CN102250787B - 一株能提高桉树净光合速率的有机解磷菌 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株有机解磷菌，有机解磷菌为梭形杆菌属（Lysinibacillussphaericus）菌株YP17，所述菌株YP17的保藏号为CGMCCNo.4770。将所述有机解磷菌接种于桉树，能提高桉树净光合速率。本发明的菌株YP17具有较强的提高桉树光合作用速率的能力，具有高效的解磷能力，能够大幅提高桉树植株的光合作用速率，从而达到促进植株生长的能力。

Description

一株能提高桉树净光合速率的有机解磷菌

技术领域

本发明涉及一株梭形杆菌属菌株及其应用，更具体地涉及了一株能提高桉树净光合速率的有机解磷菌。

背景技术

随着对木材需求量的巨增，森林资源的逐步匮乏，速生桉树的种植量明显上升。最初仅作为观赏树种和科研林木，后来逐渐被引种为绿化树种，现在作为缓解木材和林产品需求紧张的主要树种，桉树被广泛种植。桉树被誉为世界四大速生树种（杨树、松树、桉树、相思）之一^[1~2]，具有重要的经济和生态价值。桉树生长快，耗水耗费量大，种植桉树的林地往往容易导致土壤养分缺乏。就影响桉树生长的养分因素来看，土壤中有效磷含量高低是制约桉树生长的重要因素之一。具统计，我国有74%的耕地土壤明显缺磷，而土壤中95 %以上的磷为无效磷，很难被植物吸收植物利用^[3~5]。而通过人工施加磷肥，施入的磷肥本季节利用效率仅为5%～25%，大部分磷与土壤中的Fe²⁺、Ca²⁺、Al³⁺、Fe³⁺结合形成难溶性的磷酸盐^[6]。这种通过施加磷肥来提高土壤总有效磷的含量，能耗高，成本高，有效转化率低，浪费严重^[7]。利用土壤中自有的微生物的解磷功能，可以在保持土壤原有结构形状的前提下，提高土壤可被植物吸收利用的可溶性磷含量。

土壤微生物包含细菌、真菌和放线菌，繁殖快，分布广泛。能将土壤中具高效解磷作用的菌株筛选出来，研制成解磷菌剂拌种或直接施入土壤，对发展可持续林业就有深远的意义。不仅解磷菌会直接提高土壤中的有效磷含量，而且可以替代有机肥、化肥等发挥同样的功效。曾有意、德、比利时的一份试验报告显示，玉米接种固氮螺菌可取代20 %～30 %氮肥^[8~9]。通过菌株的选择，田间试验的验证，以及新科学技术在分子、基因水平的研究，解磷微生物的价值将得以最大实现。

解磷微生物是土壤微生物的重要组成部分。解磷微生物或解磷菌( phosphatesoluble microorganisms，PSMs)是指土壤中能将难溶性化合态磷转化为植物能够吸收利用的简单的可溶性磷的一类特殊的微生物功能类群，主要包括解磷细菌、解磷真菌和解磷放线菌^[10~11]。三大类解磷微生物解磷的效果存在较大的差异性，真菌数量少于细菌，但有些真菌的解磷能力则明显大于细菌。又有学者根据解磷微生物作用于磷的形态不同，将其分为解无解磷菌和解有机磷菌。认为能够将复杂的有机磷矿化为简单的植物可吸收形态磷的微生物称之为有机磷微生物；能够将植物难以吸收的无机磷酸盐化合物转化为可直接吸收利用形态磷的微生物，称之为无机磷微生物。但是，很多解无机磷微生物也同时具有解有机磷的能力，因此，在实际上却很难将它们分得很清楚，有些菌仅具有单一的解磷能力，有些菌同时具有两种解磷能力，后者是比较理想的筛选对象。

解磷菌的作用对象主要是土壤中的难溶性的磷，利用土壤中自有的这种微生物特有的功能来提高土壤有效磷的含量，比传统方法还有更多的优势：（1）解磷微生物的存在可促进农作物对其它营养元素的吸收。解磷微生物由于新陈代谢，可吸附植物根系周围锌、铜、钙等微量元素，改善植物根系的营养；其次，其分泌的其它调节物，还可在一定程度上影响植物的生长。（2）增强植物的抗病能力。某些解磷微生物接种到植物根际后，适合那里的土壤环境得以迅速的繁殖。其分泌的有些物质能抑制其它病原微生物的生存和生长，具有一定的拮抗病原菌的作用。（3）保护原有土壤性状，减少环境污染和生态破坏。解磷微生物替代传统有机肥料的使用，不仅减少了成本，而且微生物在生产过程中不产生污染物，也避免了土壤有机化的污染。（4）肥效高。筛选出来的解磷微生物可以直接作用于土壤中，也可制成菌肥施入土壤，直接将难溶性性磷转化为可吸收利用的磷，生产过程中利用率高，减少化肥使用过程中的淋失和固化作用。因此，在当今土壤严重缺磷的情况下，筛选出高效的解磷微生物，提高土壤磷的有效利用，降低农林业的生产成本，保护环境和资源，具有较大的时代意义。

发明内容

本发提供了一株有机解磷菌能提高桉树净光合速率。

本发明所述有机解磷菌为梭形杆菌属（Lysinibacillus sphaericus）菌株YP17，所述菌株YP17的保藏号为CGMCC No. 4770。

本发明的梭形杆菌属（Lysinibacillus sphaericus）菌株YP17，已经于2011年4月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No. 4770。

本发明的菌株YP17可应用于接种桉树。

所述接种的具体步骤如下：

⑴将菌种点接入液体培养基，经过48h振荡培养，培养温度为28℃；所述液体培养基配制为：每升液体培养基含有牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，pH 7.2-7.4；

⑵将菌液滴入血球计数板，在光学显微镜下计数，得出菌液浓度；

⑶将菌液用超纯水稀释；

⑷在桉树根际施入菌株浓度为0.5×10⁶cfu/ml -2.0×10⁶cfu/ml的菌液。

本发明的菌株YP17具有较强的提高桉树光合作用速率的能力，具有高效的解磷能力。

本发明的显著优点：本发明的菌株YP17能够大幅提高桉树植株的光合作用速率，从而达到促进植株生长的能力。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：有机解磷菌菌株YP17的获得

一、有机解磷菌菌株YP17的分离筛选过程如下：

（1）野外采集桉树根际土壤。土壤取自福建省永安国有林场，地处永安市城郊，经纬度为E117°23'18"，N25°56'27"。

（2）有机解磷菌分离

①根际土壤悬浊液的制备：在无菌室中，准确称取新鲜土壤样品5 g，放入装有95 ml无菌水的250 ml三角瓶中，置摇床上振荡20 min，使微生物细胞分散，静置20-30 s，即成10^-1稀释液；在按10倍逐步稀释的方法，连续稀释，制成10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9等一系列稀释菌液，用于有关微生物的测定^[12]。

②采用稀释平板涂抹法分离解磷菌时，采用10^-4、10^-5、10^-6稀释度，用移液器各取100ul的稀释菌液于有机磷平板中央，并用接菌环在平板上涂布均匀。每个样品设3个重复。有机解磷细菌 28℃ 培养 3d，观察菌落生长情况，同时计算具有解磷作用的解磷菌的菌株数。分离解有机磷菌采用有机磷培养基。

③用接种环挑取培养基上出现明显溶磷圈或透明圈的菌落，用连续划线的方法划线纯化，有机解磷菌于 28 ℃ 培养 4 d，得到单株具解磷能力的菌株。同时测量解磷菌的菌落直径和透明圈直径，计算透明圈与菌落直径比，初步断定菌落解磷效果。将提纯的解磷菌株接种到斜面培养基上，培养保存置于4℃冰箱备用。

④培养液有效磷含量测定——钼锑抗比色法。

取菌株培养液离心后的上清液200 μl加入50 ml容量瓶中，加水至15-20ml，加1滴2，4-二硝基酚指示剂，用稀碱溶液和稀酸（硫酸）调节pH值至溶液呈微黄色。用移液管加5 ml钼锑抗显色剂，用水定容，摇匀。30 min后，在分光光度计上用700 nm波长比色，以空白试验溶液为参比液，调吸收值到零，然后测定待测液的吸收值，在工作曲线上查出显示液的溶磷量，颜色在8 h内可保持稳定。

⑤有机磷菌解有机磷能力的定量测定。将每升加入0.5g的卵磷脂有机磷培养基在分装于150ml的三角瓶中，每瓶30ml，灭菌后加入1ml已用牛肉膏蛋白胨液体培养基活化48 h的待测菌液，3次重复。置28℃全温振荡培养箱160 r·min^-1培养5d，然后取菌株培养液，10000 rpm离心20 min，上清液采用钼锑抗比色法测定其磷含量，同时用pH计测定培养液的pH值，以加1ml牛肉膏蛋白胨液体培养基做为参比液。离心后的沉淀用溶菌液处理^[13]，37℃水浴1h，然后4℃下离心(10000r/min) 15min，取上清液定容至50ml，用钼蓝比色法测定菌体的含磷量。溶菌液：将5mg溶菌酶加入到1mlTEN溶液中，现配现用。

牛肉膏蛋白胨培养基^[14]：牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，琼脂18.0 g/L，pH 7.2-7.4。

有机磷培养基：葡萄糖(C₆H₁₂O₆ ·H₂O)10.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，MgSO₄ ·7H₂O 0.3g/L，NaCl 0.3g/L，KCl 0.3g/L，FeSO₄ ·7H₂O 0.03g/L，MnSO₄ ·7H₂O 0.03g/L，CaCO₃ 5.0g/L，卵磷脂2.0g/L，琼脂18g/L，PH 7.2-7.5。

（5）结果分析

①有机磷菌平板试验

有机磷平板上筛选出30株具有明显透明圈的有机解磷菌。菌株YP17，透明圈与菌落直径的比为2.300cm，从平板试验分析具有较强的解磷能力。

②有机磷菌菌体吸收磷含量

解磷菌在分解液体中难溶性有机磷时部分有效磷会被菌体吸收利用，储存在菌体内，为了更准确的判定菌体是否具有解磷能力，被菌体吸收的磷含量不能忽略。不同菌株吸收利用磷的含量差异很大。菌株YP17，为1.095μg/ml，从菌体本身的磷含量分析可知，菌种YP17具有较强的吸收磷的能力。

③有机磷菌溶解的有效磷含量

测定发现，有机解磷菌菌株YP17溶解的有效磷含量为19.370μg/ml，而对照仅5.340μg/ml，有机解磷菌菌株YP17的解磷能力是对照的3.63倍。菌株YP17具有较强的解磷能力。

④有机磷菌培养液pH值

进一步测定有机解磷菌菌株YP17的培养液pH值为8.07，对照为8.18。菌株P17的培养液pH值比对照下降了0.11。结果表明，溶磷量与pH值存在相关关系，这与陈阳等^[15]研究结果相一致，表明菌株P17具有较强的溶磷能力。

二、菌株YP17鉴定

有机解磷菌菌株YP17的光学显微镜鉴定：将菌种制成载玻片，在显微镜下观察并参考《伯杰细菌鉴定》进行初步鉴定。

[1]供试菌株：YP17。

[2]梭形杆菌属（Lysinibacillus）：为严格的专性厌氧菌，革兰氏染色阴性，菌体呈梭状，两端尖细，大小为（5~10）μm，常见到游离者为椭圆体，有时菌体中有革兰阳性颗粒存在。无芽胞，无鞭毛。经48小时培养后，菌落直径1～2mm，不规则圆形，略凸起，灰色，发光，透明。生化反应不活泼，菌株多数不发酵任何糖类，少数对葡萄糖、果糖可出现弱发酵反应。吲哚和DNA酶试验阳性，触酶阳性，不还原硝酸盐，在20%胆汁中不生长，脂酶试验阴性，主要代谢产物是丁酸。

有机解磷菌菌株分子分类鉴定：

⑴供试菌株

YP17。

⑵培养基

将菌种点接入液体培养基，经过48h振荡培养，培养温度为28℃。所述液体培养基配制为：牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，pH 7.2-7.4。

⑶引物

利用细菌16S rDNA特异引物F27和R1492进行PCR扩增^[16]，该引物可以扩增供试菌株几乎全部的16S rDNA序列，引物序列如下：

Primer l(F27)：5ˊ-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3ˊ

Primer2(R1492)：5ˊ-TAG GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3ˊ；

试验方法

①细菌总DNA的提取

将供试菌株分别用牛肉膏蛋白胨液体培养基进行活化，大约24-48 h。采用离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒（购自上海生工生物工程有限公司）提取总DNA，步骤如下：

a. 取1.5 m1菌体培养液于一灭菌EP管中，10 000 rpm离心1 min，去上清液，收集菌体。

b. 向菌体沉淀中加入200 μl 缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。

c. 向管中加入20 μl 蛋白酶K溶液，混匀。

d. 加入220 μl缓冲液GB，振荡15 s，70℃放置10 min，溶液变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

e. 加入220 μl无水乙醇，充分振荡混匀15 s，简短离心以管盖内壁的水珠。

f. 将上一步所得都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000 rpm离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

g. 向吸附柱CB3中加入500μl 缓冲液GD，12000 rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

h. 向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW，12000 rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

i.向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000 rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

j. 将吸附柱CB3放入收集管中，12000 rpm离心2 min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数8 min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

k. 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴100 μl洗脱缓冲液TE，室温放置5 min，12000 rpm离心2 min，将溶液收集到离心管中，－20℃保存备用。

② PCR扩增

（1） PCR反应体系为                25 μl

10×PCR Buffer                      2.5 μl

dNTP(浓度2.5 mmol/L)              2.5 μl

Mg^2＋                                 3.25 μl

引物1 (50 μmol)                           1.0 μl

引物2 (50 μmol)                           1.0 μl

模板DNA                           2.0 μl

Tag酶(1 U/μl)                         1.0 μl

补ddH₂O 至总体积                       25.0 μ1

（2） PCR反应条件

            95℃变性                  5 min

            95℃变性                  1 min

            56.0℃复性                50 s                                                   

 33个循环

            72℃延伸                  1 min

            72℃延伸                  10 min。

（3） PCR产物检测

PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳（含核酸染料0.5 μl/ml），电解液为0.5×TAE，以Marker指示谱带的大小及相对位置，然后在紫外凝胶成像系统中观察并拍照记录。

DNA 序列测定：

③凝胶成像系统下出现亮带的PCR扩增产物经纯化后直接测序，测序由上海生化生物工程有限公司完成。

④16S rDNA序列分析

将菌株的16S rDNA序列（如SEQ ID NO.1所示）在美国国立生物信息中心NCBI网页上进行BLAST比对，找到与Genebank中同源性最高的相关序列，相似菌株为Lysinibacillus sphaericus（登录号为FJ738150），相似性为99%，为此初步确定菌株YP17为梭形杆菌属（Lysinibacillus）。

实施例2：菌株YP17对桉树苗木生长的影响

供试土壤为黑色泥炭土（来自福州建新花卉市场），pH值为7.23，有效磷5 mg·kg^-1。有机肥购置福州建新花卉市场，供试桉树苗来自福建林业科学研究学院，巨桉5号无性系。设空白、施P对照(KH₂PO₄)、有机肥（氮4％、磷3％、钾4%、有机质30%、水分25%、腐殖酸10%）及单菌YP17等处理。菌株YP17接种于桉树的接种量为每盆50 ml培养液/(1×10⁶CFU·ml^-1) ，三天时间重复3次，用蒸馏水处理作为空白对照。施P肥为每盆KH₂PO₄ 5g，装土5 kg，3次重复。有机肥为每盆20 g，装土5 kg，3次重复。本试验于2010年4月25日前往苗圃接种，桉树生长132d后收获，测定植株株高、茎粗、鲜质量、干重量。105℃下杀青30 min，75℃烘干至恒重，植株样品粉碎后用H₂SO₄-H₂O₂消煮，钼锑抗比色法测定磷含量。

将菌株YP17接种于桉树，具体步骤如下：

⑴将菌种点接入液体培养基，经过48h振荡培养，培养温度为28℃。所述液体培养基配制为：牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L，pH 7.2-7.4。

⑵将菌液滴入血球计数板，在光学显微镜下计数，得出菌液浓度。

⑶将菌液用超纯水稀释成1.0×10⁶cfu/ml。

⑷在桉树根际施入菌株浓度为1.0×10⁶cfu/ml的菌液50ml，三天时间重复3次，用蒸馏水处理作为空白对照。

采用GFS-3000光合仪，设定光强800μmol·m^-2·s^-1，温度25℃，湿度70%，同时控制气温(Ta)、相对湿度(RH)和CO₂浓度(Ca)与测定时外界环境一致。从顶端开始，选择植物第5-6片成熟叶片，测定不同处理下桉树净光合速率^[17~18]。

1、菌种处理桉树植株净光合速率

对照处理植株净光合速率为5.286 CO₂μmol·m^-2 ·s^-1，接种菌株YP17处理植株净光合速率为11.813 CO₂μmol·m^-2 ·s^-1，比对照增加了123.48％。施磷肥和有机肥处理植株净光合速率分别为9.960 CO₂μmol·m^-2 ·s^-1和8.711m CO₂μmol·m^-2 ·s^-1，均较接种菌株YP17处理更低，表明菌株YP17具有较强的提高植株光合速率的能力。

在30株筛选得到的具有明显透明圈的有机解磷菌中，菌株YP17提高桉树植株净光合速率的能力高于其它菌株。

2、菌种处理对桉树植株鲜重、干重的影响

对照处理单株平均鲜重为51.500g，单株平均干重为15.400g。菌株YP17处理单株平均鲜重为89.733g，单株平均干重为31.367g，分别比对照增加了74.24％和103.68％。施磷肥和有机肥处理单株平均鲜重分别为68.433g和74.500g、干重分别为18.700g和23.533g，均较接种有机解磷菌YP17生物量更小，表明菌株YP17具有较强的促进植株干物质积累的能力。

3、菌种处理对桉树植株树高、地径的影响

对照处理苗木平均树高为80.767 cm，地径为0.571 cm。菌株YP17处理平均树高为100.533 cm，地径为0.880 cm，分别比对照增加了24.47％和54.12％。施磷肥和有机肥处理植株平均树高分别为86.00cm和88.933cm、平均地径分别为0.675cm和0.815cm，也均较接种有机解磷菌YP17生长量更小，表明菌株YP17具有较强的促进植株生长的能力。

4、菌种处理对桉树植株体内磷含量影响

对照处理植株磷含量为1.018 g/kg，菌株YP17处理磷含量为2.585 g/kg，比对照增加了153.93％。施磷肥和有机肥处理植株磷含量分别为1.5343 g/kg和1.4187 g/kg，均较接种菌株YP17处理更低，表明菌株YP17具有较强的促进植株对磷的吸收的能力。

综合以上各项指标考虑，菌株YP17对桉树光合速率提高具有较强的促进作用，具有高效解磷能力。

本发明大幅提高了桉树植株的光合速率，促进了桉树对有机磷的吸收率，提高了植株干物质的积累。

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<110> 福建农林大学

<120> 一株能提高桉树净光合速率的有机解磷菌

<160> 1

<210> 1

<211> 1457

<212> DNA

<213> 梭形杆菌属（Lysinibacillus sphaericus）菌株YP17

<400> 1

gacttggcgg cagctataca tgcaagtcga gcgaacagat taggagcttg ctcctttgac 60

gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gcaacctacc ttatagtttg ggataactcc 120

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Claims (3)

1.一株有机解磷菌，其特征在于：所述有机解磷菌为梭形杆菌属（Lysinibacillus sphaericus）菌株YP17，保藏号为CGMCC No.4770。

2.一种如权利要求1所述的有机解磷菌的用途，其特征在于：将所述有机解磷菌接种于桉树。

3.根据权利要求2所述的有机解磷菌的用途，其特征在于：所述接种的具体步骤如下：

⑴将菌种点接入液体培养基，经过48h振荡培养，培养温度为28℃；所述液体培养基配制为：牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，氯化钠10.0 g/L， pH 7.2-7.4；

⑵将菌液滴入血球计数板，在光学显微镜下计数，得出菌液浓度；

⑶将菌液用超纯水稀释；

⑷在桉树根际施入菌株浓度为0.5×10⁶cfu/ml -2.0×10⁶cfu/ml的菌液。