkt. Denne fremgangsmåte er nokså grov og gir et urent produkt, selv om et renere produkt kan oppnås ved utfelling med alkohol. De grove betingelser ved ekstraksjon og bearbeidelse har tendens til å gi. produktet farge og forringe dette. Faste urenheter, såsom cellerester og sandpartikler fjernes ikke fullstendig,

og en viss lukt er ofte nærværende.

Denne vanlige fremgangsmåte har den ulempe at den er av-hengig av tilførsel av alginatinneholdende tang som råstoff. Den, er ubekvem å utføre på grunn av de involverte tangmengder, og en betydelig ytterligere rensing kan være nødvendig, særlig dersom det kreves et produkt for næringsmidler eller farmasøy-tiske produkter. Disse vanskeligheter har hatt tendens til å begrense fullstendig utnyttelse av alginater, og følgelig er det behov for en ny, enkel fremgangsmåte hvorved alginater kan fremstilles i industriell målestokk med den forlangte ren-het av billige og lett tilgjengelige råstoffer.

Det er kjent at arter av Azotobacter kan frembringe eksocellulære polysakkarider. Særlig har det vist seg at Azotobacter vinelandii frembringer et polysakkarid som strukturelt tilsvarer alginsyre frembrakt av tang med unntagelse av at det er delvis acetylert. Biosyntesen av dette alginatliknende polysakkarid er beskrevet av P.A.J. Gorin og J.F.T. Spencer i Canadian Journal of Chemistry, £4 993-998 (1966) og av B. Larsen og A. Haug i Carbohydrate Research, _17, 287-296 (1971). Men selv om fremstillingen av dette polysakkarid er påvist på labora-toriet, er det hittil ikke foreslått noen fremgangsmåte som ville gjøre det mulig å fremstille det med akseptabelt høyt utbytte i kommersiell målestokk.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse frembringes det en fremgangsmåte for fremstilling av en alginatliknende polysakkarid som unngår ulempene med å anvende tang som råstoff, som er praktisk i kommersiell målestokk og anvender lettvint tilgjengelige stoffer samt muliggjør fremstilling av polysakkarid med høyt utbytte ved dyrking av Azotobacter vinelandii.

Overraskende er det iakttatt at utbyttet av det alginatliknende polysakkarid økes sterkt og at en fremgangsmåte i kommersiell målestokk blir mulig dersom Azotobacter vinelandii dyrkes under kulturbetingelser som avviker sterkt fra dem som tidligere alltid ble benyttet for denne mikroorganisme. Nærmere bestemt er det funnet at polysakkaridutbyttet kan økes omtrent fire ganger dersom fosfatkonsentrasjonen i kulturmediet redus-eres til omtrent en tidel av det som vanligvis benyttes og dersom mediets pH-verdi reguleres innenfor visse grenser. Disse iakttagelser er helt uventet og går på tvers av læren ifølge kjent teknikk.

Fremgangsmåten kjennetegnes ved at det anvendes en fosfatkonsentrasjon i mediet på fra 0,1 til 0,8 millimol pr. liter og at mediets pH-verdi under dyrkingen holdes i området 7,0 til 8,2.

En vilkårlig stamme av Azotobacter vinelandii kan anvendes ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse. Imidlertid er særlig verdifulle stammer som gir særlig høyt utbytte av polysakkarid de som har kultursamlingsnumrene NCIB 9068 og NCIB 8789. En annen stamme som kan anvendes har sam-lingsnummeret NCIB 8660. Disse stammer er tilgjengelig uten forbehold fra National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, P.O.Box 31, 13 5 Abbey Road, Aberdeen, Scot-land, Great Britain, og er beskrevet i samlingens katalog.

Et kritisk trekk ved frembringelsen av høye polysakkarid-utbytter ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse er fosfatkonsentrasjonen i kulturmediet. Det er funnet at best polysakkaridutbytte oppnås dersom det arbeides ved en fosfatkonsentrasjon på omtrent 0,1 - 0,8 millimol, fortrinnsvis 0,2 - 0,6 millimol, helst omtrent 0,4 millimol. Dette er i sterk motsetning til de kulturmedier som man hittil har tenkt vil gi de beste vekstbetingelser for Azotobacter vinelandii og som inneholder en fosfatkonsentrasjon på omtrent fem millimol eller mer. For eksempel anvendte Gorin og Spencer i deres ovenfor refererte arbeid med Azotobacter vinelandii Burks medium som er det mest anvendte, vanlige kulturmedium for denne mikroorganisme og som har et fosfatnivå på omtrent 5 mM. Tilsvarende anvendte Larsen og Haug basalmedier med en fosfatkonsentrasjon på omtrent 6 mM. De høye fosfatkonsentrasjoner i disse vanlige medier gir ikke polysakkarid i høyt utbytte.

Fosfatet kan frembringes i kulturmediet på vanlig måte

ved hjelp av egnete fosfatsalter såsom I^HPO^ og ^ 2^ 0^.

En annen kritisk faktor for vellykket utførelse av oppfinnelsen er at mediets pH-verdi holdes på riktig nivå. Dersom det ikke tas skritt for å hindre det, synker kulturmediets pH når dyrking av mikroorganismen skrider frem på grunn av dannelsen av polysakkaridet og andre sure produkter. Tidligere er kulturmediets pH-verdi ikke blitt regulert under dyrkingen av Azotobacter vinelandii. For eksempel vil selv om pH-verdien i det vanligvis anvendte Burkmedium er omtrent 7,4 når dette inokuleres med mikroorganismen, pH-verdien vanligvis ha sunket til omtrent 5,5 ved slutten av dyrkingen. Det er nå.funnet at ved å holde kulturmediets pH-verdi i området fra omtrent 7,0 til omtrent 8,2 under hele dyrkingen, bedres ut-nyttelsen av kulturmediet betydelig, særlig av karbonkilden, og det.oppnås et betydelig høyere polysakkaridutbytte. Kulturmediets pH-verdi holdes fortrinnsvis i området fra omtrent 7,3 til omtrent 7,9 under hele dyrkingen, helst ved omtrent 7,5.

Kulturmediets pH-verdi kan reguleres med vilkårlige midler som ikke innviiter ugunstig på mikroorganismens dyrking. For eksempel kan en utmålt mengde av et alkalisk middel såsom en natriumhydroksydoppløsning tilsettes mediet med mellomrom etter behov, og dette kan gjennomføres automatisk ved hjelp - av en reagensmålende anordning som er forbundet med den pH-målende anordning i kulturmediet. Alternativt kan pH-verdien reguleres ved tilsetning av en egnet buffer til mediet, for eksempel tri-(hydroksyetyl)-aminometan-buffer.

De medfølgende tegninger illustrerer effekten av fosfatkonsentrasjon og pH-verdi på polysakkaridfremstilling, idet: Fig. 1 er et diagram som viser effekten av fosfatkon-sentras jonen i kulturmediet på polysakkaridutbyttet.

•Fig. 2 er et diagram som viser effekten av pH-verdien i

kulturmediet på polysakkaridutbyttet.

Fremgangsmåten for utførelse av disse målinger vil bli beskrevet i de etterfølgende eksempler. Disse diagrammer viser tydelig nytten av å arbeide ifølge den foreliggende oppfinnelse i motsetning til ifølge kjent teknikk.

Dyrkingen av mikroorganismen gjennomføres under aerobe betingelser. Azotobacter vinelandii har en ytterst høy respira-sjonshastighet. Følgelig vil enhver grense av oksygenmengden som tilføres kulturmediet mer påvirkes av praktiske hensyn, såsom utformingen av fermenteringsbeholderen og tilhørende utstyr enn av mikroorganismens krav. Det er funnet at gode resultater kan oppnås med oksygenoppløsningsmengder på fra omtrent 8 til 80, fortrinnsvis omtrent 8 til omtrent 20 millimol oksygen pr. liter medium pr. time, selv om luftningsmengder utenfor disse områder også kan anvendes. Luft anvendes vanligvis som oksygenkilde idet Azotobacter vinelandii er en nitrogen-bindende mikroorganisme og derfor kan utnytte nitrogeninnholdet i luften som nitrogenkilde. Andre oksygen/nitrogenblandinger enn luft er også egnet, og selv rent oksygen eller gassformete blandinger som inneholder oksygen uten nitrogen kan anvendes forutsatt at kulturmediet inneholder en bundet nitrogenkilde som et alternativ.

Én eller flere kilder av vanlig type med bundet nitrogen, såsom nitrater, ammoniumsalter, aminosyrer eller peptonløsning kan eventuelt tilsettes kulturmediet, selv om dette ikke er helt nødvendig når gassformet nitrogen tilføres sammen med oksygen, såsom i luft eller tilsvarende nitrogeninneholdende blandinger. På teoretisk grunnlag kan det ventes at mer effek-tiv vekst kan oppnås dersom en kilde med bundet nitrogen er til stede idet energien som kreves av bakteriecellene for å binde nitrogen stammer fra karbonkilden i mediet. Ikke desto mindre foretrekkes det av praktiske og økonomiske grunner å anvende luft som nitrogenkilde.

Et monosakkarid, disakkarid eller en blanding av disse

kan anvendes som karbonkilde i kulturmediet. For eksempel er sukrose en egnet karbonkilde, noe som også glukose, inklusivt glukose dannet ved hydrolyse av stivelse, er. Mellomprodukter som dannes ved fremstilling av sukker, for eksempel melasse eller invertsukker kan også anvendes som karbonkilde forutsatt at de omfatter ett eller flere monosakkarider eller disakkarider.

Kulturmediet inneholder fortrinnsvis omtrent 0,2 - 3 g sukrose eller en ekvivalent mengde av et annet monosakkarid eller disakkarid pr. 100 ml vann. Karbonkildekonsentrasjoner på omtrent 1 g eller mer sukrose eller ekvivalent pr. 100 ml vann foretrekkes for satsprosesser uten en kilde med bundet nitrogen. Imidlertid kan konsentrasjoner utenfor disse områder anvendes dersom det er ønskelig, for eksempel opp til 10 g sukrose eller ekvivalent av annet monosakkarid eller disakkarid pr. 100 ml vann.

Nærværet av kalsium i kulturmediet er en annen viktig faktor for å sikre høyt polysakkaridutbytte. Det er funnet at dersom det ikke tilsettes noe kalsium, fremstilles det meget

få celler av mikroorganismen, selv om polysakkaridutbyttet pr. celle er høyt. Dersom imidlertid en kalsiumkilde tilsettes, fortrinnsvis slik at det frembringes en kalsiumkonsentrasjon på omtrent 0,02 - 0,6 millimol i kulturmediet, er det mulig å oppnå god vekst av mikroorganismen, noe som gir høyt polysakkaridutbytte. Større eller mindre kalsiummengder kan anvendes, men generelt oppnås ikke ytterligere forbedring med konsentrasjoner på over omtrent 0,6 millimol. Kalsiumet kan tilføres i enhver form som er forenelig med mediet og effektivt styrer veksten. For eksempel kan det tilsettes omtrent 0,01 - 0,25 g kalsium-klorid eller en ekvivalent mengde av et annet kalsiumsalt på 1000 ml medium.

Kulturmediet må også inneholde kilder for kalsium, natrium, jern, molybden, magnesium samt sulfat, som er vesentlige for mikroorganismens riktige vekst. Måten disse elementer kan tilføres er velkjent på området, og de finnes i de vanlige kulturmedier for Azotobacter vinelandii, såsom Burks medium. Typisk kan de tilføres ved tilsetning til kulturmediet av

slike salter som dikaliumhydrogenfosfat, kaliumdihydrogen-fosfat, magnesiumsulfat, natriumklorid, natriummolybdat samt ferrosulfat.

Dyrkingen av mikroorganismen kan utføres under vanlige betingelser. Temperaturen er vanligvis omtrent 25 - 30°C. Høyere eller lavere temperaturer er mulig, men over 34°C

avtar generelt polysakkaridutbyttet. Fermenteringen kan ut-føres enten som en satsvis eller som en kontinuerlig prosess under undervannsbetingelser i en egnet fermenteringsbeholder. Dersom den gjennomføres som en satsvis prosess er fermenter-

ingen vanligvis fullstendig på omtrent 96 timer eller mindre dersom de forskjellige parametre reguleres riktig, selv om lenger tid kan behøves i noen tilfeller.

Cellene av Azotobacter vinelandii som anvendes for å inokulere kulturmediet kan fremstilles ved en vilkårlig teknikk som er kjent på området. For eksempel kan en egnet inokulator fremstilles ved å inkubere bakterien i 48 timer på agar-agar-substrat og deretter i 24 timer i rystekolber. Inokuleringen utgjør fortrinnsvis 1-20 volumprosent av fermenteringsbeholderinnholdet. Før inokulering med mikroorganismen må kulturmediet og fermenteringsbeholderen sterili-seres på vanlig måte.

Når fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes for fremstilling av polysakkarid i kommersiell målestokk gjennomføres dyrkingen av mikroorganismen i en fermenteringsbeholder med stor kapasitet, for eksempel en som har et volum på omtrent 1000 liter. Den tilsvarende store inokuleringsmengde som be-høves for en slik fermenteringsbeholder kan ikke lettvint fremstilles ved hjelp av en rystekolbekultur, og det anvendes derfor én eller flere fermenteringsbeholdere. For eksempel inokuleres en første fermenteringsbeholder med omtrent 5 liters volum med bakterier som er dyrket på et fast medium eller i en rystekolbekultur. Etter en passende inkubasjons-periode anvendes innholdet i denne første fermenteringsbeholder til å inokulere en andre fermenteringsbeholder med et volum på omtrent 100 liter. Etter en ytterligere passende inkubasjons-periode anvendes innholdet i denne andre fermenteringsbeholder for å frembringe inokulering av den endelige fermenteringsbeholder med volum på omtrent 1000 liter, og dykkingen fort-settes i den siste fermenteringsbeholder inntil optimalt polysakkaridutbytte er oppnådd. Kulturbetingelsene og sammensetningen av mediet som er anvendt på de tidligere fermenteringstrinn kan tilsvare de som allerede er beskrevet for sluttfermenteringen. Det er også mulig å gjennomføre disse tidligere fermenteringstrinn under betingelser som kjent fra teknikken for dyrkingen av Azotobacter vinelandii, idet det ikke er nødvendig å gjøre polysakkaridfremstillingen i de foregående fermenteringsbeholderne størst mulig. Likevel foretrekkes det å gjennomføre alle fermenteringstrinn, inklusiv de foregående, ifølge betingelsene ifølge den foreliggende oppfinnelse, slik at inokulatoren som anvendes for det endelige kulturmedium ikke har en uønsket høy fosfatkonsentrasjon eller en uønsket lav pH-verdi.

Ved slutten av fermenteringsprosessen er det oppnådd en kulturvæske som inneholder oppløst polysakkarid. For noen an-vendelser av polysakkaridet er det ikke nødvendig å fjerne cellene av Azotobacter vinelandii. I slike tilfeller kan den viskøse væske som oppnås fra fermenteringsbeholderen enten anvendes som den er, eller den kan sprøytetørkes til et celle-inneholdende pulver. På den annen side kan cellene dersom det er ønskelig fjernes' med vanlige midler, for eksempel i en sentrifuge eller en filterpresse, og den resulterende cellefrie polysakkaridløsning kan også sprøytetørkes eller anvendes som den er. Et renere produkt kan oppnås ved å utfelle polysakkaridet fra løsning med en alkohol såsom isopropanol. Alternativt kan det utfelles et uløselig salt av polysakkaridet

ved tilsetning av et egnet reagens, for eksempel kalsiumsaltet ved tilsetning av kalsiumkloridoppløsning, og den frie syre kan regenereres av saltet ved tilsetning av en sterkere syre.

Andre salter inklusiv løselige salter såsom natriumsaltet kan fremstilles på vanlig måte.

Polysakkaridproduktet som oppnås ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse er en delvis acetylert varierende blokkopolymer av 1,4-sammenbundet-D-mannuronsyre- og L-guluron-syreenheter, idet acetyleringsgraden vanligvis er omtrent 20%. Bortsett fra acetylgruppene er det kjemisk tilsvarende algin-syreekstraktet som ekstraheres fra tang. Det bakterielle produkt og dets derivater stemmer overens med de normer som er foreskrevet for alginsyre og alginater og kan anvendes på samme anvendelsesområder, inklusive for næringsmidler, og farmasøytiske produkter samt ved papir- og tekstilfremstilling.

Oppfinnelsen vil bli ytterligere illustrert ved hjelp av de etterfølgende eksempler.

Eksempel 1

Dette eksempel illustrerer virkningen av forskjellige

fosfatkonsentrasjoner i kulturmediet på polysakkaridutbyttet.

Azotobacter vinelandii NOIB 9068 ble dyrket i rystekolber i et vandig kulturmedium som hadde sammensetningen som er vist i tabell I.

Fosfatkonsentrasjonen i mediet som ble anvendt i forskjellige rystekolber ble variert fra 0,005 til 5,0 millimol ved passende variasjon av de tilsatte mengder KH^PO^ og K2HP04. Etter at mediet var inokulert med mikroorganismen som var dyrket i 48 timer på agar-agar-substrat ble kolbene inkubert i 9 6 timer ved 3 0°C mens de ble rystet ved 20 0 omdreininger pr. minutt på en baneryster (orbital shaker). Under dyrkingen ble mediet holdt på pH 7,5 ved hjelp av tri-(hydroksymetyl)-aminometan-buffer. Ved slutten av dyrkingsperioden på 96 timer ble polysakkaridutbyttet i hver kolbe målt ved isopropanolutfelling av kulturfiltratet etterfulgt av tørrstoffsbestemmelse.

De oppnådde resultater er angitt i tabell 2 og er vist

i grafisk form i fig. 1.

Av tabell 2 og den medfølgende fig. 1 kan det sees at høyere polysakkaridutbytte oppnås ifølge oppfinnelsen med fosfatkonsentrasjoner på omtrent 0,1 - 0,8 millimol. Polysakkaridutbytte synker dersom det arbeides utenfor disse grenser, og kulturmediet som hadde en fosfatkonsentrasjon på 5 millimol ga utpreget dårlige resultater. Dette sistnevnte medium hadde en sammensetning som tilsvarte sammensetningen av Burks medium som tidligere vanligvis ble anvendt for dyrking av Azotobacter vinelandii.

Eksempel 2

Dette eksempel illustrerer virkningen av dyrking ved forskjellige konstante pH-verdier på polysakkaridutbyttet.

Azotobacter vinelandii NCIB 9068 ble dyrket i 4 liter vandig kulturmedium som hadde sammensetningen som er vist i tabell 3 og omrørt i en fermenteringsbeholder.

Fermenteringsbeholderen var utstyrt med en automatisk pH-kontrollanordning for utmåling av IM NaOH for å holde mediets pH på en valgt verdi, og med en oksygenelektrode. Fermenteringsbeholderen var sterilisert på vanlig måte før tilsetning av mediet.

Til mediet i fermenteringsbeholderen ble det tilsatt 10 volumprosent av en inokulator beregnet av mikroorganismen som var blitt dyrket i 48 timer på agar-agar-substrater og deretter inkubert i 24 timer i rystkolber. Fermentering ble deretter gjennomført i 60 timer ved 30°C. Mediet ble omrørt med 400 omdr. pr. minutt, og luft ble boblet gjennom dette med en hastighet av 1,4 liter pr. minutt. Mediets pH-verdi ble holdt konstant ved hjelp av den automatiske tilsetning av den IM NaOH-løsning om nødvendig.

Separate fermenteringsserier ble gjennomført mens kulturmediets pH-verdi ble holdt på 6, 6,5, 7, 7,5, 7,75 samt 8.

Ved slutten av hver serie ble polysakkaridfremstilling målt

ved isopropanolutfelling etterfulgt av tørrstoffbestemmelse.

De oppnådde resultater er angitt i tabell 4 og er vist grafisk i fig. 2.

Tabell 4 og fig. 2 viser at høyere polysakkaridutbytte oppnås når pH i kulturmediet ifølge oppfinnelsen holdes på verdier på 7,0 eg over. Når mediets pH var 6,0 foregikk ingen vekst av mikroorganismen.

Eksempel 3.

Dette eksempel viser de høyere utbytter som oppnås ved

å arbeide under betingelsene ifølge den foreliggende oppfinnelse sammenliknet med kultiveringsbetlngelsene ifølge kjent teknikk. Det ble gjennomført tre serier hvor det ble anvendt samme apparatur, mikroorganisme, kulturmedium og fremgangsmåter som ifølge eksempel 2, med følgende unntagelser: Serie A, ifølge oppfinnelsen, ble gjennomført i et medium som hadde en fosfatkonsentrasjon på 0,25 millimol ved konstant pH-verdi på 7,4.

Serie B, for sammenlikning, ble gjennomført i et medium som hadde en fosfatkonsentrasjon på 5,00 millimol ved konstant pH-verdi på 7,4.

Serie C, for sammenlikning, ble også gjennomført i et medium som hadde en fosfatkonsentrasjon på 5,00 millimol, men mediets pH-verdi ble ikke regulert under kultiveringen og falt således fra en begynnelsesverdi på 7,4 til 6,4 etter 24 timer og til 6,05 etter 48 timer.

I hver serie ble polysakkaridutbyttet målt etter 24 og 48 timer ved samme fremgangsmåte som ifølge eksempel 2. De oppnådde resultater er angitt i tabell 5.

Disse resultater viser klart at utpreget bedre polysakkaridutbytte oppnås under betingelsene med lav fosfatkonsentrasjon og pH-regulering ifølge den foreliggende oppfinnelse enn under betingelsene ifølge kjent teknikk med høy fosfatkonsentrasjon og fallende pH-verdi.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et polysakkarid, som består av en delvis acetylert, varierende blokkopolymer av 1,4-sammenbundete-D-mannuronsyre- og L-guluronsyrerester, ved aerob dyrking av en bakterie av arten Azotobacter vinelandii i et vandig kulturmedium som inneholder som vesentlige bestanddeler i det minste ett monosakkarid eller disakkarid som karbonkilde og kilder for fosfat, molybden, jern, magnesium, kalium, natrium, kalsium og sulfat, karakterisert ved at det anvendes en fosfatkonsentrasjon i mediet på fra 0,1 til 0,8 millimol pr. liter og at mediets pH-verdi under dyrkingen holdes i området 7,0 til 8,2.

2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at det anvendes en fosfatkonsentrasjon i mediet på fra 0,2 til 0,6 millimol pr. liter.

3. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1 eller 2, karakterisert ved at mediets pH-verdi under dyrkingen holdes i området 7,3 til 7,9.

4. Fremgangsmåte i samsvar med ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at det dyrkes en bakterie fra stamme NCIB 8660, NCIB 8789 eller NCIB 9068.

5. Fremgangsmåte i samsvar med ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at det anvendes en kalsiumkonsentrasjon i mediet på fra 0,02 til 0,6 millimol pr. liter.