NO771843L - Fremgangsm}te til fremstilling av polysakkarid - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av polysakkarid. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen fremstilling av et alginattype-polysakkarid ved kultivering av bakterier av arten Azotobacter vinelandii.

Alginsyre, en hydrofil, kolloidal karbohydratsyre, er en varierende blokkopolymer som består av D-mannuronsyre-.og L-guluronsyreenheter. Selv om alginsyre selv er praktisk talt uløselig i vann kan den lettvint løses ved nøytralisering med et egnet alkali. En av de utmerkete egenskaper hos alginatløs-ninger er deres høye viskositet i meget lave konsentrasjoner,

og dersom visse divalente ioner, såsom kalsium eller magnesium, tilsettes til alginatløsninger, frembringes det gelatinering. Alginsyres og alginaters enestående egenskaper gir dem et vidt industrielt anvendelsesområde som emulgeringsmidler, stabili-satorer og tykningsmidler.

. Alginater og alginsyre er blitt fremstilt i kommersiell målestokk ved ekstraksjon av visse arter brun tang, f.eks. Laminaria digitata og Ascophyllum nodosum, hvori de utgjør en

stor del av celleveggene.

Denne konvensjonelle tangekstraksjonsprosess har den ulempe at den er avhengig av tilførsel av alginatinneholdende tang som råstoff. Den er ubekvem å utføre på grunn av de involverte tang-mengder, og en betydelig ytterligere rensing kan være nødvendig, særlig dersom det kreves et produkt for næringsmidler eller farma-søytiske produkter.

På grunn av disse vanskeligheter er alginatliknende poly-sakkarider blitt fremstilt ved dyrking av atskillige arter av Azotobacter, særlig Azotobacter vinelandii. Alginsyren som frem-stilles med denne mikroorganisme er strukturelt lik den som oppnås av tang, med unntagelse av at den er delvis acetylert.

Det er kjent at fremstillingen av polysakkarid under anvendelse av en stamme avAzotobacter vinelandii er kritisk avhengig av flere faktorer, særlig mediets pH, og også fosfatnivået i mediet.

Fra britisk patentskrift 1.331.771 er det kjent en fremgangsmåte til fremstilling av et polysakkarid, hvor en mikroorganisme av arten Azotobacter vinelandii dyrkes under aerobe betingelser i et vandig næringsmedium som inneholder minst ett monosakkarid og/eller disakkarid som karbonkilde og som inneholder som vesentlige bestanddeler kilder for molybden, jern, fosfat, magnesium, kalium, natrium, kalsium samt sulfat, under kontrol-lerte pH-betingelser slik at pH holdes i området 6,5-8,5 i det minste i den første halvdel av fermenteringsperioden og i området 4,5-8,5 i en eventuell resterende fermenteringsperiode, inntil en vesentlig dannelse av polysakkarid har foregått, og..hvor det dannete polysakkarid isoleres. Dyrkingsmetoden som benyttes ved denne fremgangsmåte kan være satsvis eller kontinuerlig.

I britisk patentskrift 1.394.413 er det beskrevet et spesielt valg av disse betingelser som gir særlig gode polysakkarid-utbytter. Fra dette patentskrift er det kjent en fremgangsmåte som likner fremgangsmåten ifølge det ovennevnte patentskrift, men er begrenset ved at fosfatkonsentrasjonen i mediet er fra 0,1 til 0,8 millimol pr. liter og ved at mediets pH under dyrkingen holdes i området 7,0-8,2.

Også i nevnte patentskrift 1.394.413 fremheves det at best resultater oppnås med lave fosfatkonsentrasjoner. Under kontinuerlige dyrkingsbetingelser vil en bestanddel i mediet alltid være begrensende for veksten av mikroorganismen selv om alle andre næringsstoffer foreligger i overskudd. Ved lave fosfatnivåer kan fosfatet selv være begrensende substrat, avhengig av tilgjengelig-heten av andre næringsstoffer.

Sukkeret, enten monosakkarid eller disakkarid, som anvendes i dyrkingsmediet hvorav polysakkaridproduktet dannes. I konven-sjonell praksis, enten denne er satsvis eller kontinuerlig, til-føres det således ubegrenset sukker til mikroorganismene for å maksimere utbyttet av det oppnådde polysakkarid, idet mangel på sukker anses for å være skadelig for det totale utbytte. Over-skuddet av sukker som ikke anvendes av mikroorganismen, forblir i dyrkingsmediet etter at cellene og polysakkaridet er blitt fjernet. Denne fremgangsmåte er selvfølgelig ugunstig for sukker- ressurser, og bevirker også alvorlige forurensningsproblemer når spillvæsken opptas i vannkilder, såsom elver eller innsjøer. Sukkeroverskuddet bevirker at spillvæsken har et høyt biologisk oksygenbehov (B.O.D.), og resulterer således i deoksygenering av vannet som den flyter i, med derav følgende skade på dyre-

og planteliv. Men ethvert forsøk på å begrense tilførselen av sukker i en kontinuerlig fermentering av denne type forårsaker alvorlige problemer idet systemet blir meget ustabilt og er vanskelig å kontrollere.

Det har ifølge oppfinnelsen meget overraskende vist seg

at dersom tilførselen av sukker til et kontinuerlig fermenterings-system begrenses så mye at sukkeret blir den vekstbegrensende bestanddel i mediet, er polysakkaridutbyttet godt og systemet er stabilt og lettvint å kontrollere, mens spillvæsken er stort sett fri for sukker og følgelig har meget lavere biologisk oksygenbehov.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kjennetegnes ved at konsentrasjonen av sakkaridkarbonkilden i mediet er ^egrensende på veksten av bakterien.

En vilkårlig stamme av Azotobacter vinelandii kan anvendes ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse. Imidlertid er særlig verdifulle stammer som gir særlig høye utbytter av polysakkarid de som er særlig nevnt i ovennevnte to britiske patentskrifter og som har kultursamlingsnumrene NCIB 9068 og NCIB 8789, og den som har kultursamlingsnummeret NCIB 8660.

Disse stammer er tilgjengelige fra National Collection of Indus-trial Bacteria,Torry Research Station, P.O.Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen, Scotland, og er beskrevet i samlingens katalog.

Nivået av monosakkarid- eller disakkaridkarbonkilden som anvendes i mediet vil variere avhengig av cellekonsentrasjonen i fermenteringsvekkeren, jo høyere cellekonsentrasjon desto høyere sakkaridnivå som er begrensende. Det har f.eks. vist seg at under anvendelse av et kjemisk definert medium av den type som er nevnt i eksempel 1 i ovennevnte britiske patentskrift 1 .-331.771 er en sukrosekonsentrasjon på 24 millimol effektivt begrensende ved en cellekonsentrasjon på ca 1,3 g/liter når respirasjonshastig-heten er ca 16 millimol oksygen/g celle/h. Tilsvarende er en sukrosekonsentrasjon på 240 millimol effektivt begrensende ved en cellekonsentrasjon på ca 13,6 g/liter og en respirasjonshastighet på ca 5 millimol/oksygen/g celle/h. Disse resultater er oppnådd ved fortynningshastigheter på henholdsvis 0,15 og 0,05 h - 1.

I ethvert spesielt tilfelle kan en antydning av om sukrose-(eller andre mono- eller disakkarider) konsentrasjonen virkelig er begrensende oppnås ved å øke sukrosekonsentras jorden og iaktta virkningen på cellekonsentrasjonen. Dersom konsentrasjonen av en ikke begrensende bestanddel i mediet økes, iakttas det ingen vesentlige forandringer av cellekonsentrasjonen, men dersom konsentrasjonen av den begrensende bestanddel økes, reagerer celle-konsentras jonen hurtig med økning.

Det har vist seg at under konvensjonelle, kontinuerlige kulturbetingelser, f.eks. de som foreligger ved anvendelse av en kimostat (se Herbert, Elsworth og Telling, Journal of Ceneral Microbiology, 14_, 601, 1956), er særlig fordelaktige sukrose-nivåer så høye som 240 millimol/1, men det kan ikke settes noen øvre grense for sukrosekonsentrasjonen bortsett fra den grense som bestemmes av de praktiske betraktninger som bestemmer den kontinuerlige fermenteringsprosess.

Men uavhengig av mediets sukrosenivå, forutsatt at dette virkelig er begrensende på veksten av Azotobacter vinelandii er spillvæsken stort sett fri for resterende sukker. Dessuten reguleres sukkernivået i selve dyrkingsmediet lettvint ved et stabilt nivå idet det faktisk er selve mikroorganismen som funk-sjonerer som reguleringsmiddel.

Av de forskjellige mono- og disakkarider som er egnet som karbonkilder vil fremstillingen av polysakkarid ved hjelp av Azotobacter vinelandii har det vist seg at sukrose er å fore-trekke .

Bortsett fra bruken av begrensende betingelser for monosakkarid- og disakkaridkarbonkilden kan mediet forøvrig inneholde enhver av de vanlige bestanddeler som anvendes ved fremstillingen av polysakkarid med Azotobacter vinelandii.

Det har vist seg at oksygentilførselshastigheten er for-bundet med effektiviteten av monosakkarid- eller disakkaridkarbon-kildens omdannelse til polysakkarid. Under kontinuerlige kulturbetingelser er det forholdet mellom oksygennivået og cellekonsentrasjonen som er kritisk og ikke oksygenkonsentrasjonen i mediet som sådan. Høye oksygennivåer fremmer mikroorganismens respirasjon og omdanner således sukrosen (eller andre karbonkilder) til karbondioksyd. På den annen side begrenser oksygen-begrensende betingelser dannelsen av polysakkarid. Nøye regul-ering av oksygentilførselen kan imidlertid gi en sukroseomdannelse på ca 30 eller sågar over 40% og således bevirke en meget mer effektiv utnyttelse av karbonkilden. Typisk er oksygenopptaket begrenset til fra 5 til 20 mmol 02/h/g celle.

Det aktuelle opptak av oksygen i millimol/1 pr. time som svarer til disse tall vil selvfølgelig avhenge av cellekonsen-tras jonen i fermenteringsvekkeren. Opptaket pr. liter pr. time ligger generelt i de områder som er angitt i ovennevnte patentskrifter, men det må fremheves at det er forholdet mellom oksy-gentilførselen og cellekonsentrasjonen som er viktig.

Forandring av oksygentilførselen til kulturen kan foretas på forskjellig måte. For det første kan konsentrasjonen av oksygen i gassen, vanligvis luft, som føres inn i kulturen under fermenteringen, forandres ved fortynning av luften med nitrogen eller en inert gass, eller ved å anrike luften med ekstra oksygen. For det andre kan trykket av gassen som føres inn i kulturen forandres slik at oppløsningshastigheten senkes. For det tredje kan effektiviteten hvormed oksygenet i gassfasen overføres til den vandige fase forandres ved forandring av gass-væskeblandekarakteristikkene, hensiktsmessig ved forandring av hastigheten og effektiviteten av omrøreren. En kombinasjon av to eller flere av disse fremgangsmåter kan også benyttes for å frembringe den riktige balanse mellom nitrogen og oksygen.

Oppfinnelsen vil bli nærmere forklart i det etterfølgende ved hjelp av eksempler.

Eksempel 1

Alginatfremstilling under karbonbegrensende betingelser

i kontinuerlig kultur.

Azotobacter vinelandii NCIB 9068 ble dyrket kontinuerlig i en kontinuerlig kultur av kjemostattype (Herbert, Elsworth og Telling, Journal of GeneralMicrobiology, _14, 601, 1956), under anvendelse av Azotobacter vinelandii NCIB 9068 i et apparat for kontinuerlig kultur med et kulturvolum på 1,0 liter, hvor fos-fatmengden ble senket til. de angitte konsentrasjoner. Mediet ble pumpet inn i kulturen ved 150 ml/h, og kulturen strømmet via et stigerør inn i opptaksbeholderen. Temperaturen ble regulert til 30°C. pH ble regulert til 7,4 ved automatisk tilsetning av 1 m NaOH. Luft ble sprøytet inn i fermenteringsvekkeren med

1 liter/min, mens omrørerhastigheten ble regulert slik at oksygenopptakshastigheter i området 10-3 0 mmol/g celle/h ble oppnådd. Prøver ble tatt fra fermenteringsvekkeren med daglige intervaller og undersøkt vedrørende cellemasse og polysakkaridkonsentrasjon. Til hver prøve på 4 0 ml ble tilsatt 0,8 ml 0,5

m EDTA pluss 0,8 ml 5 m NaCl. Prøvene ble deretter sentrifugert ved 25.0 00 g i 4 0 minutter. Den oppnådde cellepellet ble re-suspendert i destillert vann, sentrifugert ved 25.000 g i 40 minutter og den overliggende væske dekantert. Røret som var veiet på forhånd og som inneholdt sedimentet ble tørket ved 105°C i 12 timer og veiet. Polysakkaridet ble felt ut fra den' overliggende væske fra den første sentrifugering ved tilsetning av tre ganger volumet med propan-2-ol. Utfellingen ble oppsamlet ved filtrering, og tørket under vakuum ved 4 5°C i 24 timer og veiet.

Dyrkingsmediet, hvis endelige sammensetning er angitt i tabell 1, ble tilberedet og tilsatt til kulturen i to satser.

Sats 1 ble autoklavbehandlet ved 1 kg/cm 2i 1 time i to deler

som ble kombinert aseptisk etter avkjøling. Den ene del inneholdt sukrose, KI^PO^og I^HPO^i 14 liter mens den annen del inneholdt MgS04, NaCl samt andre sporelementer enn Ca og Fe,

i 4 liter. Sats 2 inneholdt CaCl2og FeCl2i 2 liter. CaCl2 ble autoklavbehandlet i 1,9 liter, og FeCl2ble filtersterilisert og deretter tilsatt til resten av sats 2. Satsene 1 og 2 ble tilsatt til kulturen gjennom separate ledninger, idet sats 1

ble tilsatt ved en hastighet på 135 ml/h og sats 2 med 15 ml/h.

Karbonbegrensning ble demonstrert ved økning av sukrosekonsentras jonen i mediet til 40 g/l: i løpet av fire timer økte cellekonsentrasjonen med mer enn 10%. Sukrosenivået ble bestemt ved gasskromatografi.

Mengden fremstilt polysakkarid pr. g/celle under karbon-begrensningen og mengden resterende sukrose er angitt i tabell 2. Sammenlikningsvis kan det resterende sukrosenivå under konvensjonelle betingelser hvor sukrose ikke er det begrensende næringsmedium være så høyt som 10 eller 15 mmol.

Eksempel 2

Under anvendelse av mediet som angitt i tabell^. 1 var et sukkernivå på 10 ganger det som er angitt i tabell 1 vekstbegrensende ved en fortynningshastighet på 0,05 h . Det resterende sukker var neglisjerbart, men en polysakkaridkonsentrasjon på 20 g/l ble oppnådd ved en omdannelsesvirkningsgrad på 25%.

Eksempel 3

Dette eksempel viser virkningen av å ikke begrense oksygenopptaket. Ved en respirasjonshastighet på 28 mmol C^/h/g celle (i motsetning til 16 og 5,2 mmol C^/h/g celle i henholdsvis eksempel 1 og 2) samt omdannelsesvirkningsgraden til 14%.

Men eksemplet viser at nitrogenet i luften i det minste delvis kan erstattes med en fast nitrogenkilde.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et polysakkarid som består av en delvis acetylert, varierende blokkopolymer av 1,4-sammen-bundete-D-mannuronsyre- og L-guluronsyrerester, ved kontinuerlig dyrking av en bakterie av arten Azotobacter vinelandii under aerobe betingelser i et vandig dyrkingsmedium som inneholder som vesentlige bestanddeler minst ett monosakkarid eller disakkarid som karbonkilde og kilder for fosfat, molybden, jern, magnesium, kalium, natrium, kalsium og sulfat, samt en fast nitrogenkilde og/eller en luftingsgass som inneholder nitrogen, idet mediets pH under dyrkingen ligger i området 6,0-8,2,karakterisert vedat konsentrasjonen av sakkaridkarbonkilden i mediet er begrensende for veksten av bakterien.

2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat oksygentilførselshastigheten begrenses til et område som gir optimal omdannelse til polysakkarid.

3. Fremgangsmåte i samsvar med krav 2,karakterisert vedat oksygenopptakshastigheten er fra 5 til 20 m mol C^/h/g celle.