TWI792803B - 天然型n-乙醯葡萄糖胺生產方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種N-乙醯葡萄糖胺生產方法，其包含下列步驟：(a)提供
Chitinibacter tainanensis菌株；(b)將Chitinibacter tainanensis菌株接種於液體培養基中，該液體培養基中含有幾丁質、磷酸氫二銨及酵母菌萃取物，該磷酸氫二銨在該液體培養基中的濃度為1.9mg/mL，該酵母菌萃取物在該液體培養基中的濃度為1.5mg/mL；及(c)使Chitinibacter tainanensis菌株在溫度為30℃的環境中進行發酵，以將該幾丁質分解成N-乙醯葡萄糖胺。藉由如上所述之N-乙醯葡萄糖胺生產方法，可以提升天然型N-乙醯葡萄糖胺的產率。
Description
本發明係關於一種N-乙醯葡萄糖胺生產方法，尤其是一種以微生物來生產天然型N-乙醯葡萄糖胺的N-乙醯葡萄糖胺生產方法。
N-乙醯葡萄糖胺(N-acetylglucosamine，NAG)是在人體中具有重要生理功能的胺基糖(Aminosugar)，NAG與人體中氨基葡聚醣(Glycosamino-glycan，GAG)、醣蛋白(Glycoprotein)或蛋白多醣(Proteoglycan)的合成有關，上述醣類為構成人體細胞成分的重要材料。
關於NAG的生產製程，當前製程所使用的原料主要是葡萄糖或幾丁質，其中幾丁質較常被用於製造NAG。在以幾丁質製造NAG的製程中，主要分成下列三種方法。
第一種方法為化學法，其為以強酸將幾丁質在高溫下進行水解以產生葡萄糖胺，然後使酸酐與前述葡萄糖胺作用，然後將前述作用的反應物接上乙醯基來產生N-乙醯葡萄糖胺。但以化學法製造出的NAG可能有殘留化學藥劑的問題。
第二種方法為酵素法，其為透過幾丁質內切酶、幾丁質外切酶與N-乙醯葡萄糖胺酶等酵素，將幾丁質水解來產生NAG。由酵素法所生產出的NAG為天然型NAG，天然型NAG具有安全性高、純度高且無化學物質殘留的優點，但以酵素法生產NAG的生產成本較高。
第三種方法為生物轉化法，其為利用微生物將幾丁質分解為NAG，此種方式所生產出的NAG亦為天然型NAG，且其生產成本較低。
然而，當使用生物轉化法來生產NAG時，此製程的產率會受到微生物的生長條件和發酵情形的影響。例如，在發酵環境中給予微生物適量的氮源能夠提供微生物生長，並將幾丁質分解成NAG。目前一般用於供微生物使用的氮源為胰化蛋白與酵母菌萃取物，而如何提供更佳的氮源配方以進一步提升微生物生產NAG的製程之產率，仍為有待解決的問題。
本發明之目的即針對上述問題，提供一種N-乙醯葡萄糖胺生產方法，其包含下列步驟：(a)提供Chitinibacter tainanensis菌株；(b)將Chitinibacter tainanensis菌株接種於液體培養基中，該液體培養基中含有幾丁質、磷酸氫二銨及酵母菌萃取物，該磷酸氫二銨在該液體培養基中的濃度為1.9mg/mL，該酵母菌萃取物在該液體培養基中的濃度為1.5mg/mL；及(c)使Chitinibacter tainanensis菌株在溫度為30℃的環境中進行發酵，以將該幾丁質分解成N-乙醯葡萄糖胺。
如上所述之方法，在(b)步驟中，該幾丁質在該液體培養基中的重量百分濃度為6%。
如上所述之方法，該液體培養基中的幾丁質為α-幾丁質。
如上所述之方法，該α-幾丁質的來源為蝦殼。
如上所述之方法，該α-幾丁質的來源為蟹殼。
藉由如上所述之N-乙醯葡萄糖胺生產方法，透過使用更佳的氮源配方，可以進一步提升天然型N-乙醯葡萄糖胺的產率。
圖1示出本發明實施例5之N-乙醯葡萄糖胺生產方法利用不同幾丁質來源生產NAG的產率比較結果。
為充分瞭解本發明之目的、特徵及功效，茲藉由下述具體之實施例，並配合所附之圖式，對本發明做一詳細說明，說明如後：
實施例1之N-乙醯葡萄糖胺生產方法
本實施例1中所使用的菌株為Chitinibacter tainanensis。上述Chitinibacter tainanensis菌株是參考台灣I328041號專利，由中華民國食品工業發展研究所生物資源保存中心內取得，其菌種編號為BCRC910256。
首先，將Chitinibacter tainanensis菌落接種於400ml的LB培養基中，於30℃環境中進行發酵培養16小時後，從發酵液中取五份10ml的接種用菌液(濃度約為1.7 x 109cfu/ml)。同時準備五個500ml的錐形瓶，各錐形瓶中倒入100ml的液體BH培養基(Difco Bushnell-Haas broth)，該BH培養基中含有重量百分濃度為6%的α-幾丁質(此僅為本實施例1中提供的幾丁質類型示例，在其他實施例中，使用者可視需求使用其他類型的幾丁質)。將前述五份10ml的接種
用菌液分別接種到前述五份液體BH培養基中，上述接種有Chitinibacter tainanensis菌株的五份BH培養基分別作為控制組與實驗組一至實驗組四，控制組的培養基中不添加任何額外氮源；實驗組一的培養基中添加最終濃度為1.5mg/ml的酵母菌萃取物(Yeast Extract)；實驗組二的培養基中添加最終濃度為3mg/ml的酵母菌萃取物；實驗組三的培養基中添加最終濃度為4.5mg/ml的酵母菌萃取物；實驗組四的培養基中添加最終濃度為6mg/ml的酵母菌萃取物。
上述控制組與實驗組的樣本於30℃環境中進行發酵培養96小時，以使其中的Chitinibacter tainanensis菌株將該幾丁質分解成N-乙醯葡萄糖胺。上述控制組與實驗組的樣本培養96小時後，取控制組與實驗組的樣本進行離心(離心轉速為10000rpm，離心時間為10分鐘)，離心完畢，取出控制組與實驗組的樣本中之上清液，以屈折度計(ATAGO)測量控制組與實驗組的樣本上清液之屈折度(Brix%)(即測量上清液中所溶解N-乙醯葡萄糖胺的總濃度百分比)，換算成N-乙醯葡萄糖胺的濃度。
實驗結果如下表1所示，結果顯示，在培養基中添加酵母菌萃取物可以提升Chitinibacter tainanensis菌株生產NAG之產率，並且Chitinibacter tainanensis菌株的產率提升程度隨著酵母菌萃取物添加濃度之增加而提升。上述實驗結果證實了給予微生物適量的氮源能夠提升微生物將幾丁質分解成NAG的效率。
實施例2之N-乙醯葡萄糖胺生產方法
本實施例2之N-乙醯葡萄糖胺生產方法的流程與實施例1大致相同，本實施例2之控制組培養基成分亦與實施例1相同，唯一差別在於本實施例2之實驗組一至實驗組四中所添加的氮源種類與實施例1不同。本實施例2中實驗組一至實驗組四中的氮源種類及濃度如下表2所示。
實驗結果如下表3所示，結果顯示，在培養基中添加胰化蛋白與酵母菌萃取物可以提升Chitinibacter tainanensis菌株生產NAG之產率，並且Chitinibacter tainanensis菌株的產率提升程度隨著胰化蛋白與酵母菌萃取物添加濃度之增加而提升。並且將本實施例2的實驗結果與實施例1的實驗結果比較時可以發現，培養基中的部分酵母菌萃取物以胰化蛋白取代，Chitinibacter tainanensis菌株的產率提升程度更佳。上述實驗結果證實了不同類型氮源對微生物產生NAG效率的提升程度有所不同。尤其是加入胰化蛋白作為氮源的效果比單純以酵母菌萃取物作為氮源的效果更佳。
實施例3之N-乙醯葡萄糖胺生產方法
本實施例3之N-乙醯葡萄糖胺生產方法的流程與實施例2大致相同，本實施例3之控制組培養基成分亦與實施例2相同，唯一差別在於本實施例3之實驗組一至實驗組四中所添加的氮源種類與實施例2不同。本實施例3中實驗組一至實驗組四中的氮源種類及濃度如下表4所示。
實驗結果如下表5所示，結果顯示，在培養基中添加無機氮源與酵母菌萃取物可以提升Chitinibacter tainanensis菌株生產NAG之產率，並且將本實施例3的實驗結果(實驗組一，含有1.9mg/ml的(NH4)2HPO4與1.5mg/ml的酵母
菌萃取物)與實施例2的實驗結果(實驗組三，含有3.0mg/ml的胰化蛋白與1.5mg/ml的酵母菌萃取物)比較時可以發現，培養基中的胰化蛋白以磷酸氫二銨((NH4)2HPO4)取代，Chitinibacter tainanensis菌株的產率提升程度更佳。另外，由本實施例3的實驗結果中也可以發現，即使在四種無機碳源之中，磷酸氫二銨亦為較佳的無機氮源來源。
實施例4之N-乙醯葡萄糖胺生產方法
首先，準備160克的α-幾丁質粉末，將上述幾丁質粉末倒入2公升的BH培養基中並均勻混合，該BH培養基中還添加有最終濃度為1.9mg/ml的磷酸氫二銨與1.5mg/ml的酵母菌萃取物。將上述幾丁質粉末與BH培養基的培養基混合物倒入5公升發酵槽中，以通用的高壓滅菌釜進行滅菌。
然後，依據實施例1中的接種用菌液之製備方式來製備接種用菌液。取100ml的Chitinibacter tainanensis接種用菌液接種於上述培養基混合物中，以轉速200rpm，溫度30℃，通氣量2L/min的條件進行發酵，發酵時間為165小時每隔五小時從發酵液中取出發酵液樣本，並且依據實施例1的方法，從發酵液樣本中取得上清液，並測量上清液的屈折度，在各個時間點所測得之上清液的
NAG濃度中最高值可以達65mg/ml，若換算成NAG產率則可達81.3%(NAG產率=NAG產生量/幾丁質添加量x 100%)。
實施例5之N-乙醯葡萄糖胺生產方法
首先，依據實施例1的方法製備五份10ml的接種用菌液。同時準備五個500ml的錐形瓶以及五份實驗組液體培養基，上述五份實驗組液體培養基係以BH培養基作為基礎培養基，其中加入不同來源的α-幾丁質(在培養基中的重量百分濃度為6%)、磷酸氫二銨(在培養基中的最終濃度為1.9mg/ml)以及酵母菌萃取物(在培養基中的最終濃度為1.5mg/ml)。上述五份實驗組液體培養基分別作為實驗組一至實驗組五。
然後，依據實施例1的方法製備五份10ml的接種用菌液。同時準備五個500ml的錐形瓶以及五份控制組液體培養基，上述五份控制組液體培養基係以BH培養基作為基礎培養基，其中加入不同來源的α-幾丁質(在培養基中的重量百分濃度為6%)，但不加入氮源。上述五份實驗組液體培養基分別作為控制組一至控制組五。
其中實驗組一與控制組一使用相同α-幾丁質來源；實驗組二與控制組二使用相同α-幾丁質來源；實驗組三與控制組三使用相同α-幾丁質來源；實驗組四與控制組四使用相同α-幾丁質來源；實驗組五與控制組五使用相同α-幾丁質來源。在下表6中，實驗組一與控制組一並稱為組別一，實驗組二與控制組二並稱為組別二，實驗組三與控制組三並稱為組別三，；實驗組四與控制組四並稱為組別四，實驗組五與控制組五並稱為組別五。
組別一至組別五中的α-幾丁質來源如下表6所示。
表6-組別一至組別五中的α-幾丁質來源及型態
接著，將前述五份10ml的接種用菌液分別接種到實驗組一至實驗組五的液體BH培養基中，實驗組一至實驗組五的樣本於30℃環境中以200rpm的轉速搖瓶培養72小時，以使其中的Chitinibacter tainanensis菌株將該幾丁質分解成N-乙醯葡萄糖胺。上述實驗組的樣本進行發酵培養72小時後，依據實施例1的方法，從實驗組一至實驗組五的樣本中取得上清液，並測量上清液的NAG屈折度。
同時，也將前述五份10ml的接種用菌液分別接種到控制組一至控制組五的液體LB培養基中，進行如同上述實驗組一至實驗組五的發酵操作流程之發酵操作，以測量控制組一至控制組五之上清液的NAG屈折度。
實驗結果如圖1所示，圖1中的黑色長條表示組別中的實驗組，白色長條表示組別中的控制組，在組別一至組別五中，實驗組皆添加有最終濃度為1.9mg/ml的磷酸氫二銨以及最終濃度為1.5mg/ml的酵母菌萃取物作為氮源，各個實驗組相較於對應的對照組(使用相同α-幾丁質來源但未添加上述氮源)，各個實驗組的NAG產率皆有所提升。基於上述實驗結果可知，不管使用何種α-幾丁質來源為原料，只要在培養基中添加上述的氮源配方，都可以使得利用微生物生產N-乙醯葡萄糖胺之生產方法的NAG產率有所提升。並且，由上述實驗
結果可知，即使使用不同來源蝦殼或蟹殼等廢棄生質材料作為幾丁質，只要培養基中含有上述的氮源配方，Chitinibacter tainanensis菌株皆可有效地生產NAG，而幾丁質來源選擇的多元性，有助於進一步降低NAG的生產成本。
如上所述，藉由上述N-乙醯葡萄糖胺生產方法，該生產方法提供更佳的氮源配方，即1.9mg/ml的磷酸氫二銨與1.5mg/ml的酵母菌萃取物，相較於單純以BH培養基之習知N-乙醯葡萄糖胺生產方法，上述添加更佳的氮源配方之N-乙醯葡萄糖胺生產方法可以進一步提升天然型N-乙醯葡萄糖胺的產率。
本發明在上文中已以較佳實施例揭露，然熟習本項技術者應理解的是，該實施例僅用於描繪本發明，而不應解讀為限制本發明之範圍。應注意的是，舉凡與該實施例等效之變化與置換，均應設為涵蓋於本發明之範疇內。因此，本發明之保護範圍當以申請專利範圍所界定者為準。
Claims (8)
- 一種N-乙醯葡萄糖胺生產方法，其包含下列步驟：(a)提供Chitinibacter tainanensis菌株，該Chitinibacter tainanensis菌株寄存於食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910256；(b)將該Chitinibacter tainanensis菌株接種於液體培養基中，該液體培養基中含有幾丁質、磷酸氫二銨及酵母菌萃取物，該磷酸氫二銨在該液體培養基中的濃度為1.9mg/mL，該酵母菌萃取物在該液體培養基中的濃度為1.5mg/mL；及(c)使該Chitinibacter tainanensis菌株在溫度為30℃的環境中進行發酵，以將該幾丁質分解成N-乙醯葡萄糖胺。
- 如請求項1所述之方法，其中，在(b)步驟中，該幾丁質在該液體培養基中的重量百分濃度為6%。
- 如請求項2所述之方法，其中，該液體培養基中的幾丁質為α-幾丁質。
- 如請求項3所述之方法，其中，該α-幾丁質的來源為蝦殼。
- 如請求項3所述之方法，其中，該α-幾丁質的來源為蟹殼。
- 如請求項1所述之方法，其中，在(b)步驟中，該液體培養基中的幾丁質為α-幾丁質。
- 如請求項6所述之方法，其中，該α-幾丁質的來源為蝦殼。
- 如請求項6所述之方法，其中，該α-幾丁質的來源為蟹殼。
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| 期刊 Faiza Jabeen et al., Potential of bacterial chitinolytic, Stenotrophomonas maltophilia, in biological control of termites, 2018. |
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