FR2906819A1 - Nouveau polysaccharide,son procede de preparation et ses utilisations notamment dans le domaine cosmetique - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne l'utilisation de la souche bactérienne ALV104 de la famille des Rhizobiaceae, déposée à la CNCM le 21 mars 2006 sous le numéro I-3591, pour la préparation d'un composé polysaccharidique, répondant à la formule (I) suivante : dans laquelle :- k varie de 1 à n,- n représente un nombre entier compris de 5 à 300, notamment de 8 à 270,- R<k>1, R<k>2, R<k>3, R<k>4, R<k>5, R<k>6, R<k>7 et R<k>8 représentent, indépendamment les uns des autres, H ou un groupe acyle comprenant de 1 à 6 atomes de carbone.
Description
NOUVEAU POLYSACCHARIDE, SON PROCÉDÉ DE PRÉPARATION ET SES UTILISATIONS
NOTAMMENT DANS LE DOMAINE COSMÉTIQUE La présente invention a pour objet un nouveau polysaccharide, ainsi que son procédé de préparation à partir d'une souche bactérienne, et ses utilisations notamment dans le domaine cosmétique. Le sol est une réserve inépuisable de micro- organismes possédant des propriétés innovantes toutes reliées à une fonction biologique. Au sein de la partie du sol appelé rhizosphère, il existe une population bactérienne spécifique présentant une aptitude à synthétiser des polysaccharides. Le rôle de ces polysaccharides au niveau du sol est de permettre une adhésion entre la bactérie et la plante ainsi que de structurer le sol au voisinage proche de cette dernière. De nombreuses bactéries issues de la rhizosphère appartiennent au genre 15 Rhizobium. Ces bactéries possèdent la capacité de former avec les végétaux des nodules symbiotiques. La présente invention a pour objet de fournir une souche bactérienne produisant un composé polysaccharidique présentant des propriétés intéressantes pour des applications en cosmétique. 20 La présente invention a pour objet de fournir un polysaccharide présentant des propriétés intéressantes pour des applications en cosmétique. La présente invention concerne l'utilisation de la souche bactérienne ALV 104 de la famille des Rhizobiaceae, déposée à la CNCM le 21 mars 2006 sous le numéro I-3591, ou d'une souche dont le gène rrs présente un pourcentage d'identité supérieur 25 ou égal à 99,9%, de préférence égal à 100%, avec le gène rrs de ladite souche ALV104, pour la préparation d'un composé polysaccharidique, répondant à la formule (I) suivante : 30 HOOC n H dans laquelle : ù k varie de 1 à n, 2906819 2 ù n représente un nombre entier compris de 5 à 300, notamment de 8 à 270, - Rkl, Rk2, Rk3, Rk4, Rk5, Rk6, Rk7 et Rk8 représentent, indépendamment les uns des autres, H ou un groupe acyle comprenant de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 atomes de carbone, notamment un groupe acétyle. 5 Le pourcentage d'identité entre deux gènes désigne le pourcentage de bases identiques entre ces deux gènes. La bactérie ALV104 susmentionnée a été isolée pour ses propriétés particulières à synthétiser un polysaccharide au cours d'un criblage des microorganismes présents dans le sol d'une plante commune : Arabidopsis thaliana. Cette souche a été classée par le 10 biais des outils de génétique moléculaire, comme appartenant à la famille des Rhizobiaceae et elle a été déposée le 21 mars 2006 auprès de la CNCM selon le traité de Budapest sous le numéro d'enregistrement I-3591. Le composé polysaccharidique de formule (I) susmentionnée est constitué d'une répétition de motifs comprenant 3 sucres dont 2 sucres neutres et 1 sucre acide, à savoir 15 l'acide mannuronique, le glucose et le galactose. La souche susmentionnée, déposée le 21 mars 2006 auprès de la CNCM selon le traité de Budapest sous le numéro d'enregistrement I-3591, a été identifiée après séquençage de son gène rrs qui code pour l'ARN ribosomal 16S. L'étude phylogénétique du gène rrs codant pour la petite sous-unité du ribosome 20 (ADNr 16S) montre que la souche ALV 104 est une bactérie qui appartient au genre Rhizobium, de la famille Rhizobiaceae, dans l'ordre des Rhizobiales de la subdivision alpha des Protéobactéries. Le groupe d'espèces décrites les plus proches phylogénétiquement de cette souche sont Rhizobium sullae (Squartini A, Struffi P, Dôring H., Selenska-Pobell S., Tola E., 25 Giacomini A., Vendramin E., Velazquez E., Mateos PF, Martnez-Molina E, Dazzo FB, Casella S. and Nuti MP (2002). Rhizobium sullae sp. Nov. (formerly `Rhizobium hedysari'), the root-nodule microsymbiont of Hedysarum coronarium L. Int J Syst Evol Microbiol 52, 1267-1276), Rhizobium indigoferae (Wei GH, Wang ET, Tan ZY, Zhu ME and Chen WX (2002). Rhizobium indigoferae sp. nov. and Sinorhizobium 30 kummerowiae sp. nov., respectively isolated from Indigofera spp. and Kummerowia stipulacea. Int J Syst Evol Microbiol, 52, 2231ù2239), Rhizobium yanglingense (Tan ZY, Kan FL, Peng GX, Wang ET, Reinhold-Hurek B and Chen WX (2001). Rhizobium yanglingense sp. nov., isolated from arid and semi-arid regions in China. Int J Syst Evol Microbiol, 51, 909-914), Rhizobium gallicum (Amarger N, Macheret V and Laguerre G 2906819 3 (1997) Rhizobium gallicum sp. nov. and Rhizobium giardinii sp. nov., from Phaseolus vulgaris nodules Int J Syst Bact , 47, 996-1006), et Rhizobium mongolense (van Berkum, P, Beyene D, Bao G, Campbell TA and Eardly BD.1998. Rhizobium mongolense sp. nov. is one of three rhizobial genotypes identified which nodulate and 5 form nitrogen-fixing symbioses with Medicago ruthenica [(L.) Ledebour] Int J Syst Bact, 48, 13-22). Toutefois la séquence du gène rrs de la souche ALV 104 a un pourcentage d'identité maximal de 98,8% avec celle du gène rrs des souches-type de chacune de ces espèces, ce qui suggère qu'elle appartient à une autre espèce. La séquence du gène rrs de la souche ALV 104 est par ailleurs très proche de 10 celles de trois autres souches, S109, USDA 1920 et YAS34, présentes dans GenBank (N d'accession respectivement AY509211, U89823 et AF23924). La souche S109, nommée par erreur R. gallicum, a un pourcentage d'identité de 99,7% avec ALV 104 pour sa séquence rrs. Pour la souche Rhizobium sp. USDA 1920 ce pourcentage est de 99,6%. Van Berkum et coll. (1998) ont montré que la souche USDA1920 appartient à une nouvelle espèce génomique qu'ils n'ont pas formellement décrite. La souche YAS34 isolée de la rhizosphère du tournesol sur un sol français (Alami Y., Achouak W., Marol C. and Heulin T. (2000). Rhizosphere soil aggregation and plant growth promotion of sunflower by an EPS-producing Rhizobium sp. isolated from sunflower roots. Appl. Environ. Microbiol., 66(8), 3393-3398), partage 99,5% de son gène rrs avec ALV 104 et appartient à une espèce qu'il reste également à décrire. L'arbre phylogénétique construit à partir des cent séquences de GenBank les plus proches de celle du gène rrs d'ALV 104, permet de visualiser ces quatre souches qui forment un groupe monophylétique et qui représente probablement une seule et même espèce nouvelle.
La technique des empreintes génétiques a été utilisée pour montrer que la souche ALV 104 est différente de la souche YAS34. Les empreintes sont obtenues par amplification de l'ADN total des souches en présence de séquences répétées de type "rep". Les amorces REP ont été utilisées avec les deux souches et les profils éléctrophorétiques de fragments d'ADN amplifiés sont nettement différents pour les deux souches : l'empreinte REP-PCR d'ALV104 comporte 9 bandes majeures de tailles comprises entre 500 et 4 000 paires de bases (pb) dont une bande très intense de taille approximative 2 500 pb alors que dans la même gamme, l'empreinte REP-PCR de la souche YAS34 comporte 6 bandes majeures dont une très intense de taille approximative 1 400 pb et aucune de taille 2 500 pb. 2906819 4 La souche déposée le 21 mars 2006 auprès de la CNCM selon le traité de Budapest sous le numéro d'enregistrement I-3591 est un bacille polymorphe, mobile, à coloration de Gram négative, aérobie stricte, catalase positive et oxydase négative. Sa capacité à assimiler une grande diversité de substrats glucidiques autorise la 5 production de polymère par cette souche à partir d'une grande variété de substrats glucidiques issus de la valorisation de coproduits d'origine agricole. Cette souche présente les caractéristiques biochimiques décrites dans le tableau ci-dessous : Test Résultat Gram Gram négatif Etat Frais Bacille mobile polymorphe Oxydase Ox - Catalase Cat - Type respiratoire Aérobie stricte Gélose au sang Non hémolytique Equipement Glucose + enzymatique Mannose + Arabinose + Saccharose + Ribose + Xylose + Maltose + Lactose + Mannitol + Nitrate Réductase + a-glucosidase + (3-glucosidase + 10 L'appartenance de cette souche à la famille des Rhizobiaceae est déterminée par les résultats des tests ci-dessus, à savoir : Gram, état frais, oxydase, catalase, type respiratoire et gélose au sang. La présente invention concerne également l'utilisation telle que définie ci-dessus, de la souche bactérienne ALV 104 telle que définie ci-dessus, pour la préparation d'un 15 composé polysaccharidique de formule (I) telle que définie ci-dessus, dans laquelle au moins 12,5% de la totalité des groupes Rkl, Rk2, Rk3, Rk4, Rk5, Rk6, Rk7 et Rk8 représente un groupe acétyle. 2906819 5 La présente invention concerne également l'utilisation telle que définie ci-dessus, de la souche bactérienne ALV 104 telle que définie ci-dessus, pour la préparation d'un composé polysaccharidique de formule (I) telle que définie ci-dessus, dans laquelle d'environ 40% à environ 60%, notamment d'environ 43% à environ 56%, et de 5 préférence d'environ 43,75% à environ 56,25% de la totalité des groupes Rkl, Rk2, Rk3, Rk4, Rk5, Rk6, Rk7 et Rk8 représente un groupe acétyle. La présente invention concerne également l'utilisation telle que définie ci-dessus, de la souche bactérienne ALV 104 telle que définie ci-dessus, pour la préparation d'un composé polysaccharidique de formule (I) telle que définie ci-dessus, dans laquelle au 10 moins 12,5% de la totalité des groupes Rkl, Rk2, Rk3, Rk4, Rk5, Rk6, Rk7 et Rk8 représente un atome d'hydrogène. La présente invention concerne également l'utilisation telle que définie ci-dessus, de la souche bactérienne ALV 104 telle que définie ci-dessus, pour la préparation d'un composé polysaccharidique de formule (I) telle que définie ci-dessus, dans laquelle au 15 moins 60% de la totalité des groupes Rkl, Rk2, Rk3, Rk4, Rk5, Rk6, Rk7 et Rk8 représente un atome d'hydrogène. Un composé polysaccharidique de formule (I) telle que définie ci-dessus, dans laquelle au moins 60% de la totalité des groupes Rkl, Rk2, Rk3, Rk4, Rk5, Rk6, Rk7 et Rk8 représente un atome d'hydrogène, correspond à la forme désacétylée du composé 20 polysaccharidique de l'invention. La présente invention concerne également l'utilisation telle que définie ci-dessus, de la souche bactérienne ALV 104 de la famille des Rhizobiaceae, déposée à la CNCM le 21 mars 2006 sous le numéro I-3591, ou d'une souche dont le gène rrs présente un pourcentage d'identité supérieur ou égal à 99,9%, de préférence égal à 100%, avec le 25 gène rrs de ladite souche ALV 104, pour la préparation d'un composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, dans un milieu de culture approprié, comprenant notamment une source d'azote, telle que de l'extrait de levure ou des protéines d'origine organique comme des peptones végétales de type peptones de blé, de luzerne, de pomme de terre, une source de carbone comme le glucose, maltose, mannose, arabinose, saccharose, 30 ribose, xylose, lactose ou mannitol, et une source d'oligo-éléments contenant du fer, sulfate, magnésium, calcium, chlorure, zinc, bore, cuivre, cobalt ou manganèse. 2906819 6 La présente invention concerne également un composé polysaccharidique, répondant à la formule (I) suivante : dans laquelle : û k varie de l à n, 10 û n représente un nombre entier compris de 5 à 300, notamment de 8 à 270, - Rkl, Rk2, Rk3, Rk4, Rk5, Rk6, Rk7 et Rk8 représentent, indépendamment les uns des autres, H ou un groupe acyle comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, notamment un groupe acétyle. Selon un mode de réalisation avantageux, sur les 8 groupements hydroxyles de 15 l'unité répétitive du polymère de l'invention, entre 3,5 et 4,5 groupements acétyles sont présents. Le nombre de n de l'unité répétitive est compris entre 20 et 270, ce qui correspond à un poids moléculaire compris entre 250 000 et 3 000 000 g/mol lors de la synthèse du polymère par la souche dans le moût de fermentation. 20 La présente invention concerne également un composé tel que défini ci-dessus, dans lequel au moins 12,5% de la totalité des groupes Rkl, Rk2, Rk3, Rk4, Rk5, Rk6, Rk7 et Rk8 représente un groupe acétyle, et notamment dans lequel au moins 12,5% de la totalité des groupes Rkl, Rk2, Rk3, Rk4, Rk5, Rk6, Rk7 et Rk8, pour une valeur de k donnée, représente un groupe acétyle. 25 Un composé préféré selon la présente invention est un composé tel que défini ci-dessus, dans lequel au moins d'environ 43% à environ 56%, et de préférence d'environ 43,75% à environ 56,25% de la totalité des groupes Rkl, Rk2, Rk3, Rk4, Rk5, Rk6, Rk7 et Rk8 représente un groupe acétyle. Selon un mode de réalisation particulier, les composés de l'invention tels que 30 définis ci-dessus peuvent se présenter sous la forme d'une double hélice. La présente invention concerne également un composé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que au moins 12,5% de la totalité des groupes Rkl, Rk2, Rk3, Rk4, Rk5, Rk6, Rk7 et Rk8 représente un atome d'hydrogène. n H 5 2906819 7 Un composé préféré selon la présente invention est un composé tel que défini ci-dessus, dans lequel au moins 60% de la totalité des groupes Rkl, Rk2, Rk3, Rk4, Rk5, Rk6, Rk7 et Rkg représente un atome d'hydrogène. Ce composé correspond à la forme désacétylée du composé de l'invention. 5 Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne également un composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, dans laquelle tous les groupes Rkl, Rk2, Rk3, Rk4, Rk5, Rk6, Rk7 et Rk8 représentent un atome d'hydrogène. Un tel composé répond à la formule (I-1) suivante : n O 10 15 La présente invention concerne également une composition comprenant un composé tel que défini ci-dessus, en association avec une souche bactérienne telle que définie ci-dessus et/ou le milieu de culture ou une partie du milieu de culture de ladite souche, comprenant notamment une source d'azote, telle que de l'extrait de levure ou des protéines d'origine organique comme des peptones végétales de type peptones de 20 blé, de luzerne, de pomme de terre, une source de carbone comme le glucose, maltose, mannose, arabinose, saccharose, ribose, xylose, lactose ou mannitol, et une source d'oligo-éléments contenant du fer, sulfate, magnésium, calcium, chlorure, zinc, bore, cuivre, cobalt ou manganèse. Selon un mode de réalisation avantageux, la composition de l'invention est 25 caractérisée en ce qu'elle comprend d'environ 0,1% à environ 8% en masse d'un composé de fonnule (I) telle que définie ci-dessus, et d'environ 0,05% à environ 2% en masse d'une souche bactérienne telle que définie ci-dessus. La présente invention concerne également une composition comprenant un composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, en association avec une souche 30 bactérienne telle que définie ci-dessus, notamment la souche ALV 104. La présente invention concerne également une composition comprenant un composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, en association avec un milieu de culture comprenant notamment une source d'azote, telle que de l'extrait de levure ou des protéines d'origine organique comme des peptones végétales de type peptones de 2906819 8 blé, de luzerne, de pomme de terre, une source de carbone comme le glucose, maltose, mannose, arabinose, saccharose, ribose, xylose, lactose ou mannitol, et une source d'oligo-éléments contenant du fer, sulfate, magnésium, calcium, chlorure, zinc, bore, cuivre, cobalt ou manganèse. 5 La présente invention concerne également une composition comprenant un composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, en association avec une souche bactérienne telle que définie ci-dessus et le milieu de culture ou une partie du milieu de culture de ladite souche, comprenant notamment une source d'azote, telle que de l'extrait de levure ou des protéines d'origine organique comme des peptones végétales 10 de type peptones de blé, de luzerne, de pomme de terre, une source de carbone comme le glucose, maltose, mannose, arabinose, saccharose, ribose, xylose, lactose ou mannitol, et une source d'oligo-éléments contenant du fer, sulfate, magnésium, calcium, chlorure, zinc, bore, cuivre, cobalt ou manganèse. La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, agro-15 alimentaire ou cosmétique, comprenant un composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, en association avec un véhicule approprié. La présente invention concerne également un procédé de préparation d'une composition telle que définie ci-dessus comprenant une étape de fermentation en présence d'une souche bactérienne ALV 104 de la famille des Rhizobiaceae, déposée à 20 la CNCM le 21 mars 2006 sous le numéro I-3591, ou d'une souche dont le gène rrs présente un pourcentage d'identité supérieur ou égal à 99,9%, de préférence égal à 100%, avec le gène rrs de ladite souche ALV104, et d'un milieu de culture comprenant notamment une source d'azote, telle que de l'extrait de levure ou des protéines d'origine organique comme des peptones végétales de type peptones de blé, de luzerne, de 25 pomme de terre, une source de carbone comme le glucose, maltose, mannose, arabinose, saccharose, ribose, xylose, lactose ou mannitol, et une source d'oligo-éléments contenant du fer, sulfate, magnésium, calcium, chlorure, zinc, bore, cuivre, cobalt ou manganèse. La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un 30 composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, comprenant les étapes suivantes : ù une étape de fermentation en présence d'une souche bactérienne ALV 104 de la famille des Rhizobiaceae, déposée à la CNCM le 21 mars 2006 sous le numéro I-3591, ou d'une souche dont le gène rrs présente un pourcentage d'identité supérieur ou égal à 99,9%, de préférence égal à 100%, avec le gène rrs de ladite souche ALV 104, et d'un 2906819 9 milieu de culture comprenant notamment une source d'azote, telle que de l'extrait de levure ou des protéines d'origine organique comme des peptones végétales de type peptones de blé, de luzerne, de pomme de terre, une source de carbone comme le glucose, maltose, mannose, arabinose, saccharose, ribose, xylose, lactose ou mannitol, 5 et une source d'oligo-éléments contenant du fer, sulfate, magnésium, calcium, chlorure, zinc, bore, cuivre, cobalt ou manganèse, afin d'obtenir une composition comprenant un composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, en association avec une souche bactérienne telle que définie ci-dessus et le milieu de culture tel que défini ci-dessus, et ù une étape de filtration, notamment de filtration tangentielle, afin de se 10 débarrasser de ladite souche bactérienne et dudit milieu de culture, et pour obtenir le composé polysaccharidique de l'invention de formule (I). La présente invention concerne également un procédé de préparation tel que défini ci-dessus, comprenant, après l'étape de filtration, une étape de précipitation du composé polysaccharidique de formule (I), afin d'obtenir ledit composé sous forme de 15 poudre. La présente invention concerne également un procédé de préparation tel que défini ci-dessus, comprenant, après l'étape de précipitation du composé polysaccharidique, une étape consistant à mettre en solution le composé obtenu sous forme de poudre, afin de procéder à la désacétylation complète dudit composé, et 20 d'obtenir un composé désacétylé tel que défini ci-dessus. La présente invention concerne également un procédé de préparation tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'une étape de désacétylation complète du composé de formule (I) telle que définie ci-dessus est effectuée après l'étape de fermentation et avant l'étape de filtration, afin d'obtenir un composé désacétylé tel que défini ci-dessus. 25 La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un composé désacétylé tel que défini ci-dessus, comprenant les étapes suivantes : ù une étape de fermentation en présence d'une souche bactérienne ALV 104 de la famille des Rhizobiaceae, déposée à la CNCM le 21 mars 2006 sous le numéro I-3591, ou d'une souche dont le gène rrs présente un pourcentage d'identité supérieur ou égal à 30 99,9%, de préférence égal à 100%, avec le gène rrs de ladite souche ALV104, et d'un milieu de culture comprenant notamment une source d'azote, telle que de l'extrait de levure ou des protéines d'origine organique comme des peptones végétales de type peptones de blé, de luzerne, de pomme de terre, une source de carbone comme le glucose, maltose, mannose, arabinose, saccharose, ribose, xylose, lactose ou mannitol, 2906819 10 et une source d'oligo-éléments contenant du fer, sulfate, magnésium, calcium, chlorure, zinc, bore, cuivre, cobalt ou manganèse, afin d'obtenir une composition comprenant un composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, en association avec une souche bactérienne telle que définie ci-dessus et un milieu de culture tel que défini ci-dessus, 5 û une étape de désacétylation complète du composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, pour obtenir une composition comprenant un composé désacétylé tel que défini ci-dessus, en association avec ladite souche bactérienne et ledit milieu de culture, et û une étape de filtration, notamment de filtration tangentielle, afin de se l0 débarrasser de ladite souche bactérienne et dudit milieu de culture, et pour obtenir le composé polysaccharidique désacétylé tel que défini ci-dessus. La présente invention concerne également un procédé tel que défini ci-dessus comprenant une étape supplémentaire d'hydrolyse du polysaccharide de formule (I), cette étape permettant d'obtenir un polysaccharide hydrolysé de formule (I) dans 15 laquelle n représente un nombre entier compris de 8 à 120. Cette étape d'hydrolyse peut être effectuée indifféremment avant ou après l'étape de désacétylation susmentionnée. La présente invention concerne également l'utilisation du composé polysaccharidique de formule (I) telle que définie ci-dessus, pour la préparation d'une 20 composition cosmétique. La présente invention concerne également l'utilisation du composé polysaccharidique de formule (I) telle que définie ci-dessus, en tant qu'agent de texture ou de toucher, ou en tant qu'agent stabilisateur d'émulsion. L'expression "agent de texture ou de toucher" désigne une molécule ou un 25 ensemble de molécules modifiant de façon significative les propriétés sensorielles de toucher d'une préparation cosmétique. L'expression "agent stabilisateur d'émulsion" désigne une molécule ou un ensemble de molécules, permettant en présence d'une molécule tensioactive, de maintenir en une seule phase un mélange corps gras/eau naturellement instable. 30 La présente invention concerne également l'utilisation du composé polysaccharidique de formule (I) telle que définie ci-dessus, dans le domaine du diagnostic microbiologique, notamment en tant que support de croissance de micro-organismes. 2906819 11 La présente invention concerne également l'utilisation du composé polysaccharidique de formule (I) telle que définie ci-dessus, sous forme de gel, en substitution totale ou partielle des bases gélifiantes utilisées dans les milieux de culture, notamment pour remplacer le gel d'agarose ou d'Agar Agar. 5 La présente invention concerne également un procédé de préparation tel que défini ci-dessus, comprenant, après l'étape de fermentation de la souche bactérienne, une étape de pasteurisation de la composition telle que définie ci-dessus, comprenant un composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, en association avec une souche bactérienne telle que définie ci-dessus et/ou le milieu de culture ou une partie du milieu 10 de culture de ladite souche tel que défini ci-dessus, afin d'inactiver les bactéries constituant la souche bactérienne, cette étape de pasteurisation correspondant à une étape de maintien de ladite composition à une température d'environ 45 C à environ 90 C pendant d'environ 5 minutes à environ 60 minutes. La présente invention concerne également une composition comprenant un 15 composé de formule (I) telle que définie ci-dessus, en association avec une souche bactérienne telle que définie ci-dessus et/ou le milieu de culture ou une partie du milieu de culture de ladite souche tel que défini ci-dessus, comprenant notamment une source d'azote, telle que de l'extrait de levure ou des protéines d'origine organique comme des peptones végétales de type peptones de blé, de luzerne, de pomme de terre, une source 20 de carbone comme le glucose, maltose, mannose, arabinose, saccharose, ribose, xylose, lactose ou mannitol, et une source d'oligo-éléments contenant du fer, sulfate, magnésium, calcium, chlorure, zinc, bore, cuivre, cobalt ou manganèse, caractérisée en ce que les bactéries constituant ladite souche bactérienne sont tuées. 25 30 2906819 DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 représente l'évolution de la viscosité d'une solution de 1 g/L du polymère dans NaCl 0,1 M à 25 C en fonction de la vitesse de cisaillement et du temps 5 de stockage. L'axe des ordonnées représente la viscosité en mPa.s et l'axe des abscisses la vitesse de cisaillement en s-1. La courbe avec les carrés noirs (^) correspond au temps initial (pas de stockage) ; la courbe avec les losanges blancs (0) correspond à un temps de stockage de 4 jours ; la courbe avec les croix noires (x) correspond à un temps de stockage de 6,5 jours ; la courbe avec les ronds noirs (.) correspond à un temps de 10 stockage de 8,5 jours ; la courbe avec les triangles blancs (A) correspond à un temps de stockage de 11 jours ; la courbe avec les losanges noirs (•) correspond à un temps de stockage de 39 jours ; la courbe avec les triangles noirs (A) correspond à un temps de stockage de 46 jours ; la courbe avec les cercles (0) correspond à un temps de stockage de 46 jours ; la courbe avec les; la courbe avec les cercles blancs (0) correspond à un 15 temps de stockage de 88 jours et la courbe avec les carrés blancs (^) correspond à un temps de stockage de 95 jours. L'absence de certains des symboles cités ci-dessus provient de la parfaite superposition des différents points. La Figure 2 représente l'évolution de la viscosité d'une émulsion en fonction du 20 pH. L'axe des abscisses représente le pH et l'axe des ordonnées représente la viscosité en mPa.s (Brookfiled DVIII Ultra Aig E-Vit 12 Helipath 2 min, 20 C). La courbe en trait plein avec les losanges noirs (,) correspond au produit Sepigel 305 ; la courbe en trait pointillé avec les carrés noirs correspond au produit Rheocare ATH (a) et la courbe en trait plein gris avec les triangles noirs correspond au produit de l'invention. 25 12 30 2906819 13 DESCRIPTION DÉTAILLÉE DES PROCÉDÉS DE L'INVENTION La production du polysaccharide de l'invention au niveau industriel suit deux étapes principales, une première étape de production de cellules en fioles de petite taille ; cette première culture appelée préculture sert à inoculer le fermenteur 5 proprement dit où est réalisée la production du polymère au cours du temps (2eme étape). La chaîne de préculture comprend la reviviscence de la souche conservée dans une cryobanque à -196 C (azote liquide) par versement du contenu d'un cryotube d'une contenance de 2 ml (noté N2) dans un erlenmeyer d'une capacité de 500 ml contenant un milieu de préculture dont la composition est décrite ci-après. 10 Le milieu de préculture pour la production de polymère suit la composition suivante : 3 g/1 d'extrait de levure (Autolysat 106, Biospringer) 70 ml/1 de solution minérale* 11 g/1 de glucose Eau déminéralisée qsp 1000 ml * Solution Minérale ** Solution Eléments 0,44 g FeSO4, 7H20 0,43 g ZnSO4, 7H20 2 g MgSO4, 7H20 1,30 g MnSO4, H2O 2 g CaC12, 2H20 2,80 g H3BO3 20 ml Solution Eléments** 0,023 g CuSO4, 5H20 0,07 g CoSO4, 7H20 qsp 1000 ml qsp 1000 ml (eau déminéralisée) (eau déminéralisée) Après une incubation à 30 C +/- 3 C sur une durée comprise entre 15 et 30 15 heures, 10 ml de cette culture sont transférés dans des erlemneyers d'une capacité de 3 litres notés I pour Inoculum, Spour suivi et Se pour secours. Seul le récipient noté I sera utilisé pour inoculer les fermenteurs. L'erlenmeyer noté S sert quant à lui de suivi et celui noté Se correspond au secours en cas de contamination de l'erlenmeyer noté I. 20 A chaque transfert un contrôle bactériologique est effectué par une observation microscopique en contraste de phase à un grossissement de 100 fois (Microscope Axioskop2 Carl Zeiss, Germany). 2906819 14 Les paramètres de préculture comme ceux de culture sont les suivants : - pH : 6,8 +/- 0,3 Température : 30 C +/- 3 C - Durée 24 heures. Lorsque la mesure de la densité optique à 600 nm de la préculture atteint 2,00 ou que la durée totale de la préculture est de 24 heures, le milieu est transféré stérilement dans un fermenteur de 450 litres dont le milieu de culture est le suivant : Matières Concentration Extrait de levures 3,5 g/1 MgSO4, 7H20 0,35 g/1 FeSO4, 7H20 40 mg/1 H3BO3 4,5 mg/1 MnSO4, H2O 35 g/l ZnSO4, 7H20 35 g/1 CoSO4 7 g/l CuSO4 7 g/1 Anti-mousse (fourni par Struktol) 3,5 mg/1 10 Le taux d'inoculation du fermenteur est compris entre 1 et 10% et de préférence 5% volume de préculture/ volume du fermenteur. Après stérilisation du milieu, le glucose (source de carbone) est ajouté afin d'atteindre une concentration de 25g/L au moment de l'inoculation du fermenteur. Le rapport entre le carbone et l'azote présent dans le milieu de culture est un 15 paramètre important du comportement de la souche face à une carence en éléments carbonés ou azotés. Pour vérifier l'influence de ce rapport sur la production d'EPS (exopolysaccharide - composé polysaccharidique de l'invention) et sur la production de biomasse, la densité optique à 600 nm et la viscosité finale du moût de fermentation sont analysées. 5 20 2906819 15 La densité optique à 600 nm rend compte du nombre de cellules bactériennes présentes dans le milieu de culture alors que la viscosité finale estime la quantité de polymère produite par la bactérie. Le tableau ci-dessous présente l'influence du rapport C/N sur la DO 600 nm et sur la viscosité : Milieu testé Rapport C/N DO 600 nm finale Viscosité à 26s 1 (cPs) Viscosimètre Rhéomat 108 R/E 311 14,86 5,19 150 315 20,04 5,25 180 320 26,51 5,00 150 325 32,98 4,83 160 411 11,30 5,87 150 415 15,18 6,07 170 420 20,04 6,25 210 425 24,89 6,05 180 430 29,74 5,93 220 Les milieux testés susmentionnés ont les compositions suivantes : Milieu Extrait de levure Solution minérale Glucose (voir ci-dessus) Milieu 311 3 g/1 70 ml 11 g/1 Milieu 315 3 g/1 70 ml 15 g/1 Milieu 320 3 g/1 70 ml 20 g/1 Milieu 325 3 g/1 70 ml 25 g/1 Milieu 411 4 g/1 70 ml 11 g/1 Milieu 415 4 g/1 70 ml 15 g/1 Milieu 420 4 g/1 70 ml 20 g/1 Milieu 425 4 g/1 70 ml 25 g/1 Milieu 430 4 g/1 70 ml 30 g/1 Afin de maximiser la viscosité du moût et donc la production du polymère, le rapport C/N pour la production du polymère doit être compris entre 10 et 50 et est de 10 préférence égal à environ 30. La qualité de l'azote présent dans le rapport C/N joue un rôle important sur la croissance de la bactérie et sur la production du polymère. Certains acides aminés sont indispensables à la croissance de la bactérie. En effet, si la souche bactérienne ne trouve pas de source d'acides aminés, elle ne pousse pas. Ainsi, les acides aminés nécessaires 15 sont présents sous forme de peptides ou de protéines dans un extrait de levure ou dans 5 2906819 16 des peptones. Ainsi, le milieu de culture utilisé dans le procédé de l'invention contient notamment des peptones riches en acides aminés indispensables pour la souche bactérienne. Une analyse des besoins qualitatifs de la souche fournit les résultats suivants : Aminoacide manquant Conclusion DL-Ala Non indispensable L-Arg Non indispensable L-Asp Non indispensable L-Asn Indispensable L-Cys Non indispensable L-Glu Non indispensable L-Gln Indispensable L-Gly Non indispensable L-His Indispensable L-Ile Indispensable L-Leu Non indispensable L-Lys Non indispensable L-Met Non indispensable L-Phe Non indispensable L-Pro Indispensable HL-Pro Non indispensable L-Ser Indispensable L-Thr Indispensable L-Trp Indispensable L-Tyr Non indispensable À l'issue de l'étape de fermentation industrielle, on obtient les résultats suivants : Fermentation DO 600 nm finale 13,5 Durée de la fermentation 32 heures Durée de la phase de latence 5 heures Durée de la phase de production de l'EPS 27 heures max (h-') (taux de croissance de la souche) 0,35 DS/dt Consommation moyenne en glucose 0,92 g/l.h de glucose DP/dt Productivité moyenne en EPS 0,51 g/l.h de polymère Concentration finale en EPS 10,54 g/kg de moût La phase de latence est une phase pendant laquelle on n'observe rien, c'est-à-dire une phase pendant laquelle il n'y a pas de consommation de glucose et où aucun trouble 10 n'est observé. 5 2906819 17 Le moût en fin de fermentation contient le milieu de culture tel que décrit précédemment n'ayant pas été consommé par les bactéries, les cellules bactériennes (ou bactéries) et le polysaccharide (ou polymère) de l'invention. Suivant le procédé de purification mis en oeuvre, il est possible d'obtenir 5 différentes formes de la molécule : 1) Moût brut contenant le polymère : À l'issue de la fermentation, les souches bactériennes sont inactivées par l'utilisation d'un biocide de nature chimique. Le moût de culture contenant le polymère 10 peut ainsi être utilisé pour des applications dans les secteurs industriels de la cosmétique, de la pharmacie ou de l'agroalimentaire pour ses propriétés rhéologiques particulières. Le produit final obtenu à l'issue de ce traitement contient le milieu de culture, les bactéries inactivées et le polymère. Le polymère sous cette forme présente un nombre n 15 d'unités répétitives compris de 20 à 270. 2) Moût de fermentation traité thermiquement : À l'issue de la fermentation, afin de "tuer" les bactéries, le moût (contenant le milieu de culture, les bactéries et le polymère) est chauffé à une température variant 20 d'environ 35 C à environ 80 C et préférentiellement environ 60 C pendant une durée d'environ 25 minutes à environ 2 heures et préférentiellement environ 40 minutes. Ce traitement permet à la fois une stérilisation du moût de fermentation, mais confère aussi au polymère de nouvelles propriétés rhéologiques que la molécule native ne présente pas. Le moût de fermentation stérile peut être notamment utilisé dans les secteurs 25 industriels de la cosmétique, de la pharmacie ou de l'agroalimentaire en raison de ses propriétés rhéologiques particulières. Le produit final obtenu à l'issue de ce traitement contient le milieu de culture, les bactéries tuées et le polymère. Le polymère sous cette forme présente un nombre n d'unités répétitives compris de 20 à 240. 30 3) Moût de fermentation purifié par filtration puis précipité : À l'issue de la fermentation, le moût présentant une viscosité comprise entre 550 et 1 600 Centipoises (Cps)(Viscosimètre Rhéomat 205) est dilué avec de l'eau osmosée 2906819 18 suivant un facteur de dilution situé entre 1/4 et 1/10 afin d'obtenir une viscosité du moût dilué entre 15 et 150 cps. Une étape de microfiltration suit l'étape de dilution. La purification de ce polymère peut être réalisée suivant différentes techniques : la centrifugation, la filtration frontale comme tangentielle ou tout autre méthode 5 permettant une séparation de constituants. La filtration permet la séparation des cellules bactériennes du milieu de culture contenant le polymère. Les seuils de coupure de filtration frontale permettant une séparation optimale du produit, se situent dans une plage de 0,6 m et 1, 2 m. Ainsi, cette première filtration permet d'éliminer les bactéries et d'obtenir un 10 produit contenant uniquement le milieu de culture et le polymère. Le tableau ci-dessous décrit la réponse du produit en fonction du seuil de coupure pour une filtration frontale sur filtre seringue au stade laboratoire. Seuil de coupure Tps de filtration par filtre Observations sur le filtrat (unités arbitraires) 0,22 m oo Absence de filtrat 0,45 m 50 Filtrat limpide, peu visqueux, beaucoup de pertes 0,6 m 20 Filtrat limpide, visqueux, pertes à prendre en compte 0,8 m 10 Filtrat +1- limpide, visqueux, quantité finale correcte 1,2 m 8 Filtrat troublé, visqueux, peu de pertes 3 m 5 Filtrat trouble, peu de pertes 5 m 1 Filtrat très trouble, très peu de pertes 15 La filtration tangentielle permet une séparation compatible avec les impératifs industriels de production. Les seuils de coupure des membranes pouvant être utilisés se situent entre 0,1 tm et 1,2 m. La dilution du moût doit être ajustée en fonction des paramètres de viscosité du moût de fermentation afin de diminuer la viscosité finale du moût de 1 600 cps à une viscosité comprise entre 15 et 150 cps. 20 Ce moût dilué est par la suite concentré afin d'obtenir une concentration en polymère conforme au cahier des charges de l'industrie cosmétique, pharmaceutique ou de l'agroalimentaire, à savoir variant d'environ 0,1 à environ 100 g/L et de préférence égale à environ 10 g/L de polymère. Les techniques utilisées pour la concentration du moût pourront être des 25 techniques d'évaporation comme l'évaporation sous pression réduite ou sur évaporateur couche mince ou préférentiellement par des techniques d'ultrafiltration. 2906819 19 L'ultrafiltration peut être effectuée par un système de filtration tangentielle faisant intervenir des membranes minérales ou organiques ayant un seuil de coupure compris entre environ 10 000 Daltons et environ 500 000 Daltons, avec un seuil de coupure préférentiellement d'environ 150 000 Daltons. 5 On utilise de préférence la filtration tangentielle par un souci d'efficacité et de coût de traitement. Le matériel utilisé pour l'étape de microfiltration est un système de filtration tangentielle avec des membranes minérales ayant un seuil de coupure compris entre 0,1 et 1,2 m et préférentiellement 0,22 m. A l'issue du procédé de purification, au rétentat d'ultrafiltration, on ajoute 0,2 M de 10 NaCl afin d'écranter la molécule, c'est-à-dire diminuer l'affinité du polymère vis-à-vis de l'eau, puis on ajoute un premier solvant alcoolique par exemple de l'éthanol pour obtenir un premier précipité. Le précipité est ensuite essoré puis mis en contact avec un mélange hydroalccolique ayant un titre alcoolique croissant. Le solvant alcoolique est utilisé pour précipiter le polymère et donc pour éliminer le milieu de culture. Le polymère sous cette 15 forme présente un nombre n d'unités répétitives compris de 20 à 220. À l'issue de l'étape de précipitation, le précipité est séché sous vide et conditionné. On obtient le polymère pur sous forme de poudre présentant une grande stabilité au cours du temps. Ainsi le suivi de la viscosité d'une solution à lg/1 de polymère de l'invention stocké à 25 C sur une période de 95 jours permet d'obtenir les profils représentés dans la 20 Figure 1. L'absence de diminution de la viscosité à faible contrainte de cisaillement (entre 102 et 10"1 s-1) met en évidence que le maintien d'une solution à 1 g/L de polymère à 25 C pendant 95 jours n'a que peu d'effet sur le polymère. Le polymère ainsi obtenu présente des propriétés filmogènes. 25 4) Moût de fermentation hydrolysé puis purifié et précipité : À l'issue de la fermentation, le moût est ajusté à un pH compris entre 1,5 et 4,0 et préférentiellement 2,0 par l'ajout d'un acide fort tel que, par exemple, l'acide sulfurique. Le moût est ensuite chauffé à une température comprise d'environ 60 C à environ 95 C et préférentiellement d'environ 92 C sur une durée d'environ 3 à environ 30 15 heures et préférentiellement d'environ 5 heures. A l'issue de ces deux étapes, le polymère est hydrolysé et les bactéries sont tuées. À l'issue de la fermentation, le moût présentant une viscosité variant de 550 à 1 600 Centipoises (Cps) (Viscosimètre Rhéomat 205) est dilué avec de l'eau osmosée suivant un facteur de dilution situé entre 1/4 et 1/10 afin d'obtenir une viscosité du moût 2906819 20 dilué entre 15 et 150 cps. Une étape de microfiltration pour éliminer les bactéries du moût de fermentation suit l'étape de dilution. La filtration tangentielle est préférée par un souci d'efficacité et de coût de traitement. Le matériel utilisé pour l'étape de microfiltration est un système de filtration tangentielle avec des membranes minérales 5 ayant un seuil de coupure compris entre 0,1 et 1,2 m et préférentiellement 0,22 m. Ce moût hydrolysé et dilué est par la suite concentré afin d'obtenir une concentration en polymère conforme au cahier des charges de l'industrie cosmétique, pharmaceutique ou de l'agroalimentaire soit d'environ 0,1 à environ 100g/L et de préférence d'environ 10g/L de polymère. 10 Les techniques utilisées pour la concentration et la précipitation sont celles telles que décrites précédemment notamment dans le paragraphe 3. À l'issue de l'étape de précipitation, le précipité est séché sous vide et conditionné. On obtient le polymère hydrolysé pur sous forme de poudre. Le polymère sous cette forme présente un nombre n d'unités répétitives compris de 8 à 120. 15 5) Moût de fermentation désacétylé puis purifié et précipité : À l'issue de la fermentation, le moût est refroidi à température ambiante (20 C) puis le pH est ajusté entre 10 et 14, préférentiellement à 12 par l'ajout d'une base (hydroxyde de sodium par exemple) pendant une durée de 5 heures. Les groupements 20 acétyles sont éliminés par le biais de ce traitement. Cette étape correspond à la désacétylation du composé de l'invention, ce qui permet d'obtenir un composé désacétylé de formule (I-1) telle que définie ci-dessus. À l'issue de la fermentation, le moût présentant une viscosité comprise entre 550 et 1 600 Centipoises (Cps) (Viscosimètre Rhéomat 205) est dilué avec de l'eau osmosée 25 suivant un facteur de dilution situé entre 1/4 et 1/10 afin d'obtenir une viscosité du moût dilué entre 15 et 150 cps. Une étape de microfiltration pour éliminer la biomasse suit l'étape de dilution. La filtration tangentielle est préférée par un souci d'efficacité et de coût de traitement. Le matériel utilisé pour l'étape de microfiltration est un système de filtration tangentielle avec des membranes minérales ayant un seuil de coupure compris 30 entre 0,1 et 1,2 m et préférentiellement 0,22 m. Ce moût désacétylé et dilué est par la suite concentré afin d'obtenir une concentration en polymère conforme au cahier des charges de l'industrie cosmétique, pharmaceutique ou de l'agroalimentaire soit d'environ 0,1 à environ 100 g/L et de préférence égale à environ 10 g/L de polymère. 2906819 21 Les techniques utilisées pour la concentration et la précipitation sont celles telles que décrites précédemment notamment dans le paragraphe 3. À l'issue de l'étape de précipitation, le précipité est séché sous vide et conditionné. On obtient le polymère désacétylé pur sous forme de poudre. Ce polymère 5 présente notamment des propriétés filmogènes. Le polymère sous cette forme présente un nombre n d'unités répétitives compris de 20 à 220. 6) Moût de fermentation désacétylé, hydrolysé puis purifié et précipité : À l'issue de la fermentation, le moût est refroidi à température ambiante (20 C) 10 puis le pH est ajusté entre 10 et 14, préférentiellement à 12 par l'ajout d'une base (hydroxyde de sodium par exemple) pendant une durée de 5 heures. Les groupements acétyles sont éliminés par le biais de ce traitement. Cette étape correspond à la désacétylation du composé de l'invention, ce qui permet d'obtenir un composé désacétylé de formule (I-1) telle que définie ci-dessus. 15 Le moût désacétylé est ajusté à un pH d'environ 1,5 à environ 4,0 et préférentiellement d'environ 2,0 par l'ajout d'un acide fort tel que, par exemple, l'acide sulfurique. Le moût est ensuite chauffé à une température d'environ 95 C à environ 60 C et préférentiellement d'environ 92 C sur une durée d'environ 3 à environ 15 heures et préférentiellement d'environ 5 heures. (étape d'hydrolyse) 20 À l'issue de la fermentation, le moût présentant une viscosité comprise entre 550 et 1 600 Centipoises (Cps) (Viscosimètre Rhéomat 205) est dilué avec de l'eau osmosée suivant un facteur de dilution situé entre 1/4 et 1/10 afin d'obtenir une viscosité du moût dilué entre 15 et 150 cps. Une étape de microfiltration suit l'étape de dilution. On utilise de préférence la filtration tangentielle par un souci d'efficacité et de coût de traitement. 25 Le matériel utilisé pour l'étape de microfiltration est un système de filtration tangentielle avec des membranes minérales ayant un seuil de coupure compris entre 0,1 et 1,2 m et préférentiellement 0, 22 m. Ce moût désacétylé, hydrolysé et dilué est par la suite concentré afin d'obtenir une concentration en polymère conforme au cahier des charges de l'industrie cosmétique, 30 pharmaceutique ou de l'agroalimentaire soit d'environ 0,1 à environ 100 g/L et de préférence égale à environ 10g/L de polymère. Les techniques utilisées pour la concentration et la précipitation sont celles telles que décrites précédemment notamment dans le paragraphe 3. 2906819 22 À l'issue de l'étape de précipitation, le précipité est séché sous vide et conditionné. On obtient le polymère désacétylé et hydrolysé sous forme de poudre. Le polymère sous cette forme présente un nombre n d'unités répétitives compris de 8 à 120. PARTIE EXPÉRIMENTALE l0 Le polymère de l'invention, contenu dans le moût de fermentation, traité thermiquement, désigné ci-après par le terme "polymère de l'invention" ou Alcos 04, apporte une amélioration notable dans le domaine de la cosmétique. En effet, les propriétés viscoélastiques du produit permettent son utilisation dans 15 la préparation d'émulsions cosmétiques en substitution des produits couramment utilisés dans ce secteur d'activité. Les molécules apportant de la viscosité comme les polyacrylates ou polyacrylamides, dérivent de l'industrie du pétrole alors que le polysaccharide de l'invention, lui, est produit de façon naturelle en utilisant des matières premières renouvelables dérivées de l'agriculture. 20 A - Influence du pH sur la viscosité Le polymère peut être utilisé par exemple comme gélifiant dans la confection de produit cosmétique stable. La nature chimique du polymère le rend peu sensible aux 25 variations de pH comparé aux produits dérivés de la pétrochimie favorisant ainsi la stabilité de la formule. 5 30 2906819 23 Exemples de formules cosmétiques : Phase Alcos 04 Sepigel ATH (Cosmetics (invention)
(SEPPIC) Rheologies) Emuliance 05-295 (ARE)) 2,5% 2,5% 2,5% Acide stéarique 0,5% 0,5% 0,5% Dimethicone 200 350cps 3% 3% 3% A Huile de macadamia raffinée 7% 7% 7% Phenonip 0,4% 0,4% 0,4% Dry Flo PC 2% 2% 2% Eau Osmosée QSP 100% QSP 100% QSP 100% B Glycérine/Sorbitol 2% 2% 2% ALCOS 04 Pasteurisé (MS 0,235%) 10% ù ù Sepigel 305 (MS 47%) ù 0,5% ù C Rheocare ATH (MS 60%) ù ù 0,39% Acide citrique qs pH 3 D !Hydroxyde qsp qsp qsp de Sodium qs pH 10 Viscosité Aig E Vit 12 Système Hélipath 15700 33000 27000 (Brookfield) 2 minutes. à 20 C en mPa.s pH à 20 C 5,44 4,3 5,87 Centrifugation 4* 15 min. à 4080G à 20 C RAS RAS RAS Le procédé de fabrication laboratoire suit le protocole suivant : a. On pèse séparément les phases A et B et on chauffe à 75 C. 5 b. On additionne lentement la phase B sur la phase A sous émulseur à 3 000 tpm (Polytron PT 300, Prolabo) pendant 5 minutes. c. A 60 C, on ajoute la phase C, toujours sous émulseur. d. On ajoute ensuite la phase D si nécessaire. e. On refroidit sous hélice jusqu'à température ambiante.
10 Les produits testés sont : • Sepigel 305 (polyacrylamide/C13-14 isoparaffin/laureth-7) (SEPPIC) • Rheocare ATH (sodium polyacrylate/ethylhexyl stéarate/trideceth-6) (Cosmetics Rheologies) 15 • Alcos 04 Past le polymère de l'invention. Le polymère de l'invention est peu sensible aux variations de pH lorsque ce dernier varie d'une gamme de 2 à 12. Contrairement aux produits non naturels indiqués 2906819 24 ci-dessus, la variation de viscosité est faible et ne modifie pas la stabilité des émulsions formées (voir Figure 2). L'étude de la viscosité et de la stabilité des émulsions par centrifugation de ces 5 dernières permet de vérifier la stabilité des formules testées : • le polymère de l'invention : émulsions stables sur toute la gamme de pH, • Sepigel 305 : perte de stabilité à pH 12, • Rhéocare ATH : émulsions non stables à pH 3 et 12.
10 La nature chimique du polymère le rend par ailleurs peu sensible à la variation de la force ionique du milieu permettant d'ajout de sels dans une formule cosmétique comme les shampoings par exemple sans variation de stabilité ce celle-ci.
15 B - Influence du sel (0,2-0,5-1%) sur la viscosité Formulations : Alcos 04 Sepigel ATH Emuliance 05-295 (ARD) 2,5% 2,5% 2,5% Acide stéarique 0,5% 0,5% 0,5% Dimethicone 200 350cps 3% 3% 3% A Huile de macadamia raffinée 7% 7% 7% Phenonip 0,4% 0,4% 0,4% Dry Flo PC 2% 2% 2% Eau Osmosée QSP 100% QSP 100% QSP 100% Glycérine/Sorbitol 2% 2% 2% B Chlorure de Sodium 0,2 -0,5- 1% 0,2 -0,5- 1% 0,2 -0,5- 1% ALCOS 04 Pasteurisé MS 0,235% 10% ù ù Sepigel 305 (MS 47%) ù 0,5% ù C Rheocare ATH (MS 60%) ù ù 0,39% 20 2906819 25 Le procédé de fabrication laboratoire suit le protocole suivant : a. Peser séparément les phases A et B et chauffer à 75 C. b. Additionner lentement B sur A sous émulseur à 3000 rpm (Polytron PT 300) pendant 5 min. 5 c. A 60 C, ajouter la phase C, toujours sous émulseur. d. Refroidir sous hélice jusqu'à température ambiante Résultats : % NaC1 Viscosité en mPa.s (Brookfield DVIII Ultra Aig E-Vit 12 Hélipath 2 min.20 C) Sépigel 305 Rheocare ATH Alcos 04 past 0 40 000 27 000 15 700 0,2 14 500 12 500 11 500 0,5 8 500 10 700 10 900 1 4 590 2 400 8 000 10 L'étude de la viscosité et de la stabilité des émulsions par centrifugation de ces dernières permet de vérifier la stabilité des formules testées : • polymère de l'invention : à 0,2% l'émulsion est stable, entre 0,2% et 0,5%, on observe un léger filet d'huile à la surface du tube ; à 1% de sel, un déphasage de 65% 15 d'eau apparaît ; la variation de viscosité oscille entre 30 et 50%. • Sepigel 305 : à 0,2% l'émulsion est stable ; à 0,5% et 1% on observe un déphasage d'eau de 20 à 55%, plus un re-largage d'huile ; la variation de viscosité oscille entre 60 et 90%. • Rhéocare ATH : aucune émulsion n'est stable ; déphasage d'eau de 20 à 35% 20 et d'huile de l'ordre de 19% ; la variation de viscosité oscille entre 55 et 90%. De plus, alors qu'en conditions hydroalcooliques, certaines molécules voient leur viscosité chuter, le polymère de l'invention n'est que peu affecté. Par exemple : 2 solutions dans 20 et 36,2% d'éthanol 96 à 1,5% en matière sèche 25 (MS) de polymères sont préparées pour chacun des 3 polymères (Sepigel 305, Rheocare ATH, Alcos 04 Past - polymère de l'invention).
2906819 26 Les pH natifs sont compris entre 6,8 et 7,2. Viscosité en mPa.s (Cylindre 4, Vit 6 ou 3 à 20 C) Alcos 04 Past Sepigel 305 Rheocare ATH Sans éthanol 10 000 86 000 91 700 20% éthanol 96 12 500 197 000 97 200 36,2% éthanol 96 12 600 65 500 500 L'étude de la viscosité permet d'obtenir les résultats suivants : 5 • polymère de l'invention : viscosité de l'ordre de 10 000 à 12 000 mPa.s, peu sensible à l'ajout d'éthanol 96 ; • Sepigel 305 : augmentation de la viscosité à 20% d'éthanol et diminution à 36,2% ; • Rhéocare ATH : peu d'influence à 20% mais perte totale de la viscosité à 10 36,2% d'éthanol. C - Influence de la nature de la base huileuse L'industrie cosmétique utilise un grand nombre de bases huileuses différentes 15 pour la confection de crèmes, de lotions ou de laits. Ces matières premières d'origine hydrophobe peuvent modifier le comportement rhéologique des molécules de type polymère présentes dans la formule. Le polymère de l'invention n'est que peu influencé par la nature chimique de la base huileuse et ce contrairement aux autres molécules d'origine pétrochimique.
20 Dans l'exemple ci-dessous, 4 huiles sont testées : l'huile de paraffine, l'huile d'amande douce, l'isostéarate d'isostéaryle et la dimethicone 200 350cps. La formule est la suivante : Phase Ingrédients Quantités A Polymère 1.5% MS Eau Osmosée QSP 100% B Phase lipidique 10% 2906819 27 Pour la confection de cette formule il convient de procéder comme suit : Il faut peser séparément les phases A et B et additionner lentement B sur A sous émulseur à 3000 tpm (Polytron PT 300, Prolabo) pendant 5 minutes. Résultats : Alcos 04 Past Sepigel 305 Rheocare ATH Huile de Paraffine 13 700 30 000 15 000 Huile d'amandes douces 15 500 45 000 53 800 Isostéarate d'isostéaryle 20 000 18 700 17 700 Dimethicone 200 350cps 19 200 30 700 42 900 L'étude de la viscosité des émulsions permet de déterminer l'impact de la base huileuse sur la viscosité de la formule : 10 • polymère de l'invention : viscosité de l'ordre de 10 000 à 12 000 mPa.s, peu sensible à la nature de l'huile ; • Sepigel 305 : viscosité de l'ordre de 20 000 à 45 000 mPa.s ; • Rhéocare ATH : viscosité de l'ordre de 15 000 à 55 000 mPa.s. L'ensemble de ces propriétés permet de classer le polymère de l'invention comme 15 un agent apportant de la viscosité et stabilisant les émulsions ayant des faibles taux d'émulsionnant. L'utilisation du polymère de l'invention permet l'obtention d'émulsion de type lait ou sérum présentant une faible viscosité, une texture légère et un toucher doux et 20 soyeux. 5
Claims (17)
1. Utilisation de la souche bactérienne ALV104 de la famille des Rhizobiaceae, déposée à la CNCM le 21 mars 2006 sous le numéro I-3591, ou d'une souche dont le gène rrs présente un pourcentage d'identité supérieur ou égal à 99,9% avec le gène rrs de ladite souche ALV104, pour la préparation d'un composé polysaccharidique, répondant à la formule (I) suivante : O n dans laquelle : k varie de 1 à n, n représente un nombre entier compris de 5 à 300, notamment de 8 à 270, Rk1, Rk2, Rk3, Rk4, Rk5, Rk6, Rk7 et Rk8 représentent, indépendamment les uns des autres, H ou un groupe acyle comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, notamment un groupe acétyle.
2. Utilisation selon la revendication 1, de la souche bactérienne ALV104 de la famille des Rhizobiaceae, déposée à la CNCM le 21 mars 2006 sous le numéro I-3591, pour la préparation d'un composé polysaccharidique de formule (I) telle que définie dans la revendication 1, dans laquelle d'environ 40% à environ 60%, notamment d'environ 43% à environ 56%, et de préférence d'environ 43,75% à environ 56,25% de la totalité des groupes Rki, Rk2, Rk3, Rk4, Rk5, Rk6, Rk7 et Rk8 représente un groupe acétyle.
3. Utilisation selon la revendication 1, de la souche bactérienne ALV104 de la famille des Rhizobiaceae, déposée à la CNCM le 21 mars 2006 sous le numéro I-3591, pour la préparation d'un composé polysaccharidique de formule (I) telle que définie dans la revendication 1, dans laquelle au moins 60% de la totalité des groupes Rkl, Rk2, Rk3, Rk4, Rk5, Rk6, Rk7 et Rk8 représente un atome d'hydrogène. 2906819 29
4. Composé polysaccharidique, répondant à la formule (I) suivante : dans laquelle : k varie de 1 à n, n représente un nombre entier compris de 5 à 300, notamment de 8 à 270, 10 Rkl, Rk2, Rk3, Rk4, Rk5, Rk6, Rk7 et Rk8 représentent, indépendamment les uns des autres, H ou un groupe acyle comprenant de 1 à 6 atomes de carbone, notamment un groupe acétyle.
5. Composé selon la revendication 4, dans lequel au moins d'environ 40% à 15 environ 60%, notamment d'environ 43% à environ 56%, et de préférence d'environ 43,75% à environ 56,25% de la totalité des groupes Rk1, Rk2, Rk3, Rk4, Rk5, Rk6, Rk7 et Rk8 représente un groupe acétyle.
6. Composé selon la revendication 4, caractérisé en ce que au moins 60% de la 20 totalité des groupes Rk1, Rk2, Rk3, Rk4, Rk5, Rk6, Rk7 et Rk8 représente un atome d'hydrogène.
7. Composition comprenant un composé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, en association avec une souche bactérienne telle que définie dans 25 la revendication 1 et/ou le milieu de culture ou une partie du milieu de culture de ladite souche, comprenant notamment une source d'azote, telle que de l'extrait de levure ou des protéines d'origine organique comme des peptones végétales de type peptones de blé, de luzerne, de pomme de terre, une source de carbone comme le glucose, maltose, mannose, arabinose, saccharose, ribose, xylose, lactose ou mannitol, et une source 30 d'oligo-éléments contenant du fer, sulfate, magnésium, calcium, chlorure, zinc, bore, cuivre, cobalt ou manganèse. n 5 2906819 30
8. Composition pharmaceutique, agro-alimentaire ou cosmétique, comprenant un composé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, en association avec un véhicule approprié. 5
9. Procédé de préparation d'une composition selon la revendication 8 comprenant une étape de fermentation en présence d'une souche bactérienne ALV104 de la famille des Rhizobiaceae, déposée à la CNCM le 21 mars 2006 sous le numéro I-3591, ou d'une souche dont le gène rrs présente un pourcentage d'identité supérieur ou égal à 99,9% avec le gène rrs de ladite souche ALV 104, et d'un milieu de culture 10 comprenant notamment une source d'azote, telle que de l'extrait de levure ou des protéines d'origine organique comme des peptones végétales de type peptones de blé, de luzerne, de pomme de terre, une source de carbone comme le glucose, maltose, mannose, arabinose, saccharose, ribose, xylose, lactose ou mannitol, et une source d'oligo-éléments contenant du fer, sulfate, magnésium, calcium, chlorure, zinc, bore, 15 cuivre, cobalt ou manganèse.
10. Procédé de préparation d'un composé selon la revendication 4, comprenant les étapes suivantes : û une étape de fermentation en présence d'une souche bactérienne ALV 104 de la 20 famille des Rhizobiaceae, déposée à la CNCM le 21 mars 2006 sous le numéro I-3591, ou d'une souche dont le gène rrs présente un pourcentage d'identité supérieur ou égal à 99,9% avec le gène rrs de ladite souche ALV104, et d'un milieu de culture comprenant notamment une source d'azote, telle que de l'extrait de levure ou des protéines d'origine organique comme des peptones végétales de type peptones de blé, de luzerne, de 25 pomme de terre, une source de carbone comme le glucose, maltose, mannose, arabinose, saccharose, ribose, xylose, lactose ou mannitol, et une source d'oligo-éléments contenant du fer, sulfate, magnésium, calcium, chlorure, zinc, bore, cuivre, cobalt ou manganèse, afin d'obtenir une composition comprenant un composé selon la revendication 4, en association avec une souche bactérienne telle que définie dans la 30 revendication 1 et le milieu de culture tel que défini ci-dessus, et û une étape de filtration, notamment de filtration tangentielle, afin de débarrasser la susdite composition de ladite souche bactérienne et dudit milieu de culture, et pour obtenir le composé polysaccharidique selon la revendication 4. 2906819 31
11. Procédé de préparation selon la revendication 10, comprenant, après l'étape de filtration, une étape de précipitation du composé polysaccharidique selon la revendication 4, afin d'obtenir ledit composé sous forme de poudre, et comprenant, le cas échéant, après ladite étape de précipitation, une étape consistant à mettre en solution 5 le composé obtenu sous forme de poudre, afin de procéder à la désacétylation complète dudit composé, et d'obtenir un composé selon la revendication 6.
12. Procédé de préparation selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'une étape de désacétylation complète du composé selon la revendication 4 est effectuée 10 après l'étape de fermentation et avant l'étape de filtration, afin d'obtenir un composé selon la revendication 6.
13. Procédé de préparation d'un composé selon la revendication 6, comprenant les étapes suivantes : 15 û une étape de fermentation en présence d'une souche bactérienne ALV104 de la famille des Rhizobiaceae, déposée à la CNCM le 21 mars 2006 sous le numéro I-3591, ou d'une souche dont le gène rrs présente un pourcentage d'identité supérieur ou égal à 99,9% avec le gène rrs de ladite souche ALV 104, et d'un milieu de culture comprenant notamment une source d'azote, telle que de l'extrait de levure ou des 20 protéines d'origine organique comme des peptones végétales de type peptones de blé, de luzerne, de pomme de terre, une source de carbone comme le glucose, maltose, mannose, arabinose, saccharose, ribose, xylose, lactose ou mannitol, et une source d'oligo-éléments contenant du fer, sulfate, magnésium, calcium, chlorure, zinc, bore, cuivre, cobalt ou manganèse, afin d'obtenir une composition comprenant un composé 25 selon la revendication 4, en association avec une souche bactérienne telle que définie dans la revendication 1 et un milieu de culture tel que défini ci-dessus, û une étape de désacétylation complète du composé selon la revendication 4, pour obtenir une composition comprenant un composé selon la revendication 6, en association avec ladite souche bactérienne et ledit milieu de culture, et 30 û une étape de filtration, notamment de filtration tangentielle, afin de débarrasser la susdite composition de ladite souche bactérienne et dudit milieu de culture, et pour obtenir le composé polysaccharidique selon la revendication 6. 2906819 32
14. Utilisation du composé polysaccharidique selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, pour la préparation d'une composition cosmétique.
15. Utilisation du composé polysaccharidique selon l'une quelconque des 5 revendications 4 à 6, en tant qu'agent de texture ou de toucher, ou en tant qu'agent stabilisateur d'émulsion, ou dans le domaine du diagnostic microbiologique, notamment en tant que support de croissance de micro-organismes.
16. Utilisation du composé polysaccharidique selon l'une quelconque des 10 revendications 4 à 6, sous forme de gel, en substitution totale ou partielle des bases gélifiantes dans les milieux de culture, notamment pour remplacer le gel d'agarose ou d'Agar Agar.
17. Procédé de préparation selon la revendication 9, comprenant, après l'étape 15 de fermentation de la souche bactérienne, une étape de pasteurisation de la composition selon la revendication 7 afin d'inactiver les bactéries constituant la souche bactérienne, cette étape de pasteurisation correspondant à une étape de maintien de ladite composition à une température d'environ 45 C à environ 90 C pendant d'environ 5 minutes à environ 60 minutes. 20
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