JPH06505146A - ヒアルロン酸の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒアルロン酸の製造 本発明は、細菌発酵によるヒアルロン酸（ＨＡ）の製造プロセスに関するもので ある。

ＨＡは、グリコ号ミノグリカンとして知られている高分子のクラスの１つである 。ＨＡは、長い直鎖の多糖であり、通常、ｃ　Ｃ１４Ｈ２０Ｎ　Ｎ　ａ　０１１ ）　、の分子式を有するナトリウム塩として存在している（ただし、ｎは、源、 単離過程及び測定方法によって変化する）。しかしながら、］、４×１０６まで の分子量が報告されているのみである。

ＨＡおよびその塩は、はとんどすべてのを推動物体の結合基質等の多くの源から 単離できる。しかしながら、ＨＡはまた、ケンダル（Ｋｅｎｄａｌｌ）　ら、（ １９３７年）、バイオケム　バイオフィズ　アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ ｐｈｙｓ、　Ａｃ＋ａ、）、２７９巻、ページ４０１〜４０５によって示される ように、ストレプトコッカス等の細菌の莢膜成分でもある。

ＨＡは、非免疫原性であり、このため、薬剤において大きな潜在力を有している 。大きい分子量（百方以北）を有するＨＡは、粘弾性の性質のため、とくに有用 であることが知られている。現在市販されているＨＡは、雄鶏の鶏冠等の鳥類か ら通常得られるが、上記材料に関してはウィルスの混入の恐れがあるという問題 がある。したがって、複合体の精製処理が必要であり、適当なプロセスがＵＳ− Ａ−４，１４１，９７３号に記載されている。しかしながら、このように広範囲 な精製が必要であるため、材料の製造コストが高くなることは明らかである。

鳥類のＨＡの単離に関する問題があるため、ＨＡを生産する発酵プロセスを開発 しようとする試みがなされてきた。

すべての種のストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）がＨＡを生産 するが、ＨＡを良好に産生じ、ヒアルロニダーゼ活性を有しない種を選ぶことが 重要である。

ＵＳ−Ａ−４，５１７，２９５号は、ストレプトコッカス　ピオゲネス（Ｓ、ｐ ｙｏｇｅｎｅｓ）を用いた発酵プロセスを記載しているが、生成物の平均分子量 が５５．０ＯＯＬ、かない。ＥＰ−Ａ〜０，１４４，０１９号は、高分子量のＨ Ａを生産するとしているストレプトコッカス　エクイ（Ｓ、ｅｑｕｉ）を用いた 別の発酵プロセスを記載しているが、分子量を標準的でない方法で計算している ため、他の方法で計算されている分子量と簡単に比較できない。ＷＯ−Ａ−８゜ ６０４．３５５号およびＵＳ−Ａ−４，８９７，３４９号は両方とも、高分子量 のＨＡを高収率で製造する発酵プロセスを記載しているが、両方とものプロセス では、ストレプトコッカス（Ｓｊｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の毒性のある種が使 用されているため、細菌毒素による混入のためＨＡ生成物を薬剤に使用するのに は適さないと考えられる。

さらに、記載されている従来のプロセスはすべて、バッチ式の発酵プロセスであ る。様々なバッチ式の発酵プロセスによる問題点があり、例えば、精製しにくい ような不純物の混入した生成物の製造が挙げられる。

したがって、バッチ式の発酵の従来の欠点のない、高分子ｆｆ１（例えば、数百 刃）を有するＨＡを製造できる発酵プロセスを開発することは非常に好ましい。

したがって、本発明の第一の概念においては、プロセスが、ｐＨを６．０から７ ．０、希釈率を０．０５から０゜１２／時間および溶存酸素の分圧を１％飽和未 満に維持した連続培養装置による培養におけるストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐ ｔｏｃｏｃｃｕｓ）の連続発酵からなることを特徴とした、ストレプトコッカス （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の発酵によるＨＡの製造のプロセスを提供する ことである。

連続発酵プロセスは既知であり、理論はハーバ−）（Ｊｌｅｒｂｅｒｔｌ　ら（ １９５６年）によって、ジエー　ケン　ミクロ（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏ、 　）、１４巻、ページ６０２〜６２２に記載されている。従来あるバッチ式のプ ロセスに比べて連続発酵プロセスは難しいため、一般的な連続発酵プロセスの数 は限られている。また、バッチ培養は通常少量生産による出荷、ＨＡの作製に使 用される設備等の高い生産価値の設備に用いられ、連続発酵プロセスは、大量生 産による出荷、低生産価値の設備にのみ適していると考えられてきた。

本発明のプロセスは、従来のバッチ培養技術に関する様々な問題を解決するもの である。バッチ培養においては、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ ｕｓ）は定常期で行われているので、様々な分解酵素が発酵槽の肉汁中に細胞の 内容物を放出する細胞を破壊し始めるため、精製が難しくなる。

連続発酵プロセスを使用すれば、上記酵素の発現が減少するように発酵培養液は 定常状態に維持されるので、このようなことは起きない。連続発酵によって得ら れる定常状態の他の長所は、細胞壁の代謝回転が減少することがある。

このことは、発酵培養液中に放出される細胞壁成分からＨＡを分離するのが非常 に困難であることが知られているため好ましい。最後は、連続培養を使用するこ とによって、バッチ培養の定常期の間には発現する様々な毒素の発現が阻害され る。したがって、連続発酵プロセスを用いることによって、より精製した生成物 の製造が可能となる。

本発明のプロセスによって製造されるＨＡは、１，００ｏ、ｏｏｏから３，００ ０，０００の平均分量を有し、好ましい条件下では分子量は１，６００．０００ から２，５ｏｏ、ｏｏｏである。溶液における高分子量のＨＡは、創傷治療、眼 の外科および整形外科等の様々な医療分野において非常に有用である粘弾性特性 を有している。ＨＡは、また、様々な医療でない分野においても潜在的に有用で ある。

本発明のプロセスによって製造されるＨＡが医療においてを用であるような場合 には、いずれの混入物も毒性がないことが当然重要である。したがって、発酵プ ロセスにおいて用いられるストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ） の種は、生成物中に残存する細菌の混入物が毒性を有するという危険性を最小限 にするためにヒトの病原体でないものであることが好ましい。さらに、非病原性 のストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）が使用され、発酵槽から 誤って漏れることによって重大な健康上の危険性が生じない際には、製造設備の 安全性が増加する。他の種ももちろん使用できるが、本発酵プロセスにおいて使 用される特に好ましい種はストレプトコッカス　エクイ（Ｓ、ｅｑｕｉ）である 。

本プロセスにおいて使用するのに適当なストレプトコッカス　エクイ（Ｓ、　ｅ ｑｕｉ）の菌株は、連続培養装置による培養において長期間選択し、培養物を単 離することによって長期間培養するのに適した、安定な、高収率の表現型変異体 を選択することによって容易に当業者によって選択でき、細胞自身をさらに発酵 するためのシード（ｇｓｅｄ）をして使用する。培養サンプルを固体培地上で条 をつけ、個々の（または少数の）細胞から生じたコロニーを生育させる。ループ を用いて引いた際に粘質性の様相を呈する大きな粘液性の莢膜を有する生育の早 いコロニーを選択することによって、ストレプトコッカス　エクイ（５，ｅｑｕ ｉ）の出発菌株を改良できる。これらのコロニーは、次の作業で発酵槽に撒くた めに使用される。好ましくは、最初に上記コロニーをプレート上でざらに継代培 養し、同様の選択基準をシード−コロニー（ｓｅｅｄ−ｃｏｌｏｎｙ）を選択す るために使用する。

特に好ましい菌株は、受託番号ＮＣＩＭＢ　４０３２７で１９９０年１０月２４ 日にナショナル　コレクションオブ　インダストリアル　アンド　マリン　バク テリア（Ｎａ＋１ｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ 　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ）（ＮＣＩＭＢ）、アベルディーン 、スコツトランド（Ａｂｅｒｄｅｅｎ、５ｃｏｔｌａｎｄ）にブダペスト条約に 基づいて我々によって寄託された。

本発明の発酵プロセスは、以下の成分を含む栄養培地中で行われる： 同化炭素源； 窒素源； リン、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、鉄、亜鉛及びマンガン源； 生長因子源；および 硫黄源。

炭素は、糖、スクロースも使用できるが、特にグルコースの形態で供給される。

窒素源は、塩、特に水溶性の塩を含む毒性のない窒素であり、例えば、塩化アン モニウム等のアンモニウム塩が挙げられる。金属およびリンもまた、水溶性の塩 の形態で供給される。必要とされる生長因子は、必要である硫黄源でもある酵母 エキス等の源中にすべて含まれている。

栄養培地はさらに１種もしくはそれ以上のカルシウム源、モリブデン源、コバル ト源、銅源またはホウ素源を含んでいてもよい。

連続発酵プロセスにおける細菌の生育速度は、栄養培地の一必須成分の利用能を 制限することにより、エネルギー変換または多糖形成ではなく、バイオマス生成 を制限することによって制御される。上記で列挙した必須成分の供給はいずれも 制限できるが、硫黄の供給を制限することが好ましい。

栄養培地のｐＨは、上述したように、６．０から７．０の範囲内でなければなら ない。好ましい範囲は６．０から６．４であり、最も好ましい条件はｐＨが６． ２の時に行われる。

培地のｐＨは、発酵プロセス中水酸化ナトリウム等のアルカリの添加によって目 的とする範囲内に維持される。生じる発泡は、例えばポリプロピレングリコール を基礎とした物質等の、適当な毒性のない起泡剤の添加によって制御される。

上記したように、栄養培地を０．０５から０．１２／時間の希釈率（流量／発酵 槽の単位容積）で発酵領域に供給する。希釈率が約０．０７／時間の際に最も好 ましい条件となる。発酵容器内の培地の容積を一定に保つために、発酵槽に栄養 培養液を供給する割合と同じ割合で流出液を発酵槽から回収する。長期間連続し て培養する間、ストレプトコッカス　エクイ（Ｓ、ｅｑｕｉ）の選択された菌株 を一定の最適な条件に維持する自動調節器を用いて、物理化学的環境を一定に保 つ。生成物を流出液から収集する。

ストレプトコッカス（Ｓｒｒｅｐｌｏｃｏｃｃｕｓ）の培養を微好気性の条件下 で行う。発酵培養液の溶存酸素分圧を１％飽和未満、好ましくは０．１から０． 　５％飽和の範囲内に維持するのに十分な速度で、空気または他の酸素含有ガス を培養液に注入する。発酵培養液に供給されたガスは滅菌されていなければなら ず、空気を使用する際には、適当な流速は０．１から０．　５ｖ、ｖ、　ｍ、（ 容積／発酵槽の容積７分）である。

発酵培養液は粘性があり、ＨＡを生成しない好ましくないストレプトコッカス　 エクイ（Ｓ、ｅｑｕｉ）の菌株が生育する「デッドゾーン（ｄｅａｄ　ｚｏｎｅ ）　Ｊを排除するために培養液をよく攪拌することは必要であるため、発酵は連 続して攪拌しながら行うことが望ましい。

発酵培養液の温度は、３０から４０℃の範囲内に維持されなければならないが、 好ましい範囲は３５から４０℃であり、最も好ましい温度は３７℃である。

好ましい操作条件下では、本発明のプロセスは、発酵培養液１リツトル当たり２ ．５ｇ位のＨＡを産生じ、より多（の産生量を得ることさえも可能である。安定 した培養条件は５００時間以上維持することができる。したがって、プロセスは 、従来のバッチ発酵プロセスに比べてかなり改良されていることが示される。

発酵プロセス後は、バイオマスは殺され、陰イオン界面池性剤を含む水溶性の溶 媒でＨＡを抽出する。これらの２段階は同時に行われてもまた続けて行われても よい。加熱または抗細菌物質等の殺剤等の様ノｒな手段がバ・イオマスを殺すた めに用いられる。バ・イオマスを殺ずための特に好ましい物質は、ホルマリンと して一般的に知られている水溶液と１７で使用されるホルムアルデヒドである。

上記溶液の好ま１．、い濃度は、０．５から１．５％（ｖ　／　ｖ　）である。

界面活性剤は、０．０１から０．０５％（Ｗ／Ｖ）の濃度で、好ましくは０．０ ２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で添加される。

殺されたバイオマスからＨＡを抽出するのに適当な界面活性剤はドデシル硫酸ナ トリウムである。

バイオマスは、実質的にすべてのＨＡが細胞莢膜から放出されるまでの、１０か ら２４時間、通常約１６時間、殺剤及び界面活性剤と接触され続けられる。

次に、残ったバイオマスを、例えば、プレートおよびフレームフィルタープロセ ス（ｐｌａｔｅ　ａｎｄ　Ｉｒａｍｅ　ｆｉｌｔｅｒ　ｐｒｏｃｅｓｓ）やキー ゼルグールフィルターパッド（ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ　ｆｉｌｔｅｒ　ｐａｄｓ ）等の適当な濾過材料を用いて、濾過によって水溶液から分離する。発酵プロセ ス中はこれらのフィルターパッドを掃除或いは交換する必要があり、上記の適当 な間隔は２４毎である。大規模に操作するために特に用いられる他の濾過方法と しては、フィルターカートリッジ（ｆｉｌｔｅｒｃａｒｆｐｒｉｄｇｅ）を用い るものがある。このようなカートリッジはフィルターパッドのときと同じ間隔で 交換しなければならない。濾過後、細胞を含まないＨＡの濾過溶液が得られ５１ ．二の溶液をダイアフィルト１ノージヨンによってＭ’ＪＪし、低分子量の不純 物を除去する。これらの不純物は、製造ａ機体の代謝産物、栄養培地の残存した 成分、残りの殺剤および残りの陰イオン界面活性剤由来のものである。通常公称 、分子量が１０．０００から２５，０００ダルトン、好ましくは２０．０００ダ ルトンであるおおよその分子量のカットオフを何する限外濾過膜を用いることは 、この段階では必要である。ポリスルホンを基礎とした膜が好ま（７く、これは 市販されている。溶解したＨＡを含む濾過溶液を、８から２０倍容曾、好ま１． ２＜は約１０倍容量の純水でダイアフィルトレージョンし、濾液を連続して捨て る。好ま］７い純度を有する水は１０μ５ｃｒｎ−１未満での導電率を有する。

ダイアフィルトレージョン後、ＨＡの精製された溶液のモル濃度を、塩化ナトリ ウムに換算して０．１８から０゜２４Ｍの範囲内、好ましくは０．２０Ｍに調節 する。ｐＨもまた、必要であれば、６．３から７．８、好ましくは７゜０から７ ．５の値に調節する。ｐＨが７．２の際に、最も好ましい結果が得られる。ＰＨ は、水酸化ナトリウム等の塩基または適当なバッファー、特にリン酸バッファー を添加することによって調節できる。

医療用グレードの製品が必要である際には、溶液から核酸を沈殿させるという段 階をさらにプロセスに加える。上記は、例えば、塩化セチルピリジニウムの第４ 級アンモニウム化合物等の陽イオン界面活性剤を添加することによって行われる 。陽イオン界面活性剤は以下のような希釈した水溶液として添加される：例えば 、１％（ｗ／ｖ）塩化セチルピリジニウム溶液を上記溶液に１＝６０の容積比で 加える。さらに、３６２μｍから０．２μｍ、好ましくは１゜２μｍから０．２ μｍのポアサイズ（ｐｏｒｅ　５ｉｚｅ）の適当なフィルター材料を通して濾過 することによって、沈殿した核酸を除去する。この段階を用いる際には、以降の プロセスを非発熱性（ｐｙｒｏｇｅｎ−ｔｒｅｅ）装置を用いて滅菌条件下で行 わなければならない。

上記の段階をさらに経た後、または、上記の段階を用いない際には、溶液のモル 濃度およびｐＨを調節した後、例えば、イソプロピルアルコール等の低級アルコ ールの非溶剤を添加することによってＨＡを沈殿させる。沈殿したＨＡを濾過し 、濾液を捨てる。

ＨＡを塩化ナトリウム溶液に再度溶解し、さらに上記したのと同様にして非溶剤 を添加して再度沈殿させることによって、ＨＡ生成物の精製がさらに行える。塩 化ナトリウム溶液のモル濃度は、０．１８から０．２４Ｍでなけれなならず、最 も好ましい値は０．２０Ｍである。この溶液のｐＨは６．３から７．８でなけれ ばならず、好ましくは７゜０から７．５であり、最も好ましくは７．２である。

この溶液は、例えば、リン酸バッファーによって緩衝化される（ｂｕｆｆｅｒｅ ｄ）。

本発明の第二の概念においては、第一の概念のプロセスによって製造されたヒア ルロン酸を提供するものである。

このＨＡは、少なくとも１，０００．０００の平均分子量を有し、生成品の分子 量の範囲は好ましくは１，６００゜０００から２，５００．０００である。

本発明の第三の概念においては、菌株ＮＣＩＭＢ４０３２７のストレプトコッカ ス　エクイ（ｓＩｒｅｐｔＯｃＯｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ）を提供するものである。

本発明を以下の実施例を参考にしながらさらに説明する。

実施例１ ストレプトコッカス　エクイ（Ｓ、ｅｑｕｉ）の生育培地を以下のように配合す るニ ゲルコース　：６０．００ｇ 酵母エキス　：６．２５ｇ （オキソイド　エル２１（Ｏｘｏｉｄ　Ｌ２１））リン酸二水素ナトリウム　（ ２１１２０）　：　２．　０２ｇ塩化アンモニウム　：２．１４ｇ 塩化カリウム　：０．７１ｇ クエン酸　：０．４２ｇ 酸化マグネシウム　：０．４０ｇ 炭酸カルシウム　：０．１０ｇ モリブデン酸ナトリウム　ｆ２Ｈ２０）　：　２．４２　ｍ　ｇ塩化鉄（６Ｈ２ ０）　：　１０．　８０　ｍ　ｇ塩化コバルト　（６Ｈ２０）　：　０．　９５ ｍｇ塩化銅（２Ｈ２０）　：　０．３２ｍｇ酸化亜鉛　：　０．８１ｍｇ 塩化マンガン　（６１２０１：　４．　００ｍｇホウ酸　：０．１２ｍｇ 濃塩酸　：　０．１７８ｍＬ 上記培地を純水で１リツトルにする。さらに、０．２２μｍの絶対速度フィルタ ー（ａｂｓｏｌｕｔｅ　ｒａｔｅｄ　ｆｉｌｔｅｒ）で濾過することによって滅 菌する。

発酵槽の容積に比例して、０．０７／時間の流量で、この発酵培地を発酵槽に連 続して注入する。０．　２μｍの絶対速度フィルター（ａｂｓｏｌｕｔｅ　ｒａ ｔｅｄ　ｆｉｎｅｒ）で濾過した滅菌した空気で培地を通気する。空気の流量は ０．　２ｖ、ｖ。

ｍ、に維持し、発酵槽の肉汁中の溶存酸素分圧を０．　２％飽和に維持する。ス トレプトコッカス　エクイ（Ｓｔｒｅｐｒｏｃ。

ｃｃｕｇ　ｅｑｕｉ）をこの培地において３７℃で生育させる。水酸化ナトリウ ムを自動的に調節しながら添加することによって、ｐＨを６．２に維持する。必 要であれば消泡剤を基礎としたポリプロピレングリコールを添加することによっ て、泡の発生を制御する。

新しい培地を供給するのと同じ速度で、発酵培地を連続して発酵槽から抜く。こ の流出液は約２．５ｇ／リットルのヒアルロン酸を含んでいる。ドデシル硫酸ナ トリウム及びホルマリン溶液を、ドデシル硫酸ナトリウム及びホルマリンの最終 濃度がそれぞれ０．０２５％（ｗ／ｖ）及び１％（Ｖ／Ｖ）になるまで、発酵槽 から採った流出液に連続して供給する。流出液とドデシル硫酸ナトリウム／ホル マリンの流れの混合をインライン静的ミキサー（ｉｎ−１ｉｎｅ　５ｔａｔｉｃ 　ｍ１ｘｅｒ）で行う。接触時間は１６時間であり、混合後、この流れを、上記 滞留時間の間、設計された容器を通す。

ヒアルロン酸を水溶性の溶媒中に放出した後、適当なポアサイズ（ｐｏｒｅ　５ ｉｚｅ）のフィルターを用いたカートリッジフィルター（ｃａｒＨｉｄｇｅ　ｆ ｉｌｔｅｒ）でデプスフィルターで濾過（ｄｅｐｔｈ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ） することによって、残ったバイオマスを連続して除去する。周期的に生成物がき れいなフィルターに流れるようにし、これにより使用されたフィルターを洗浄、 交換できるように、２重のフィルターユニットを用いる。これらのフィルターユ ニットは、流れを転換するのが必要になるまでの最大２４時間操作できるような ものである。

次に、細胞が除去された溶液を純水でダイアフィルトレージョン処理し、培養培 地、ドデシル硫酸ナトリウム及びホルマリンの残存する材料を除去する。上記ダ イアフィルトレージョンは、公称分子１ｉ２０，０００ダルトンのカットオフを 有するポリスルホンを基礎とした限外濾過膜を用いて行われる。この溶液を、１ ０μＳｃｍ−’未満の導電率を有する１０倍８の水でダイアフィルトレージョン を行い、濾液を連続して捨てる。ダイアフィルトレージョン後、塩化ナトリウム （最終濃度０．２Ｍ）を得られた溶液に加え、リン酸バッファー（Ｎａ　ＨＰＯ ４，０，２２ｇ／リットル；ＮａＨ２ＰＯ４−２Ｈ２０，０，０４５ｇ／リット ル）を添加することによってｐＨを７．２に調節する。さらに、１％（Ｗ／　Ｖ 　）の塩化セチルピリジニウム溶液を約１＝６０の容積比で加える。このように して沈殿した核酸を、溶液を直列に並べた１、２μｍおよび０．２μｍ（絶対速 度（ａｂｓｏｌｕｔｅ　ｒａｔｅｄ））のデプスフィルターに通して吸入排出に よって除去する。さらに、このようにして得られたヒアルロン酸の濾過溶液に、 イソプロピルアルコールを１：２の流量で測量して流しながら連続して混合する 。上記混合は、静的ミキサー内で行い、沈殿したヒアルロン酸は、バスケットフ ィルター（ｂａｓｋＮ　ｆｉＨ！ｒ）で水溶液から分離される。濾液は捨てる。

回収されたヒアルロン酸を、ＨＡ　ｉ農度が０．２％（Ｗ／Ｖ）になるように、 リン酸バッファー（Ｎａ２ＨＰＯ４，０，０２２ｇ／リットル；　Ｎ　ａ　Ｈ２ ＰＯ４・２Ｈ２０，０，０４５ｇ／リットル）でｐＨ７，２に緩衝化された０、 ２Ｍの塩化ナトリウム溶液に再度溶解する。前述したのと同様にしてイソプロピ ルアルコールを添加することによって、ヒアルロン酸を上記溶液から沈殿させる 。

沈殿したヒアルロン酸をイソプロピルアルコールで洗浄し、洗浄液を捨てる。最 終的に残った微量のイソプロピルアルコールは、滅菌条件下で空気中で乾燥する ことによって除去する。すべての精製工程は室温で行われる。

医療用グレードの溶液は、１％（Ｗ／Ｖ）のヒアルロン酸溶液になるように、上 記したようにして製造されたヒアルロン酸を上述したリン酸バッファーでｐ）（ ’７．３に緩衝化された０、１５Ｍの滅菌生理食塩水に溶解することによって作 製される。このようにして調製されたヒアルロン酸ナトリウム溶液は、低角変レ ーザー光線散乱技術（ｌｏｗ　ａｎｇｌｅ　１ａｓｅｒ　ｌｉｇｈｔ　ｓｃａ目 ｅｒｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）および粘度測定法によって測定される］、 ６から２．５Ｘ１０６ダルトンの平均分子量を有する。上記溶液は、０．２％（ ｗ　／　ｗ　）未満のタンパク質含量および０．１５％（Ｗ／Ｗ）未満のヌクレ オチド量を有する。１％（ｗ／ｖ）溶液は、２６０ｎｍで０．１４ＡＵのおよび ２８０ｎｍで０．１ＡＵの紫外線吸収を示す。また、この溶液の粘度は、１００ ０ｓ’でＩＰａ、ｓ未満になるゼロ部所応力で１５９Ｐａ、ｓである。

以下の実施例は、本発酵プロセスに用いるのに適したストレプトコッカス　エク イ（Ｓ、ｅｑｕｉ）の選択方法を示すものである。

実施例２ ストレプトコッカス　エクイ（Ｓ、ｅｑｕｉ）の生育用の固体培地を以下のよう に配合するニ ゲルコース　８２０ｇ 酵母エキス　ニ　５ｇ （オキソイド　エル２１（Ｏｘｏｉｄ　Ｌ２１））寒天　：１５ｇ （オキソイド　エル１３（Ｏｘｏｉｄ　Ｌ２１）寒天Ｎｏ、３） 無水オルトリン酸水素二カリウム　：１．７０６ｇオルトリン酸二水素カリウム 　：１．３８８ｇオルトリン酸二水素ナトリウム　：２．９２ｇ塩化アンモニウ ム　：５．０１ｇ 塩化カリウム　：３７２ｍｇ クエン酸　：４２０ｍｇ 酸化マグネシウム　＋５０．４ｍｇ 炭酸カルシウム　：１０ｍｇ モリブデン酸ナトリウム　：２．４ｍｇ酸化亜鉛　：２．０５ｍｇ 塩化マンガン（４Ｈ２Ｃ１）　＋　１０　ｍ　ｇホウ酸　：０゜３ｍｇ 濃塩酸　：０．２４ｍＬ グルコースを５０ｍＬの水に溶解し、酵母エキスを１００ｍＬに、および寒天／ 塩を８２０　ｒｎ　Ｌの水にそれぞれ溶解ｌ−５１２］℃、１５分間オートクレ ーブすることによってそれぞれを滅菌し、さらに、−緒に混合した後にプレート に注入する。

実施例１で記載したのと同様に（−で行った発酵実験から得られたストレプトコ ッカス　エクイ（Ｓ、ｅｑｕｉｌ　のザンブルを、菌株の改良のために得た。ル ープを用いて引いた際に粘質性の様相を呈する大きな粘液性の莢膜を有する大き な生育の早いドーム状のコロニーを選択することによって、菌株の改良を行った 。これらのコロニーを、同様の選択基準を使用したプレート上にさらに継代培養 した。

したがって、本発明のプロセスは、高分子量の精製ＨＡを得るための経済的な生 菌発酵プロセスを提供［７、これにより従来のプロセスに比べて非常に改良され たものであることが示される。

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．プロセスがｐＨを６．０から７．０、希釈率を０．０５から０．１２／時間 および溶存酸素の分圧を１％飽和未満に維持した連続培養装置による培養におけ るストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の連続発酵からなること を特徴とした、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の発酵によ るヒアルロン酸の製造プロセス。
2. ２．ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の種がヒトに対して非 病原性である請求の範囲１に記載のプロセス。
3. ３．該ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）がストレプトコッカ ス　エクイ（Ｓ．ｅｑｕｉ）である請求の範囲１または請求の範囲２に記載のプ ロセス。
4. ４．該ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）がストレプトコッカ ス　エクイ（Ｓ．ｅｑｕｉ）ＮＣＩＭＢ　４０３２７である請求の範囲３に記載 のプロセス。
5. ５．栄養培地が以下を含む請求の範囲１から４のいずれかに記載のプロセス： 同化炭素源； 窒素源； リン、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、鉄、亜鉛及びマンガン源； 生長因子源；および 硫黄源。
6. ６．該炭素源が糖である請求の範囲５に記載のプロセス。
7. ７．該窒素源がアンモニウム塩である請求の範囲５または請求の範囲６に記載の プロセス。
8. ８．該リン、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、鉄、亜鉛及びマンガン源が 上記成分の水溶性の塩である請求の範囲５から７のいずれかに記載のプロセス。
9. ９．該生長因子源および硫黄源が酵母エキスである請求の範囲５から８のいずれ かに記載のプロセス。
10. １０．該栄養培地がさらに１種もしくはそれ以上のカルシウム源、モリブデン源 、コバルト源、銅源またはホウ素源を含む請求の範囲５から９のいずれかに記載 のプロセス。
11. １１．該栄養培地における制限成分が硫黄である請求の範囲１から１０のいずれ かに記載のプロセス。
12. １２．該栄養培地のｐＨが６．２である請求の範囲１から１１のいずれかに記載 のプロセス。
13. １３．該希釈率が０．０７／時間である請求の範囲１から１２のいずれかに記載 のプロセス。
14. １４．発酵培養液の該溶存酸素分圧が０．１から０．５％飽和の範囲内である請 求の範囲１から１３のいずれかに記載のプロセス。
15. １５．該発酵プロセスが連続して撹拌しながら行われる請求の範囲１から１４の いずれかに記載のプロセス。
16. １６．温度が３５から４０℃の範囲内に維持される請求の範囲１から１５のいず れかに記載のプロセス。
17. １７．流出液より得られたバイオマスを殺し、ヒアルロン酸を殺されたバイオマ スより抽出する段階をさらに含む、請求の範囲１から１６のいずれかに記載のプ ロセス。
18. １８．該バイオマスがホルムアルデヒドの水溶液を用いて殺される請求の範囲１ ７に記載のプロセス。 １８．ヒアルロン酸がドデシル硫酸ナトリウムを用いて殺されたバイオマスより 抽出される請求の範囲１６または請求の範囲１７に記載のプロセス。
19. １９．濾過によって残存するバイオマスを水溶液より分離する段階をさらに含む 請求の範囲１６から１８のいずれかに記載のプロセス。
20. ２０．濾過されたヒアルロン酸溶液をダイアフィルトレーションによって精製し 、低分子量の不純物を除去する段階をさらに含む、請求の範囲１９に記載のプロ セス。
21. ２１．精製された溶液のモル濃度を塩化ナトリウム換算で０．１８から０．２４ Ｍの範囲内に、およびｐＨを６．３から７．８に調節し、非溶剤を添加すること によってヒアルロン酸を沈殿させる段階をさらに含む、請求の範囲２０に記載の プロセス。
22. ２２．溶液のモル濃度およびｐＨを調節した後、陽イオン界面活性剤を添加する ことによって溶液から核酸を沈殿させる段階をさらに含む請求の範囲２１に記載 のプロセス。
23. ２３．請求の範囲１から２２のいずれかに記載のプロセスによって製造されたヒ アルロン酸。
24. ２４．１，６００，０００から２，５００，０００の分子量を有する請求の範囲 ２３に記載のヒアルロン酸。
25. ２５．菌株ＮＣＩＭＢ　４０３２７のストレプトコッカスェクイ（Ｓｔｒｅｐｔ ｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ）。