CN113913331B - 一种产聚谷氨酸耐盐碱的短小芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种产聚谷氨酸耐盐碱的短小芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于农业技术、环境保护和生态改良应用领域，公开了一种产聚谷氨酸耐盐碱的短小芽孢杆菌及其应用。Bacillus pumilus YG35发酵72h后粗提聚谷氨酸产量约为0.12g/mL，在NaCl浓度12％pH 10.0复合培养基中良好生长。以Bacillus pumilus YG35为原料，经细菌活化发酵后制备成发酵液。接种在砒砂岩中，可以显著提高砒砂岩土壤的有机质、速效磷、速效钾及多糖，阳离子交换量等土壤肥力指标，提高砒砂岩土壤的持水能力，促进黑麦草生长。

Description

一种产聚谷氨酸耐盐碱的短小芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于农业技术、环境保护和生态改良应用领域，涉及一种产聚谷氨酸耐盐碱芽孢杆菌及其应用。
背景技术
我国砒砂岩区域约为1.67万km2，主要分布在以内蒙古鄂尔多斯市准格尔旗为中心的晋陕蒙接壤区。因其粗粉粒含量大，土壤中缺乏粘粒使其结构及稳定性降低，抗腐蚀性减弱，且砒砂岩属于碱性土壤，土壤总体养分含量非常低，植物很难从土壤中获取营养元素，因此传统的生物措施拦截和工程措施难以全面实施。
芽孢杆菌(Bacillus)作为植物促生菌在改善土壤质量和微环境，促进植物生长上发挥着重要的作用。其次，芽孢杆菌具有超强的耐受性，在抵御外界环境胁迫方面具有较好的优势。聚谷氨酸(Polyglutamic acid)是一种高分子多肽聚合物，存在大量游离亲水性羧基和氢键，使其具有较强的保水能力、絮凝性等，能够改善黏质土壤的膨松度及空隙度,砂质土壤的持水持肥能力。
国内外已经有应用改良剂肥料和微生物来改善缺水缺肥土壤的研究。王成永、杜小莉、汪杨等通过将聚谷氨酸与水溶性肥料、磷酸脲、腐殖酸和谷黄素等不同原料配比施用，在能够快速降盐降碱的同时，又能够增加土壤的有机质及微量元素，有效改良土壤盐碱化、土壤的膨松度及孔隙度、提高作物耐盐碱性和品质。邓琳等通过制备复合微生物菌剂探讨微生物对砒砂岩土壤的影响，发现该菌剂能够增加土壤的氮磷钾含量及酶活性，且促进黑麦草及苜蓿的生长，从而达到改良砒砂岩的效果。但目前应用的这些菌株多是具有产IAA，铁载体等促植物生长特性，并没有特异性的针对砒砂岩土壤本身pH值较高、不保水等特性筛选有效菌株。而聚谷氨酸的应用基本都是通过与其他原料配比制成复合肥、抗旱松土助剂和增效剂等来实现对盐碱地土壤的改良，虽然效果较好，但前期投入较大且需要完整的制备工艺技术。
盐碱地与砒砂岩都属于贫瘠土壤，不保水且不利于植物生长，现有的聚谷氨酸改良剂制备难度较大，而微生物改良方法成本低，无二次污染，因此可以借助微生物发酵产聚谷氨酸来改良土壤，且目前还未有通过聚谷氨酸产生菌来改良砒砂岩土壤的应用。因此，利用产聚谷氨酸的耐盐碱芽孢杆菌减少土壤中水分、养分流失，提高土壤肥力，促进植物生长，有望对砒砂岩区水土流失起到一定防治作用。
发明内容
本发明的目的是针对目前砒砂岩区生物修复和工程修复存在的问题，提供一种能够改良砒砂岩土壤肥力的芽孢杆菌YG35及其应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种改良砒砂岩土壤肥力的芽孢杆菌YG35，分类命名为Bacillus pumilus YG35，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年9月6日，菌种保藏号为CCTCC NO：M20211144。筛选培养基上菌落呈圆形，不透明乳白色，倒置平板菌落中心有明显倒挂液滴，流动性较强。LB固体培养基上菌落外表粗糙、不拉丝、无倒挂液滴。菌体短杆状且相互连接，有芽孢，不溶血，能够分泌吲哚乙酸，铁载体及具有溶磷能力。好氧，耐受pH 11.0、NaCl浓度13％，且在NaCl浓度12％pH 10.0也能良好生长，发酵72h粗提聚谷氨酸产量约为0.12g/mL。
本发明所述的短小芽孢杆菌YG35在改良砒砂岩土壤肥力、促进黑麦草生长中的应用。
本发明所述的短小芽孢杆菌YG35在增加砒砂岩土壤有机质、增加砒砂岩土壤速效磷、速效钾、多糖、阳离子交换量、蔗糖酶活性及土壤持水能力中的应用。
由所述的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)YG35制备的生物菌剂。
作为本发明的一种优选，所述的菌剂中短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)YG35细胞数量达到5亿CFU/mL以上。
本发明所述的菌剂在改良砒砂岩土壤肥力、促进黑麦草生长中的应用。
作为本发明的一种优选，所述的菌剂在增加砒砂岩土壤有机质、增加砒砂岩土壤速效磷、速效钾、多糖、阳离子交换量、蔗糖酶活性及提高持水能力中的应用。
有益效果
本发明筛选到一株能够改良砒砂岩土壤肥力的短小芽孢杆菌Bacillus pumilusYG35，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年9月6日，菌种保藏号为CCTCCNO：M 20211144，且该芽孢杆菌能够促进黑麦草在砒砂岩上的生长，增加植物生物量。
本发明所述的Bacillus pumilus YG35菌株能够改良砒砂岩土壤肥力，促进黑麦草生长，增加植物生物量。与现有技术相比有如下优点：
(1)本发明所述的Bacillus pumilus YG35能够产生聚谷氨酸，发酵72h粗提聚谷氨酸产量约为0.12g/mL。
(2)Bacillus halotolerans YG35具有优良的耐盐碱性，耐受pH 11.0、NaCl浓度13％，且在NaCl浓度12％pH10.0复合培养基中也能良好生长。
(3)Bacillus pumilus YG35能够产生吲哚乙酸，铁载体且具有溶磷能力。
(4)接种Bacillus pumilus YG35发酵液处理的黑麦草鲜重及株高显著增加33％和15％(P<0.05)。
(5)接种Bacillus pumilus YG35发酵液的砒砂岩土壤有机质含量显著增加23％(P<0.05)。
(6)接种Bacillus pumilus YG35发酵液的砒砂岩土壤多糖含量显著增加40％(P<0.05)。
(7)接种Bacillus pumilus YG35发酵液的砒砂岩土壤的速效磷含量显著增加41％(P<0.05)。
(8)接种Bacillus pumilus YG35发酵液的砒砂岩土壤的速效钾含量显著增加9.7％(P<0.05)。
(9)接种Bacillus pumilus YG35发酵液的砒砂岩土壤的蔗糖酶含量显著增加17％(P<0.05)。
(10)接种Bacillus pumilus YG35发酵液的砒砂岩土壤的阳离子交换量显著增加6.2％(P<0.05)。
(11)接种Bacillus pumilus YG35发酵液的砒砂岩土壤的渗水率显著减少3.63％(P<0.05)。
生物样品保藏信息
短小芽孢杆菌YG35，分类命名为Bacillus pumilus YG35，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年9月6日，菌种保藏号为CCTCC NO:M 20211144。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求保护范围之内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。
以下实施例中除特例说明外，均为本领域内的常规实验方法和操作步骤。
实施例1
本发明所述的改良砒砂岩土壤肥力的产聚谷氨酸耐盐碱短小芽孢杆菌YG35是从山东滨州盐碱土分离纯化得到的，分离鉴定方法如下：
称取20g土样于摇瓶，再加入10％的NaCl混匀，置于30℃培养箱驯化30天。取10g驯化后的土样加入已灭菌的90ml无菌水摇瓶，煮沸5-10min后180rpm充分振荡30min，再用无菌水进行梯度稀释，取100μl释梯度为10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的土壤悬液涂布于分离培养基上，30℃培养2天。挑出生长快，表面光滑粘稠且拉丝的单菌落再次进行分离划线纯化，检查特征是否一致，4℃保存。
按常规方法提取细菌总DNA，PCR扩增细菌16S rDNA，扩增产物经测序后与GenBank中已知16S rDNA序列进行比对分析，与Bacillus pumilus ATCC 7061的16S rDNA序列相似性达到99.93％，结合其它细菌生理生化实验，将其鉴定为这个种。
实施例2菌株YG35的活化和发酵液制备
将YG35斜面菌种接种于LB液体培养基(胰蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.0)中，30℃ 180rpm培养1d。按2％接种量接种于LB液体培养基(胰蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，NaCl10.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.0)，30℃，180rpm振荡培养72h。
实施例3菌株YG35耐盐碱能力
将菌株分别接种到NaCl浓度为10％、12％、13％；pH10.0、pH11.0；NaCl浓度10％和pH 10.0；NaCl浓度12％和pH 10.0的固体LB平板上，30℃培养1-2天，观察菌株生长情况，以是否生长作为耐盐碱能力判定。结果表明，YG35具有优良的耐盐碱性，耐受pH 11.0、NaCl浓度13％，且在NaCl浓度12％pH10.0复合培养基中也能良好生长。
实施例4菌株YG35产聚谷氨酸的能力
参考N.Bai等人的方法并作适量改进。将菌株接种到50ml种子培养基富集培养16h，以2％的接种量接种到50ml发酵培养基中，30℃、180rpm振荡培养72小时，将发酵液置于50ml离心管，12000rpm离心20min，取上清加入四倍体积的预冷无水乙醇，过夜沉淀，离心收集沉淀物，加入等体积的无菌水溶解，透析过夜，与配置好的CTAB的NAOH溶液(5％的CTAB溶于8％NaOH)混合静置观察是否有絮状物产生来快速判断能否产聚谷氨酸，离心收集絮状沉淀并称重，以此来判断聚谷氨酸的产量。结果表明，YG35能够产生聚谷氨酸，粗提聚谷氨酸产量约为0.12g/mL。
实施例5菌株YG35产IAA的能力
根据Gordon和Weber(1951)的测定方法，用试管分装LB液体培养基，每管4ml，121℃高温灭菌后加入过滤除菌的2.5mg/mL色氨酸溶液1ml，使培养基中色氨酸的终浓度为0.5mg/mL。将菌株接种于上述培养基中，30℃摇床振荡培养3d。发酵液于12000rpm离心5min，取上清液1ml，加入10mM的正磷酸50μl，再加2ml Sackowski's显色剂，充分混合，黑暗下25℃显色30min，于530nm波长下测定吸光值。无菌培养基同上做相同的处理作为对照调零。以浓度为0、5、10、20、40、60mg/L的IAA标准液同法作标准曲线，计算发酵液中IAA的浓度。结果表明YG35能产生吲哚乙酸，IAA产量约为7.63mg/L。
实施例6菌株YG35产铁载体的能力
根据王平等的方法测定铁载体。将菌株YG35接种于LB液体培养基中，30℃ 150rpm振荡培养48h。发酵液12000rpm离心5min，取上清液与等体积CAS检测液充分混匀，显色1h后测定630nm波长处的吸光值(A)，以去离子水作对照调零。另以等体积无菌LB培养基与CAS检测液充分混匀的处理，同法测定吸光值即为参比值(Ar)。A/Ar值<1，可被认为高产铁载体。结果表明菌株YG35能够产微量铁载体。
实施例7菌株YG35溶磷的能力
配制100ml无机磷液体培养基于三角瓶中，121℃灭菌25min。将种子培养基中培养了16小时的待测菌液按1％(体积分数)的接种量接入到无机磷液体培养基中,以不接菌的处理作为空白对照,每个处理3个重复，30℃、180rpm摇床培养3d。取样5ml，6000rpm离心10min，采用钼锑抗比色法测定上清液中的水溶性磷(PO4 3-)含量。结果表明菌株YG35溶磷量约为98mg/L。
实施例8菌株YG35发酵液制备
将YG35斜面菌株接种到50ml种子培养基(葡萄糖20.0g，酵母膏5.0g，L-谷氨酸钠10.0g，NaCl 5.0g，MgSO4 0.25g，K2HPO4·3H2O 2.0g，MnSO4·H2O 0.03g，蒸馏水1L，pH＝7.5)中，30℃、180rpm摇床培养16h，按2％的接种量接种至装有50ml发酵培养基(葡萄糖40.0g,L-谷氨酸钠40.0g，MgSO4 0.3g，K2HPO4·3H2O 2.0g，MnSO4 0.03g，(NH4)2SO4 10.0g，蒸馏水1L，pH＝7.5)的250ml锥形瓶中，30℃、180rpm摇床培养72h，使最终发酵液的活菌数≥2.5×109CFU/ml。
实施例9砒砂岩土壤中菌株YG35促进黑麦草生长的作用
土壤取自内蒙古砒砂岩区的土壤。每盆装入200g过2mm筛的砒砂岩土壤，以10％的体积比加入生物炭并混匀。选取种子饱满、大小一致的黑麦草种子用5％的H2O2消毒10min，用去离子水反复冲洗多次后，用实施例8制备的菌剂浸种约2h，对照用无菌水处理。每盆均匀铺洒黑麦草种子，每个处理三个重复，再接种实施例8制备的菌剂30ml，对照接入等体积的无菌培养基，表面盖薄土萌发10天后间苗，每盆留生长一致的苗30株，每日浇水。30天后收获黑麦草，称取鲜重，测量株高。以评判菌株对它们的促生效果。
由表1可知，与对照相比，接菌YG35处理后的黑麦草的鲜重及株高显著增加33％和15％(P<0.05)。
表1菌株Bacillus pumilus YG35对黑麦草的促生作用
Figure BDA0003309484830000061
实施例10菌株YG35提高砒砂岩土壤肥力的作用
按照实施例9布置盆栽试验，取试验后的盆栽土壤，采用重铬酸钾容量法-稀释热法测量土壤中有机质的含量；采用0.5mol/L NaHCO3提取、钼锑抗试剂显色、比色测定法测量土壤中速效磷的含量；采用NH4OAc浸提，火焰光度法测定土壤中速效钾的含量。由表2可知，与对照相比，接菌处理的砒砂岩土壤中有机质含量显著增加23％(P<0.05)；速效磷含量显著增加31％(P<0.05)；速效钾含量显著增加9.7％(P<0.05)。
表2菌株Bacillus pumilus YG35对砒砂岩土壤有机质、速效钾含量和速效磷含量的影响
Figure BDA0003309484830000071
采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定各处理土壤的蔗糖酶活性。蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。采用蒽酮-硫酸法测定溶液中多糖含量。采用氯化钡-硫酸强迫交换法。土壤用BaCl2缓冲液处理，使之为钡离子饱和，洗去剩余的BaCl2溶液后，加标准硫酸镁溶液于钡饱和的土壤中，通过测定滴定氢氧化钠标准溶液测定交换反应后的硫酸含量的变化，以等体积硫酸为对照，算出硫酸消耗量，进而计算出阳离子交换量。由表3可知，与对照相比，接菌处理的砒砂岩土壤中蔗糖酶活性显著增加17％。与对照相比，接菌处理的砒砂岩土壤中多糖含量显著增加40％(P<0.05)。与对照相比，接菌处理的砒砂岩土壤中阳离子交换量显著增加6.2％(P<0.05)。
表3菌株Bacillus pumilus YG35对砒砂岩土壤蔗糖酶活性、多糖含量、阳离子交换量的影响
Figure BDA0003309484830000072
实施例11菌株YG35提高砒砂岩土壤保水性的作用
按照实施例9布置盆栽试验，植物收获后，在装有70g土壤的盆钵下方放置培养皿，取50ml水缓缓倒入，5小时后测定培养皿中渗水体积V，按V×100％/50ml计算渗水率。表4结果表明，与对照相比，接菌处理的砒砂岩土壤中渗水率显著减少3.63％(P<0.05)。
表4菌株Bacillus pumilus YG35对砒砂岩土壤渗水率的影响
Figure BDA0003309484830000073
Figure BDA0003309484830000081

Claims (7)

1. 一株能够改良砒砂岩土壤肥力的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）YG35，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年9月6日，菌种保藏号为CCTCC NO:M20211144。
2.权利要求1所述的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）YG35在改良砒砂岩土壤肥力或促进黑麦草生长中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于短小芽孢杆菌YG35在增加砒砂岩土壤有机质、增加砒砂岩土壤速效磷、速效钾、多糖、阳离子交换量和蔗糖酶活性及提高砒砂岩持水能力中的应用。
4.由权利要求1所述的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）YG35制备的生物菌剂。
5.根据权利要求4所述的生物菌剂，其特征在于其中短小芽孢杆菌YG35细胞数量达到5亿CFU/mL以上。
6.权利要求4所述的菌剂在改良砒砂岩土壤肥力或促进黑麦草生长中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的菌剂在增加砒砂岩土壤有机质、增加砒砂岩土壤速效磷、速效钾、多糖、阳离子交换量和蔗糖酶活性及提高砒砂岩持水能力中的应用。
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