CN112481169A - 一种耐盐碱泌铵型自生固氮菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种耐盐碱泌铵型自生固氮菌株及其应用，其解决了现有非共生固氮菌根际生物逆境和非生物逆境等环境因素的影响非常大、固氮效率低下的技术问题，本发明提供一种耐盐碱泌铵型自生固氮菌株，其命名为盐居固氮菌(Azotobacter salinestris)MX‑3；其保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号编号为：CGMCC No.19426。本发明同时提供了其应用。本发明可应用于耐盐碱菌株领域。

Description

一种耐盐碱泌铵型自生固氮菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种固氮菌株及其应用，具体地说，涉及一种耐盐碱泌铵型自生固氮菌株及其应用。

背景技术

自然界中存在一些微生物能将大气中的N₂还原为NH₃，这种现象被称为生物固氮。固氮菌及其固氮酶的研究已成为当今农业生产应用和科学研究的热点。根据固氮菌与高等植物的关系，生物固氮分为共生固氮、自身固氮、联合固氮三种类型。共生固氮菌的固氮效率高，通常为75～300千克纯氮/(公顷·年)，可为豆科植物提供100％的氮素来源。然而共生固氮菌只能特异性与某些豆科作物形成根瘤，但不能应用在非豆科作物上。非共生固氮菌广泛分布于非豆科粮食作物根际；接种非共生固氮菌在非豆科作物节肥增产方面具有巨大的应用潜力。非共生固氮菌的研究，成为当前生物固氮的前沿和热点。但非共生固氮菌根际生物逆境和非生物逆境等环境因素的影响非常大，固氮效率低下，通常只有1～50千克纯氮/(公顷·年)。

通常情况下，固氮微生物固定的铵不会分泌到环境中，而固氮酶的表达和活性受活性铵的抑制，成为生物固氮在农业中广泛应用的关键瓶颈；针对普通非共生固氮菌的固氮效率不高、施肥条件下不固氮、固定的铵不能分泌到胞外被作物根系直接利用等特点，为提高成功接种固氮菌的可能性，筛选耐铵和泌铵的高效固氮野生菌株株的研究成为生物固氮领域的热点。

能存在于非豆科作物根际，并能在盐渍化的土壤中生存的固氮菌，具备了在盐碱地改良上的应用潜力。盐居固氮菌作为这样一类细菌，其应用尚未得到重视。作为农业生产用细菌类的一个新菌种，马鸣超等认为盐居固氮菌普遍存在于土壤环境中，未见致病性报道，属于风险一级(马鸣超，姜昕，曹凤明，李俊。生物有机肥生产菌种安全分析及管控对策研究[J].农产品质量与安全，2019(6):57-61.)，因此耐盐碱的盐居固氮菌的开发和应用具有重要意义。

发明内容

本发明就是为了解决现有非共生固氮菌根际生物逆境和非生物逆境等环境因素的影响大、固氮效率低下的技术问题，提供一种具有较强的固氮和泌铵能力的耐盐碱泌铵型自生固氮菌株及其应用。

为此，本发明提供一种耐盐碱泌铵型自生固氮菌株，所述菌株的命名为盐居固氮菌(Azotobacter salinestris)MX-3；其保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号编号为：CGMCC No.19426，保藏日期为：2020年2月19日。

本发明同时提供一种耐盐碱泌铵型自生固氮菌株作为单一菌种菌剂在盐碱地作为固氮菌促进植物生长中的应用。

本发明还提供一种耐盐碱泌铵型自生固氮菌株在促进巨大芽孢杆菌在盐碱条件下的解磷能力中的应用。

本发明也提供一种耐盐碱泌铵型自生固氮菌株作为复合菌剂成份在盐碱地作为固氮菌促进植物生长中的应用。

优选的，将所述耐盐碱泌铵型自生固氮菌株与芽孢杆菌、根瘤菌复配制成复合菌剂，所述菌剂的成份按菌剂质量比为盐居固氮菌：巨大芽孢杆菌：中华苜蓿根瘤菌＝(1-2)：(0.5-1)：(1-5)。

本发明具有以下有益效果：

本发明所述的耐盐碱地固氮菌MX-3具有较强的固氮和泌铵能力，其固氮酶活性353.49±7.78nmol C₂H₄/(mL·h)，固氮菌培养液总氮为58.1mg/L，其中液体培养胞外分泌的氨氮为29.0mg/L，并具有产ACC脱氨酶的能力，其产量为1.36U/mg。该菌株的培养条件研究表明其具有很广的应用范围。将该菌株复合溶磷菌巨大芽孢杆菌、中华苜蓿根瘤菌等制成的微生物菌肥，可用于改良盐碱地土壤的改良和活化养分，促进植株的生长，提高农作物的生物量。

附图说明

图1a为为本发明菌株MX-3菌落形态；

图1b为为本发明菌株MX-3液体培养；

图2为本发明中温度对菌株MX-3生长的影响；

图3为本发明中pH对菌株MX-3生长的影响；

图4为本发明中盐浓度对菌株MX-3生长的影响；

图5为本发明中铵离子浓度对菌株MX-3生长的影响。

本发明提供的耐盐碱泌铵型自生固氮菌株命名为盐居固氮菌(Azotobactersalinestris)MX-3；其保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏号编号为：CGMCCNo.19426，保藏日期为：2020年2月19日。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步描述。

本发明公开了一种耐盐碱地固氮菌株为盐居固氮菌(Azotobacter salinestris)菌株。该固氮菌株MX-3是从滨海盐碱地土壤中分离纯化所得，并对菌株的16S rDNA部分序列进行测定，通过系统发育分析，确定为盐居固氮菌，并命名为MX-3。该菌株的形态特征是：革兰氏阴性；细胞(18h)呈椭圆形，末端尖(2×3～4μm)，液体培养基中，单个细胞、成对细胞或6～8个细胞链出现。周围鞭毛运动。后期细胞变圆变大(直径3-5μm)，多形态，不运动，形成囊肿。在37℃下培养2至3天后，菌落或培养液呈现棕色至棕黑色。

本发明提供的固氮菌株其生长温度范围为20～42℃，最适生长温度是30～40℃；生长pH范围是4～10，最适生长pH是6～9；耐受NaCl浓度范围是0％～5％，最佳生长NaCl浓度是1％～4％；极限铵离子浓度是0～2.0mmol/L，最适生长铵离子浓度是0.5～1.5mmol/L。

本发明提供的固氮菌株具有固氮泌铵和产ACC脱氨酶能力，其固氮酶活性353.49±7.78nmol C₂H₄/(mL·h)，其中无氮液体培养基培养胞外分泌的氨氮为29.0mg/L；并具有产ACC脱氨酶的能力，其产量为1.36U/mg。

本发明提供的固氮菌株及其固氮泌铵和产ACC脱氨酶能力，其可作为单一菌种菌剂使用。

本发明提供的固氮菌株具有促进巨大芽孢杆菌在盐碱条件下的解磷能力。

本发明实施例中所使用的巨大芽孢杆菌和中华苜蓿根瘤菌均为常用菌种，可从中国科学院微生物研究所公开取得。

实施例1：耐盐碱地固氮菌的分离

1、Ashby无氮培养基：甘露醇10g，KH₂PO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO₄·2H₂O 0.2g，CaCO₃ 5g，pH7.2。

耐盐Ashby无氮培养基：甘露醇10g，KH₂PO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 50g，CaSO₄·2H₂O 0.2g，CaCO₃ 5g，pH7.2。

2、固氮菌的初筛：

称取山东潍坊滨海盐碱地土壤样品10g，放入装有适量玻璃珠和100mL生理盐水的250mL的三角瓶中，180r/min振荡1h，静置20min后系列稀释涂布于Ashby无氮培养基固体培养基。将涂有菌液的平板在37℃恒温培养箱中倒置培养3d。分离并纯化出固氮菌，将获得的菌株置于4℃冰箱内保藏。

3、固氮菌的复筛

将初次筛选的菌株接种于耐盐Ashby无氮液体培养基，37℃，180r/min振荡培养3d。以不接菌种的液体培养基为对照，用凯氏定氮法测定不同菌株发酵液内总氮的含量，根据含氮量的多少来确定菌株的固氮能力。将复筛得到的高效固氮菌株的发酵液用30％甘油1:1混合，置于-80℃冰箱内保藏。

实施例2：固氮菌MX-3的鉴定

提取菌株MX-3基因组DNA，使用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')、1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')对菌株基因组DNA的16S rRNA基因全长序列进行PCR扩增。PCR产物送华大基因公司测序。双向测序进行拼接，得到接近1.5Kb全长的16S rDNA基因序列。使用EzBioCloud Identify service(https：//www.ezbiocloud.net/identify)和NCBI Nucleotide BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)将16S rDNA基因序列结果与GenBank数据库进行比对，选择有效命名的模式菌株作为参考。

该菌株的培养形态特征是：革兰氏阴性；细胞(18h)呈椭圆形，末端尖(2×3～4μm)，液体培养基中，单个细胞、成对细胞或6～8个细胞链出现。周围鞭毛运动。后期细胞变圆变大(直径3-5μm)，多形态，不运动，形成囊肿。在37℃下培养2至3天后，菌落或培养液呈现棕色至棕黑色(见图1)。

实施例3：耐盐碱地固氮菌的培养条件优化

将耐盐碱地固氮菌MX-3接种到Ashby无氮培养基，37℃，180r/min振荡培养3d。

1、温度对菌株MX-3生长的影响

将菌种接种到Ashby无氮液体培养基中，分别置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，180r/min振荡培养3d，然后紫外分光光度计测定菌悬液的OD₆₀₀吸光值。

2、pH对菌株生长的影响

将菌种接种到pH 5、6、7、8、9、10的Ashby无氮液体培养基中，37℃200r/min振荡培养3d，然后可见光分光光度计测定菌悬液的OD₆₀₀吸光值。

3、盐浓度对菌株生长的影响

将菌种接种到NaCl浓度0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％的Ashby无氮液体培养基中，37℃200r/min振荡培养3d，然后紫外分光光度计测定菌悬液的OD₆₀₀吸光值。

4、铵离子浓度对菌株生长的影响

将菌种接种到含有NH₄Cl浓度0mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L的Ashby液体培养基中，37℃，180r/min振荡培养5d，然后紫外分光光度计测定菌悬液的OD₆₀₀吸光值。

实施例4：耐盐碱地固氮菌的生理生化特性研究

1、固氮及泌铵能力的定性试验

利用气相色谱结合乙炔还原法测定固氮酶活性。将待测菌株接种于Ashby培养基中37℃，180r/min振荡培养48h，取1mL接种于含10mL Ashby液体培养基的60mL磨口小口瓶中，再培养24h，然后抽出5mL气体，再注入5mL乙炔气体，继续培养24h，上机检测。

将菌株接种于Ashby液体培养基，37℃，180r/min振荡培养3d。测定培养液总氮和上清氨氮，总氮的测定采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法，氨氮的测定采用水杨酸分光光度法。

实验结果，固氮菌MX-3的固氮酶活性353.49±7.78nmol C₂H₄/(mL·h)，固氮菌培养液总氮为58.1mg/L，其中胞外分泌的氨氮含量为29.0mg/L，结果表明固氮菌具有良好的固氮、泌铵性能。

2、产ACC脱氨酶活性

(1)DF培养基：葡萄糖2.0g，葡萄糖酸钠2.0g，柠檬酸2.0g，KH₂PO₄ 4.0g，Na₂HPO₄6.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，(NH₄)₂SO₄ 2.0g，组分一、组分二溶液各0.1mL，蒸馏水定容至1000mL，pH值7.0-7.2；其中组分一：H₃BO₃ 10mg，MnSO₄·H₂O 11.19mg，ZnSO₄·7H₂O124.6mg，CuSO₄·5H₂O 78.22mg，灭菌蒸馏水100mL；组分二：FeSO₄·7H₂O 100mg溶于10mL灭菌蒸馏水中。

(2)ADF培养基：ACC溶于灭菌蒸馏水，0.22μm滤膜过滤除菌，然后加到不含(NH4)₂SO₄的DF培养基内，使其终浓度为3.0mmol/L。

(3)测定：将保存在-80℃的固氮菌株活化，按1％(V/V)的比例将活化后的菌液接种于无氮培养基中，37℃条件下过夜培养，离心(1200r/min，10min)，收集菌体，用5mL的DF培养基洗涤菌体2次，将菌体重悬于5mL的ADF培养基中，37℃条件下过夜培养，离心(1200r/min，10min)，收集菌体。0.1mol/L的Tris-HCl(pH 7.6)缓冲液洗冲洗菌体2次，再次将菌体重悬于600μL的0.1mol/L的Tris-HCl(pH 8.5)缓冲液，加入30μL的甲苯。取200μL提取液与20μL的0.5mol/L的ACC溶液混合，37℃条件下孵育15min，然后加300μL的0.2％的2,4-二硝基苯肼，37℃条件下孵育30min，最后，加入2mL的2mol/L NaOH溶液，利用紫外分光光度计测吸光率(OD＝540nm)。以牛血清蛋白为标准，以每分钟形成1μmolα-酮丁酸盐为一个酶活单位。

菌株MX-3的ACC脱氨酶活性测定结果表明，其具有产ACC脱氨酶的能力，其产量为1.36U/mg。ACC脱氨酶是一种抑制乙烯生物合成的胞内酶，具有分泌ACC脱氨酶活性的微生物接种在植物根际时，能够降低植物由于盐胁迫产生的过量乙烯浓度，促进植物生长。

实施例5：菌株MX-3对溶磷菌溶磷能力的影响

(1)LB培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，用蒸馏水定容至1.0升，pH7.0-7.2。

(2)PKO培养基：葡萄糖10.0g，(NH₄)₂SO4 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，MnSO₄·H₂O0.03g，K₂SO₄ 0.3g，FeSO₄·H₂O 0.03g，Ca₃(PO₄)₂ 5.0g，卵磷脂0.2g，H₂O 1000mL，其中NaCl浓度和pH分别设定为：pH7，1％NaCl；pH8，2％NaCl；pH9，3％NaCl三个梯度。

将菌株MX-3接种于Ashby无氮液体培养基，37℃，180r/min振荡培养3d。将具有溶磷作用的巨大芽孢杆菌接入LB培养基，37℃，180r/min振荡培养1d；各取3％接种至PKO培养基培养基，对照为PKO培养基3％接种量的菌株巨大芽孢杆菌，37℃，180r/min振荡培养5d后，用钼锑抗比色法测定溶液中有效磷的含量。

结果表明(见表1)，混合培养解磷菌和固氮菌生长较好，较单独培养解磷菌和固氮菌，其耐盐碱性更强，菌株MX-3能够促进巨大芽孢杆菌的溶磷效果，一定程度上解除盐碱的抑制。

表1菌株MX-3对溶磷菌盐碱条件下溶磷能力的影响

实施例6：菌株MX-3的定植能力试验

将菌株MX-3发酵液进行稀释，按照2×10⁸cfu/kg的比例，添加到经150℃，120min干热灭菌2次后的滨海盐碱地土壤，采用花盆分装(2.5kg土壤)，五个平行(光照温度一致)，每隔5天浇水一次，每次每盆浇水500mL，采用插管法取样，每盆取10g，每组5个样品混匀。将混匀的土样取10g，进行菌活数检测。每隔五天检测一次，记录数据，分析比较MX-3的定植情况。

研究结果表明(见表2)，菌株能够在盐碱地土壤中有效定植，一个月的活菌数达到3×10⁵cfu/kg。

表2菌株MX-3的定植能力试验

实施例7：耐盐碱地固氮菌的促生试验

采用盆栽试验，种植普通白菜(Brassica campestris)。试验在温室中进行，每花盆装土1000g。实验土壤为滨海盐碱地土壤(全氮0.28g/kg，有效磷20.6mg/kg，速效钾151.6mg/kg)。实验组为接种耐盐碱地固氮菌，对照组不接种菌剂(添加同菌剂等量的水)，五个平行(光照温度一致)，出苗7d后每盆定植普通白菜1株。将菌株MX-3发酵液，用无菌水洗涤菌体，按照2×108cfu/kg的比例，定植后每隔5天浇水一次，每次每盆浇水500ml。30d后收获，测定植株鲜重。实验结果取3次重复的平均值。

结果显示，实验组小白菜植株鲜重在(4.87±1.43)g/盆，对照组(1.36±0.15)g/盆。与对照相比，接菌处理使小白菜鲜重显著增加，说明菌株MX-3具有促进植物生长的作用。

实施例8：耐盐碱地固氮菌复合菌剂的在苜蓿中的应用

选择山东省昌邑市滨海盐碱地苜蓿种植基地，第一年9月份新种紫花苜蓿作为应用对象，选取同一地块各1亩，设定对照和处理。在第二年机械收割1茬后，对照地不做任何措施，试验地采用固氮菌MX-3、巨大芽孢杆菌、中华苜蓿根瘤菌按菌剂质量比1:1:1复配的复合菌剂10L，稀释300倍喷施。对照地和试验地其他种植措施和管理相同；试验发现使用复合菌剂的试验地比对照地地上生物量高，生长齐整、苗壮、株高、叶绿，说明各菌剂处理可以明显促进苜蓿生长。第二茬收割前，随机采样测定土壤养分。株高是植物的形态指标，是描述牧草生长状况，反映其产量高低较为理想的一个特征量。单株结瘤数是根瘤菌结瘤能力的重要指标，这里所说的根瘤菌包括土壤中原有的根瘤菌和新接入的根瘤菌。因此同时随机选取20棵苜蓿进行测定生长情况。

结果表明(见表3)，土壤全氮试验地高于对照地；而有效磷和速效钾，对照地高于试验组，这可能是由于复合菌组合具有改良、活化土壤的作用，导致地上部分吸收过多的养分所致。苜蓿的单株结瘤数和生长高度，试验地均高于对照地，说明复合菌剂有效提高土壤总氮，并促进了苜蓿的结瘤和生长。

表3固氮菌复合菌剂的对耐盐碱地苜蓿生长的影响

惟以上所述者，仅为本发明的具体实施例而已，当不能以此限定本发明实施的范围，故其等同组件的置换，或依本发明专利保护范围所作的等同变化与修改，皆应仍属本发明权利要求书涵盖之范畴。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种耐盐碱泌铵型自生固氮菌株及其应用

<130> WPFC1200420

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1424

<212> DNA

<213> 盐居固氮菌(Azotobacter salinestrisMX-3)

<400> 1

aaaaactccg tggtaccgtc ctcccgaggg ttagactagc tacttctgga gcaacccact 60

cccatggtgt gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc gacattctga 120

ttcgcgatta ctagcgattc cgacttcacg cagtcgagtt gcagactgcg atccggacta 180

cgatcggttt tctgggatta gctccgcctc gcggcttggc aaccctctgt accgaccatt 240

gtagcacgtg tgtagccctg gccgtaaggg ccatgatgac ttgacgtcat ccccaccttc 300

ctccggtttg tcaccggcag tctccttaga gtgcccaccc gaggtgctgg taactaagga 360

caagggttgc gctcgttacg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacagc 420

catgcagcac ctgtctctgc gttcccgaag gcacccgggt atctctaccc agttcgcagg 480

atgtcaaggc caggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct 540

tgtgcgggcc cccgtcaatt catttgagtt ttaaccttgc ggccgtactc cccaggcggt 600

cgacttaatg cgttagctgc gccactaagc tctcaaggag cccaacggct agtcgacatc 660

gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcacctc 720

agtgtcagta tcagtccagg tggtcgcctt cgccactggt gttccttcct atatctacgc 780

atttcaccgc tacacaggaa attccaccac cctctaccgt actctagcct ggcagttttg 840

gatgcagttc ccaggttgag cccggggctt tcacatccaa cttaccaaac cacctacgcg 900

cgctttacgc ccagtaattc cgattaacgc ttgcaccctt cgtattaccg cggctgctgg 960

cacgaagtta gccggtgctt attctgtcgg taacgtcaaa actgcagggt attcgcctac 1020

agcccttcct cccgacttaa agtgctttac aatccgaaga ccttcttcac acacgcggca 1080

tggctggatc aggctttcgc ccattgtcca atattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt 1140

ctggaccgtg tctcagttcc agtgtgactg atcatcctct cagaccagtt acggatcgtc 1200

gccttggtgg gccgttaccc caccaaccag ctaatccgac ctaggctcat ctgttagcgt 1260

gaggcccgaa ggtcccccac tttctcccgt aggacgtatg cggtattagc gcgagtttcc 1320

ccgcgttatc ccccactaac aggcagattc ctaggcatta ctcacccgtc cgccgctcgc 1380

cggcaacccg aaggtcccgc tgccgctcga cttgcatggt aggc 1424

Claims (5)

1.一种耐盐碱泌铵型自生固氮菌株，其特征是，所述菌株的命名为盐居固氮菌(Azotobacter salinestris)MX-3；其保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号编号为：CGMCC No.19426。

2.如权利要求1所述的耐盐碱泌铵型自生固氮菌株作为单一菌种菌剂在盐碱地作为固氮菌促进植物生长中的应用。

3.如权利要求1所述的耐盐碱泌铵型自生固氮菌株在促进巨大芽孢杆菌在盐碱条件下的解磷能力中的应用。

4.如权利要求1所述的耐盐碱泌铵型自生固氮菌株作为复合菌剂成份在盐碱地作为固氮菌促进植物生长中的应用。

5.根据权利要求4所述的耐盐碱泌铵型自生固氮菌株作为复合菌剂成份在盐碱地作为固氮菌促进植物生长中的应用，其特征在于，将所述耐盐碱泌铵型自生固氮菌株与芽孢杆菌、根瘤菌复配制成复合菌剂，所述菌剂的成份质量比为盐居固氮菌：巨大芽孢杆菌：中华苜蓿根瘤菌＝(1-2)：(0.5-1)：(1-5)。

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