SU1147749A1 - Способ получени стрептокиназы - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ПОЛЗГЧЕНИЯ СТРЕПТОКЙНА путем периодического культивировани  продуцента - стрептококка групШ С в присутствии глокозы и бикарбоната кали  с последующю{ отделением культуральной жидкости и двукратным о аждением целевого продукта эта«олом сначала при рН 6,3 - 6,9 и затем, в изозлектркческой точке, о т л и ,ч а ю щ и и с   тем, что, с целью уменьшени  расхода пищевого сырь  и снижени  себестоимости целевого продукта, в качестве продуцента используют Streptococcus eguisimilis 921/18-77, продуцент культивируют на питательной среде 8 которую дополнительно ввод т гидролизат казеина с содержанием аю1нного азота 90-220 мг %, а также двузамещен1а1Й фосфорнокислый натрий и сернокислый магний при следукщем соотношении компонентов , мас.%: 0,4-0,9 Глюкоза Двузамещенный фос0 ,1-0,4 форнокислый натрий 0,01-0,02 Сернокислый магний 1.0-1,2 Бикарбонат кали  (Л Гидролизат казеина с содержанием аминного азота 90-220 мг Z Остальное 2. Способ (ю п. 1, от л и ч а ющ и и с   тем« что после осажденн  концентрат фермента подвергают диализу против фосфатного буферного р астBopai и сорбционной очистке на фосфа4ib те кал,ьцн . 1 4311 00

Description

Изобретение относитс  к технологии получени  микробных ферментов и может быть использовано дл  получени  препаратов стрептокиназы медици ского и вереринарного назначени . Цель изобретени  - уменьшение расхода пищевого сырь  и снижение себестоимости целевого продукта. Цель достигаетс  тем, что соглас но способу получени  стретокиназы в качестве продуцента используют штамм Streptococcus eguisimilis 921/18-77, продуцент культивируют на питательной среде, в которую дополнительно ввод т гидролиэат казеи на, с содержанием амийного азота 90 . 220 нг %, а также двузамещенный фос форнокислый натрий и сернокислый натрий при сйотношении компонентов, мае.%: Глюкоза0,4-0,9 Двузамещенный форсфорнокислый натрий0,1-0,4 CepHOKHCJHirii магний 0,01-0,02 Бикарбонат кали  1,0-1,2 Гидролизат казеина с содержанием аминного азота 90-220 мг % Остальное После осаждени  концентрат ферме та подвергают диализу против фосфат ного буферного раствора н сорбционной очистке на фосфате кальци . Пример 1. Производственный штамм Streptococcus eguisimilis 921/18-77 засевают на агар с 5 вес крови барана и помещают в термостат при 36°е на 18 ч. Затем, не допуска охлаждени  культуры, ее .1вают с агара казеиновым бульоном и полученную взвесь гаьщерживают при той же температзфе в течение 6 ч, приго говл   таким образом посевной материал . Казеиновую питательную .среду дл  смыва и культивировани  продуцента стрептокиназы готов т из панкреотического гидролизата казеина, содержащего 800 мг % аминного азота. Эт Гидролизат развод т, внос  в 371 л апирогенной дистиллированной воды 89 л гидролизата, после чего кип т т в течение 15 мин, фильтруют через асбесто-целлюлозные пластины типа ФС-1 и стерилизуют при 116 С в течение 30 мин. После охлаждени  до 36 С в разведенный гидролизат 92 добавл ют при перемешивании стерильные ингредиенты: глюкозу, двузамещенный фосфорнокислый натрий, сернокислый магний н бикарбонат кали  до .получени  среды следующего состава, мас.%: Глюкоза Бикарбонат кали  Двузамещенный фосфат натри  Сульфат магни  Гидролизат казеина, разведенный до содержани  аминного азота 142 мг % Остальное Посевной материал в объеме 40 л ввод т в ферментер с 500 л приготовленной питательной среды. Культивирование осуществл ют под контролем рН. Стадию культивировани  осуществл ют в течение 5,5 ,ч. За это врем  рН снижаетс  до 6,8. Культуральную жидкость освобождают от микробной массы центрифугированием при факторе разделени  F 4000. Получают осветленную культуральную жидкость в объеме 520 л с активностью стрептокиназы 11000 ед/мл и содержанием побочнь1х ферментов (стрептолизина ) 128 ед/мл. Концентрацию водородных ионов довод т добавлением в осветленную культуральную жидкость лед ной уксусной кислоты до рН. 6,5, после чего производ т осаждение стрептокиназы при температуре -7 С зтанолом из расчета концентрации последнего в смеси 42 об.%. Операцию первого осаждени  провод т в течение 5 ч. Затем отдел ют осадок центрифугированием при факF 1500 и температуторе разделени  ре -5 С н течение 20 мин. Дл  извлечени  стрептокиназы осадок раствор ют в физиологическом растворе, забуференном до рН 7,8. При этом объем физиологического раствора берут равным 26 л. ( Во врем  выполнени  операции первого осаждени  рН при введении зтанола повышаетс  до 6,9, а по истечении часа достигает ранее установленного уровн  6,5. Нераствориршеес  в забуференном физиологическом растворе компоненты отдел ют центрифугированием при F 1500 в течение 20 мин при комнатной температуре. 31 Далее производ т второе осаждение стрептокиназы при рН 4,9 (т.е. в-изо электрической точке) и следующих режимных параметрах: количество этанола в смеси - 43 об. %; температура осаждени  - минус 11°С; врем  осаждени  - 2,5 ч. Образовавшийс  осадок отдел ют центрифугированием при F 1500 и температуре -5 С в течение 20 мин. Дл  извлечени  стрептокиназы осадок раствор ют в 1,8 л 0,0158 М фосфатного буферного раствора. Нерастворившиес  компоненты удал ют. После вьтолнени  данной операции получают 1,8 л концентрата, активность стрептокиназы в котором равна 241000 ед/мп, а стрептолизина - 512 ед/мл. Следовательно, выход стрептокиназы после второго осаждени  составл ет 241000x1i8xJ Of; -X ,( 11000x520x103 Концентрат внос т в целлофановые мешки (3 мешка по 600 мл) и диализуют в них против 100-кратного объема 0,0t58 М фосфатного буферного раствора в течение 3-х суток при температуре 612 С. В результате диализа стандартизируетс  солевой состав концентрата и происходит освобож дение от оставшихс  солей питательной среды. Концентрат очищают от стрептолизи на и пигментирующих веществ сорбцией на фосфате кальци . Дл  проведени  операции сорбции предварительно гото в т гель фосфата кальци  путем смеши вани  450 мл 0,5 М фосфатного буфера (рН 7,2) с 225 мл 1 М раствора уксус нокислого кальци  с последующей трехкратной oт ЯJlвкoй гел  фосфата кальци  0,05 М фосфатным буфером (рН 7,2). На образовавшийс  гель нанрс т 1,8 л концентрата стрептокиназы и перемешивают в течение 20 мин при комнатной температуре. После это го ферментный раствор отдел ют центрифугированием в течение 20 мин при F 1500. В результате получают концентрат стрептокиназы в объеме 1,8 л с актив ностью 125000 ед/мл, свободный от стрептолизина и пигментирующих веществ . I Выход стрептокиназы после сорбци: онной очистки составл ет 125000x1 jtBxlOi „,f.o. „„ 110000x520x10 00%-3,9%. 9 П р и М е р 2. Производственный штамм Streptococcus eguisimilis 921/18-7/ засевают на агар с 5 вес.% крови барана и помещают в термостат при температуре 37 С на 20 ч. Затем, не допуска  охлаждени  культуры, ее смывают с агара казеиновым бульоном и полученную взвесь выдерживают при той же температуре в течение 6ч, приготовл   таким образом посевной материал. Казеиновую питательную среду дл  смыва и культивировани  продуцента стрептокиназы готов т из панкреатического гидролизата казеина, содержащего 900 мг % аминного азота. Этот гидролизат развод т, внос  в 100 л апирогенной дистиллированной воды 10,3 л гидролизата, после чего кип т т в течение 15 мин, фильтруют через асбесто-целлюлозные пластины типа ФС-1 и стерилиззлот при 116 С в течение 30 мин. После охлаждени  до 37 С в разведенный гидролизат казеина добавл ют при перемешивании стерильные ингредиенты: глюкозу, двузамещенный фосфорнокислый натрий, сернокислый магний и бикарбонат кали  до получени  среды следующего состава, мас.%: Глюкоза0,9 Двузамещенный фосфат натри 0,3 Сульфат магни  0,015 Бикарбонат кали  1,2 Гидролизат казеина до содержани  аминного азота 103 мг% Остальное Приготовленньй посевной материал в объеме 8 л ,ввод т в ферментер с 112   вьшгеуказанной питательной среды. Операцию культивировани  продуцента осуществл ют при 36 С в течение 5 ч в периодическом режиме под контролем рН. При этом, начина  со 2-го часа культивировани , осуществл ют импульсное перемешивание микробной взвеси. За врем  культивировани  происходит снижение рН до 6,3. Культуральную жидкость осветл ют ентрифугированием при факторе разелени  F 4500, после чего произво т фильтрование ее сначала через сбестовую пластину Ф-300, а затем ерез миллипоровую мембрану с размеом пор 0,22 мкм. Получают ферментодержащий раствор с активностью стрептокиназы 7520 ед/мл, стрептопиназы - 128 ед/мл в объеме 110 л. Концентрацию водородных ионов в ферментном растворе довод т добавлением лед ной уксусной кислоты до 6,3, после чего производ т первое осаждение стрептокиназы обработкой данного- раствора 40 об.% этанола при температзгре -8 С в течение Л ч. При введении этанола до выпеукаэанной концентраци  его в смеси рН повышает с  до 6,7, а по истечении часа дости гает 6,4. Затем отдел ют осадок центрифугированием смеси в течение 20 мин при F 1500 и температуре -5 С Дп  извлечени  стрептокиназы осадок раствор ют в 5 л 0,0158 М фосфатного буферного раствора. Нерастворившиес  компоненты удал ют. Далее производ т второе осаждение стрептокиназы при рН Д,9, т.е. в изо электрйческой точке, при следующих режимных параметрах: количество этанола в смеси - 40 о6.%; температура д т-ельность второго рсаждени  - 3 ч. Образо вавшийс  осадок отдел ют центрифугированием при F 1500 и температуре 5С в течение 20 НИН. Дл  извлечени  стрептокиназы осадок раствор ют в 0,4 л 0,0158М ; фосфатного буферного раствора. Нерастворивииес  компоненты удал ют. После выиопнени  данной операции получают 0,4 л концентрата с актив;йостью стрептокшааы 430000 ед/мл, а стрептопиэина - 512 ед/мл. Поэтому выход стрептокинаэы после 2-го осажде и  равев .« Кон1 ентрат внос т в целлофановый iMCfflOK и диализуют против 40 л М фосфатного буферного раствора в течение 3-х суток при температуре 6±2°С. Дл  проведени  операции сорбционной очистки предварительно готов т гель фосфата кальци  путем смешивани  100 мл 0,5 М фосфатного буфера (рН 7,2) с 50 мл 1 М раствора уксуснокислого кальци  с последукмцей трехкратной отмьткой гел  фосфата кальци  0,05 М фосфатным буфером (рН 7,2). На образовавшийс  гель фосфата кальци  нанос т 0,4 л концентрата стрептокиназы и перемешивают в течение 20 мин при комнатной температуре . После этого ферментный раствор отдел ют центрифугированием в течение 20 мин при F 1500. В результате получают концентрат стрептокиназы в объеме 0,4 л с активностью 196500 ед/мп, свободный от стрептолизина и пигментирующих веществ. Выход стрептвкиназы после сорбционной очистки составл ет 12§50952г $101 1007 -9 52 7520x110x10 х10и% -9,Ь%. В табл. 1 доказано культивирование Streptococcus eguicimilis 921/18-77 в казеиновой питательной среде при различных режимных параметрах . В табл. 2 представлен выход стрептокиназы по стади м технологического процесса Дл  установлени  оптимального режима получени  стрептокиназы принимают во внимание не только количество фермента, накопленное на стадии культивировани , но учитывают также потери целевого продукта на последующих стади х технологического процесса , которые, как представлено в табл.2 завис т от условий культивировани . Т а блица 1

1аО 0,7 0,4 0,017 8,1 0,16

2150 0,5 0,2 0,010 7,8 0,40

3150 0,5 0,2 0,010 7,3 0,35

1760

10000

6390

Claims (2)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТРЕПТОКИHA^i путем периодического культивирования продуцента - стрептококка группы ’’С в присутствии глокозы и бикарбоната калия с последующим отделением культуральной жидкости и двукратным осаждением целевого продукта этанолом сначала при pH 6,3 - 6,9 и затем, в изоэлектрической точке, от л и- ,ч а ю щ и й с я тем, что, с целью уменьшения расхода пищевого сырья и снижения себестоимости целевого продукта, в качестве продуцента используют штат Streptococcus eguisimilis 921/18-77, продуцент культивируют на питательной среде, в которую дополнительно вводят гидролизат казеина с содержанием амйнного азота 90-220 мг %, а также двузамещенный ' фосфорнокислый натрий и сернокислый магний при следующем соотношении компонентов, мас.%:

   Глюкоза Двузамещенный фосфорнокислый натрий Сернокислый магний Бикарбонат калия Гидролизат казеина '0,4-0,9

   0,1-0,4 0,01-0,02

   1,0-1,2 с содержанием аминного азота 90-220 мг % Остальное
2. 2. Способ поп. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что после осаждения концентрат фермента подвергают диализу против фосфатного буферного раствора и сорбционной очистке яа фосфа те кальция.

   I >

   1 1147749