JPS582673B2

JPS582673B2 - 好アルカリ性バチルス属菌によるペクチン酸リア−ゼの製造法

Info

Publication number: JPS582673B2
Application number: JP14580479A
Authority: JP
Inventors: 吉原一年; 小林良生
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1979-11-09
Filing date: 1979-11-09
Publication date: 1983-01-18
Also published as: JPS5668393A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はペクチン酸の分解に有効なペクチン酸リアーゼ
の製造法に関するものである。

更に詳細には、本発明は、バチルス属に属し、好アルカ
リ性で、かつペクチン酸リアーゼを生産する菌をアルカ
リ性で、かつペクチン質を含む培地で培養し、培養物か
ら誘導的にペクチン酸リアーゼを採増する方法に関する
。

一般に、ペクチン解重合酵素には２種類あって、その一
つはペクチン酸（あるいはペクチン）を加水分解的に切
断するポリガラクチュロナーゼ（あるいはポリメチルガ
ラクチュロナーゼ）であり、もう一つはペクチン酸（あ
るいはペクチン）をβ一脱離的に分解するベクチン酸リ
アーゼ（あるいはペクチンリアーゼ）である。

そして、従来、ポリガラクチュロナーゼ（あるいはポリ
メチルガラクチュロナーゼ）及びペクチン酸リアーゼ（
あるいはペクチンリアーゼ）については中性領域と酸性
領域において生育する微生物を用いて生産することはよ
く知られている。

また、アルカリｆｊ４Ｅ微生物によってアルカリ性ポリ
ガラクチュロナーゼを生産することは特公昭４８−６５
５７及びアグリカルチュラルアンドバイオロジカルケミ
ストリー（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＢｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）第３６巻、２
号２８５−２９３頁（１９７２年）に発表され、公知と
なった。

さらに、好アルカリ性細菌が、ペクチン若しくはペクチ
ン酸などのべクチン質を含まない培地で、最も良好に構
成的に後述する酵素単位量で最高８単位／ｍｌのペクチ
ン酸リアーゼを生産することは、カナディアン・ジャー
ナル・オブ・マイクロバイオロジー（Ｃａｎａｄｉａｎ
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏ１ｏｇｙ
）第２４巻１１６４〜１１７２ページ（１９７８年）に
発表され、公知となった。

しかしながら、好アルカリ性細菌のうちで誘導的に、す
なわち培地中にべクチン質、例えばペクチン、若しくは
ペクチン酸などの誘導物質を含有せしめることによって
、ペクチン酸リアーゼを生産せしめるようなものについ
ては、全く知られていない。

本発明者らは、靭皮繊維のパルプ化により有効？ペクチ
ン分解酢素を求めて研究したところ、新たに分離した菌
株が、アルカｌＪｔｌＥ条件下で、培地成分として、ペ
クチン質を添加することによって、誘導的にペクチン酸
リアーゼを有利に生産することを知り、本発明を完成す
るに至った。

本発明は、バチルス属に属し、好アルカリ性
で、かつペクチン酸リアーゼを生産する酌をアルカリ性
でかつペクチン質を含む培地に培養し、培養物からペク
チン酸リアーゼを採取するペクチン酸リアーゼの製造法
である。

本発明の大きな特色は、アルカリ性培地、好ましくはｐ
ｉ−ｉｓ．Ｏ〜１０．０のアルカリ性でかつペクチ
ン質を含む培地でペクチン酸リアーゼ生産菌を培養する
点にある。

すなわち、本発明で使用する菌は、中１生以下ではほと
んど生育できず、したかつ，てペクチン酸リアーゼの生
産も認められない。

また、ｐ｝１８．０〜１０．０のアルカリ性であっ
ても、培地成分のうち炭素源としてグルコース、シュー
クロース、デンプンなどでは、生育は可能であるが、全
くべクチン酸リアーゼの生産はおこらず、ペク：チン質
、例えばペクチンを１％、２％、４％と添加することに
よって、はじめて培地中に各々後述する酵素単位量で１
．０，１．４，２．２単位／ｒｒＬｌのペクチ
ン酸リアーゼを誘導的に生産するのである。

アルカリ性培地におけるペクチン酸リアーゼ生産・菌の
培養は、開放下の培養でも雑菌による汚洗がほとんどみ
られず、培養等において経済的にきわめて有利である。

本発明において使用する菌株は好アルカリ性でバチルス
属に属するペクチン酸リアーゼ生産菌であるが、新たに
分離された菌株はバチルス・フイルマスＧＩＲ２７
７と同定され、微工研に微工研菌寄第５２０８号とし
て寄託された。

次にバチルス・フイルマスＧＩＲ２７７の菌学的性質を
示す。

なお、以下に記載の菌学的諸性質の試験ならびに分類方
法は、すべてエス・テー・コーワンの１マニュアル・フ
ォー・ザ・アイデンテイフイケーション・オブ・メディ
カル・バクテリア」（ ” Ｍａｎｕａｌｆｏｒ
ｔｈｅＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｅｄｉ
ｃａｌＢａｃｔｅｒｉａ”（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ））およびバージーズ
゜マニュアル・オブ・デタミネイティブ・バクテリオロ
ジー第８版（１９７２）（Ｂｅｒｇｅｙ
’ｓＭａｎｕａｌｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９７２））に基づいて行
なわれた。

培地は１％Ｎａ２ＣＯ３にて、もしくは、ＩＮＮａ
ＯＨにてｐＨを約１０．０とし、あるいは添加せずにｐ
Ｈを所定の値とした。

■．形態的性質大きさは１．２μ×３．６μで楕円形の胞子を形成する
。

周鞭毛により運動する。またｐＨ９．５に調整した
肉汁寒天、ボテ｛・デキスｌ−ｏ−ス培地、サブロード
培地によく生育し灰色である。

本菌を種々のｐＩ−｛に調整した肉汁に接種して生育を
みたのが表１である。

表より、本菌がｐｉ−１７．０〜１０．２で生育す
ることができ、ＰＩ−｛８．７〜９．６で良好に生
育する好アルカＩＪ（’ｔ細菌であることがわかる。

２．生理的性質 ■）最適生育条件ｐＨ：８．７〜９．６温度＝４０〜４５°Ｃ好気性２）生育しつる条件ｐＨ：７．０〜１０．５温度：最高５０℃まで３）ダラム染色性培養の初期に陽性であるが、しだいに陰性に変化する。

４）フオーゲス・プロスカウエル反応：陰性５）硝酸塩
：還元する６）カタラーゼ反応：陽性７）ゼラチン・カゼインの液化：陽性８）でんぷんの加水分解性：陽性９）クエン酸の利用性：利用しない１０）アンモニウム塩の利用性：利用しない１１）７％
食塩にわずかに生育する１２）嫌気性下で生育しない１３）抗酸性なし１４）インドールの生成：なし１５）硫化水素の生成：なし１６）フエニルアラニンからアンモニアを生成しない。

１７）牛乳の凝固：アルカリ性培地のため凝固しない。

１８）糖に対する作用グルコースから酸を形成するがガスを生産しない。

アラビノースから酸を形成するがガスを生産しない。

キシロースから酸を形成せず、ガスも生産しない。

マンニトールから酸を形成し、ガスは生産しない。

１９）馬尿酸塩の分解二分解する２０）チロシンの分解二分解しない以上の菌学的諸性質から、前記文献の分類方法に従って
本菌の検索を行なった結果、バチルス・フイルマス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｆｉｒｍｕｓ）に属すべきものと同定
された。

しかし、本菌はバチルス・フイルマスの菌学的性質と全
く一致するものではなく、．また、本臼のアルカｌＪＰ
ｉＥ下におけるペクチン酸リアーゼの生産性はきわめて
特異的であるために、本菌をバチルス・フイルマスＧＩ
Ｒ２７７と命名した。

本発明においてはバチルス・フイルマスＧＩＲ．２７７
が培養される。

培地として固体培地、液体培地のいずれでもよく、固体
培地としては皺、大豆粕等が用いられる。

液体培地としては、コーンステイプリカー、酵母エキス
、加工大豆粉末、ポリペプトン、カジトン、カザミノ酸
、グルタミン，酸等の窒素源、廃糖蜜、各種糖類、各種
澱粉、ペクチン、ペクチン酸、もしくはこれらの含有物
である三棟、緒などの靭皮などの炭素源、及びＫ２ＨＰ
Ｏ，，ＭｎＳ０４− ６Ｈ２０，などの無機塩類、そ
の他各種ビタミン等の微量要素などを適宜混合したもの
が適している。

なお、炭素源では、各種糖類若しくは各種澱粉類は単独
で使用するのではなく、かならずペクチン質、例えば廃
糖蜜、ベクチン、ペクチン酸、キシラン、ガラクタンな
どを誘導物質として添加しておく必要がある。

本発明において使用する培地はアルカリ性で、好ましく
はｐＨ８．７〜９．６程度でなければならない。

培地をアルカリ性にするには、カセイカリ、カセイソー
ダ、炭酸カリ、炭酸ソーダ、重炭酸ソーダ等が適宜使用
されるが、培地のｐＨを８．７〜９．６に安定に保つに
は炭酸ソーダを使用するのが最も好ましい。

本発明の培養は培地をアルカリ性に維持しつつ行なわれ
るが、アルカリ性下の培養では雑菌の増殖はほとんどな
く、特に無菌状態にしなくても開放下に培養することが
でき、経済的にきわめて有利である。

培養は、２０〜４０℃で、通風、通気、攪拌、振とう等
の手段によって好気的に行なわれる。

２〜４日の培養によってベクチン酸リアーゼの蓄積量は
最高に達する。

得られた培養物は、抽出、沢過等の手段によりＰ液中に
ペクチン酸リアーゼを含有させることができる。

必要によっては、塩析、溶媒沈澱処理、イオン交換樹脂
、透析等通常の精製手段によってペクチン酸リアーゼを
単離することができる。

次に、本発明によって得られるペクチン酸リアーゼの理
化学的性質を示す。

なお、以下に使用する酵素液は、いずれも実施例１で示
す培養法で培養した培養上清をセロファン膜で脱塩した
ものであり、酵素活性は、酵素液１ｍｌに２％ペクチン
酸溶ｇ１ｒｒｔｌ及びｐＨ９．５の０．１Ｍ
ＮＨ４０ｉ｛−ＮＨ４ＣＡ緩衝液を加えて、３０℃で２
０分間反応させて生じた還元力、もしくは２３５ｎｍに
おける吸光度の増加を、前者はソモギネルソン法（Ｓｏ
ｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法）により、後者は分光光度
計にて測定して生成したアルデヒド基の量を求めたもの
である。

１単位の酵素とは、この条件で１分間にガラクチュロン
帳１μｍｏｌｅに相当するアルデヒド基を生産する酵素
量をいう。

■．作用本酵素はペクチン酸に作用して非還元性末端に４，５一
不飽和ガラクチュロン酸を生じる。

分解物としては４，５一不飽和ガラクチュロン酸及び４
，５一不飽和結合を有するジーもしくはそれ以上のオリ
ゴウロニドを生成する。

実験として酵素液をｐｉ｛＝９．５でペクチン酸に
２分、５分、１０分作用させると第１図に示すように２
３５ｎｍに極大吸収を示す物質が生成し、かつ、時間経
過に従って増加する。

これは酵素液中に含まれているペクチン酸リアーゼが、
ペクチン酸に作用して、非還元性未端に４．５＝不飽和
ガラクチュロン酸ができ、このものが２３５ｎｍに極大
吸収をもっためであることが分る。

更に、実験として酵素液をｐＨ＝９．５でペクチン
暇に作用させ、４，５一不飽和結合を有するジー以上の
オリゴウロニドの生成量と還元糖の生成量を測定した。

前者は２３５ｎｍの吸収の増大で測定し、吸光係数５，
２００として生成アルデヒド量に換算した。

後者はソモギ・ネルソン法で、Ｄ−ガラクチュロン酸を
標準物質として直接生成アルデヒド量を計算した。

その結果は第２図に示されるが、これによると両者の生
成速度は完全に一致し、分解がβ一脱離のみで起ってい
ることが明らかである。

２．基質特異性ペクチン酸に作用して分解し、４，５一不飽和ガラクチ
ュロン酸を生じるが、ペクチンにはほとんど作用しない
。

実，験として、酵素液をｐ｝ｉ＝９．５でベクチン
酸．とべクチンに作用させると、第３図に示されるよう
に、ペクチン酸では吸光度が増加するが、ペクチンでは
ほとんど増加しないのが分る。

３，至適ｐＨ本酵素の至適ｐＨは８．５〜１０である。

実験として、ｐＨ４〜５．５は酢酸塩、ｐＨ６．０
〜７．０はリン酸塩ｐＨ７．５〜８．０はＴｒ
ｉｓ−ＣＡＴｐｌ」８．０〜１０．０はＮＨ４０Ｈ−
ＮＨ４Ｃｔ，ｐＨ１０．５〜１１．５はＮａ２ＣＯ
３−ＮａＯＨの緩衝液を用いて、酵素液をベクチン酸に
作用させた。

その結．果は第４図に示されるが、これから明らかなよ
うに至適ｐｈｉは９．５付近にあることがわかる。

なお、第４図においてはいずれも、ｐＨ９．５での
活性を１００として示される。

４．安定ｐＨ範囲本酵素の安定ｐＨ範囲は６〜１０である。

実１験として、酵素ｇ０．２ｒｄに種々のｐＨの
緩衝ｉｌ１．８ｍｌを加え、３０℃で、１時間反応させ
た後、ｐｔｉ９．５の０．１ＭＮＨ４０Ｈ−ＮＨ
４Ｃ２緩衝液にて５０倍に稀釈して、残存活性を調べた
。

その結果は第５図に示される。

図からも明らかなように、ｐｉ−ｉ６〜９．５の範囲
で極めて安定であることがわかる。

なお、ｐＨ７．０の？ｆｆｉ性を１００として示し
た。

５．作用適温の範囲本酵素の作用適温は６０゜Ｃである。

６．温度安定性ｐＨ９．０で１時間、種々の温度で処理した後、そ
の残存活性を調べた結果、３５〜４０℃では、全く失話
せず、５０℃の時、６０％、５５℃以上で１００％失活
した。

７．阻害・活性化及び安定化ＥＤＴＡによって失活し、Ｃａ＋＋によって活性化、ま
たは安定化された。

本発明によって得られるペクチン酸リアーゼはアルカｌ
Ｊｆ’４Ｅ培養条件下で生産され、アルカリｔｆｆ４Ｅ
によって作用するので雑菌から保護するのにきわめて有
利であり、また、靭皮繊維のパルプ化、ペクチン含有の
有機廃水の処理、果汁の清澄等に広く活性できるもので
ある。

以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるもの
ではない。

実施例１．加工大豆粉末（パフミン：商品名）５．！ｉ’、イース
トエキストラクト５ｇ、Ｋ２ＨＰ０，１．９、ＭｎＳＯ
４− ６Ｈ２００．０５．９、ベクチン２ｉを
水８００ｒｒＬｌにとかし、１２１℃、１５分間蒸気殺
菌する。

別に、へａ２ｃｏ３５．９を２００ｍｌにとかし、同
様に殺菌する。

冷却後、両者を混合し、５０ｒｒＬｌ（Ｎａ２Ｃ０３は
０．５％となる）ずつ、５００ｒＩｌｌ容肩付きフラス
コに分注して、バチルス・フイルマスＧＩＲ２７７、Ｆ
ＥＲＭＰ／％５２０８を２〜３白金耳量接種し
、３０℃で振とう培養する。

１日おぎに１０ｒＩＬｌをとり遠心分離により除菌後、
ペクチン酸リアーゼの活性を測定した。

第６図の８に示すように、ペクチン酸リアーゼは、４日
で約１．８単位／ｒｎｌ生産された。

これとは別に、培養方法は全く同様で、Ｎａ２Ｃ
Ｏ３が１．５％になるようにした培地とＮａ２ＣＯ３
を全く添加しない培地で、同様培養して、ベクチン酸リ
アーゼの活性を測定した。

Ｎａ２Ｃ０３１．５％の活性は第６図の９に示され、Ｎ
ａ２ＣＯ３０％の活性は第６図の１０に示される。

実施例２，コーンステイプリカ−３＆，ｅ母エキス５ｙ、Ｋ２ＨＰ
０４１＆，ＭｎＳＯ４・６ｆ｛２００．０５
７ｉ，ペクチン１０．９を水８００ｒｒＬｊにとかし
、１２１℃、１５分間蒸気殺菌する。

別に、Ｎａ２ＣＯ３１０．９を２００＋７１ｌにと
かし、同様に殺菌する。

冷却後両者を混合し、５０ｒＩ１ｌずつ、５００ＷＬｌ
容肩付きフラスコに分注して前記バチルス・フイルマス
ＧＩＲ２７７，ＦＥＲＭ−Ｐ／ｌ６５２０
８を２〜３白金耳量接種し、３０℃で振とう培養する
。

１日おきに１０ｒｎｌをとり遠心分離により除菌後、ペ
クチン酸リアーゼの活性を測定した。

第Ｔ図に示されるように、活性は３日目で最高となり、
約０．７５単位／ｒｒｔｌ生産された。

実施例３．ポリペプトン５ｇ、酵母エキス５９、Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ
、ＭｒＳＯ４＋６Ｈ２００．０５９
、廃糖蜜１０ｇを水８００ｒＩｌｌにとかし１２１℃
、１５分間蒸気殺菌する。

別にＮａ２ｃｏ３１０Ｅｌを２００ｒｎｌにとか
し、同様に殺菌する。

冷却後、両者を混合し５０彪ずつ５００ｍｌ容肩付きフ
ラスコに分注して前記バチルス・フイルマスＧＩＲ２７
７，ＦＥＲＭ−ＰＡ５２０８を２〜３白金耳量接
種し、３０℃で振とう培養する。

１日おきに１０ｗｌｌをとり、遠心分離により除菌後、
ベクチン酸リアーゼの活性を測定した。

第８図に示すように、その活性は３口目で最高となり約
０．３単位／ｒＩｌｌ生産された。

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素液をｐＨ＝９．５でペクチン酸に２
分、５分、１０分作用させ各波長の吸光度をみた図で、
１は２分、２は５分、３は１０分の作用後を示す。第２図は本酵素液をｐＨ＝９．５でペクチン酸に作用さ
せ、生成アルデヒドとして２３５ｎｍの吸光度と
ソモギ・ネルソン法の両方で測定した図で、４は吸光度
、５はソモギ・ネルソン法によるものを示す。第３図は本酵素液をｐｉ−］一９．５でペクチン酸
とべクチンに作用させた図で、６はペプチン酸、７はペ
クチンを示している。第４図は本酵素の至適ｐＨを示す図である。第５図は本酵素の安定ｐＨを示す図である。第６図は実施例１における測定活性を示す図で、８はＮ
ａ２Ｃ０３０，５％、７は同１．５％、８は同０％を
それぞれ示している。第７図は実施例２における生成話性を示す図で、第８図
は実施例３における生成活性を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】１バチルス属に属し、好アルカリ性で、かつペクチン
酸リアーゼを誘導的に生産する菌を、アルカリ性でかつ
ペクチン質をもむ培地に培養し、誘導的に培養液中にべ
クチン酸リアーゼを生産採取することを特徴とする、ベ
クチン酸リアーゼの新規製造法。２アルカリｆ’４培地がアルカリ金属の炭酸塩を添加
されたものである特許請求の範囲第１項の方法。３培地が粉末状あるいは断片状の靭皮繊維を含有せし
めたものである特許請求の範囲第１項の方法。４バチルス属に属し、好アルカリ性で、かつペクチン
酸リアーゼを生産する菌がバチルス・フイルマスＧＩ
Ｒ２７７である特許請求の範囲第１項の方法。