NO135993B

NO135993B -

Info

Publication number: NO135993B
Application number: NO221873A
Authority: NO
Inventors: F K E Imrie
Original assignee: Tate & Lyle Ltd
Priority date: 1973-05-29
Filing date: 1973-05-29
Publication date: 1977-03-28
Also published as: NO135993C

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte The present invention relates to a method

til fremstilling av et polysakkarid, som består av en delvis acetylert, varierende blokkopolymer av 1,4-sammenbundete-D-mannuronsyre- og L-guluronsyrerester, ved aerob dyrking av for the production of a polysaccharide, consisting of a partially acetylated, varying block copolymer of 1,4-linked-D-mannuronic acid and L-guluronic acid residues, by aerobic cultivation of

en bakterie av arten Azotobacter vinelandii i et vandig kulturmedium som inneholder som vesentlige bestanddeler i det minste ett monosakkarid eller disakkarid som karbonkilde og kilder for fosfat, molybden, jern, magnesium, kalium, natrium, kalsium og sulfat. a bacterium of the species Azotobacter vinelandii in an aqueous culture medium containing as essential constituents at least one monosaccharide or disaccharide as a carbon source and sources for phosphate, molybdenum, iron, magnesium, potassium, sodium, calcium and sulphate.

Alginsyre, en hydrofil, kolloidal karbohydratsyre, er en varierende blokkopolymer som består av D-mannuronsyre og L-guloronsyreenheter. Selv om alginsyre selv er praktisk talt uløselig i vann kan den lettvint løses ved nøytralisering med et egnet alkali. En av de utmerkete egenskaper hos alginat-løsninger er deres høye viskositet i meget lave konsentrasjoner, og dersom divalente ioner, såsom kalsium eller magnesium, tilsettes alginatløsninger, frembringes det gelatinering. Alginic acid, a hydrophilic, colloidal carbohydrate acid, is a variable block copolymer composed of D-mannuronic acid and L-guluronic acid units. Although alginic acid itself is practically insoluble in water, it can easily be dissolved by neutralization with a suitable alkali. One of the excellent properties of alginate solutions is their high viscosity in very low concentrations, and if divalent ions, such as calcium or magnesium, are added to alginate solutions, gelatinization is produced.

Alginsyres og alginaters enestående egenskaper gir dem et vidt industrielt anvendelsesområde som emulgeringsmidler, sta-bilisatorer og tykningsmidler. For eksempel kan de i nærings-middelindustrien anvendes som emulsjonsstabilisatorer i iskrem, som gelatineringsmiddel i melkepudding, som tykningsmiddel i saus, samt som skumstabilisatorer i øl. I farmasøytiske produkter kan de anvendes som emulgeringsmiddel og tykningsmiddel for kirurgiske seper og vaskemidler, som oppløsnings- og gran-uleringsmiddel i tabletter, som suspenderingsmiddel i salve, samt som absorberbar gel i kirurgisk bandasje. Ved papir- og tekstilfremstilling kan de anvendes til liming, belegging, appretering, farging og betrykking av komposisjoner. I land-bruket kan de anvendes som jordkondisjoneringsmiddel. The unique properties of alginic acid and alginates give them a wide range of industrial applications as emulsifiers, stabilizers and thickeners. For example, in the food industry they can be used as emulsion stabilizers in ice cream, as a gelatinizing agent in milk pudding, as a thickener in sauce, and as foam stabilizers in beer. In pharmaceutical products, they can be used as an emulsifier and thickener for surgical septa and detergents, as a dissolving and granulating agent in tablets, as a suspending agent in an ointment, and as an absorbable gel in a surgical bandage. In paper and textile production, they can be used for gluing, coating, finishing, dyeing and printing compositions. In agriculture, they can be used as a soil conditioner.

Tidligere er alginsyre og alginater frembrakt i kommersiell målestokk utelukkende ved ekstraksjon av visse tangarter, for eksempel Laminaria digitata og Ascophyllum nodosum hvori de utgjør en stor del av celleveggene. Ved den industrielle fremgangsmåte oppmales og vaskes først våt eller tørket tang, etterfulgt av behandling med natriumkarbonat til dannelse av ubehandlet natriumalginat. Deretter tilsettes kalsiumklorid-løsning, og utfelt kalsiumalginat utvaskes med syre for å In the past, alginic acid and alginates have been produced on a commercial scale exclusively by the extraction of certain species of seaweed, for example Laminaria digitata and Ascophyllum nodosum in which they form a large part of the cell walls. In the industrial method, wet or dried seaweed is first ground and washed, followed by treatment with sodium carbonate to form untreated sodium alginate. Calcium chloride solution is then added, and the precipitated calcium alginate is washed out with acid to

fjerne kalsiumioner. En omtrent ekvimolar mengde fast natriumkarbonat tilsettes, og den halvfaste blanding pulveriseres inntil det er oppnådd en pasta av natriumalginat. Til slutt tørkes og oppmales denne pasta til dannelse av pulverisert produkt. Denne fremgangsmåte er nokså grov og gir et urent produkt, selv om et renere produkt kan oppnås ved utfelling med alkohol. De grove betingelser ved ekstraksjon og bearbeidelse har tendens til å gi. produktet farge og forringe dette. Faste urenheter, såsom cellerester og sandpartikler fjernes ikke fullstendig, remove calcium ions. An approximately equimolar amount of solid sodium carbonate is added, and the semi-solid mixture is pulverized until a paste of sodium alginate is obtained. Finally, this paste is dried and ground to form a powdered product. This method is rather rough and gives an impure product, although a cleaner product can be obtained by precipitation with alcohol. The harsh conditions of extraction and processing tend to give product color and deteriorate this. Solid impurities, such as cell debris and sand particles, are not completely removed,

og en viss lukt er ofte nærværende. and a certain odor is often present.

Denne vanlige fremgangsmåte har den ulempe at den er av-hengig av tilførsel av alginatinneholdende tang som råstoff. Den, er ubekvem å utføre på grunn av de involverte tangmengder, og en betydelig ytterligere rensing kan være nødvendig, særlig dersom det kreves et produkt for næringsmidler eller farmasøy-tiske produkter. Disse vanskeligheter har hatt tendens til å begrense fullstendig utnyttelse av alginater, og følgelig er det behov for en ny, enkel fremgangsmåte hvorved alginater kan fremstilles i industriell målestokk med den forlangte ren-het av billige og lett tilgjengelige råstoffer. This common method has the disadvantage that it depends on the supply of alginate-containing seaweed as raw material. It is inconvenient to carry out because of the amounts of seaweed involved, and a considerable further purification may be necessary, especially if a product for foodstuffs or pharmaceutical products is required. These difficulties have tended to limit the full utilization of alginates, and consequently there is a need for a new, simple process by which alginates can be produced on an industrial scale with the required purity from cheap and readily available raw materials.

Det er kjent at arter av Azotobacter kan frembringe eksocellulære polysakkarider. Særlig har det vist seg at Azotobacter vinelandii frembringer et polysakkarid som strukturelt tilsvarer alginsyre frembrakt av tang med unntagelse av at det er delvis acetylert. Biosyntesen av dette alginatliknende polysakkarid er beskrevet av P.A.J. Gorin og J.F.T. Spencer i Canadian Journal of Chemistry, £4 993-998 (1966) og av B. Larsen og A. Haug i Carbohydrate Research, _17, 287-296 (1971). Men selv om fremstillingen av dette polysakkarid er påvist på labora-toriet, er det hittil ikke foreslått noen fremgangsmåte som ville gjøre det mulig å fremstille det med akseptabelt høyt utbytte i kommersiell målestokk. It is known that species of Azotobacter can produce exocellular polysaccharides. In particular, it has been shown that Azotobacter vinelandii produces a polysaccharide that structurally corresponds to alginic acid produced by seaweed, with the exception that it is partially acetylated. The biosynthesis of this alginate-like polysaccharide is described by P.A.J. Gorin and J.F.T. Spencer in Canadian Journal of Chemistry, £4,993-998 (1966) and by B. Larsen and A. Haug in Carbohydrate Research, _17, 287-296 (1971). However, although the production of this polysaccharide has been demonstrated in the laboratory, no method has so far been proposed which would make it possible to produce it with an acceptably high yield on a commercial scale.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse frembringes det en fremgangsmåte for fremstilling av en alginatliknende polysakkarid som unngår ulempene med å anvende tang som råstoff, som er praktisk i kommersiell målestokk og anvender lettvint tilgjengelige stoffer samt muliggjør fremstilling av polysakkarid med høyt utbytte ved dyrking av Azotobacter vinelandii. According to the present invention, a method for the production of an alginate-like polysaccharide is produced which avoids the disadvantages of using seaweed as raw material, which is practical on a commercial scale and uses readily available substances and enables the production of polysaccharide with a high yield when cultivating Azotobacter vinelandii.

Overraskende er det iakttatt at utbyttet av det alginatliknende polysakkarid økes sterkt og at en fremgangsmåte i kommersiell målestokk blir mulig dersom Azotobacter vinelandii dyrkes under kulturbetingelser som avviker sterkt fra dem som tidligere alltid ble benyttet for denne mikroorganisme. Nærmere bestemt er det funnet at polysakkaridutbyttet kan økes omtrent fire ganger dersom fosfatkonsentrasjonen i kulturmediet redus-eres til omtrent en tidel av det som vanligvis benyttes og dersom mediets pH-verdi reguleres innenfor visse grenser. Disse iakttagelser er helt uventet og går på tvers av læren ifølge kjent teknikk. Surprisingly, it has been observed that the yield of the alginate-like polysaccharide is greatly increased and that a process on a commercial scale becomes possible if Azotobacter vinelandii is grown under culture conditions that deviate greatly from those that were always used for this microorganism in the past. More specifically, it has been found that the polysaccharide yield can be increased approximately fourfold if the phosphate concentration in the culture medium is reduced to approximately one-tenth of what is usually used and if the medium's pH value is regulated within certain limits. These observations are completely unexpected and go against the teachings of the prior art.

Fremgangsmåten kjennetegnes ved at det anvendes en fosfatkonsentrasjon i mediet på fra 0,1 til 0,8 millimol pr. liter og at mediets pH-verdi under dyrkingen holdes i området 7,0 til 8,2. The method is characterized by the fact that a phosphate concentration in the medium of from 0.1 to 0.8 millimol per liter and that the medium's pH value during cultivation is kept in the range 7.0 to 8.2.

En vilkårlig stamme av Azotobacter vinelandii kan anvendes ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse. Imidlertid er særlig verdifulle stammer som gir særlig høyt utbytte av polysakkarid de som har kultursamlingsnumrene NCIB 9068 og NCIB 8789. En annen stamme som kan anvendes har sam-lingsnummeret NCIB 8660. Disse stammer er tilgjengelig uten forbehold fra National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, P.O.Box 31, 13 5 Abbey Road, Aberdeen, Scot-land, Great Britain, og er beskrevet i samlingens katalog. Any strain of Azotobacter vinelandii can be used in the method according to the present invention. However, particularly valuable strains that give a particularly high yield of polysaccharide are those with culture collection numbers NCIB 9068 and NCIB 8789. Another strain that can be used has collection number NCIB 8660. These strains are available without reservation from the National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, P.O.Box 31, 13 5 Abbey Road, Aberdeen, Scotland, Great Britain, and is described in the collection's catalogue.

Et kritisk trekk ved frembringelsen av høye polysakkarid-utbytter ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse er fosfatkonsentrasjonen i kulturmediet. Det er funnet at best polysakkaridutbytte oppnås dersom det arbeides ved en fosfatkonsentrasjon på omtrent 0,1 - 0,8 millimol, fortrinnsvis 0,2 - 0,6 millimol, helst omtrent 0,4 millimol. Dette er i sterk motsetning til de kulturmedier som man hittil har tenkt vil gi de beste vekstbetingelser for Azotobacter vinelandii og som inneholder en fosfatkonsentrasjon på omtrent fem millimol eller mer. For eksempel anvendte Gorin og Spencer i deres ovenfor refererte arbeid med Azotobacter vinelandii Burks medium som er det mest anvendte, vanlige kulturmedium for denne mikroorganisme og som har et fosfatnivå på omtrent 5 mM. Tilsvarende anvendte Larsen og Haug basalmedier med en fosfatkonsentrasjon på omtrent 6 mM. De høye fosfatkonsentrasjoner i disse vanlige medier gir ikke polysakkarid i høyt utbytte. A critical feature in the production of high polysaccharide yields by the method according to the present invention is the phosphate concentration in the culture medium. It has been found that the best polysaccharide yield is achieved if working at a phosphate concentration of approximately 0.1 - 0.8 millimoles, preferably 0.2 - 0.6 millimoles, preferably approximately 0.4 millimoles. This is in stark contrast to the culture media that have so far been thought to provide the best growth conditions for Azotobacter vinelandii and which contain a phosphate concentration of approximately five millimoles or more. For example, in their work with Azotobacter vinelandii referred to above, Gorin and Spencer used Burk's medium which is the most commonly used culture medium for this microorganism and which has a phosphate level of approximately 5 mM. Similarly, Larsen and Haug used basal media with a phosphate concentration of approximately 6 mM. The high phosphate concentrations in these common media do not produce polysaccharide in high yield.

Fosfatet kan frembringes i kulturmediet på vanlig måte The phosphate can be produced in the culture medium in the usual way

ved hjelp av egnete fosfatsalter såsom I^HPO^ og ^ 2^ 0^. by means of suitable phosphate salts such as I^HPO^ and ^ 2^ 0^.

En annen kritisk faktor for vellykket utførelse av oppfinnelsen er at mediets pH-verdi holdes på riktig nivå. Dersom det ikke tas skritt for å hindre det, synker kulturmediets pH når dyrking av mikroorganismen skrider frem på grunn av dannelsen av polysakkaridet og andre sure produkter. Tidligere er kulturmediets pH-verdi ikke blitt regulert under dyrkingen av Azotobacter vinelandii. For eksempel vil selv om pH-verdien i det vanligvis anvendte Burkmedium er omtrent 7,4 når dette inokuleres med mikroorganismen, pH-verdien vanligvis ha sunket til omtrent 5,5 ved slutten av dyrkingen. Det er nå.funnet at ved å holde kulturmediets pH-verdi i området fra omtrent 7,0 til omtrent 8,2 under hele dyrkingen, bedres ut-nyttelsen av kulturmediet betydelig, særlig av karbonkilden, og det.oppnås et betydelig høyere polysakkaridutbytte. Kulturmediets pH-verdi holdes fortrinnsvis i området fra omtrent 7,3 til omtrent 7,9 under hele dyrkingen, helst ved omtrent 7,5. Another critical factor for the successful implementation of the invention is that the medium's pH value is kept at the correct level. If steps are not taken to prevent it, the pH of the culture medium drops as cultivation of the microorganism progresses due to the formation of the polysaccharide and other acidic products. In the past, the culture medium's pH value has not been regulated during the cultivation of Azotobacter vinelandii. For example, although the pH value of the commonly used Burk medium is about 7.4 when it is inoculated with the microorganism, the pH value will usually have dropped to about 5.5 by the end of the cultivation. It has now been found that by keeping the pH value of the culture medium in the range from approximately 7.0 to approximately 8.2 during the entire cultivation, the utilization of the culture medium is significantly improved, particularly of the carbon source, and a significantly higher polysaccharide yield is achieved. The pH value of the culture medium is preferably maintained in the range from about 7.3 to about 7.9 throughout the cultivation, preferably at about 7.5.

Kulturmediets pH-verdi kan reguleres med vilkårlige midler som ikke innviiter ugunstig på mikroorganismens dyrking. For eksempel kan en utmålt mengde av et alkalisk middel såsom en natriumhydroksydoppløsning tilsettes mediet med mellomrom etter behov, og dette kan gjennomføres automatisk ved hjelp - av en reagensmålende anordning som er forbundet med den pH-målende anordning i kulturmediet. Alternativt kan pH-verdien reguleres ved tilsetning av en egnet buffer til mediet, for eksempel tri-(hydroksyetyl)-aminometan-buffer. The culture medium's pH value can be regulated with arbitrary means that do not adversely affect the cultivation of the microorganism. For example, a measured amount of an alkaline agent such as a sodium hydroxide solution can be added to the medium at intervals as needed, and this can be carried out automatically by means of - a reagent measuring device which is connected to the pH measuring device in the culture medium. Alternatively, the pH value can be regulated by adding a suitable buffer to the medium, for example tri-(hydroxyethyl)-aminomethane buffer.

De medfølgende tegninger illustrerer effekten av fosfatkonsentrasjon og pH-verdi på polysakkaridfremstilling, idet: Fig. 1 er et diagram som viser effekten av fosfatkon-sentras jonen i kulturmediet på polysakkaridutbyttet. The accompanying drawings illustrate the effect of phosphate concentration and pH value on polysaccharide production, in that: Fig. 1 is a diagram showing the effect of the phosphate concentration in the culture medium on the polysaccharide yield.

•Fig. 2 er et diagram som viser effekten av pH-verdien i •Fig. 2 is a diagram showing the effect of pH i

kulturmediet på polysakkaridutbyttet. the culture medium on the polysaccharide yield.

Fremgangsmåten for utførelse av disse målinger vil bli beskrevet i de etterfølgende eksempler. Disse diagrammer viser tydelig nytten av å arbeide ifølge den foreliggende oppfinnelse i motsetning til ifølge kjent teknikk. The procedure for carrying out these measurements will be described in the following examples. These diagrams clearly show the benefit of working according to the present invention as opposed to according to the prior art.

Dyrkingen av mikroorganismen gjennomføres under aerobe betingelser. Azotobacter vinelandii har en ytterst høy respira-sjonshastighet. Følgelig vil enhver grense av oksygenmengden som tilføres kulturmediet mer påvirkes av praktiske hensyn, såsom utformingen av fermenteringsbeholderen og tilhørende utstyr enn av mikroorganismens krav. Det er funnet at gode resultater kan oppnås med oksygenoppløsningsmengder på fra omtrent 8 til 80, fortrinnsvis omtrent 8 til omtrent 20 millimol oksygen pr. liter medium pr. time, selv om luftningsmengder utenfor disse områder også kan anvendes. Luft anvendes vanligvis som oksygenkilde idet Azotobacter vinelandii er en nitrogen-bindende mikroorganisme og derfor kan utnytte nitrogeninnholdet i luften som nitrogenkilde. Andre oksygen/nitrogenblandinger enn luft er også egnet, og selv rent oksygen eller gassformete blandinger som inneholder oksygen uten nitrogen kan anvendes forutsatt at kulturmediet inneholder en bundet nitrogenkilde som et alternativ. The cultivation of the microorganism is carried out under aerobic conditions. Azotobacter vinelandii has an extremely high respiration rate. Consequently, any limit to the amount of oxygen supplied to the culture medium will be more influenced by practical considerations, such as the design of the fermentation vessel and associated equipment, than by the requirements of the microorganism. It has been found that good results can be obtained with oxygen solution amounts of from about 8 to about 80, preferably about 8 to about 20 millimoles of oxygen per liter of medium per hour, although aeration amounts outside these areas can also be used. Air is usually used as an oxygen source as Azotobacter vinelandii is a nitrogen-fixing microorganism and can therefore utilize the nitrogen content in the air as a nitrogen source. Oxygen/nitrogen mixtures other than air are also suitable, and even pure oxygen or gaseous mixtures containing oxygen without nitrogen can be used provided that the culture medium contains a bound nitrogen source as an alternative.

Én eller flere kilder av vanlig type med bundet nitrogen, såsom nitrater, ammoniumsalter, aminosyrer eller peptonløsning kan eventuelt tilsettes kulturmediet, selv om dette ikke er helt nødvendig når gassformet nitrogen tilføres sammen med oksygen, såsom i luft eller tilsvarende nitrogeninneholdende blandinger. På teoretisk grunnlag kan det ventes at mer effek-tiv vekst kan oppnås dersom en kilde med bundet nitrogen er til stede idet energien som kreves av bakteriecellene for å binde nitrogen stammer fra karbonkilden i mediet. Ikke desto mindre foretrekkes det av praktiske og økonomiske grunner å anvende luft som nitrogenkilde. One or more sources of the usual type with bound nitrogen, such as nitrates, ammonium salts, amino acids or peptone solution can optionally be added to the culture medium, although this is not absolutely necessary when gaseous nitrogen is supplied together with oxygen, such as in air or similar nitrogen-containing mixtures. On a theoretical basis, it can be expected that more effective growth can be achieved if a source of bound nitrogen is present, as the energy required by the bacterial cells to bind nitrogen comes from the carbon source in the medium. Nevertheless, it is preferred for practical and economic reasons to use air as a nitrogen source.

Et monosakkarid, disakkarid eller en blanding av disse A monosaccharide, disaccharide or a mixture of these

kan anvendes som karbonkilde i kulturmediet. For eksempel er sukrose en egnet karbonkilde, noe som også glukose, inklusivt glukose dannet ved hydrolyse av stivelse, er. Mellomprodukter som dannes ved fremstilling av sukker, for eksempel melasse eller invertsukker kan også anvendes som karbonkilde forutsatt at de omfatter ett eller flere monosakkarider eller disakkarider. can be used as a carbon source in the culture medium. For example, sucrose is a suitable carbon source, as is glucose, including glucose formed by hydrolysis of starch. Intermediate products formed during the production of sugar, for example molasses or invert sugar, can also be used as a carbon source, provided that they comprise one or more monosaccharides or disaccharides.

Kulturmediet inneholder fortrinnsvis omtrent 0,2 - 3 g sukrose eller en ekvivalent mengde av et annet monosakkarid eller disakkarid pr. 100 ml vann. Karbonkildekonsentrasjoner på omtrent 1 g eller mer sukrose eller ekvivalent pr. 100 ml vann foretrekkes for satsprosesser uten en kilde med bundet nitrogen. Imidlertid kan konsentrasjoner utenfor disse områder anvendes dersom det er ønskelig, for eksempel opp til 10 g sukrose eller ekvivalent av annet monosakkarid eller disakkarid pr. 100 ml vann. The culture medium preferably contains approximately 0.2 - 3 g of sucrose or an equivalent amount of another monosaccharide or disaccharide per 100 ml of water. Carbon source concentrations of approximately 1 g or more of sucrose or equivalent per 100 ml of water is preferred for batch processes without a source of bound nitrogen. However, concentrations outside these ranges can be used if desired, for example up to 10 g of sucrose or the equivalent of another monosaccharide or disaccharide per 100 ml of water.

Nærværet av kalsium i kulturmediet er en annen viktig faktor for å sikre høyt polysakkaridutbytte. Det er funnet at dersom det ikke tilsettes noe kalsium, fremstilles det meget The presence of calcium in the culture medium is another important factor to ensure a high polysaccharide yield. It has been found that if no calcium is added, a lot is produced

få celler av mikroorganismen, selv om polysakkaridutbyttet pr. celle er høyt. Dersom imidlertid en kalsiumkilde tilsettes, fortrinnsvis slik at det frembringes en kalsiumkonsentrasjon på omtrent 0,02 - 0,6 millimol i kulturmediet, er det mulig å oppnå god vekst av mikroorganismen, noe som gir høyt polysakkaridutbytte. Større eller mindre kalsiummengder kan anvendes, men generelt oppnås ikke ytterligere forbedring med konsentrasjoner på over omtrent 0,6 millimol. Kalsiumet kan tilføres i enhver form som er forenelig med mediet og effektivt styrer veksten. For eksempel kan det tilsettes omtrent 0,01 - 0,25 g kalsium-klorid eller en ekvivalent mengde av et annet kalsiumsalt på 1000 ml medium. few cells of the microorganism, even if the polysaccharide yield per cell is high. If, however, a calcium source is added, preferably so that a calcium concentration of approximately 0.02 - 0.6 millimoles is produced in the culture medium, it is possible to achieve good growth of the microorganism, which gives a high polysaccharide yield. Larger or smaller amounts of calcium can be used, but generally no further improvement is achieved with concentrations above about 0.6 millimoles. The calcium can be added in any form that is compatible with the medium and effectively controls growth. For example, approximately 0.01 - 0.25 g of calcium chloride or an equivalent amount of another calcium salt can be added to 1000 ml of medium.

Kulturmediet må også inneholde kilder for kalsium, natrium, jern, molybden, magnesium samt sulfat, som er vesentlige for mikroorganismens riktige vekst. Måten disse elementer kan tilføres er velkjent på området, og de finnes i de vanlige kulturmedier for Azotobacter vinelandii, såsom Burks medium. Typisk kan de tilføres ved tilsetning til kulturmediet av The culture medium must also contain sources of calcium, sodium, iron, molybdenum, magnesium and sulphate, which are essential for the correct growth of the microorganism. The way in which these elements can be added is well known in the field, and they are found in the usual culture media for Azotobacter vinelandii, such as Burk's medium. Typically, they can be supplied by adding to the culture medium of

slike salter som dikaliumhydrogenfosfat, kaliumdihydrogen-fosfat, magnesiumsulfat, natriumklorid, natriummolybdat samt ferrosulfat. such salts as dipotassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulphate, sodium chloride, sodium molybdate and ferrous sulphate.

Dyrkingen av mikroorganismen kan utføres under vanlige betingelser. Temperaturen er vanligvis omtrent 25 - 30°C. Høyere eller lavere temperaturer er mulig, men over 34°C The cultivation of the microorganism can be carried out under normal conditions. The temperature is usually around 25 - 30°C. Higher or lower temperatures are possible, but above 34°C

avtar generelt polysakkaridutbyttet. Fermenteringen kan ut-føres enten som en satsvis eller som en kontinuerlig prosess under undervannsbetingelser i en egnet fermenteringsbeholder. Dersom den gjennomføres som en satsvis prosess er fermenter- generally decreases the polysaccharide yield. The fermentation can be carried out either as a batch or as a continuous process under underwater conditions in a suitable fermentation container. If it is carried out as a batch process, the fermenter

ingen vanligvis fullstendig på omtrent 96 timer eller mindre dersom de forskjellige parametre reguleres riktig, selv om lenger tid kan behøves i noen tilfeller. none usually completely in about 96 hours or less if the various parameters are adjusted correctly, although longer time may be needed in some cases.

Cellene av Azotobacter vinelandii som anvendes for å inokulere kulturmediet kan fremstilles ved en vilkårlig teknikk som er kjent på området. For eksempel kan en egnet inokulator fremstilles ved å inkubere bakterien i 48 timer på agar-agar-substrat og deretter i 24 timer i rystekolber. Inokuleringen utgjør fortrinnsvis 1-20 volumprosent av fermenteringsbeholderinnholdet. Før inokulering med mikroorganismen må kulturmediet og fermenteringsbeholderen sterili-seres på vanlig måte. The cells of Azotobacter vinelandii which are used to inoculate the culture medium can be produced by any technique known in the field. For example, a suitable inoculator can be prepared by incubating the bacterium for 48 hours on agar-agar substrate and then for 24 hours in shake flasks. The inoculation preferably makes up 1-20 percent by volume of the fermentation vessel contents. Before inoculation with the microorganism, the culture medium and the fermentation container must be sterilized in the usual way.

Når fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes for fremstilling av polysakkarid i kommersiell målestokk gjennomføres dyrkingen av mikroorganismen i en fermenteringsbeholder med stor kapasitet, for eksempel en som har et volum på omtrent 1000 liter. Den tilsvarende store inokuleringsmengde som be-høves for en slik fermenteringsbeholder kan ikke lettvint fremstilles ved hjelp av en rystekolbekultur, og det anvendes derfor én eller flere fermenteringsbeholdere. For eksempel inokuleres en første fermenteringsbeholder med omtrent 5 liters volum med bakterier som er dyrket på et fast medium eller i en rystekolbekultur. Etter en passende inkubasjons-periode anvendes innholdet i denne første fermenteringsbeholder til å inokulere en andre fermenteringsbeholder med et volum på omtrent 100 liter. Etter en ytterligere passende inkubasjons-periode anvendes innholdet i denne andre fermenteringsbeholder for å frembringe inokulering av den endelige fermenteringsbeholder med volum på omtrent 1000 liter, og dykkingen fort-settes i den siste fermenteringsbeholder inntil optimalt polysakkaridutbytte er oppnådd. Kulturbetingelsene og sammensetningen av mediet som er anvendt på de tidligere fermenteringstrinn kan tilsvare de som allerede er beskrevet for sluttfermenteringen. Det er også mulig å gjennomføre disse tidligere fermenteringstrinn under betingelser som kjent fra teknikken for dyrkingen av Azotobacter vinelandii, idet det ikke er nødvendig å gjøre polysakkaridfremstillingen i de foregående fermenteringsbeholderne størst mulig. Likevel foretrekkes det å gjennomføre alle fermenteringstrinn, inklusiv de foregående, ifølge betingelsene ifølge den foreliggende oppfinnelse, slik at inokulatoren som anvendes for det endelige kulturmedium ikke har en uønsket høy fosfatkonsentrasjon eller en uønsket lav pH-verdi. When the method according to the invention is used for the production of polysaccharide on a commercial scale, the cultivation of the microorganism is carried out in a fermentation container with a large capacity, for example one with a volume of approximately 1000 litres. The correspondingly large amount of inoculation required for such a fermentation vessel cannot easily be produced using a shake flask culture, and one or more fermentation vessels are therefore used. For example, a first fermentation vessel of approximately 5 liters volume is inoculated with bacteria grown on a solid medium or in a shake flask culture. After a suitable incubation period, the contents of this first fermentation vessel are used to inoculate a second fermentation vessel with a volume of approximately 100 litres. After a further suitable incubation period, the contents of this second fermentation vessel are used to inoculate the final fermentation vessel with a volume of approximately 1000 litres, and diving is continued in the last fermentation vessel until optimum polysaccharide yield is achieved. The culture conditions and composition of the medium used in the previous fermentation steps may correspond to those already described for the final fermentation. It is also possible to carry out these previous fermentation steps under conditions known from the technique for the cultivation of Azotobacter vinelandii, as it is not necessary to make the polysaccharide production in the preceding fermentation containers as large as possible. Nevertheless, it is preferred to carry out all fermentation steps, including the previous ones, according to the conditions according to the present invention, so that the inoculum used for the final culture medium does not have an undesired high phosphate concentration or an undesired low pH value.

Ved slutten av fermenteringsprosessen er det oppnådd en kulturvæske som inneholder oppløst polysakkarid. For noen an-vendelser av polysakkaridet er det ikke nødvendig å fjerne cellene av Azotobacter vinelandii. I slike tilfeller kan den viskøse væske som oppnås fra fermenteringsbeholderen enten anvendes som den er, eller den kan sprøytetørkes til et celle-inneholdende pulver. På den annen side kan cellene dersom det er ønskelig fjernes' med vanlige midler, for eksempel i en sentrifuge eller en filterpresse, og den resulterende cellefrie polysakkaridløsning kan også sprøytetørkes eller anvendes som den er. Et renere produkt kan oppnås ved å utfelle polysakkaridet fra løsning med en alkohol såsom isopropanol. Alternativt kan det utfelles et uløselig salt av polysakkaridet At the end of the fermentation process, a culture liquid containing dissolved polysaccharide has been obtained. For some applications of the polysaccharide, it is not necessary to remove the cells of Azotobacter vinelandii. In such cases, the viscous liquid obtained from the fermentation vessel can either be used as is, or it can be spray-dried into a cell-containing powder. On the other hand, if desired, the cells can be removed by conventional means, for example in a centrifuge or a filter press, and the resulting cell-free polysaccharide solution can also be spray-dried or used as is. A purer product can be obtained by precipitating the polysaccharide from solution with an alcohol such as isopropanol. Alternatively, an insoluble salt of the polysaccharide can be precipitated

ved tilsetning av et egnet reagens, for eksempel kalsiumsaltet ved tilsetning av kalsiumkloridoppløsning, og den frie syre kan regenereres av saltet ved tilsetning av en sterkere syre. by adding a suitable reagent, for example the calcium salt by adding calcium chloride solution, and the free acid can be regenerated by the salt by adding a stronger acid.

Andre salter inklusiv løselige salter såsom natriumsaltet kan fremstilles på vanlig måte. Other salts including soluble salts such as the sodium salt can be prepared in the usual way.

Polysakkaridproduktet som oppnås ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse er en delvis acetylert varierende blokkopolymer av 1,4-sammenbundet-D-mannuronsyre- og L-guluron-syreenheter, idet acetyleringsgraden vanligvis er omtrent 20%. Bortsett fra acetylgruppene er det kjemisk tilsvarende algin-syreekstraktet som ekstraheres fra tang. Det bakterielle produkt og dets derivater stemmer overens med de normer som er foreskrevet for alginsyre og alginater og kan anvendes på samme anvendelsesområder, inklusive for næringsmidler, og farmasøytiske produkter samt ved papir- og tekstilfremstilling. The polysaccharide product obtained by the method according to the present invention is a partially acetylated varying block copolymer of 1,4-linked-D-mannuronic acid and L-guluronic acid units, the degree of acetylation being usually about 20%. Apart from the acetyl groups, the chemical equivalent is the alginic acid extract extracted from seaweed. The bacterial product and its derivatives comply with the norms prescribed for alginic acid and alginates and can be used in the same areas of application, including for foodstuffs and pharmaceutical products as well as in paper and textile manufacturing.

Oppfinnelsen vil bli ytterligere illustrert ved hjelp av de etterfølgende eksempler. The invention will be further illustrated by means of the following examples.

Eksempel 1 Example 1

Dette eksempel illustrerer virkningen av forskjellige This example illustrates the impact of different

fosfatkonsentrasjoner i kulturmediet på polysakkaridutbyttet. phosphate concentrations in the culture medium on the polysaccharide yield.

Azotobacter vinelandii NOIB 9068 ble dyrket i rystekolber i et vandig kulturmedium som hadde sammensetningen som er vist i tabell I. Azotobacter vinelandii NOIB 9068 was grown in shake flasks in an aqueous culture medium having the composition shown in Table I.

Fosfatkonsentrasjonen i mediet som ble anvendt i forskjellige rystekolber ble variert fra 0,005 til 5,0 millimol ved passende variasjon av de tilsatte mengder KH^PO^ og K2HP04. Etter at mediet var inokulert med mikroorganismen som var dyrket i 48 timer på agar-agar-substrat ble kolbene inkubert i 9 6 timer ved 3 0°C mens de ble rystet ved 20 0 omdreininger pr. minutt på en baneryster (orbital shaker). Under dyrkingen ble mediet holdt på pH 7,5 ved hjelp av tri-(hydroksymetyl)-aminometan-buffer. Ved slutten av dyrkingsperioden på 96 timer ble polysakkaridutbyttet i hver kolbe målt ved isopropanolutfelling av kulturfiltratet etterfulgt av tørrstoffsbestemmelse. The phosphate concentration in the medium used in different shake flasks was varied from 0.005 to 5.0 millimoles by appropriately varying the amounts of KH 2 PO 4 and K 2 HPO 4 added. After the medium was inoculated with the microorganism which had been cultivated for 48 hours on agar-agar substrate, the flasks were incubated for 96 hours at 30°C while being shaken at 200 revolutions per minute. minute on an orbital shaker. During cultivation, the medium was maintained at pH 7.5 using tri-(hydroxymethyl)aminomethane buffer. At the end of the 96 hour cultivation period, the polysaccharide yield in each flask was measured by isopropanol precipitation of the culture filtrate followed by dry matter determination.

De oppnådde resultater er angitt i tabell 2 og er vist The results obtained are set out in Table 2 and are shown

i grafisk form i fig. 1. in graphic form in fig. 1.

Av tabell 2 og den medfølgende fig. 1 kan det sees at høyere polysakkaridutbytte oppnås ifølge oppfinnelsen med fosfatkonsentrasjoner på omtrent 0,1 - 0,8 millimol. Polysakkaridutbytte synker dersom det arbeides utenfor disse grenser, og kulturmediet som hadde en fosfatkonsentrasjon på 5 millimol ga utpreget dårlige resultater. Dette sistnevnte medium hadde en sammensetning som tilsvarte sammensetningen av Burks medium som tidligere vanligvis ble anvendt for dyrking av Azotobacter vinelandii. From table 2 and the accompanying fig. 1 it can be seen that higher polysaccharide yields are achieved according to the invention with phosphate concentrations of approximately 0.1 - 0.8 millimoles. Polysaccharide yield decreases if work is carried out outside these limits, and the culture medium which had a phosphate concentration of 5 millimoles gave distinctly poor results. This latter medium had a composition which corresponded to the composition of Burk's medium which was previously usually used for the cultivation of Azotobacter vinelandii.

Eksempel 2 Example 2

Dette eksempel illustrerer virkningen av dyrking ved forskjellige konstante pH-verdier på polysakkaridutbyttet. This example illustrates the effect of cultivation at different constant pH values on polysaccharide yield.

Azotobacter vinelandii NCIB 9068 ble dyrket i 4 liter vandig kulturmedium som hadde sammensetningen som er vist i tabell 3 og omrørt i en fermenteringsbeholder. Azotobacter vinelandii NCIB 9068 was grown in 4 liters of aqueous culture medium having the composition shown in Table 3 and stirred in a fermentation vessel.

Fermenteringsbeholderen var utstyrt med en automatisk pH-kontrollanordning for utmåling av IM NaOH for å holde mediets pH på en valgt verdi, og med en oksygenelektrode. Fermenteringsbeholderen var sterilisert på vanlig måte før tilsetning av mediet. The fermentation vessel was equipped with an automatic pH control device for metering out IM NaOH to keep the pH of the medium at a selected value, and with an oxygen electrode. The fermentation vessel was sterilized in the usual way before adding the medium.

Til mediet i fermenteringsbeholderen ble det tilsatt 10 volumprosent av en inokulator beregnet av mikroorganismen som var blitt dyrket i 48 timer på agar-agar-substrater og deretter inkubert i 24 timer i rystkolber. Fermentering ble deretter gjennomført i 60 timer ved 30°C. Mediet ble omrørt med 400 omdr. pr. minutt, og luft ble boblet gjennom dette med en hastighet av 1,4 liter pr. minutt. Mediets pH-verdi ble holdt konstant ved hjelp av den automatiske tilsetning av den IM NaOH-løsning om nødvendig. To the medium in the fermenter was added 10% by volume of an inoculant calculated by the microorganism which had been grown for 48 hours on agar-agar substrates and then incubated for 24 hours in shake flasks. Fermentation was then carried out for 60 hours at 30°C. The medium was stirred at 400 rpm. minute, and air was bubbled through this at a rate of 1.4 liters per minute. minute. The pH of the medium was kept constant by the automatic addition of the IM NaOH solution if necessary.

Separate fermenteringsserier ble gjennomført mens kulturmediets pH-verdi ble holdt på 6, 6,5, 7, 7,5, 7,75 samt 8. Separate fermentation series were carried out while the culture medium's pH value was kept at 6, 6.5, 7, 7.5, 7.75 and 8.

Ved slutten av hver serie ble polysakkaridfremstilling målt At the end of each series, polysaccharide production was measured

ved isopropanolutfelling etterfulgt av tørrstoffbestemmelse. by isopropanol precipitation followed by dry matter determination.

De oppnådde resultater er angitt i tabell 4 og er vist grafisk i fig. 2. The results obtained are indicated in table 4 and are shown graphically in fig. 2.

Tabell 4 og fig. 2 viser at høyere polysakkaridutbytte oppnås når pH i kulturmediet ifølge oppfinnelsen holdes på verdier på 7,0 eg over. Når mediets pH var 6,0 foregikk ingen vekst av mikroorganismen. Table 4 and fig. 2 shows that a higher polysaccharide yield is achieved when the pH in the culture medium according to the invention is kept at values of 7.0 eg above. When the medium's pH was 6.0, no growth of the microorganism took place.

Eksempel 3. Example 3.

Dette eksempel viser de høyere utbytter som oppnås ved This example shows the higher yields achieved by

å arbeide under betingelsene ifølge den foreliggende oppfinnelse sammenliknet med kultiveringsbetlngelsene ifølge kjent teknikk. Det ble gjennomført tre serier hvor det ble anvendt samme apparatur, mikroorganisme, kulturmedium og fremgangsmåter som ifølge eksempel 2, med følgende unntagelser: Serie A, ifølge oppfinnelsen, ble gjennomført i et medium som hadde en fosfatkonsentrasjon på 0,25 millimol ved konstant pH-verdi på 7,4. to work under the conditions according to the present invention compared to the cultivation conditions according to the known technique. Three series were carried out using the same apparatus, microorganism, culture medium and methods as according to example 2, with the following exceptions: Series A, according to the invention, was carried out in a medium which had a phosphate concentration of 0.25 millimoles at a constant pH value of 7.4.

Serie B, for sammenlikning, ble gjennomført i et medium som hadde en fosfatkonsentrasjon på 5,00 millimol ved konstant pH-verdi på 7,4. Series B, for comparison, was conducted in a medium having a phosphate concentration of 5.00 millimoles at a constant pH of 7.4.

Serie C, for sammenlikning, ble også gjennomført i et medium som hadde en fosfatkonsentrasjon på 5,00 millimol, men mediets pH-verdi ble ikke regulert under kultiveringen og falt således fra en begynnelsesverdi på 7,4 til 6,4 etter 24 timer og til 6,05 etter 48 timer. Series C, for comparison, was also carried out in a medium which had a phosphate concentration of 5.00 millimoles, but the pH value of the medium was not regulated during cultivation and thus fell from an initial value of 7.4 to 6.4 after 24 hours and to 6.05 after 48 hours.

I hver serie ble polysakkaridutbyttet målt etter 24 og 48 timer ved samme fremgangsmåte som ifølge eksempel 2. De oppnådde resultater er angitt i tabell 5. In each series, the polysaccharide yield was measured after 24 and 48 hours using the same method as in example 2. The results obtained are shown in table 5.

Disse resultater viser klart at utpreget bedre polysakkaridutbytte oppnås under betingelsene med lav fosfatkonsentrasjon og pH-regulering ifølge den foreliggende oppfinnelse enn under betingelsene ifølge kjent teknikk med høy fosfatkonsentrasjon og fallende pH-verdi. These results clearly show that a distinctly better polysaccharide yield is achieved under the conditions of low phosphate concentration and pH regulation according to the present invention than under the conditions according to known technology with high phosphate concentration and falling pH value.

Claims

1. Process for the production of a polysaccharide, which consists of a partially acetylated, varying block copolymer of 1,4-linked-D-mannuronic acid and L-guluronic acid residues, by aerobic cultivation of a bacterium of the species Azotobacter vinelandii in an aqueous culture medium containing as essential components at least one monosaccharide or disaccharide as a carbon source and sources for phosphate, molybdenum, iron, magnesium, potassium, sodium, calcium and sulphate, characterized in that a phosphate concentration in the medium of from 0.1 to 0.8 millimoles is used per liter and that the medium's pH value during cultivation is kept in the range 7.0 to 8.2.

2. Method in accordance with claim 1, characterized in that a phosphate concentration in the medium of from 0.2 to 0.6 millimol per litres.

3. Method in accordance with claim 1 or 2, characterized in that the medium's pH value during cultivation is kept in the range 7.3 to 7.9.

4. Method in accordance with any of the preceding claims, characterized in that a bacterium from strain NCIB 8660, NCIB 8789 or NCIB 9068 is cultivated.

5. Method in accordance with any of the preceding claims, characterized in that a calcium concentration in the medium of from 0.02 to 0.6 millimol per litres.