CN116769679B - 一株产酸的节杆菌jy3-2及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株有较高产酸（包括吲哚乙酸）能力的节杆菌JY3‑2及其应用，属于农业微生物技术领域。本发明筛选得到的节杆菌JY3‑2有较高的产酸能力，其产生的酸通过溶解和络合作用，不仅可以与牡蛎壳粉中的CaCO3发生反应，有效缩短牡蛎壳的堆积陈化时间，而且可以大幅度提高牡蛎壳粉中有效态钙含量，促进作物生长，同时还可以增加无机养分有效性和移动性，改变土壤肥力，促进植物吸收养分、提高抗逆性及抗菌效果。
Description
技术领域
本发明涉及一株节杆菌及其应用，具体涉及一株有较高产酸（包括吲哚乙酸）能力的节杆菌JY3-2及其应用，属于农业微生物技术领域。
背景技术
牡蛎壳是由矿物质和蛋白、多糖等有机质大分子共同组成的高度有序的多重微层结构。牡蛎壳中的无机物主要成分为CaCO3，占牡蛎壳质量分数的90%以上。牡蛎壳中除Ca含量丰富外，还富含以氧化物形式存在的Cu、Fe、Zn、Mn、Sr等20多种微量元素。此外，牡蛎壳中还含有多糖、糖蛋白和珍珠蛋白以及 17 种氨基酸等有机成分，这些物质的含量约占牡蛎壳总质量的3-5%。目前，牡蛎壳在医药、医疗保健品开发和轻工业中制备各种添加剂等方面具有很大应用价值。
现有技术还将牡蛎壳应用在土壤改良领域，但牡蛎壳直接、单独作为改良剂对植物生长的改善作用不明显，并且用新鲜牡蛎壳制备而成的土壤调理剂需要3-8年的时间堆积陈化。
用牡蛎壳粉制作而成的土壤调理剂可使土壤具有保水性、保肥性和透气性，可以改善土壤物理结构，促进土壤微生物繁殖，促进作物对土壤养分的吸收，从而达到增产、改善作物品质的目的。近年来，将牡蛎壳经过处理后作为土壤调理剂的研究越来越多，目前，对牡蛎壳的处理方式主要有粉碎和高温煅烧。
粉碎是最方便的处理工艺，粉碎后的牡蛎壳粉仅结构发生变化，其主要成分还是CaCO3，但CaCO3施入到土壤后，由于其结构稳定且难溶于水，需要经过长期转化才能被植物吸收利用，对酸性土壤的调理效果相对较慢，并且长期施用还会造成土壤板结和复酸。
高温煅烧后牡蛎壳中的CaCO3分解成CaO，CaO容易与H2O发生反应生成Ca（OH）2，不仅碱性增强，还能中和土壤中H+，提高土壤盐基饱和度，但由于温度过高会使得牡蛎壳表面的原生微生物失去活性，得到的产品与石灰类似，而且牡蛎壳煅烧过程中会产生大量CO2等温室气体，对环境有一定的负面影响。
发明内容
本发明的第一个目的在于：提供一株有较高产酸（包括吲哚乙酸）能力的菌株，该菌株发酵过程中会产生大量的酸，是牡蛎壳粉土壤调理剂增效的有益菌株。
本发明的第二个目的在于：利用上述有益菌株制备一种陈化时间较短、有效态钙含量较高的牡蛎壳粉土壤调理剂。
本发明采用如下技术方案：
一株产酸的节杆菌JY3-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为节杆菌Arthrobacter sp.，保藏编号为CGMCC NO.27065，保藏日期为2023年4月12日，保藏地址为中国北京。
一种牡蛎壳粉土壤调理剂，由JY3-2菌粉和牡蛎壳粉组成，其中，JY3-2菌粉由前述的节杆菌JY3-2经发酵和喷雾干燥制得，JY3-2菌粉的质量含量为0.5-1.0%，牡蛎壳粉的质量含量为99.0-99.5%。
优选的，节杆菌JY3-2的发酵条件具体如下：挑取节杆菌JY3-2，溶解于无菌水中，接种于发酵培养基中，30℃、200rpm培养48h。
优选的，牡蛎壳粉为将牡蛎壳粉碎后研磨成粉。
本发明的有益之处在于：
（1）本发明筛选得到的节杆菌JY3-2，经过产酸测试和产吲哚乙酸（IAA）测试，结果证明：菌株JY3-2有较高的产酸能力和产IAA能力；
（2）本发明筛选得到的节杆菌JY3-2，其产生的酸可与牡蛎壳粉中的CaCO3发生反应，有效缩短牡蛎壳的堆积陈化时间；
（3）本发明筛选得到的节杆菌JY3-2，其产生的酸通过溶解和络合作用，可以使牡蛎壳粉中植物不可直接吸收利用的CaCO3转化为有效态钙，大幅度提高牡蛎壳粉中有效态钙含量，促进作物生长；
（4）本发明筛选得到的节杆菌JY3-2，其产生的酸通过溶解和络合作用，可以增加无机养分有效性和移动性，改变土壤肥力，促进植物吸收养分，提高抗逆性及抗菌效果，从而达到作物抗逆、增产改善品质的目的；
（5）本发明筛选得到的节杆菌JY3-2，其产生的IAA能够促进作物生长。
附图说明
图1是本发明筛选得到的节杆菌JY3-2的系统发育树分析图；
图2是本发明筛选得到的节杆菌JY3-2不同发酵时长发酵液的pH值检测结果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、产酸菌株的分离与筛选
采集牡蛎壳堆积物中的植物根际土壤，取10g土壤样品，加入到90mL无菌水中，放置在摇床中震荡30min，将样品配制成10-1-10-6浓度梯度的土壤悬液。
取10-4、10-5、10-6浓度梯度的土壤悬液各200μL，分别涂布至筛选培养基中，30℃倒置培养48h。
从筛选培养基上将产生较大蓝色或紫色透明圈的菌挑出，反复划线分离获得纯种菌株，斜面保藏于试管中备用。
对纯化后的菌株再次进行筛选，产生的透明圈最大（产酸最多）的菌株即为牡蛎壳粉土壤调理剂增效的有益菌株，记为JY3-2。
筛选培养基的配方为：KNO3 0.1g/L，NaCl 0.5g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，可溶性淀粉20g/L，琼脂15g/L，刚果红0.2g/L。
二、菌株的形态特征、生长特性和种属鉴定
菌株的形态特征
经观察，JY3-2为革兰氏阳性菌，呈短杆状，菌落在LB培养基上生长的形态为圆形，表面光滑，边缘规则。
菌株的生长特性
经试验，JY3-2为好氧菌，最适生长温度为30℃，可以利用葡萄糖、乳糖、半乳糖和蔗糖。
菌株的种属鉴定
经检测，JY3-2的16S rDNA 核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
利用MEGA软件构建菌株发育树，构建得到的菌株发育树具体见图1。从图1可知：JY3-2为节杆菌，与目前已发表的节杆菌序列具有较高相似性。
综合菌株形态、生长特性和16S rDNA基因序列，JY3-2被鉴定为节杆菌Arthrobacter sp.o，于2023年4月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.27065，保藏地址为中国北京。
三、菌株的产酸和产吲哚乙酸（IAA）测试
菌株的产酸测试
挑取一环节杆菌JY3-2，溶解于10mL无菌水中，分别取0.2mL接种于10个体积为50mL的发酵培养基中，30℃、200rpm培养，每隔8h取出一瓶，于12000rpm离心10min，测滤液pH值。
滤液pH值的检测结果见图2。由图2可知：节杆菌JY3-2有较高的产酸能力，在发酵最初的48h产酸较多，pH值下降较快，之后pH值逐渐趋于平稳。
节杆菌JY3-2发酵产生的酸，可与牡蛎壳粉中的CaCO3发生反应，把牡蛎壳粉中植物不可直接吸收利用的CaCO3转化为有效态钙（水溶态钙、交换态钙），可供植物直接吸收利用。
发酵培养基的配方为：葡萄糖 50g/L，酵母粉 5g/L，KH2PO4·H2O 1.4g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，（NH4）2SO4 10g/L，FeSO4·7H2O 0.03g/L，ZnSO4 0.03g/L。
菌株的产IAA测试
将节杆菌JY3-2分别接种到含有100mg/L色氨酸的King氏培养基中和不含色氨酸的King氏培养基中，以加 100μL无菌水的培养液为空白对照，置于28℃、120rpm的摇床中培养48h。
将发酵液于4℃、10000rpm离心10min，取上清液4mL，等体积加入比色液混匀，在黑暗中静置30min，立即测定D530nm值，通过IAA标准曲线计算节杆菌JY3-2产IAA的量。
计算结果：IAA的产量为27.2μg/mL。
由上述计算结果可知：节杆菌JY3-2有较高的产IAA的能力。
节杆菌JY3-2发酵产生的IAA可以促进植物生长。
King氏培养基的配方为：酵母浸粉0.5g，胰蛋白胨0.5g，酪蛋白氨基酸0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，K2HPO4 0.3g，MgSO4·7H2O 0.05g，L-色氨酸0.5g，蒸馏水1000mL，pH值7.2±0.2。
四、菌粉的制备
挑取一环节杆菌JY3-2，溶解于10mL无菌水中，取0.2mL接种于体积为50mL的发酵培养基中，30℃、200rpm培养48h，对发酵液进行喷雾干燥，制备得到JY3-2菌粉。
五、牡蛎壳粉的制备
将牡蛎壳粉碎，然后研磨成粉，得到牡蛎壳粉。
六、牡蛎壳粉土壤调理剂的制备
表1 牡蛎壳粉土壤调理剂的配比（质量百分比）
把JY3-2菌粉和牡蛎壳粉按表1比例混合，然后将混合物进行造粒，即得牡蛎壳粉土壤调理剂。
七、检测牡蛎壳粉土壤调理剂的有效态钙含量
水溶态钙和交换态钙均属于有效态钙，都可以被植物直接利用。将样品中的水溶态钙以蒸馏水为溶剂，在室温下震荡2h后离心30min提取出，交换态钙以1mol/L乙酸铵为溶剂，室温震荡2h后离心30min提取出，然后利用电感耦合等离子体质谱仪（PE Elan DRC II，PerkinElmer，加拿大）测定各形态钙的含量。
各样品的有效态钙含量的检测结果见表2、表3、表4和表5。
表2 牡蛎壳粉土壤调理剂A的有效态钙含量测定结果
表3 牡蛎壳粉土壤调理剂B的有效态钙含量测定结果
表4 牡蛎壳粉土壤调理剂C的有效态钙含量测定结果
表5 牡蛎壳粉土壤调理剂D的有效态钙含量测定结果
由表2、表3、表4和表5所示的检测结果可知：
（1）牡蛎壳粉土壤调理剂B和C的交换态钙和有效态钙的含量总体上均呈增加趋势（可能因菌株JY3-2生长过程中产生的酸与牡蛎壳粉中的CaCO3发生反应导致），与对照相比，牡蛎壳粉土壤调理剂B中交换态钙的含量增加了1.52倍、有效态钙的含量增加了1.54倍，牡蛎壳粉土壤调理剂C中交换态钙的含量增加了1.58倍、有效态钙的含量增加了1.61倍；
（2）牡蛎壳粉土壤调理剂A的交换态钙和有效态钙含量与对照相比增幅均较小，均增加了1.10倍，所以JY3-2菌粉的添加量不宜过少；
（3）牡蛎壳粉土壤调理剂D的交换态钙和有效态钙的含量与对照相比增幅也均较小，分别增加了1.16倍和1.20倍，所以JY3-2菌粉的添加量也不宜过多。
需要说明的是，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明技术方案所引申出的显而易见变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (4)
1.一株产酸的节杆菌JY3-2，其特征在于，所述节杆菌JY3-2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为节杆菌Arthrobacter sp.，保藏编号为CGMCCNo.27065，保藏日期为2023年4月12日，保藏地址为中国北京。
2.一种牡蛎壳粉土壤调理剂，其特征在于，由JY3-2菌粉和牡蛎壳粉组成，其中，所述JY3-2菌粉由权利要求1所述的节杆菌JY3-2经发酵和喷雾干燥制得，所述牡蛎壳粉为将牡蛎壳粉碎后研磨成粉，JY3-2菌粉的质量含量为0.5-1.0%，牡蛎壳粉的质量含量为99.0-99.5%。
3.根据权利要求2所述的牡蛎壳粉土壤调理剂，其特征在于，所述节杆菌JY3-2的发酵条件具体如下：
挑取节杆菌JY3-2，溶解于无菌水中，接种于发酵培养基中，30℃、200rpm培养48h。
4.根据权利要求3所述的牡蛎壳粉土壤调理剂，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：
葡萄糖 50g/L，酵母粉 5g/L，KH2PO4·H2O 1.4g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，（NH4）2SO410g/L，FeSO4·7H2O 0.03g/L，ZnSO4 0.03g/L。
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