JP3159983B2 - ヒアルロン酸の製造 - Google Patents
ヒアルロン酸の製造Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、細菌発酵によるヒアルロン酸（HA）の製造
プロセスに関するものである。
プロセスに関するものである。
HAは、グリコサミノグリカンとして知られている高分
子のクラスの１つである。HAは、長い直鎖の多糖であ
り、通常、（C14H20NNaO11）ｎの分子式を有するナトリ
ウム塩として存在している（ただし、ｎは、源、単離過
程及び測定方法によって変化する）。しかしながら、14
×106までの分子量が報告されているのみである。
子のクラスの１つである。HAは、長い直鎖の多糖であ
り、通常、（C14H20NNaO11）ｎの分子式を有するナトリ
ウム塩として存在している（ただし、ｎは、源、単離過
程及び測定方法によって変化する）。しかしながら、14
×106までの分子量が報告されているのみである。
HAおよびその塩は、ほとんどすべての脊椎動物体の結
合基質等の多くの源から単離できる。しかしながら、HA
はまた、ケンダル（Kendall）ら、（1937年）、バイオ
ケム バイオフィズ アクタ（Biochem.Biophys.Act
a.）、279巻、ページ401〜405によって示されるよう
に、ストレプトコッカス等の細菌の莢膜成分でもある。
合基質等の多くの源から単離できる。しかしながら、HA
はまた、ケンダル（Kendall）ら、（1937年）、バイオ
ケム バイオフィズ アクタ（Biochem.Biophys.Act
a.）、279巻、ページ401〜405によって示されるよう
に、ストレプトコッカス等の細菌の莢膜成分でもある。
HAは、非免疫原性であり、このため、薬剤において大
きな潜在力を有している。大きい分子量（百万以上）を
有するHAは、粘弾性の性質のため、とくに有用であるこ
とが知られている。現在市販されているHAは、雄鶏の鶏
冠等の鳥類から通常得られるが、上記材料に関してはウ
ィルスの混入の恐れがあるという問題がある。したがっ
て、複合体の精製処理が必要であり、適当なプロセスが
US−Ａ−4,141,973号に記載されている。しかしなが
ら、このように広範囲な精製が必要であるため、材料の
製造コストが高くなることは明らかである。
きな潜在力を有している。大きい分子量（百万以上）を
有するHAは、粘弾性の性質のため、とくに有用であるこ
とが知られている。現在市販されているHAは、雄鶏の鶏
冠等の鳥類から通常得られるが、上記材料に関してはウ
ィルスの混入の恐れがあるという問題がある。したがっ
て、複合体の精製処理が必要であり、適当なプロセスが
US−Ａ−4,141,973号に記載されている。しかしなが
ら、このように広範囲な精製が必要であるため、材料の
製造コストが高くなることは明らかである。
鳥類のHAの単離に関する問題があるため、HAを生産す
る発酵プロセスを開発しようとする試みがなされてき
た。すべての種のストレプトコッカス（Streptococcu
s）がHAを生産するが、HAを良好に産生し、ヒアルロニ
ダーゼ活性を有しない種を選ぶことが重要である。
る発酵プロセスを開発しようとする試みがなされてき
た。すべての種のストレプトコッカス（Streptococcu
s）がHAを生産するが、HAを良好に産生し、ヒアルロニ
ダーゼ活性を有しない種を選ぶことが重要である。
US−Ａ−4,517,295号は、ストレプトコッカス ピオ
ゲネス（S.pyogenes）を用いた発酵プロセスを記載して
いるが、生成物の平均分子量が55,000しかない。EP−Ａ
−0,144,019号は、高分子量のHAを生産するとしている
ストレプトコッカス エクイ（S.equi）を用いた別の発
酵プロセスを記載しているが、分子量を標準的でない方
法で計算しているため、他の方法で計算されている分子
量と簡単に比較できない。WO−Ａ−8,604,355号およびU
S−Ａ−4,897,349号は両方とも、高分子量のHAを高収率
で製造する発酵プロセスを記載しているが、両方ともの
プロセスでは、ストレプトコッカス（Streptococcus）
の毒性のある種が使用されているため、細菌毒素による
混入のためHA生成物を薬剤に使用するのには適さないと
考えられる。
ゲネス（S.pyogenes）を用いた発酵プロセスを記載して
いるが、生成物の平均分子量が55,000しかない。EP−Ａ
−0,144,019号は、高分子量のHAを生産するとしている
ストレプトコッカス エクイ（S.equi）を用いた別の発
酵プロセスを記載しているが、分子量を標準的でない方
法で計算しているため、他の方法で計算されている分子
量と簡単に比較できない。WO−Ａ−8,604,355号およびU
S−Ａ−4,897,349号は両方とも、高分子量のHAを高収率
で製造する発酵プロセスを記載しているが、両方ともの
プロセスでは、ストレプトコッカス（Streptococcus）
の毒性のある種が使用されているため、細菌毒素による
混入のためHA生成物を薬剤に使用するのには適さないと
考えられる。
さらに、記載されている従来のプロセスはすべて、バ
ッチ式の発酵プロセスである。様々なバッチ式の発酵プ
ロセスによる問題点があり、例えば、精製しにくいよう
な不純物の混入した生成物の製造が挙げられる。
ッチ式の発酵プロセスである。様々なバッチ式の発酵プ
ロセスによる問題点があり、例えば、精製しにくいよう
な不純物の混入した生成物の製造が挙げられる。
したがって、バッチ式の発酵の従来の欠点のない、高
分子量（例えば、数百万）を有するHAを製造できる発酵
プロセスを開発することは非常に好ましい。
分子量（例えば、数百万）を有するHAを製造できる発酵
プロセスを開発することは非常に好ましい。
したがって、本発明の第一の概念においては、プロセ
スが、pHを6.0から7.0、希釈率を0.05から0.12/時間お
よび溶存酸素の分圧を１％飽和未満に維持した連続培養
装置による培養におけるストレプトコッカス（Streptoc
occus）の連続発酵からなることを特徴とした、ストレ
プトコッカス（Streptococcus）の発酵によるHAの製造
のプロセスを提供することである。
スが、pHを6.0から7.0、希釈率を0.05から0.12/時間お
よび溶存酸素の分圧を１％飽和未満に維持した連続培養
装置による培養におけるストレプトコッカス（Streptoc
occus）の連続発酵からなることを特徴とした、ストレ
プトコッカス（Streptococcus）の発酵によるHAの製造
のプロセスを提供することである。
連続発酵プロセスは既知であり、理論はハーバート
（Herbert）ら（1956年）によって、ジェー ゲン ミ
クロ（J.Gen.Micro.）、14巻、ページ602〜622に記載さ
れている。従来あるバッチ式のプロセスに比べて連続発
酵プロセスは難しいため、一般的な連続発酵プロセスの
数は限られている。また、バッチ培養は通常少量生産に
よる出荷、HAの作製に使用される設備等の高い生産価値
の設備に用いられ、連続発酵プロセスは、大量生産によ
る出荷、低生産価値の設備にのみ適していると考えられ
てきた。
（Herbert）ら（1956年）によって、ジェー ゲン ミ
クロ（J.Gen.Micro.）、14巻、ページ602〜622に記載さ
れている。従来あるバッチ式のプロセスに比べて連続発
酵プロセスは難しいため、一般的な連続発酵プロセスの
数は限られている。また、バッチ培養は通常少量生産に
よる出荷、HAの作製に使用される設備等の高い生産価値
の設備に用いられ、連続発酵プロセスは、大量生産によ
る出荷、低生産価値の設備にのみ適していると考えられ
てきた。
本発明のプロセスは、従来のバッチ培養技術に関する
様々な問題を解決するものである。バッチ培養において
は、ストレプトコッカス（Streptococcus）は定常期で
行われているので、様々な分解酵素が発酵槽の肉汁中に
細胞の内容物を放出する細胞を破壊し始めるため、精製
が難しくなる。連続発酵プロセスを使用すれば、上記発
酵の発現が減少するように発酵培養液は定常状態に維持
されるので、このようなことは起きない。連続発酵によ
って得られる定常状態の他の長所は、細胞壁の代謝回転
が減少することがある。このことは、発酵培養液中に放
出される細胞壁成分からHAを分離するのが非常に困難で
あることが知られているため好ましい。最後は、連続培
養を使用することによって、バッチ培養の定常期の間に
は発現する様々な毒素の発現が阻害される。したがっ
て、連続発酵プロセスを用いることによって、より精製
した生成物の製造が可能となる。
様々な問題を解決するものである。バッチ培養において
は、ストレプトコッカス（Streptococcus）は定常期で
行われているので、様々な分解酵素が発酵槽の肉汁中に
細胞の内容物を放出する細胞を破壊し始めるため、精製
が難しくなる。連続発酵プロセスを使用すれば、上記発
酵の発現が減少するように発酵培養液は定常状態に維持
されるので、このようなことは起きない。連続発酵によ
って得られる定常状態の他の長所は、細胞壁の代謝回転
が減少することがある。このことは、発酵培養液中に放
出される細胞壁成分からHAを分離するのが非常に困難で
あることが知られているため好ましい。最後は、連続培
養を使用することによって、バッチ培養の定常期の間に
は発現する様々な毒素の発現が阻害される。したがっ
て、連続発酵プロセスを用いることによって、より精製
した生成物の製造が可能となる。
本発明のプロセスによって製造されるHAは、1,000,00
0から3,000,000の平均分量を有し、好ましい条件下では
分子量は1,600,000から2,500,000である。溶液における
高分子量のHAは、創傷治療、眼の外科および整形外科等
の様々な医療分野において非常に有用である粘弾性特性
を有している。HAは、また、様々な医療でない分野にお
いても潜在的に有用である。
0から3,000,000の平均分量を有し、好ましい条件下では
分子量は1,600,000から2,500,000である。溶液における
高分子量のHAは、創傷治療、眼の外科および整形外科等
の様々な医療分野において非常に有用である粘弾性特性
を有している。HAは、また、様々な医療でない分野にお
いても潜在的に有用である。
本発明のプロセスによって製造されるHAが医療におい
て有用であるような場合には、いずれの混入物も毒性が
ないことが当然重要である。したがって、発酵プロセス
において用いられるストレプトコッカス（Streptococcu
s）の種は、生成物中に残存する細菌の混入物が毒性を
有するという危険性を最小限にするためにヒトの病原体
でないものであることが好ましい。さらに、非病原性の
ストレプトコッカス（Streptococcus）が使用され、発
酵槽から誤って漏れることによって重大な健康上の危険
性が生じない際には、製造設備の安全性が増加する。他
の種ももちろん使用できるが、本発酵プロセスにおいて
使用される特に好ましい種はストレプトコッカス エク
イ（S.equi）である。
て有用であるような場合には、いずれの混入物も毒性が
ないことが当然重要である。したがって、発酵プロセス
において用いられるストレプトコッカス（Streptococcu
s）の種は、生成物中に残存する細菌の混入物が毒性を
有するという危険性を最小限にするためにヒトの病原体
でないものであることが好ましい。さらに、非病原性の
ストレプトコッカス（Streptococcus）が使用され、発
酵槽から誤って漏れることによって重大な健康上の危険
性が生じない際には、製造設備の安全性が増加する。他
の種ももちろん使用できるが、本発酵プロセスにおいて
使用される特に好ましい種はストレプトコッカス エク
イ（S.equi）である。
本プロセスにおいて使用するのに適当なストレプトコ
ッカス エクイ（S.equi）の菌株は、連続培養装置によ
る培養において長期間選択し、培養物を単離することに
よって長期間培養するのに適した、安定な、高収率の表
現型変異体を選択することによって容易に当業者によっ
て選択でき、細胞自身をさらに発酵するためのシード
（seed）をして使用する。培養サンプルを固体培地上で
条をつけ、個々の（または少数の）細胞から生じたコロ
ニーを生育させる。ループを用いて引いた際に粘質性の
様相を呈する大きな粘液性の莢膜を有する生育の早いコ
ロニーを選択することによって、ストレプトコッカス
エクイ（S.equi）の出発菌株を改良できる。これらのコ
ロニーは、次の作業で発酵槽に徹くために使用される。
好ましくは、最初に上記コロニーをプレート上でさらに
継代培養し、同様の選択基準をシード−コロニー（seed
−colony）を選択するために使用する。
ッカス エクイ（S.equi）の菌株は、連続培養装置によ
る培養において長期間選択し、培養物を単離することに
よって長期間培養するのに適した、安定な、高収率の表
現型変異体を選択することによって容易に当業者によっ
て選択でき、細胞自身をさらに発酵するためのシード
（seed）をして使用する。培養サンプルを固体培地上で
条をつけ、個々の（または少数の）細胞から生じたコロ
ニーを生育させる。ループを用いて引いた際に粘質性の
様相を呈する大きな粘液性の莢膜を有する生育の早いコ
ロニーを選択することによって、ストレプトコッカス
エクイ（S.equi）の出発菌株を改良できる。これらのコ
ロニーは、次の作業で発酵槽に徹くために使用される。
好ましくは、最初に上記コロニーをプレート上でさらに
継代培養し、同様の選択基準をシード−コロニー（seed
−colony）を選択するために使用する。
特に好ましい菌株は、受託番号NCIMB 40327で1990年
10月24日にナショナル コレクション オブ インダス
トリアル アンド マリン バクテリア（National Col
lecion of Industrial and Marine Bacteria）（NCIM
B）、アベルディーン、スコットランド（Aberdeen,Scot
land）にブタペスト条約に基づいて我々によって寄託さ
れた。
10月24日にナショナル コレクション オブ インダス
トリアル アンド マリン バクテリア（National Col
lecion of Industrial and Marine Bacteria）（NCIM
B）、アベルディーン、スコットランド（Aberdeen,Scot
land）にブタペスト条約に基づいて我々によって寄託さ
れた。
本発明の発酵プロセスは、以下の成分を含む栄養培地
中で行われる： 同化炭素源； 窒素源； リン、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、鉄、 亜鉛及びマンガン源； 生長因子源；および 硫黄源。
中で行われる： 同化炭素源； 窒素源； リン、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、鉄、 亜鉛及びマンガン源； 生長因子源；および 硫黄源。
炭素は、糖、スクロースも使用できるが、特にグルコ
ースの形態で供給される。窒素源は、塩、特に水溶性の
塩を含む毒性のない窒素であり、例えば、塩化アンモニ
ウム等のアンモニウム塩が挙げられる。金属およびリン
もまた、水溶性の塩の形態で供給される。必要とされる
生長因子は、必要である硫黄源でもある酵母エキス等の
源中にすべて含まれている。
ースの形態で供給される。窒素源は、塩、特に水溶性の
塩を含む毒性のない窒素であり、例えば、塩化アンモニ
ウム等のアンモニウム塩が挙げられる。金属およびリン
もまた、水溶性の塩の形態で供給される。必要とされる
生長因子は、必要である硫黄源でもある酵母エキス等の
源中にすべて含まれている。
栄養培地はさらに１種もしくはそれ以上のカルシウム
源、モリブデン源、コバルト源、銅源またはホウ素源を
含んでいてもよい。
源、モリブデン源、コバルト源、銅源またはホウ素源を
含んでいてもよい。
連続発酵プロセスにおける細菌の生育速度は、栄養培
地の一必須成分の利用能を制限することにより、エネル
ギー変換または多糖形成ではなく、バイオマス生成を制
限することによって制御される。上記で列挙した必須成
分の供給はいずれも制限できるが、硫黄の供給を制限す
ることが好ましい。
地の一必須成分の利用能を制限することにより、エネル
ギー変換または多糖形成ではなく、バイオマス生成を制
限することによって制御される。上記で列挙した必須成
分の供給はいずれも制限できるが、硫黄の供給を制限す
ることが好ましい。
栄養培地のpHは、上述したように、6.0から7.0の範囲
内でなければならない。好ましい範囲は6.0から6.4であ
り、最も好ましい条件はpHが6.2の時に行われる。
内でなければならない。好ましい範囲は6.0から6.4であ
り、最も好ましい条件はpHが6.2の時に行われる。
培地のpHは、発酵プロセス中水酸化ナトリウム等のア
ルカリの添加によって目的とする範囲内に維持される。
生じる発泡は、例えばポリプロピレングリコールを基礎
とした物質等の、適当な毒性のない起泡剤の添加によっ
て制御される。
ルカリの添加によって目的とする範囲内に維持される。
生じる発泡は、例えばポリプロピレングリコールを基礎
とした物質等の、適当な毒性のない起泡剤の添加によっ
て制御される。
上記したように、栄養培地を0.05から0.12/時間の希
釈率（流量／発酵槽の単位容積）で発酵領域に供給す
る。希釈率が約0.07/時間の際に最も好ましい条件とな
る。発酵容器内の培地の容積を一定に保つために、発酵
槽に栄養培養液を供給する割合と同じ割合で流出液を発
酵槽から回収する。長期間連続して培養する間、ストレ
プトコッカス エクイ（S.equi）の選択された菌株を一
定の最適な条件に維持する自動調節器を用いて、物理化
学的環境を一定に保つ。生成物を流出液から収集する。
釈率（流量／発酵槽の単位容積）で発酵領域に供給す
る。希釈率が約0.07/時間の際に最も好ましい条件とな
る。発酵容器内の培地の容積を一定に保つために、発酵
槽に栄養培養液を供給する割合と同じ割合で流出液を発
酵槽から回収する。長期間連続して培養する間、ストレ
プトコッカス エクイ（S.equi）の選択された菌株を一
定の最適な条件に維持する自動調節器を用いて、物理化
学的環境を一定に保つ。生成物を流出液から収集する。
ストレプトコッカス（Streptococcus）の培養を微好
気性の条件下で行う。発酵培養液の溶存酸素分圧を１％
飽和未満、好ましくは0.1から0.5％飽和の範囲内に維持
するのに十分な速度で、空気または他の酸素含有ガスを
培養液に注入する。発酵培養液に供給されたガスは滅菌
されていなければならず、空気を使用する際には、適当
な流速は0.1から0.5v.v.m.（容積／発酵槽の容積／分）
である。
気性の条件下で行う。発酵培養液の溶存酸素分圧を１％
飽和未満、好ましくは0.1から0.5％飽和の範囲内に維持
するのに十分な速度で、空気または他の酸素含有ガスを
培養液に注入する。発酵培養液に供給されたガスは滅菌
されていなければならず、空気を使用する際には、適当
な流速は0.1から0.5v.v.m.（容積／発酵槽の容積／分）
である。
発酵培養液は粘性があり、HAを生成しない好ましくな
いストレプトコッカス エクイ（S.equi）の菌株が生育
する「デッドゾーン（dead zone）」を排除するために
培養液をよく攪拌することは必要であるため、発酵は連
続して攪拌しながら行うことが望ましい。
いストレプトコッカス エクイ（S.equi）の菌株が生育
する「デッドゾーン（dead zone）」を排除するために
培養液をよく攪拌することは必要であるため、発酵は連
続して攪拌しながら行うことが望ましい。
発酵培養液の温度は、30から40℃の範囲内に維持され
なければならないが、好ましい範囲は35から40℃であ
り、最も好ましい温度は37℃である。
なければならないが、好ましい範囲は35から40℃であ
り、最も好ましい温度は37℃である。
好ましい操作条件下では、本発明のプロセスは、発酵
培養液１リットル当たり2.5g位のHAを産生し、より多く
の産生量を得ることさえも可能である。安定した培養条
件は500時間以上維持することができる。したがって、
プロセスは、従来のバッチ発酵プロセスに比べてかなり
改良されていることが示される。
培養液１リットル当たり2.5g位のHAを産生し、より多く
の産生量を得ることさえも可能である。安定した培養条
件は500時間以上維持することができる。したがって、
プロセスは、従来のバッチ発酵プロセスに比べてかなり
改良されていることが示される。
発酵プロセス後は、バイオマスは殺され、陰イオン界
面活性剤を含む水溶性の溶媒でHAを抽出する。これらの
２段階は同時に行われてもまた続けて行われてもよい。
加熱または抗殺菌物質等の殺剤等の様々な手段がバイオ
マスを殺すために用いられる。バイオマスを殺すための
特に好ましい物質は、ホルマリンとして一般的に知られ
ている水溶液として使用されるホルムアルデヒドであ
る。上記溶液の好ましい濃度は、0.5から1.5％（v/v）
である。界面活性剤は、0.01から0.05％（w/v）の濃度
で、好ましくは0.02％（w/v）の濃度で添加される。殺
されたバイオマスからHAを抽出するのに適当な界面活性
剤はドデシル硫酸ナトリウムである。
面活性剤を含む水溶性の溶媒でHAを抽出する。これらの
２段階は同時に行われてもまた続けて行われてもよい。
加熱または抗殺菌物質等の殺剤等の様々な手段がバイオ
マスを殺すために用いられる。バイオマスを殺すための
特に好ましい物質は、ホルマリンとして一般的に知られ
ている水溶液として使用されるホルムアルデヒドであ
る。上記溶液の好ましい濃度は、0.5から1.5％（v/v）
である。界面活性剤は、0.01から0.05％（w/v）の濃度
で、好ましくは0.02％（w/v）の濃度で添加される。殺
されたバイオマスからHAを抽出するのに適当な界面活性
剤はドデシル硫酸ナトリウムである。
バイオマスは、実質的にすべてのHAが細胞莢膜から放
出されるまでの、10から24時間、通常約16時間、殺剤及
び界面活性剤と接触され続けられる。
出されるまでの、10から24時間、通常約16時間、殺剤及
び界面活性剤と接触され続けられる。
次に、残ったバイオマスを、例えば、プレートおよび
フレームフィルタープロセス（plate and frame filter
process）やキーゼルグールフィルターパッド（kiesel
guhr filter pads）等の適当な濾過材料を用いて、濾過
によって水溶液から分離する。発酵プロセス中はこれら
のフィルターパッドを掃除或いは交換する必要があり、
上記の適当な間隔は24毎である。大規模に操作するため
に特に用いられる他の濾過方法としては、フィルターカ
ートリッジ（filtercartpridge）を用いるものがある。
このようなカートリッジはフィルターパッドのときと同
じ間隔で交換しなければならない。濾過後、細胞を含ま
ないHAの濾過溶液が得られ、この溶液をダイアフィルト
レーションによって精製し、低分子量の不純物を除去す
る。これらの不純物は、製造有機体の代謝産物、栄養培
地の残存した成分、残りの殺剤および残りの陰イオン界
面活性剤由来のものである。通常公称分子量が10,000か
ら25,000ダルトン、好ましくは20,000ダルトンであるお
およその分子量のカットオフを有する限外濾過膜を用い
ることは、この段階では必要である。ポリスルホンを基
礎とした膜が好ましく、これは市販されている。溶解し
たHAを含む濾過溶液を、８から20倍容量、好ましくは約
10倍容量の純水でダイアフィルトレーションし、濾液を
連続して捨てる。好ましい純度を有する水は10μScm-1
未満での導電率を有する。
フレームフィルタープロセス（plate and frame filter
process）やキーゼルグールフィルターパッド（kiesel
guhr filter pads）等の適当な濾過材料を用いて、濾過
によって水溶液から分離する。発酵プロセス中はこれら
のフィルターパッドを掃除或いは交換する必要があり、
上記の適当な間隔は24毎である。大規模に操作するため
に特に用いられる他の濾過方法としては、フィルターカ
ートリッジ（filtercartpridge）を用いるものがある。
このようなカートリッジはフィルターパッドのときと同
じ間隔で交換しなければならない。濾過後、細胞を含ま
ないHAの濾過溶液が得られ、この溶液をダイアフィルト
レーションによって精製し、低分子量の不純物を除去す
る。これらの不純物は、製造有機体の代謝産物、栄養培
地の残存した成分、残りの殺剤および残りの陰イオン界
面活性剤由来のものである。通常公称分子量が10,000か
ら25,000ダルトン、好ましくは20,000ダルトンであるお
およその分子量のカットオフを有する限外濾過膜を用い
ることは、この段階では必要である。ポリスルホンを基
礎とした膜が好ましく、これは市販されている。溶解し
たHAを含む濾過溶液を、８から20倍容量、好ましくは約
10倍容量の純水でダイアフィルトレーションし、濾液を
連続して捨てる。好ましい純度を有する水は10μScm-1
未満での導電率を有する。
ダイアフィルトレーション後、HAの精製された溶液の
モル濃度を、塩化ナトリウムに換算して0.18から0.24M
の範囲内、好ましくは0.20Mに調節する。pHもまた、必
要であれば、6.3から7.8、好ましくは7.0から7.5の値に
調節する。pHが7.2の際に、最も好ましい結果が得られ
る。PHは、水酸化ナトリウム等の塩基または適当なバッ
ファー、特にリン酸バッファーを添加することによって
調節できる。
モル濃度を、塩化ナトリウムに換算して0.18から0.24M
の範囲内、好ましくは0.20Mに調節する。pHもまた、必
要であれば、6.3から7.8、好ましくは7.0から7.5の値に
調節する。pHが7.2の際に、最も好ましい結果が得られ
る。PHは、水酸化ナトリウム等の塩基または適当なバッ
ファー、特にリン酸バッファーを添加することによって
調節できる。
医療用グレードの製品が必要である際には、溶液から
核酸を沈殿させるという段階をさらにプロセスに加え
る。上記は、例えば、塩化セチルピリジニウムの第４級
アンモニウム化合物等の陽イオン界面活性剤を添加する
ことによって行われる。陽イオン界面活性剤は以下のよ
うな希釈した水溶液として添加される；例えば、１％
（w/v）塩化セチルピリジニウム溶液を上記溶液に1:60
の容積比で加える。さらに、3.2μｍから0.2μｍ、好ま
しくは1.2μｍから0.2μｍのポアサイズ（pore size）
の適当なフィルター材料を通して濾過することによっ
て、沈殿した核酸を除去する。この段階を用いる際に
は、以降のプロセスを非発熱性（pyrogen−free）装置
を用いて滅菌条件下で行わなければならない。
核酸を沈殿させるという段階をさらにプロセスに加え
る。上記は、例えば、塩化セチルピリジニウムの第４級
アンモニウム化合物等の陽イオン界面活性剤を添加する
ことによって行われる。陽イオン界面活性剤は以下のよ
うな希釈した水溶液として添加される；例えば、１％
（w/v）塩化セチルピリジニウム溶液を上記溶液に1:60
の容積比で加える。さらに、3.2μｍから0.2μｍ、好ま
しくは1.2μｍから0.2μｍのポアサイズ（pore size）
の適当なフィルター材料を通して濾過することによっ
て、沈殿した核酸を除去する。この段階を用いる際に
は、以降のプロセスを非発熱性（pyrogen−free）装置
を用いて滅菌条件下で行わなければならない。
上記の段階をさらに経た後、または、上記の段階を用
いない際には、溶液のモル濃度およびpHを調節した後、
例えば、イソプロピルアルコール等の低級アルコールの
非溶剤を添加することによってHAを沈殿させる。沈殿し
たHAを濾過し、濾液を捨てる。
いない際には、溶液のモル濃度およびpHを調節した後、
例えば、イソプロピルアルコール等の低級アルコールの
非溶剤を添加することによってHAを沈殿させる。沈殿し
たHAを濾過し、濾液を捨てる。
HAを塩化ナトリウム溶液に再度溶解し、さらに上記し
たのと同様にして非溶剤を添加して再度沈殿させること
によって、HA生成物の精製がさらに行える。塩化ナトリ
ウム溶液のモル濃度は、0.18から0.24Mでなけれななら
ず、最も好ましい値は0.20Mである。この溶液のpHは6.3
から7.8でなければならず、好ましくは7.0から7.5であ
り、最も好ましくは7.2である。この溶液は、例えば、
リン酸バッファーによって緩衝化される（buffered）。
たのと同様にして非溶剤を添加して再度沈殿させること
によって、HA生成物の精製がさらに行える。塩化ナトリ
ウム溶液のモル濃度は、0.18から0.24Mでなけれななら
ず、最も好ましい値は0.20Mである。この溶液のpHは6.3
から7.8でなければならず、好ましくは7.0から7.5であ
り、最も好ましくは7.2である。この溶液は、例えば、
リン酸バッファーによって緩衝化される（buffered）。
本発明の第二の概念においては、第一の概念のプロセ
スによって製造されたヒアルロン酸を提供するものであ
る。このHAは、少なくとも1,000,000の平均分子量を有
し、生成品の分子量の範囲は好ましくは1,600,000から
2,500,000である。
スによって製造されたヒアルロン酸を提供するものであ
る。このHAは、少なくとも1,000,000の平均分子量を有
し、生成品の分子量の範囲は好ましくは1,600,000から
2,500,000である。
本発明の第三の概念においては、菌株NCIMB40327のス
トレプトコッカス エクイ（Streptococcus equi）を提
供するものである。
トレプトコッカス エクイ（Streptococcus equi）を提
供するものである。
本発明を以下の実施例を参考にしながらさらに説明す
る。
る。
実施例１ ストレプトコッカス エクイ（S.equi）の生育培地を
以下のように配合する： グルコース :60.00g 酵母エキス : 6.25g （オキソイド エル21（Oxoid L21）） リン酸二水素ナトリウム（2H2O） : 2.02g 塩化アンモニウム : 2.14g 塩化カリウム : 0.71g クエン酸 : 0.42g 酸化マグネシウム : 0.40g 炭酸カルシウム : 0.10g モリブデン酸ナトリウム（2H2O） : 2.42mg 塩化鉄（6H2O） :10.80mg 塩化コバルト（6H2O） : 0.95mg 塩化銅（2H2O） : 0.32mg 酸化亜鉛 : 0.81mg 塩化マンガン（6H2O） : 4.00mg ホウ酸 : 0.12mg 濃塩酸 : 0.178mL 上記培地を純水で１リットルにする。さらに、0.22μ
ｍの絶対速度フィルター（absolute rated filter）で
濾過することによって滅菌する。
以下のように配合する： グルコース :60.00g 酵母エキス : 6.25g （オキソイド エル21（Oxoid L21）） リン酸二水素ナトリウム（2H2O） : 2.02g 塩化アンモニウム : 2.14g 塩化カリウム : 0.71g クエン酸 : 0.42g 酸化マグネシウム : 0.40g 炭酸カルシウム : 0.10g モリブデン酸ナトリウム（2H2O） : 2.42mg 塩化鉄（6H2O） :10.80mg 塩化コバルト（6H2O） : 0.95mg 塩化銅（2H2O） : 0.32mg 酸化亜鉛 : 0.81mg 塩化マンガン（6H2O） : 4.00mg ホウ酸 : 0.12mg 濃塩酸 : 0.178mL 上記培地を純水で１リットルにする。さらに、0.22μ
ｍの絶対速度フィルター（absolute rated filter）で
濾過することによって滅菌する。
発酵槽の容積に比例して、0.07/時間の流量で、この
発酵培地を発酵槽に連続して注入する。0.2μｍの絶対
速度フィルター（absolute rated filter）で濾過した
滅菌した空気で培地を通気する。空気の流量は0.2v.v.
m.に維持し、発酵槽の肉汁中の溶存酸素分圧を0.2％飽
和に維持する。ストレプトコッカス エクイ（Streptoc
occus equi）をこの培地において37℃で生育させる。水
酸化ナトリウムを自動的に調節しながら添加することに
よって、pHを6.2に維持する。必要であれば消泡剤を基
礎としたポリプロピレングリコールを添加することによ
って、泡の発生を制御する。
発酵培地を発酵槽に連続して注入する。0.2μｍの絶対
速度フィルター（absolute rated filter）で濾過した
滅菌した空気で培地を通気する。空気の流量は0.2v.v.
m.に維持し、発酵槽の肉汁中の溶存酸素分圧を0.2％飽
和に維持する。ストレプトコッカス エクイ（Streptoc
occus equi）をこの培地において37℃で生育させる。水
酸化ナトリウムを自動的に調節しながら添加することに
よって、pHを6.2に維持する。必要であれば消泡剤を基
礎としたポリプロピレングリコールを添加することによ
って、泡の発生を制御する。
新しい培地を供給するのと同じ速度で、発酵培地を連
続して発酵槽から抜く。この流出液は約2.5g/リットル
のヒアルロン酸を含んでいる。ドデシル硫酸ナトリウム
及びホルマリン溶液を、ドデシル硫酸ナトリウム及びホ
ルマリンの最終濃度がそれぞれ0.025％（w/v）及び１％
（v/v）になるまで、発酵槽から採った流出液に連続し
て供給する。流出液とドデシル硫酸ナトリウム／ホルマ
リンの流れの混合をインライン静的ミキサー（in−line
static mixer）で行う。接触時間は16時間であり、混
合後、この流れを、上記滞留時間の間、設計された容器
を通す。
続して発酵槽から抜く。この流出液は約2.5g/リットル
のヒアルロン酸を含んでいる。ドデシル硫酸ナトリウム
及びホルマリン溶液を、ドデシル硫酸ナトリウム及びホ
ルマリンの最終濃度がそれぞれ0.025％（w/v）及び１％
（v/v）になるまで、発酵槽から採った流出液に連続し
て供給する。流出液とドデシル硫酸ナトリウム／ホルマ
リンの流れの混合をインライン静的ミキサー（in−line
static mixer）で行う。接触時間は16時間であり、混
合後、この流れを、上記滞留時間の間、設計された容器
を通す。
ヒアルロン酸を水溶性の溶媒中に放出した後、適当な
ポアサイズ（pore size）のフィルターを用いたカート
リッジフィルター（cartridge filter）でデプスフィル
ターで濾過（depth filtration）することによって、残
ったバイオマスを連続して除去する。周期的に生成物が
きれいなフィルターに流れるようにし、これにより使用
されたフィルターを洗浄、交換できるように、２重のフ
ィルターユニットを用いる。これらのフィルターユニッ
トは、流れを転換するのが必要になるまでの最大24時間
操作できるようなものである。
ポアサイズ（pore size）のフィルターを用いたカート
リッジフィルター（cartridge filter）でデプスフィル
ターで濾過（depth filtration）することによって、残
ったバイオマスを連続して除去する。周期的に生成物が
きれいなフィルターに流れるようにし、これにより使用
されたフィルターを洗浄、交換できるように、２重のフ
ィルターユニットを用いる。これらのフィルターユニッ
トは、流れを転換するのが必要になるまでの最大24時間
操作できるようなものである。
次に、細胞が除去された溶液を純水でダイアフィルト
レーション処理し、培養培地、ドデシル硫酸ナトリウム
及びホルマリンの残存する材料を除去する。上記ダイア
フィルトレーションは、公称分子量20,000ダルトンのカ
ットオフを有するポリスルホンを基礎とした限外濾過膜
を用いて行われる。この溶液を、10μScm-1未満の導電
率を有する10倍容の水でダイアフィルトレーションを行
い、濾液を連続して捨てる。ダイアフィルトレーション
後、塩化ナトリウム（最終濃度0.2M）を得られた溶液に
加え、リン酸バッファー（Na2HPO4、0.22g/リットル;Na
H2PO4・2H2O、0.045g/リットル）を添加することによっ
てpHを7.2に調節する。さらに、１％（w/v）の塩化セチ
ルピリジニウム溶液を約1:60の容積比で加える。このよ
うにして沈殿した核酸を、溶液を直列に並べた1.2μｍ
および0.2μｍ（絶対速度（absolute rated））のデプ
スフィルターに通して吸入排出によって除去する。さら
に、このようにして得られたヒアルロン酸の濾過溶液
に、イソプロピルアルコールを1:2の流量で測量して流
しながら連続して混合する。上記混合は、静的ミキサー
内で行い、沈殿したヒアルロン酸は、バスケットフィル
ター（basket filter）で水溶液から分離される。濾液
は捨てる。回収されたヒアルロン酸を、HA濃度が0.2％
（w/v）になるように、リン酸バッファー（Na2HPO4、0.
022g/リットル;NaH2PO4・2H2O、0.045g/リットル）でpH
7.2に緩衝化された0.2Mの塩化ナトリウム溶液に再度溶
解する。前述したのと同様にしてイソプロピルアルコー
ルを添加することによって、ヒアルロン酸を上記溶液か
ら沈殿させる。
レーション処理し、培養培地、ドデシル硫酸ナトリウム
及びホルマリンの残存する材料を除去する。上記ダイア
フィルトレーションは、公称分子量20,000ダルトンのカ
ットオフを有するポリスルホンを基礎とした限外濾過膜
を用いて行われる。この溶液を、10μScm-1未満の導電
率を有する10倍容の水でダイアフィルトレーションを行
い、濾液を連続して捨てる。ダイアフィルトレーション
後、塩化ナトリウム（最終濃度0.2M）を得られた溶液に
加え、リン酸バッファー（Na2HPO4、0.22g/リットル;Na
H2PO4・2H2O、0.045g/リットル）を添加することによっ
てpHを7.2に調節する。さらに、１％（w/v）の塩化セチ
ルピリジニウム溶液を約1:60の容積比で加える。このよ
うにして沈殿した核酸を、溶液を直列に並べた1.2μｍ
および0.2μｍ（絶対速度（absolute rated））のデプ
スフィルターに通して吸入排出によって除去する。さら
に、このようにして得られたヒアルロン酸の濾過溶液
に、イソプロピルアルコールを1:2の流量で測量して流
しながら連続して混合する。上記混合は、静的ミキサー
内で行い、沈殿したヒアルロン酸は、バスケットフィル
ター（basket filter）で水溶液から分離される。濾液
は捨てる。回収されたヒアルロン酸を、HA濃度が0.2％
（w/v）になるように、リン酸バッファー（Na2HPO4、0.
022g/リットル;NaH2PO4・2H2O、0.045g/リットル）でpH
7.2に緩衝化された0.2Mの塩化ナトリウム溶液に再度溶
解する。前述したのと同様にしてイソプロピルアルコー
ルを添加することによって、ヒアルロン酸を上記溶液か
ら沈殿させる。
沈殿したヒアルロン酸をイソプロピルアルコールで洗
浄し、洗浄液を捨てる。最終的に残った微量のイソプロ
ピルアルコールは、滅菌条件下で空気中で乾燥すること
によって除去する。すべての精製工程は室温で行われ
る。
浄し、洗浄液を捨てる。最終的に残った微量のイソプロ
ピルアルコールは、滅菌条件下で空気中で乾燥すること
によって除去する。すべての精製工程は室温で行われ
る。
医療用グレードの溶液は、１％（w/v）のヒアルロン
酸溶液になるように、上記したようにして製造されたヒ
アルロン酸を上述したリン酸バッファーでpH7.3に緩衝
化された0.15Mの滅菌生理食塩水に溶解することによっ
て作製される。このようにして調製されたヒアルロン酸
ナトリウム溶液は、低角度レーザー光線散乱技術（low
angle laser light scattering techniques）および粘
度測定法によって測定される1.6から2.5×106ダルトン
の平均分子量を有する。上記溶液は、0.2％（w/w）未満
のタンパク質含量および0.15％（w/w）未満のヌクレオ
チド量を有する。１％（w/v）溶液は、260nmで0.14AUの
および280nmで0.1AUの紫外線吸収を示す。また、この溶
液の粘度は、1000s-1で1Pa.s未満になるゼロ翦断応力で
159Pa.sである。
酸溶液になるように、上記したようにして製造されたヒ
アルロン酸を上述したリン酸バッファーでpH7.3に緩衝
化された0.15Mの滅菌生理食塩水に溶解することによっ
て作製される。このようにして調製されたヒアルロン酸
ナトリウム溶液は、低角度レーザー光線散乱技術（low
angle laser light scattering techniques）および粘
度測定法によって測定される1.6から2.5×106ダルトン
の平均分子量を有する。上記溶液は、0.2％（w/w）未満
のタンパク質含量および0.15％（w/w）未満のヌクレオ
チド量を有する。１％（w/v）溶液は、260nmで0.14AUの
および280nmで0.1AUの紫外線吸収を示す。また、この溶
液の粘度は、1000s-1で1Pa.s未満になるゼロ翦断応力で
159Pa.sである。
以下の実施例は、本発酵プロセスに用いるのに適した
ストレプトコッカス エクイ（S.equi）の選択方法を示
すものである。
ストレプトコッカス エクイ（S.equi）の選択方法を示
すものである。
実施例２ ストレプトコッカス エクイ（S.equi）の生育用の固
体培地を以下のように配合する： グルコース :20g 酵母エキス : 5g （オキソイド エル21（Oxoid L21）） 寒天 :15g （オキソイド エル13（Oxoid L21）寒天No.3） 無水オルトリン酸水素二カリウム :1.706g オルトリン酸二水素カリウム :1.388g オルトリン酸二水素ナトリウム :2.92g 塩化アンモニウム :5.01g 塩化カリウム :372mg クエン酸 :420mg 酸化マグネシウム :50.4mg 炭酸カルシウム :10mg モリブデン酸ナトリウム :2.4mg 塩化鉄（6H2O） :270.mg 塩化コバルト（6H2O） :2.37mg 塩化銅（2H2O） :0.85mg 酸化亜鉛 :2.05mg 塩化マンガン（4H2O） :10mg ホウ酸 :0.3mg 濃塩酸 :0.24mL グルコースを50mLの水に溶解し、酵母エキスを100mL
に、および寒天／塩を820mLの水にそれぞれ溶解し、121
℃、15分間オートレーブすることによってそれぞれを滅
菌し、さらに、一緒に混合した後にプレートに注入す
る。
体培地を以下のように配合する： グルコース :20g 酵母エキス : 5g （オキソイド エル21（Oxoid L21）） 寒天 :15g （オキソイド エル13（Oxoid L21）寒天No.3） 無水オルトリン酸水素二カリウム :1.706g オルトリン酸二水素カリウム :1.388g オルトリン酸二水素ナトリウム :2.92g 塩化アンモニウム :5.01g 塩化カリウム :372mg クエン酸 :420mg 酸化マグネシウム :50.4mg 炭酸カルシウム :10mg モリブデン酸ナトリウム :2.4mg 塩化鉄（6H2O） :270.mg 塩化コバルト（6H2O） :2.37mg 塩化銅（2H2O） :0.85mg 酸化亜鉛 :2.05mg 塩化マンガン（4H2O） :10mg ホウ酸 :0.3mg 濃塩酸 :0.24mL グルコースを50mLの水に溶解し、酵母エキスを100mL
に、および寒天／塩を820mLの水にそれぞれ溶解し、121
℃、15分間オートレーブすることによってそれぞれを滅
菌し、さらに、一緒に混合した後にプレートに注入す
る。
実施例１で記載したのと同様にして行った発酵実験か
ら得られたストレプトコッカス エクイ（S.equi）のサ
ンプルを、菌株の改良のために得た。ループを用いて引
いた際に粘質性の様相を呈する大きな粘液性の莢膜を有
する大きな生育の早いドーム状のコロニーを選択するこ
とによって、菌株の改良を行った。これらのコロニー
を、同様の選択基準を使用したプレート上にさらに継代
培養した。
ら得られたストレプトコッカス エクイ（S.equi）のサ
ンプルを、菌株の改良のために得た。ループを用いて引
いた際に粘質性の様相を呈する大きな粘液性の莢膜を有
する大きな生育の早いドーム状のコロニーを選択するこ
とによって、菌株の改良を行った。これらのコロニー
を、同様の選択基準を使用したプレート上にさらに継代
培養した。
したがって、本発明のプロセスは、高分子量の精製HA
を得るための経済的な生菌発酵プロセスを提供し、これ
により従来のプロセスに比べて非常に改良されたもので
あることが示される。
を得るための経済的な生菌発酵プロセスを提供し、これ
により従来のプロセスに比べて非常に改良されたもので
あることが示される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:46） (72)発明者 エヴァンス，チャールズ ガーヴェイズ ソーンゲイト イギリス国，エスピー１ ３アールダブ ル，ウィルトシアー，ソルスブリー，キ ャッスル ロード 81 (72)発明者 ダン，ジェフリー マイケル イギリス国，イーエッチ54 ９エーユ ー，ウェスト ロシアン，リビングスト ーン，ムーリーストン ドライブ ２ (72)発明者 ムキネス，ニール イギリス国，イーエッチ45 ９エルエ ー，ボーダーズ，ピーブルズ，キングス ミドウズ ガーデンズ 11 (72)発明者 エオ，リチャード グレンヴィレ イギリス国，イーエッチ10 ６ピーエ ル，エディンバラ，バックストーン ク レッセント 14 (72)発明者 スミス，キース ジェイムズ イギリス国，イーエッチ９ １エーデ ィ，エディンバラ，マーチモント クレ ッセント 98 (56)参考文献 特開 昭60−133894（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 19/26 C08B 37/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (23)
- 【請求項１】プロセスがpHを6.0から7.0、希釈率を0.05
から0.12/時間および溶存酸素の分圧を１％飽和未満に
維持した連続培養装置による培養におけるストレプトコ
ッカス（Streptococcus）の連続発酵からなることを特
徴とした、以下を含む栄養培地におけるストレプトコッ
カス（Streptococcus）の発酵によるヒアルロン酸の製
造プロセス： 同化炭素源； 窒素源； リン、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、鉄、 亜鉛及びマンガン源； 生長因子源；および 硫黄源。 - 【請求項２】ストレプトコッカス（Streptococcus）の
種がヒトに対して非病原性である請求の範囲１に記載の
プロセス。 - 【請求項３】該ストレプトコッカス（Streptococcus）
がストレプトコッカス エクイ（S.equi）である請求の
範囲１または請求の範囲２に記載のプロセス。 - 【請求項４】該ストレプトコッカス（Streptococcus）
がストレプトコッカス エクイ（S.equi）NCIMB 40327
である請求の範囲３に記載のプロセス。 - 【請求項５】栄養培地における該炭素源が糖である請求
の範囲１から４のいずれかに記載のプロセス。 - 【請求項６】栄養培地における該窒素源がアンモニウム
塩である請求の範囲１から５のいずれかに記載のプロセ
ス。 - 【請求項７】栄養培地における該リン、ナトリウム、カ
リウム、マグネシウム、鉄、亜鉛及びマンガン源が上記
成分の水溶性の塩である請求の範囲１から６のいずれか
に記載のプロセス。 - 【請求項８】栄養培地における該生長因子源および硫黄
源が酵母エキスである請求の範囲１から７のいずれかに
記載のプロセス。 - 【請求項９】該栄養培地がさらに１種もしくはそれ以上
のカルシウム源、モリブデン源、コバルト源、銅源また
はホウ素源を含む請求の範囲１から８のいずれかに記載
のプロセス。 - 【請求項１０】該栄養培地における制限成分が硫黄であ
る請求の範囲１から９のいずれかに記載のプロセス。 - 【請求項１１】該栄養培地のpHが6.2である請求の範囲
１から10のいずれかに記載のプロセス。 - 【請求項１２】該希釈率が0.07/時間である請求の範囲
１から11のいずれかに記載のプロセス。 - 【請求項１３】発酵培養液の該溶存酸素分圧が0.1から
0.5％飽和の範囲内である請求の範囲１から12のいずれ
かに記載のプロセス。 - 【請求項１４】該発酵プロセスが連続して攪拌しながら
行われる請求の範囲１から13のいずれかに記載のプロセ
ス。 - 【請求項１５】温度が35から40℃の範囲内に維持される
請求の範囲１から14のいずれかに記載のプロセス。 - 【請求項１６】流出液より得られたバイオマスを殺し、
ヒアルロン酸を殺されたバイオマスより抽出する段階を
さらに含む、請求の範囲１から15のいずれかに記載のプ
ロセス。 - 【請求項１７】該バイオマスがホルムアルデヒドの水溶
液を用いて殺される請求の範囲16に記載のプロセス。 - 【請求項１８】ヒアルロン酸がドデシル硫酸ナトリウム
を用いて殺されたバイオマスより抽出される請求の範囲
15または請求の範囲16に記載のプロセス。 - 【請求項１９】濾過によって残存するバイオマスを水溶
液より分離する段階をさらに含む請求の範囲16から18の
いずれかに記載のプロセス。 - 【請求項２０】濾過されたヒアルロン酸溶液をダイアフ
ィルトレーションによって精製し、低分子量の不純物を
除去する段階をさらに含む請求の範囲19に記載のプロセ
ス。 - 【請求項２１】精製された溶液のモル濃度を塩化ナトリ
ウム換算で0.18から0.24Mの範囲内に、およびpHを6.3か
ら7.8に調節し、非溶剤を添加することによってヒアル
ロン酸を沈殿させる段階をさらに含む、請求の範囲20に
記載のプロセス。 - 【請求項２２】溶液のモル濃度およびpHを調節した後、
陽イオン界面活性剤を添加することによって溶液から核
酸を沈殿させる段階をさらに含む請求の範囲21に記載の
プロセス。 - 【請求項２３】菌株NCIMB 40327のストレプトコッカス
エクイ（Streptococcus equi）。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB909024223A GB9024223D0 (en) | 1990-11-07 | 1990-11-07 | Production of hyaluronic acid |
| GB9024223.1 | 1990-11-07 | ||
| PCT/GB1991/001927 WO1992008799A1 (en) | 1990-11-07 | 1991-11-04 | Production of hyaluronic acid |
Publications (2)
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