JPS59159780A - 微生物によるセルラ−ゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はクロスＩ・リジウム属に属する新菌種クロスト
リジウム・サーモセルロボーラムをセルロース又は、セ
ルロース含有物質を含む培地を用い、５０ｃ以上の高温
がっ硅・無条件下て、培養させること？こより、培地中
１こセルラーゼを生産・蓄積せしめる方法１こががゎる
ものである。

近年、バイオマス、パイオニナシ−へのＩＭ］心が高マ
リ、その中でも最も有望な資硅であるセルロース及びセ
ルロース含有物質の分解・利用にｌハしＬ七ＶＬθηＵ
乞Ｖ“η又こ式１詰ら屯りい６゜セルロース等を分解さ
せる酵素を生産する微生物としては、好気性の糸状菌や
放線菌に属するものが従来多く知られており、これらの
生産する酵素ヲ用いたセルロース又はセルロース含有物
質の分解方法も種々検討されている。しかるに、従来知
られている方法ではセルロース含有物質の前処理を必要
としたり、完全に分解・糖化するためＥこは、極めて多
量の酵素剤を必要とする等のため、従来の方法で得られ
たグルコース等の分解産物は高価なものとなってしまう
等の問題がある。

本発明者等は推肥等の中では高温・嫌気の条件下でセル
ロース等の有機物がすみやか１こ分解される現象１こ着
目し、自然界よりロールチューブ法１こより高温かつ嫌
気の条件下で良く生育する微生物の分離について研究し
た結果、６０Ｃ〜８０Ｃという高ｎ１９１こおいても非
常に高い生育活性を示し、しかもセルロース又はセルロ
ース含有物質を効率良く分解する能力を有する細菌を分
離することに成功した。さらｔこ本菌の特性Ｖこついて
研究を重ねた結果、きわめて耐熱性の高いセルラーゼを
本菌が生産しうろことを見い出した。

本発明はかかる知見をもと？こ完成した。

以下本発明ｔこついて説明する。

本発明の方法によれば、クロストリジウム・サーモセル
ロボーラムＩ　−ａ　（以下、Ｉ−ａ株、！：略するこ
とがある。）をセルｐ−ス又はセルロース含有物質等を
含む培地で嫌気的１こ培養し、培地中にセルラーゼを生
産せしめ、培養液又は、除菌ブースをそのままセルラー
ゼ含有液として使用することができる。あるいはこれら
より通常の精製方法により酵素を採り上げ、セルラーゼ
製剤として使用することもできる。さらに、培養途中の
適当な時期にセルロース又はセルロース含有物質を培養
液に添加し、それらを分解・糖化せしめることもできる
。

本発明に用いる微生物の菌学的諸性質の検討結果を以下
１こ示す。なお、本微生物は、工業技術院微生物工業技
術研究所１こ寄託されており、微工研寄託受理番号第Ｐ
−ＩＡ３１　　号である。

（本菌は好気条件下では生育せず、以下の検討結果は嫌
気条件下で生育させ、各テストを行ったものである。） （ａ）形態 １）細胞の形および大きさ　桿菌（０，５〜０．７×１
．４〜２．７）μ ２）細胞の多形性の有無：無。

３）運動性の末無二有、周ペン毛。

４）胞子の有無：有、胞子は球状がらややオパール、タ
ーミナル。

５）　ダラム染色性：＋ ６）抗酸性、− （ｂ）　　各培地Ｅこおける生育状態（７０１Ｚ”、４
日間、嫌気培養） １）肉汁寒天平板培養：生育せず。

ｌ）“　ＹＥＤ　寒天平板培養、中程度の生育。円形か
らやや不規則状。扁平状から凸円状。周辺部は一全縁。

表面は円滑。半透明で均質であり、色は淡黄色から白色
。色素の生成は認められず。

２）肉汁寒天斜面培養：生育せず。

２）’ＹＥＤ寒天斜面培養°糸状ｔこ中程度の生育。

３）肉汁液体培養：生育せず。

３）’ＹＥＤ液体培養：全体的にかすか１こ濁る。

表面では生育せず。ガスの発生が認められ、若干の粘稠
な沈澱を生ずる。

４）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育せず。

４）’ＹＥＤゼラチン穿刺培養：液化せず。

５）　リドマス壽ミルク：酸性 ＹＥＤ培地組成 自デ母エキス　　　　　　　　４　　２／ｌグルコース
　　　　　　　　７　　７／１ＫＨ２ＰＯ４１？／ｌ Ｋ、、　ＨＰＯ４１９７１ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，５９／１ ＣａＣ：１２２Ｈ２００，０５９／Ｌ 尿　　素　　　　　　　　　　　　　　　１．０　　　
　ｆ／１ＦｅＳＯ４０，００１２５？／　Ｌ システィン　　　　　　　　０．５　　　ｔ／１（ｐＨ
）　　　　　　　　　　　７．０（Ｃ）　　生理学的性
質 １）硝酸塩の還元ニー ２）脱窒反応ニー ３）ＭＲテスト：± ４）ＶＰテストニー ５）インドールの生成ニー ６）硫化水素の生成：十 ７）　デンプンの加水分解：＋ ８）　クエン酸の利用： Ｋｏｓｅｒ培地　　　　− Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ培地　− ９）無機窒素源の利用： 硝酸塩　　　　　　− アンモニウム塩　　＋ １０）色素の生成：なし 】１）　　ウレアーゼ：＋ １２）オキシダーゼ：− １３）　　カタラーゼニー １４）生育の範囲： 温度　　５０ｒ〜ｓｏｒ ｐＨ５，５〜７．５ １５）酸素１こ対する態度： ＋６）Ｏ−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ　＆　Ｌｅｉｆｓｏｎ法
ｔこよる）：０．■ ＋７）　　糖類から酸およびガスの生成の有無酸の生成
　ガスの生成 Ｌ−アラビノース　　＋　　　　＋ Ｄ−キシロース　　　＋　　　　＋ Ｄ−グルコース　　　＋　　　　　＋ Ｄ−マンノース　　　＋　　　　十 〇−７ラクトース　　＋　　　　＋ Ｄ−ガラクトース　　＋　　　　　＋ 麦芽糖　　千　　十 シ　　ヨ　　糖　　　　　　　　　＋　　　　　　　　
＋乳　　　　糖　　　　　　　　十　　　　　　＋トレ
ハロース　　　　　＋　　　　　＋Ｄ−ツルピント　　
　　−− 〇−マンニット　　　−　　　　− イノンント　　　　　−　　　　− グリセリン　　　　　−− デンプン　　　　　　＋　　　　＋ セロビオース　　　　＋　　　　＋ （ｄ）　　その他の性質 １）セルロースの分解：きわめて強い。

２）　キシランの分解：きわめて強い。

３）糖類の分解生成物：乳酸、酢酸、エタノール、ＣＯ
，１ＳＨ２ ４）Ｇ＋Ｃ含量：　３６．８チ 以上の菌学的荀性質を［バーシーズ・マニュアル・オブ
・デイタミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅ
ｙｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔ
ｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版」及び「同第
７版」の記載と対比すると、本菌株はクロストリジウム
（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　）属ｔこ属すると考えられ
る。

木灰は「バーシーズ・マニュアル第８　版Ｊ　ｔ＝よれ
ば、胞子を末端に近い位置に作るグループ、胞子を末端
Ｆこ作るグループ、生育１こ特殊なものを要求するグル
ープの３グループ１こ分けられる。第３のグループｔこ
け５つの菌株が知られているが、Ｃ，ａｃｉｄｉｕｒｉ
ｃｉ以外はダラム染色性が陰性であり、本菌株とは異な
る。しかるｅこＣ，ａｃｉｄｉｕｒｉｃｉは大多数の糖
質を醗酵させることができないので本菌株とは明らかに
異なる。従ってこの第３のグループ１こはｌ−ａ株と一
致する菌株はないと判断された。次１こ本菌株の胞子の
生成位置が末端であるか末端ｅこ近い位置であるかは判
別が困難であり、第１及び第２のグループの全ての菌株
と比較検討を行った。

まず、胞子を末端に近い位置１こ作る第１のグループを
こは３１菌株が知られているが、糖の資化性パターン等
でｉ−ａ株と一致するものはＣ，ｂｕｔｙｒｉｃｕｍと
Ｃ，ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ＋Ｃ，ａｕｒａｎｔ
ｉｂｕｔｙｒｉｃｕｍの３菌株しかない。しかし、これ
ら３菌株ともブタノール・酪酸の生成、生育温度、Ｇ＋
Ｃ含量等の点で本菌株とは大きく異っており、この第１
のグループにはＩ−ａ株に該当する菌株は見当らない。

次ｔこ胞子を末端に作る第２のグループＦこは２５菌株
が知られているが、糖の資化性・醗酵性等のパターン等
でＩ−ａ株とｉ−〕たく一致するものはＣ，ｏｃｅａｎ
ｉｃｕｍ　　１株しかない。しかし、Ｉ−ａ株はこの菌
株ともブタノール・醋酸等の生成、生育温度、Ｇ＋Ｃ含
量の点て異りている。

従ってクロストリジウム属１こ属する既知の（・がなる
菌株ともＩ−ａ株は入っており、本発明者等は本菌株を
クロストリンラム属？こ属する新菌種と認め、クロスト
リジウム・サーモセルロボーラム（Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｃ
ｅｌｌｕｌｏｖｏｒｕｍ　ｎｏｖ、　　ｓｐ、　　）と
命名した。

本機生物を培養するためｔこ用いる培地の炭素源として
は、グルコース、セロビオース、セルロースなど各種糖
質原料を広く利用することができ、窒素源としては硫安
、塩安、などのアンモニウム塩類や尿素等を利用するこ
とかできる。その他無機金ｍ　塩ＦＡやビタミン、イー
ストエキス、コーン・スチープ・リカーなどの生育促進
因子を添加することが好ましい。

又、培養１こあたっては５０Ｃ〜８０Ｃ１好ましくは６
５Ｃ〜７５Ｃで、培地のｐ　Ｈを５．５〜７．５、好ま
しくは６．０〜７．０Ｆこ調整し、さら？こ植菌・培養
を嫌気条件下で行う必要がある。

培養時間は１日〜７日間程度でよく、培養液中、こ、’
、ｒ、　ハ’ｊ）’ｌのセルラーゼ及び、ヘミセルラー
ゼ（キ・ラナーゼく９）を蓄積する。

培↑１柊了１麦、培養液の遠心分離上澄より、エタノー
ル沈澱法の常法？こより酵素を分Ｉｌｌ、粗精製した。

冑らｈた酵素？用いて本セルラーゼの主な酵素学的性質
？こついて検討した結果を次に示す。

■　基質及び生成物 本酵素はアビセル、セルロースパウダー、ＣＭＣ、濾紙
、故紙、バガス、水利チップ、綿、もみがら、稲わら、
おから等セルロースやヘミセルロース及びそれらの含有
物に広く作用し、これらを溶解させ還元糖を生成せしめ
る。生成した還元糖を液体クロマトグラフィーｔこより
分析したところ、グルコースやキンロース等各基質を構
成する単糖及びそれらのオリゴ糖であることが確認され
た。

■　至適作用温度及びｐＨ 本酵素を濾紙を基質として作用させ、生成した還元糖の
生成仏によりその活性をｊｌ］定した場合の、各温度で
の活性及び各ｐＨでの活性な第１図及び第２図１こ示す
。本酵素の至適作用温度は８０Ｃであり、至適作用ｐ　
Ｈは５〜６である。

■　安定性 本酵素の熱安定性とｐＨ安定性を濾紙からの還元糖の生
成活性１こより検問した。熱安定性１こついてはリン酸
バッファ（ｐＨ６，０）ｔこ溶解した酵素液を各硼度ン
こ１５分間保持した後、活性を測定し、その結果を第３
図ｅこ示す。ｐＨ安定性ンこついては各ｐＨのバッファ
に酵素を溶解し、１０１Ｚ”で２４時間保持した後、ｐ
Ｈ５，５の酢酸バッファでｐＨを再調整し活性を測定し
た。その結果を第４図１こ示す。

つまり本酵素は１００ｔ：、１５分処理によってもなお
２０％の残存活性を有するほどきわめて熱安定性の高い
セルラーゼであると考えられる。

■　分子量 バイオゲルＰ−１００を用いた液体クロマト法により、
本酵素の分子量を測定Ｉまたところ、セルラーゼ１こ活
性を有する蛋白分子は４万からｌＯ万ンこ広く分布して
いることが判明した。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ ５００ｍｌ容肩伺きフラスコに培地を１００ｍ１Ｖ張込
み１２０Ｃで１５分間殺菌し、冷却後フラスコ内を、酸
素を完全？こ除却した窒素ガスを用いて置換し嫌気状態
としたものを用意する。用いた培地の組成を以下Ｖこ示
す。

成　　　　分　　　　　　　　　　　　　　　　量酵母
エキス　　　　　　　　　　　　４　７／ｌグルコース
　　　　　　　　　　　　ｌ　　ｔ／１ＫＨ２ＰＯ４１
グ／ｌ Ｋ、ＨＰ０．　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１　　　　　９７１Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ
，・７Ｈ２００，５ｆ／１ＣａＣ１２・２Ｈ，、Ｏｏ、
ｏｓｙ／を尿素　　　　　　　１．Ｏｙ／１ Ｆｅ３０４　　　　　　　　　　　　　１．２５ｍ９／
Ｌンステイン　　　　　　　　　　　　ｏ、ｓ　　ｙ７
を同様の培地を用いて嫌気的に前培養したクロストリジ
ウム・サーモセルロボーラムＩ−ａ株を５％　（、ｖ／
ｖ　）接種し、再度窒素置換により嫌気状態とした後７
０Ｃで振とぅ培養を７２時間行った。

培養終了後、培養液中のセルラーゼ活性を測定した。濾
紙を基質とした１時間の反応でｌ　ｒＪ当り３ＩＩＩｇ
のグルコース′を生成し、１ｏりの上質紙を基質とした
４８時間の反応では４７の還元糖を生成し、この還元糖
は８０％がグルコースであった。

実施例２ ３を容ガラス製小型醗酵槽を用い、実施例１で用いた培
地２ｔを張込み、１２０ｔｌｌ’、１５分間の殺菌の後
、酸素を除却した窒素ガス１こより内部を置換し嫌気状
態とした。これに同じ培地を用いた嫌気的フラスコ培養
にこより前培養したクロストリジウム・サーモセルロボ
ーラムＩ−ａ株を５％（ｖ／ｖ）になるようＦこ接種し
た。３００　ｒｐｍの速度で攪拌し、常ｔこ酸素除去窒
素ガスを少量ずつ醗酵液中に通気し、醗酵槽内の嫌気状
態を保った。

７０Ｃにコントロールするトトモｔこ、ｐＨメーク−と
連動したポンプにより、無菌的に水酸化すトリウム水溶
液を添加することにより、ｐＨを６．５以上に保った。

８０時間培養を続けた結果、セルロースの９０％以上が
分解消失していた。この培養液中の固形物を遠心分離に
より除去し得られた上澄１００ｍ１Ｖｔこ微粉化したバ
ガス（セルロース５０％含有、ヘミセルロース３３％含
有）２０２を添加し、５００ｍ／容フラスコ中でｓ　ｏ
　ｒｒこて振とう反応させた。４８時間反応させた後、
反応液中のバガスは約８２に減少し、還元糖が新たｔこ
９．５？生成していた。この還元糖の構成成分を液体ク
ロマトグラフィーにより分析したところ、グルツースが
６０チ、キンロースが２３％、アラビノースが１５％で
あった。

特許出願人　味の素株式会社 −Ｊ゛１、トノ１ １１用温度（℃） 第２図 作用円ｌ 第　３１ノ１ 温度（’Ｃ） 第４図 手続補正書（方式） ％式％ ２、発明の名称 微生物によるゼルラーゼのＩＪＡ造方法３、補正をする
者 事イ！１との関係　　特許出願人 １」所　　　東京都中央区京橋−丁目５番８弓（発送日
　　　　　昭和５８年５月３１日）５、補正により増加
する発明の数　　　なし６、補止の対象　　　図面の簡
単な説明の（開明ｌ１ｌＩＩ書第１５′ＦＡ、　１６行
目と１７行目の間に下記を挿入する。

「４、図面の簡単な説明 第１図は酵素の作用温度と相対活性を図示したものであ
る。

第２図は酵素の作用１１Ｈと相対活性を図示したもので
ある。

第３図は酵素の作用温度に対りる相対残存活性を図示し
たものである。

第４図は酵素の作用１目−１１，１口る相対残存活性を
図示したものである。」 以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. クロストリジウム属に属する新菌種クロストリジウム・
   ザーモセルロボーラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｃｌｉｕｍｔｈ
   ｅｒｍｏｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒｕｍｎｏｖ、　ｓｐ、　
   ）を培養し、耐熱性セルラーゼを培地中１こ蓄積せしめ
   ることを特徴とするセルラーゼの製造方法。