CN114015629A

CN114015629A - 一种对大豆促生和提高益生微生物种群丰度的复合菌剂

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Publication number: CN114015629A
Application number: CN202111565134.4A
Authority: CN
Inventors: 庄家尧; 毛国豪; 张文韬
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2021-12-20
Filing date: 2021-12-20
Publication date: 2022-02-08
Anticipated expiration: 2041-12-20
Also published as: CN114015629B; WO2023115830A1

Abstract

本发明公开了一种对大豆促生和提高益生微生物种群丰度的复合菌剂，属于微生物技术领域。复合菌剂由假单胞菌(Pseudomonas sp.)H1发酵液、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y1发酵液混合组成。所述的复合菌剂的应用于大豆种植中，可以促进大豆植株生长、提高土壤中益生微生物种群丰度。具体步骤如下：将上述两种菌体分别活化、发酵配成发酵液后，将所得发酵液等体积比混合制成复合菌剂并施入大豆进行处理。相比于不添加复合菌剂的对照组，复合菌剂的添加显著增加了大豆植株的地上生物量，株高、茎粗等生长指标均显著增加；同时复合菌剂的添加有效增加了大豆根部的根瘤菌科、德沃斯氏菌科这两种固氮菌种群丰度，有利于充分发挥植株的固氮作用。另外，复合菌剂对土壤有一定改善作用，相比于空白组使用复合菌剂后有效磷含量显著增加66.96％(P＜0.05)，碱解氮增加29.14％，pH由7.13降低至6.73。因此，本发明的复合菌剂在大豆生产中具备很高的应用前景。

Description

一种对大豆促生和提高益生微生物种群丰度的复合菌剂

技术领域

本发明涉及一种对大豆促生和提高益生微生物种群丰度的复合菌剂，属于微生物技术领域。

背景技术

大豆作为我国主要的食用油料来源，在食用、饲用市场需求巨大。数据显示，中国内地市场大豆进口数量连续五年增加，2020年我国进口大豆数量更是首次超过一亿吨。此外，市场上大豆品质的良莠不齐也是一大问题，如何提高我国自身的大豆产量和品质已然成为限制农业发展的一大问题。

农业发展离不开化学肥料的施用，但是近年来化肥的不科学使用带来了水体污染、重金属富集、土壤盐渍化等许多问题。调查显示传统化肥的使用并没有带来预期中作物产量的增加，反而一些农田甚至出现土壤肥力低下、作物生长差的现象。为此，广大农业生产者迫切需要一种可以替代传统化肥的新型肥料的出现。

微生物肥料以其高效绿色特点在农业应用上愈加广泛，作为其原料的微生物菌剂得到了农业生产者的普遍重视与研究。作为微生物菌剂中的一个分支，复合菌剂因其种类丰富、肥力齐全、效果显著等优点获得大力推广和应用。因此，提高我国大豆产量、实现我国大豆产业的自力更生，离不开优质复合菌剂的筛选和开发。

因此，能否从自然界中筛选出促进大豆生长的菌株并制成复合菌剂成为解决我国大豆产业发展问题的一大方案，同时也是研究微生物肥料工作者亟需解决的问题。

发明内容

[发明目的]

本发明旨在从自然界中筛选出对大豆促生的菌株并制成一种促进大豆生长的菌剂，为提高我国自身大豆产量和品质提供解决方案。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明公开了一种复合菌剂，该复合菌剂中的菌株由保藏编号为CCTCC NO：M 20211043的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y1和为保藏编号为CCTCC NO：M 20211042的假单胞菌(Pseudomonas sp.)H1组成。

本发明所述高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y1和假单胞菌(Pseudomonassp.)H1已知都具有促进豆科植物生长的功能。

复合菌剂中高地芽孢杆菌Y1菌液和假单胞菌H1菌液体积比相等且浓度均不低于10⁹CFU/ml。

本发明所述高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y1是从来源于湖南省株洲市攸县野生大豆根瘤中分离得到的，在南京林业大学水土保持实验室-80摄氏度冰箱内保存，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学。保藏编号为CCTCC NO：M20211043，保藏日期为2021年9月2日。

高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y1菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.2所示，将测序得到的序列在Genbank中进行核酸序列比对，结果显示该菌株为：Bacillus altitudinis(高地芽孢杆菌)，其与Bacillus pumilus(NR-043242)的同源性最近，核酸序列相似度高达99％。将与其相似度高的菌株构建系统进化树(具体可见附图4)，经发育树分析显示Y1菌株属于芽孢杆菌属的高地芽孢杆菌，将其命名为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y1。

本发明所述的假单胞菌(Pseudomonas sp.)H1是从来源于湖南省株洲市攸县野生大豆根瘤中分离得到的，在南京林业大学水土保持实验室-80摄氏度冰箱内保存，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学。保藏编号为CCTCC NO：M 20211042，保藏日期为2021年9月2日。

假单胞菌(Pseudomonas sp.)H1菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在Genbank中进行核酸序列比对，结果显示，与Pseudomonas sp(MG491596.1)和Pseudomonas chlororaphis(MT078671.1)的同源性较近，为99％。将与其相似度高的菌株构建系统进化树(具体可见附图5)，结果显示菌株属于假单胞菌属，将其命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)H1。

本发明还提供了一种复合菌剂在促进大豆植株生长中的应用，使用高地芽孢杆菌Y1菌剂和假单胞菌H1菌剂混合的复合菌剂作为菌肥施用，植株为大豆植株。高地芽孢杆菌Y1保藏编号为CCTCC NO：M 20211043；假单胞菌H1的保藏编号为CCTCC NO：M 20211042。

本发明还提供了一种提高益生微生物种群相对丰度的方法，使用高地芽孢杆菌Y1和假单胞菌H1混合的复合菌剂作为菌肥施用。高地芽孢杆菌Y1保藏编号为CCTCC NO：M20211043；假单胞菌H1的保藏编号为CCTCC NO：M 20211042。

进一步地，本发明的复合菌剂按照以下步骤进行制备并施入大豆盆栽中：

1)从保存完好的斜面中分别挑取一假单胞菌H1、高地芽孢杆菌Y1的菌体接种在不同的营养琼脂固体培养基中，25℃活化48h。

2)将活化后的假单胞菌H1、高地芽孢杆菌Y1菌株分别用接种环挑取一环菌泥加入到不同LB液体培养基中，25℃，200r/min恒温震荡24h制备种子液。

3)将两种种子液按5％的接种量接种在不同YMB培养基中进行扩增培养，25℃，200r/min摇床振荡培养2-3d通过加无菌水稀释或继续发酵保证菌液OD600为0.8-1.2，即得两种发酵菌液。

4)将上述单独培养的两种发酵菌液按1∶1等体积比混匀，用紫外分光光度计测量OD600，通过加无菌水稀释或继续发酵保证菌液OD600值在0.8～1.2范围内即得复合菌株发酵液，然后密封储存在4℃冰箱中备用；将上述的发酵液用无菌水稀释100倍加入大豆盆栽根部土壤中，每盆6mL。

5)对照采用等体积的稀释100倍的Y1发酵菌液、稀释100倍的H1发酵菌液、无菌水三种处理。

有益效果

本发明提供了一种可促进大豆生长的复合菌剂，将此复合菌剂使用到大豆植株中，能有效增加大豆地上部分生物量，促进大豆生长发育，发展前景可期。实验结果如附图11所示，具体为：

在大豆生长指标上

大豆幼苗经H复合菌剂处理后，地上部分生物量平均为2.20g；株高平均为32.87cm；茎粗平均为4.12mm，与空白对照组相比地上生物量增加60.58％、株高增加34.99％、茎粗增加72.38％；相较于H1菌剂处理组地上生物量增加51.72％、株高增加20.31％、茎粗增加10.75％，相较于Y1菌剂处理组地上生物量增加22.22％、株高增加9.02％、茎粗增加12.56％。

在大豆根际土壤理化性质上

复合菌剂处理H组的盆栽有效磷及碱解氮浓度分别为3.49mg/kg和486.00mg/kg，相较于空白组C组其有效磷含量显著增加66.96％(P＜0.05)，碱解氮增加29.14％，pH由7.13降低至6.73土壤有一定程度的酸化；相较于单一菌剂J组、Y组其有效磷含量分别增加22.03％、32.20％(P＜0.05)，碱解氮分别增加4.59％、10.54％，pH均有一定程度的下降。

在大豆根部土壤微生物种群丰度上

在门水平上

(1)与空白对照组相比，在经复合菌剂处理的大豆根部土壤微生物种群里，变形菌门细菌含量由61.22％减少到38.18％，而放线菌门细菌由10.54％增加到30.39％。

(2)与H1菌剂组、Y1菌剂组相比，经复合菌剂H组处理的大豆根部土壤微生物种群中，厚壁菌门细菌含量达到9.27％，显著低于H1菌剂组37.6％和Y1菌剂组60.96％比例；放线菌门细菌含量达到30.39％，显著高于H1组7.53％、Y1组0的比例；蓝藻菌门细菌含量为0.67％，低于H1菌剂组12.86％和Y1菌剂组7.88％比例；拟杆菌门细菌含量为12.92％，高于H1菌剂组4.56％和Y1菌剂组0.87％比例。

在属水平上

(1)与空白对照组相比，在复合菌剂处理的大豆根部土壤微生物种群中，马杜拉放线菌属细菌由3.29％增加到11.02％，卵黄杆菌属细菌由1.63％增加到5.97％。

(2)与H1菌剂组、在Y1菌剂组相比，复合菌剂组H组处理的大豆根部土壤微生物种群中，马杜拉放线菌属细菌含量为11.02％，高于H1菌剂组1％和Y1菌剂组0的比例，地芽孢杆菌属细菌含量为0，低于H1菌剂组16.13％和Y1菌剂组40.05％的比例。

在大豆根部微生物种群丰度上

经复合菌剂处理的大豆根部微生物种群中，根瘤菌科细菌含量为18.88％，高于空白对照组5.63％含量；伯克氏菌科细菌含量为11.29％，低于空白对照组27.15％含量；小单胞菌科细菌含量为0，低于空白对照组30.15％含量。

经由上述的技术方案可知，本发明公开提供了一种对大豆促生和提高益生微生物种群丰度的复合菌剂，取得的技术效果为本发明提供的复合菌剂施用后对大豆植株的促生作用，尤其是促进大豆植株地上生物量、苗高；提高了大豆根部根瘤菌科(Rhizobium)和德沃斯氏菌科细菌的相对丰度，使共生固氮能力得到了有效发挥。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对本发明所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为YMB培养基中的三种发酵菌液，左为Y1发酵菌液，中间为H1发酵菌液，右为H1和Y1复合菌株发酵液。

图2为YMA培养基平板上的高地芽孢杆菌Y1菌落图。

图3为YMA培养基平板上的假单胞菌H1菌落图。

图4为本发明提供的高地地孢杆菌Y1菌株进化树图。

图5为本发明提供的假单胞菌H1菌株进化树图。

图6为本发明提供的在NA培养基平板上假单胞菌H1和高地地孢杆菌Y1菌株拮抗实验结果图。

图7为本发明提供的经复合菌剂H组处理后的盆栽有效磷、碱解氮浓度和pH变化示意图。

图8为本发明提供的经对照组菌剂J、Y、空白组C和经复合菌剂H组处理的盆栽土中，在门水平上微生物群落组成示意图。

图9为本发明提供的经对照组菌剂J、Y、空白组C和经复合菌剂H组处理后的盆栽土中，在属水平上微生物群落组成示意图。

图10为本发明提供的经对照组菌剂J、Y、空白组C和复合菌剂H组处理后的大豆根部中，在科水平上微生物群落组成示意图。

图11为本发明提供的经对照组菌剂J、Y、空白组C和复合菌剂H组处理后的大豆生长状况图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中的各试剂为市售产品，而配制菌剂的两种菌体假单胞菌(Pseudomonas sp.)H1、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y1均为本实验室分离所得。假单胞菌(Pseudomonas sp.)H1由本实验室从野生大豆根瘤中分离、筛选所得，由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏单位地址为中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20211042，保藏日期为2021年9月2日。高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y1由本实验室从野生大豆根瘤中分离、筛选所得，由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏单位地址为中国武汉，武汉大学，保藏编号为保藏编号为CCTCC NO：M 20211043，保藏日期为2021年9月2日。

实施例1

两种菌株拮抗性探究

1培养基

(1)营养琼脂固体培养基的组成和含量为：蛋白胨10g、牛肉浸粉3g、氯化钠5g、琼脂15g、1000ml去离子水，pH7.2-7.4。

(2)LB液体培养基的组成和配比方法为：容器内加入去离子水950ml、胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠5g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L氢氧化钠调节溶液pH至7.4，定容至1L。

2拮抗实验步骤

假单胞菌H1、高地芽孢杆菌Y1分别用LB液体培养基中活化后，30℃、180r/min，摇床培养24h，取H1菌液5μL点解在在营养琼脂固体培养基平板中心位置，将5μL Y1点接在营养琼脂固体培养基平板的4个边缘位置，30℃培养2-3d。

结果如图6显示，假单胞菌菌株H1与高地芽孢杆菌菌株Y1没有产生明显的拮抗圈，说明相互之间不拮抗。

实施例2

复合菌剂促生大豆的能力

1制备单一菌种菌剂和复合菌剂

1.1培养基

(3)YMB培养基的组成和含量为：甘露醇10g、七水硫酸镁0.2g、氯化钠0.1g、酵母粉3g、磷酸氢二钾0.25g、磷酸二氢钾0.25g、碳酸钙3g、1000ml去离子水，pH7.2-7.4。

1.2制备菌剂的步骤

1)从保存完好的斜面中分别挑取一假单胞菌H1、高地芽孢杆菌Y1的菌体接种在营养琼脂固体培养基中，25℃活化48h。

2)将活化后的假单胞菌H1、高地芽孢杆菌Y1菌株分别用接种环挑取一环菌泥加入到LB液体培养基中，25℃，200r/min恒温震荡24h制备种子液。

3)将种子液按3％的接种量接种在YMB培养基中进行扩增培养，25℃，200r/min摇床振荡培养2-3d通过加无菌水稀释或继续发酵至发酵液OD600为0.8～1.2，即得两种发酵菌液。

4)将上述单独培养的两种发酵菌液按1∶1混合后用紫外分光光度计测量O0600，通过加无菌水稀释或继续发酵保证菌液OD600值在0.8～1.2范围内即得复合菌株发酵液，然后密封储存在4℃冰箱中备用；将上述的发酵液用无菌水稀释100倍即得到复合菌剂。

5)对照组采用等体积的稀释100倍的Y1发酵菌液、稀释100倍的H1发酵菌液、无菌水三种处理。

2大豆幼苗种植

本发明的试验对象为盆栽大豆。首先用次氯酸钠溶液对种子灭菌，然后用浸种法进行催芽。待幼芽长出后，挑取长势较好的幼芽栽植于花盆中，盆栽所用的土壤为江苏兴农基质科技有限公司所生产的育苗基质土。每盆栽入3株幼芽，放置在简易大棚。在长出第一片真叶时，每盆植物根部各接种6mL复合菌剂，以不接种和接种6mL单菌种H1、Y1菌剂为对照。每三天喷洒一次营养液保持湿润。待生长一个月后进行间苗，每盆保留一株健壮的幼苗(每盆长势一致)，保持三天喷施一次营养液。45天后，测得其地上部分与地下部分生长情况。

盆栽指标的测定和方法

对于大豆植株地上部分：使用游标卡尺、皮尺测定幼苗的地径和苗高；使用根系扫描仪测量叶面积(每盆植株选取上中下位叶片共计10片用于测量叶面积)。

对于大豆植株地下部分：使用根系扫描仪测量测量根系形态；测定植株的地下生物量。

对于大豆盆栽土：采用mettlertoledo ph计测定pH(水土比为5∶1)；采用酸溶-钼锑抗比色法测定土壤有效磷；采用碱解扩散法测定土壤的碱解氮。

结果表明：使用复合菌剂H能显著增加土壤中有效磷和碱解氮含量，同时pH下降土壤有一定程度的酸化。

对大豆植株地上部分生长的影响

注：P＜0.05。

表1所示，本发明对大豆植株进行了四个处理，包括空白对照组c、Y1菌剂Y组、H1菌剂J组、复合菌剂H组。与无菌空白对照组相比，添加菌剂的三种处理中，大豆地上部分各生长指标均显著提高。其中，Y、J、H菌剂组相较于无菌剂组地上部分生物量分别增加31.39％、5.84％、60.58％，株高分别增加23.82％、12.20％、34.99％，茎粗分别增加53.14％、55.65％、72.38％。

从表1可知，与添加单一菌株的J、Y组相比，复合菌剂组H组中大豆的促生效果最显著，其地上生物量、株高、茎粗分别为2.2g、32.87cm、4.12mm，相较于J处理组地上生物量增加51.72％、株高增加20.31％、茎粗增加10.75％，相较于Y处理组地上生物量增加22.22％、株高增加9.02％、茎粗增加12.56％。

表1不同菌剂处理后大豆植株地上部分生长情况比较

对大豆植株地下部分根长的影响

注：P＜0.05。

表2所示，本发明对大豆植株进行了四个处理，包括空白对照组C、Y1菌剂组Y组、H1菌剂J组、复合菌剂H组。与无菌空白对照组相比，添加菌剂的三种处理中，大豆地下部分根长显著提高。

从表2可知，与添加单一菌株的J、Y菌剂组相比，复合菌剂组H组中大豆的促生效果最显著，根长为9.15cm，相比于J组增加24.83％，相较于Y组增加9.84％。

表2不同菌剂处理后大豆植株地下部分根长比较

对盆栽土壤理化性质的影响

由表3和图7可知，复合菌剂处理H组的盆栽有效磷及碱解氮浓度分别为3.49mg/kg和486.00mg/kg，相较于空白组C组其有效磷含量显著增加66.96％(P＜0.05)，碱解氮增加29.14％，土壤有一定程度的酸化pH由7.13降低至6.73；相较于单一菌剂J组、Y组其有效磷含量分别增加22.03％、32.20％(P＜0.05)，碱解氮分别增加4.59％、10.54％，pH均有一定程度的下降。

表3不同菌剂处理后大豆盆栽土壤理化性质比较

实施例3

探究复合菌剂对大豆根际土壤微生物群落组成的影响。

本发明涉及四组处理组：无菌对照组C组、H1菌剂组J组、Y1菌剂Y组、复合菌剂H组，将收集整理好的四组大豆根际土样送至广州基迪奥有限公司进行测序，通过高通量测序的方法分析盆栽土中微生物多样性，探究盆栽土的微生物群落组成。

微生物门水平分析

由附图8和表4结果分析各处理在细菌门水平上最大丰度排名前5的物种，变形菌门(Proteobacteria，26.96％～61.22％)、放线菌门(Actinobacteria，0.01％～30.39％)、厚壁菌门(Firmicutes，7.20％～60.96％)、拟杆菌门(Bacteroidetes，0.87％～12.92％)、蓝藻菌门(Cyanobacteria，0.67％～12.86％)是主要的优势菌群，在各处理中的相对丰度为88.22％～96.82％。施加复合菌剂H后Proteobacteria相对丰度比空白组C组降低但是高于单一菌剂组J、Y组。同时H组Actinobacteria相对丰度均高于C、J、Y组，Actinobacteria是可以产生抗生素的一类细菌，能促使土壤中的动物和植物遗骸腐烂。同时，Firmicutes相对丰度比J、Y组降低，比C组提高，Firmicutes产生的可逆性孢子，可以抵抗极端环境，Firmicutes包括芽孢杆菌属，丰度显著提升可能与本实验施加高地芽孢杆菌Y1有关。对比J、Y组，H组Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes相对丰度均提高，Firmicutes、Cyanobacteria相对丰度均降低。对比空白组C组，H组Proteobacteria相对丰度降低，Actinobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes相对丰度均提高。

表4门水平上大豆根际土壤主要微生物群落组成比较

微生物属水平分析

如附图9和表5所示，在已知的细菌属水平上最大丰度排名前5的物种，地芽孢杆菌属(Geobacillus，0.00％～61.22％)、马杜拉放线菌属(Actinomadura，0.00％～11.02％)、芽孢杆菌属(Bacillus，2.66％～11.95％)、藤黄色单胞菌属(Luteimonas，0.31％～5.97％)是主要已知的优势菌群，在各处理中的相对丰度为11.91％～52.31％。施加复合菌剂H后Actinomadura相对丰度比空白组C组、单一菌剂组J、Y组均提高。Actinomadura具有抗菌作用，有利于生产抗生素药物。同时H组Bacillus相比于空白组C组提高，相比于菌剂组J、Y组降低。此外，H组Luteimonas均高于C、J、Y组。Luteimonas代谢产物具有抗菌作用，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有抑制作用。对比菌剂组J、Y组，H组Actinomadura、Luteimonas相对丰度均提高，Bacillus、Geobacillu相对丰度均降低。对比空白组C组，H组Actinomadura、Bacillus、Luteimonas相对丰度均提高。

表5属水平上大豆根际土壤主要微生物群落组成比较

实施例4

探究菌株对大豆根部微生物群落组成的影响。

将收集整理好的大豆根际土样送至广州基迪奥有限公司进行测序，通过高通量测序的方法分析大豆植株中微生物多样性，探究大豆根部的微生物群落组成。

微生物科水平分析

本发明涉及两组处理组：无菌对照组c、复合菌剂H组，将收集整理好的两组大豆根际样本送至广州基迪奥有限公司进行检测，通过高通量测序的方法分析根部微生物多样性，探究大都根部的微生物群落组成。由附图10和表6可以看出，经复合菌剂处理的大豆根部微生物种群中，在细菌科水平上最大丰度排名前7的物种，黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、嗜甲基菌科(Methylophilaceae)、德沃斯氏菌科(Devosiaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)。相较于空白组C组，H组在前7种主要菌的相对丰度上均提高。Rhizobiaceae菌种具有固氮作用，复合菌剂组H组Rhizobiaceae相对丰度为18.88％，高于空白无菌对照组5.63％相对丰度。Devosiaceae也是一种固氮细菌，复合菌剂组H组Devosiaceae相对丰度为9.58％，高于空白无菌对照组1.17％相对丰度。伯克氏菌科细菌相对丰度为11.29％，低于空白对照组27.15％相对丰度。Pseudomonadaceae是一种可以促进植物生长的共生菌，复合菌剂组H组Pseudomonadaceae相对丰度为5.16％，高于空白无菌对照组2.29％相对丰度。Sphingomonadaceae是一种可以促进植物抗重金属胁迫酶活性的菌种，同时有利于植物降解多环芳烃、农药。复合菌剂组H组Sphingomonadaceae相对丰度为8.12％，高于空白无菌对照组3.00％相对丰度。Xanthomonadaceae是一种植物病原细菌，一些物种能够激活植物内生菌群的抑病功能，同时一些种具有生产黄原胶的潜力，后者具有使微生物能够吸附到生物表面，保护自身免受干燥和疏水分子的影响，浓缩营养并固定有毒元素的价值。相比于空白无菌对照组4.63％相对丰度，复合菌剂组H组Xanthomonadaceae相对丰度为14.11％。

表6科水平上大豆根部微生物群落组成比较

Claims

1.一种复合菌剂，其特征在于，该复合菌剂中的菌株由保藏号为CCTCC NO：M 20211043的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)Y1与保藏号为CCTCC NO：M 20211042的假单胞菌(Pseudomonas sp.)H1混合组成。

2.权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，由浓度不低于10⁹个/ml的所述的高地芽孢杆菌Y1发酵液与浓度均不低于10⁹CFU/ml的所述的假单胞菌H1发酵液等体积比混合而成；两种发酵液的浓度相同。

3.一种权利要求1所述的复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述的复合菌剂按照以下步骤进行制备：

1)从保存完好的斜面上分别挑取一假单胞菌H1、高地芽孢杆菌Y1的菌体接种在营养琼脂固体培养基上，25℃活化48h；

2)将活化后的假单胞菌H1、高地芽孢杆菌Y1菌株分别用接种环挑取一环菌泥加入到两个LB液体培养基中，25℃，200r/min恒温震荡24h制备种子液；

3)将两种种子液按5％的接种量接种在YMB培养基中进行扩增培养，25℃，200r/min摇床振荡培养2-3d通过稀释或继续发酵至发酵液OD₆₀₀为0.8-1.2，即得两种发酵菌液。

4)将上述单独培养的两种发酵菌液按1∶1混合后用紫外分光光度计测量OD600，通过稀释或继续发酵保证菌液OD600值在0.8～1.2范围内，即得复合菌株发酵液，然后密封储存在4℃冰箱中备用。

5)将步骤4)中复合菌株发酵液用无菌水稀释100倍即得到复合菌剂。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述营养琼脂固体培养基的组成和含量为：蛋白胨10g、牛肉浸粉3g、氯化钠5g、琼脂15g、1000ml去离子水，pH 7.2-7.4。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述LB液体培养基的组成和配比方法为：容器内加入去离子水950ml、胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠5g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L氢氧化钠调节溶液pH至7.4，定容至1L。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述YMB培养基的组成和含量为：甘露醇10g、七水硫酸镁0.2g、氯化钠0.1g、酵母粉3g、磷酸氢二钾0.25g、磷酸二氢钾0.25g、碳酸钙3g、1000ml去离子水，pH 7.2-7.4。

7.权利要求1或2所述的复合菌剂在大豆植株促生和提高益生微生物相对丰度方面的应用。

8.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：将复合菌剂H按每盆6mL的接种量接种到大豆植株根部土壤中进行处理。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：经复合菌剂H处理后，大豆根部益生微生物种群相对丰度提高，根瘤菌科、德沃斯氏菌科这两种固氮菌种群丰度显著增加，大豆根部的根瘤菌科细菌相对丰度为由5.63％增加到18.88％，德沃斯氏菌科细菌相对丰度由1.17提高到9.58％；促进植物生长的共生菌假单胞菌科细菌相对丰度由2.29％提高到5.16％；促进植物抗重金属胁迫酶活性的鞘脂单胞菌科细菌丰度由3.00％增加到8.12％；有利于植物浓缩营养并固定有毒元素的黄单胞菌科细菌丰度由4.63％增加至14.11％。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于：经复合菌剂处理的大豆，由于益生微生物种群丰度增加，对植物根系和地上部分具有促生作用；地上部分生物量平均为2.20g，显著增加60.58％；株高平均为32.87cm，显著增加34.99％；茎粗平均为4.12mm，显著增加72.38％；根际土壤有效磷含量显著增加66.96％(P＜0.05)，碱解氮增加29.14％，pH由7.13降低至6.73。