CN113444672B - 一株布氏乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株布氏乳杆菌及其应用。一株布氏乳杆菌jlau 2020‑5，它的保藏编号为CGMCC No.22580，该菌株对盐碱适应能力强，可在盐碱土壤中生长，使碱性土壤得到明显改善，降低土壤pH值和盐浓度，提高土壤有机质及碱解氮、速效磷、速效钾的含量，使植物产量增加，并且与常规化肥相比，用量少，效果好。

Description

一株布氏乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株布氏乳杆菌及其应用。
背景技术
中国是盐碱地大国，主要分布在西北、东北、华北及滨海地区在内的17个省区，盐碱荒地和影响耕地的盐碱地总面积超过5亿亩，其中具有农业发展潜力的占中国耕地总面积10%以上。盐碱地的主要特征是含有较多的水溶性盐或碱性物质，土壤多以胶体为主，由于盐分多、碱性大，使土壤腐殖质遭到流失，有益菌含量极其低下，土壤结构遭到破坏，表现为湿时黏，干时硬，地表常有白色盐分积淀，通气、透水不良，严重的会造成植物萎蔫、中毒和烂根死亡。
传统改良盐碱地的方法有化学改良、物理改良、水利工程改良，但存在着一定的局限性，例如化学改良向土壤中加入改良剂，例如：石膏、磷石膏、脱硫石膏、硫磺、腐殖酸、糠醛渣等物质以达到降低土壤PH值、碱化度及改善土壤结构的目的。缺点是化学来源有限，化学物质用量过大，会导致新的化学成分残留在土壤中。物理改良通过平整土地、客土、压沙、松土、抬田等措施，破坏土壤毛细作用，阻断盐分向地表的进一步聚集。缺点是工程量大，费用高。水利工程改良是根据“水盐运动”规律，通过多次大量大水漫灌使植物根系生长层中的盐分经过土壤淋洗下沉至深层土壤中，同时，结合沟渠、深井排水，达到防止返盐的目的，缺点是工程量大，费用高，造成二次污染。微生物改良是以施加耐盐碱的微生物肥料的方式改良土壤的方法，作为新兴发展起来的盐碱地改良方法，不但改良盐碱地的方法简便，还兼具提高土壤肥力、促使化肥高效利用的作用。该方法需要从种类繁杂的微生物中筛选耐盐碱的菌株，并对其进行相应的驯化。
目前，国内已报到的能够起到改良盐碱地作用的耐盐碱菌株有：地衣芽孢杆菌（CN111480411A，一种贫瘠盐碱地生物脱盐改良方法）、盐居固氮菌(CN 112481169A，一种耐盐碱泌铵型自生固氮菌株及其应用)、解淀粉芽孢杆菌( CN106434481A，耐盐菌的分离纯化方法及分离得到的耐盐碱菌株及其应用)等，未发现布氏乳杆菌在盐碱地改良中的应用报道。
布氏乳杆菌是Lactobacillus属的微生物。革兰氏阳性细菌，兼性厌氧杆菌，最适宜生长温度为15℃-40℃。主要应用于食品领域泡菜的制造、畜牧业青贮饲料的发酵等。未见其在盐碱地改良中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一株布氏乳杆菌及其应用，用于解决现有技术中的问题。
一株布氏乳杆菌jlau 2020-5，它的分类命名为：Lactobacillus buchnen；其保藏编号为CGMCC No. 22580；
一种液体菌剂，包括如权利要求1所述的布氏乳杆菌jlau 2020-5，所述的布氏乳杆菌jlau 2020-5的浓度至少为2.0×108CFU/mL；
所述的一种液体菌剂，它是由以下方法制备的：
1）种子液的制备：将活化后的布氏乳杆菌jlau 2020-5接种至种子培养基中培养；接种量为1%，培养温度为30℃，转速为200rpm/min，培养12h；
2) 发酵培养：将培养好的种子液按照10%v/v比例接种到发酵罐，装液量70%，发酵温度37℃，搅拌速度200rpm/min，发酵时间36h，得布氏乳杆菌jlau 2020-5发酵液；
3）菌剂制备：将2）所得发酵液用无菌水按1:5比例稀释后，无菌灌装，制备成液体菌剂；
所述的种子培养基组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，吐温80 1 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，硫酸锰0.05 g/L,121℃，灭菌20min，灭菌后用碳酸钠将pH调至7.5；
所述的发酵培养基的组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，红糖10g/L，乙酸钠5 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，吐温80 1 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，121℃，灭菌20min，灭菌后用碳酸钠将pH调至7；
如权利要求2所述的液体菌剂在盐碱地植株栽培中的应用；
所述的液体菌剂施用量100kg~150kg /公顷，按1:150~1:200稀释后，贴地喷施。
本发明提供了一株布氏乳杆菌及其应用。一株布氏乳杆菌jlau 2020-5，它的分类命名为：Lactobacillus buchnen；保藏编号为CGMCC No. 22580，该菌株对盐碱适应能力强，可在盐碱土壤中生长，使碱性土壤得到明显改善，降低土壤pH值，提高氮、速效磷、速效钾的含量，使植物产量增加，并且与常规化肥相比，用量少，效果好。
具体实施方式
实施例1 菌株的分离纯化及筛选
采集不同区域来源的盐碱地玉米秸秆，（一般为秋季上霜后采集，采集地区为：吉林省松原市、大安市）切成1-2cm的小块。在无菌条件下，取5g样品加入装有45ml无菌水的锥形瓶中，于37℃下200r/min恒温振荡30min，使供试样品中的微生物充分分散于无菌水中，即为稀释10-1的样品悬液，选择浓度梯度为10-2、10-3、10-4、10-5的样品悬液，在高盐MRS培养基平板上涂布，用于初筛分离，将平板倒置放入37℃恒温培养箱中培养48h-72h，观察并记录菌落特征，挑取具有乳酸菌特性，且革兰氏染色为阳性、过氧化氢酶试验为阴性的菌落，连续划线培养纯化，直至出现单个纯菌落，纯化后的菌株接种到MRS斜面培养基后，4℃冰箱中保存备用。
将初筛菌株在pH=8、pH=8.5 、pH=9的LB培养基中各培养18小时，pH=8、pH=8.5均有活菌出现，pH=9时无菌株继续生长，选取从pH=8.5中复筛出的一株菌株，菌株命名为jlau2020-5，选取存活的菌株，取样，用pH计测定培养基pH值，并测定其降碱率，降碱率可达19.5%。
所述的高盐MRS培养基为：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，氯化钠10 g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖5 g/L，乙酸钠5 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，吐温80 1 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，碳酸钙20 g/L，琼脂15 g/L，21℃灭菌20min。
所述MRS培养基为：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖5 g/L，乙酸钠5 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，吐温80 1 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，碳酸钙20 g/L，琼脂15 g/L， 121℃灭菌20min。
所述的LB培养基为：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠10g/L、灭菌后用碳酸钠将pH调制所需要的值。
实施例2菌株的鉴定
1、形态鉴定
经形态鉴定及染色观察，该菌株在MRS平板上的菌落为白色，边缘整齐，表面光滑，无褶皱，革兰氏染色为阳性，杆状菌，不产芽孢。
2、生理生化鉴定
通过生理生化实验，结果如表1所示。根据《常用细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》初步鉴定菌株为乳酸杆菌。
Figure 199200DEST_PATH_IMAGE001
3、分子生物学鉴定
将jlau 2020-5菌株按照DNA提取试剂盒中步骤对菌株的基因组DNA进行提取，选择乳杆菌通用引物：27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)；
1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)为模板对菌株的16SrRNA进行扩增。
用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，扩增成功后的产物委托上海生工有限公司进行测序分析，菌株的基因有效序列长度为1480bp，见基因序列表SEQ ID NO.1，利用NCBI数据库将所得菌株的16SrRNA序列提交至GenBank数据库中，与已知序列的菌株进行BLAST分析对比，发现该菌株与布氏乳杆菌序列同源性为99.05%，结合形态特征最终鉴定为布氏乳杆菌。将以上获得的布氏乳杆菌jlau 2020-5，于2021年05月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，它的分类命名为：Lactobacillus buchnen；保藏号为：CGMCC No. 22580
4、菌株溶磷能力检测
用经火焰灼烧的接种环冷却后，将菌株点接在显色MRS固体培养基，培养基调整pH为8.0，30℃下培养3d，可见菌株周围出现溶磷圈（原培养基为蓝色，溶磷圈为米黄色）的菌落，证明该菌株具有溶磷的能力。
实施例3一种液体菌剂的制备
1）种子液的制备：将活化后的布氏乳杆菌jlau 2020-5接种至种子培养基中培养；接种量为1%，培养温度为30℃，转速为200rpm/min，培养12小时。
所述的种子培养基组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，吐温80 1 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，硫酸锰0.05 g/L,121℃，灭菌20min，灭菌后用碳酸钠将pH调至7.5；
2) 发酵培养：将培养好的种子液按照10%v/v比例接种到发酵罐，装液量70%，发酵温度37℃，搅拌速度200rpm/min，发酵时间36h，获得布氏乳杆菌jlau 2020-5发酵液，活菌数达1.0×109CFU/mL以上。
所述的发酵培养基的组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，红糖10g/L，乙酸钠5 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，吐温80 1 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，121℃，灭菌20min，灭菌后用碳酸钠将pH调至7；
3）菌剂制备
将2）所得发酵液用无菌水按1:5比例稀释后，无菌灌装，制备成液体菌剂。
实施例4布氏乳杆菌jlau 2020-5菌剂在盐碱地水稻区中的应用试验
大田实验在大安市区40公里处开展，选择2块水稻试验田，分为试验组和对照组，每块试验田面积为1公顷，所用水稻品种为吉宏6号。
试验组：在施用灭草剂过时效期后、插秧前3-5天施加实施例3所制备的液体菌剂，施用量150kg/公顷，按1:150稀释后，贴地喷施。
对照组：在施用灭草剂过时效期后、插秧前3-5天施加水稻复合肥，施用量400kg/公顷。
施加菌剂前采集耕作层0-20cm土样测定并测定土壤基础数据，作为空白；等植株成熟，收割测产并采集土样，进行土壤理化指标的测定。结果如表2、3所示，试验组施加布氏乳杆菌jlau 2020-5菌剂后，碱性土壤得到明显改善，且氮、磷、钾等含量的增加，也比用普通基肥效果要好。
Figure 709816DEST_PATH_IMAGE002
Figure 597875DEST_PATH_IMAGE003
实施例5 布氏乳杆菌jlau 2020-5菌液对水稻各时期工艺性状指标的影响
大田实验在大安市区40公里处开展，选择3块水稻试验田，分为空白对照组、试验组和对照组，每块试验田面积为1公顷。
试验组：在施用灭草剂过时效期后、插秧前3-5天施加实施例3所制备的液体菌剂，施用量150kg/公顷，按1:150稀释后，贴地喷施。
对照组：在施用灭草剂过时效期后、插秧前3-5天施加水稻复合肥，施用量400kg/公顷。
空白组：除草和种植方式与上述相同，但不添加任何肥料和菌剂。
水稻农艺性状分蘖期测定分蘖数、SPAD值、株高、根长和叶面积；抽穗期测定SPAD值、株高、根长、叶面积和穗长；成熟期测定SPAD值、株高、根长、叶面积和穗长。SPAD值测定，每个处理随机选择5穴，每穴取主茎顶1叶至4叶的平均值代表该植株的SPAD值，5穴主茎叶片平均值代表该小区处理的SPAD值。分蘖数以平均分蘖数为准，每个处理取5丛植株连根拔起，尽量避免根的破坏，用自来水清洗，测定分蘖数。钢卷尺测量株高、根长和穗长。长宽矫正法测定水稻叶面积，在直立植株上随机选取主茎冠层叶片，测定水稻叶片长度和最宽处叶片宽度计算叶面积，计算公式为：叶面积（cm2）=长度x宽度x0.75，校正系数0.75是参照通用水稻校正系数确定的。
水稻产量测定方法
成熟期后每个处理随机选取20丛植株测定有效穗数，计算平均有效穗数，同时选择其中10丛植株计算产量、含水量和千粒重，实际产量按照实际测产结果为准。
水稻品质测定方法
成熟期后每个处理随机选取20丛植株测定水稻品质，测定指标及方法如下：水分，采用GB5009.3-2016第一法进行测定；能量，采用GB/Z21922-2008中的方法进行测定；蛋白质，采用GB5009.5-2016第一法进行测定；脂肪，采用GB5009.6-2016第二法进行测定；碳水化合物，采用GB/Z21922-2008中的方法进行测定。
Figure 71713DEST_PATH_IMAGE004
Figure 213981DEST_PATH_IMAGE005
从表4、5中可看出施加布氏乳杆菌jlau 2020-5菌剂后水稻植株的株高、根长、叶面积的都要比普通化肥对照组要好很多。
Figure 616537DEST_PATH_IMAGE006
从表6可知，成熟期SPAD值开始下降，叶绿体含量降低，施加菌剂的水稻株高比空白高7.4%，穗长增加16.6%。
施加菌剂的水稻产量明显高于施用复合肥的水稻，且水稻的品质也有所提升，见表7、8。
Figure 696620DEST_PATH_IMAGE007
Figure 223416DEST_PATH_IMAGE008
实施例6 布氏乳杆菌jlau 2020-5菌剂在盐碱地玉米区中的应用试验
大田实验在大安市海坨乡于亮村，选择2块玉米试验田，分为试验组和对照组，每块试验田面积为1公顷，所用玉米品种为迪卡159。种植密度为6.0万株/hm2，每个小区行长8m，6垄，小区面积31.2m2。
试验组：坐水播种时施入液体菌剂，施用量100kg-150kg/hm2，按1:200稀释后施到垄底。
对照组：坐水播种时施入复合肥400 kg/hm2，大喇叭口期追尿素50 kg/hm2。
施加菌剂前采集耕作层0-20cm土样测定并测定土壤基础数据，作为空白；等植株成熟，收割测产并采集土样，进行土壤理化指标的测定。结果如表9、10所示，试验组施加布氏乳杆菌jlau 2020-5菌剂后，碱性土壤得到明显改善，且氮、磷、钾等含量的增加，也比用普通复合肥效果要好、用量少。
Figure 203879DEST_PATH_IMAGE009
Figure 525139DEST_PATH_IMAGE010
对上述方法种植的玉米产量进行测定，对照组与试验组各选择3点，每个样点面积为10cm2，测产点全部人工收获。采用PM8188型号谷物水分速测仪测定含水率，按14%标准水折算出实际亩产量，取3次平均值。布氏乳杆菌jlau 2020-5菌剂处理下玉米产量为564.7公斤/亩，对照组玉米产量为547.3公斤/亩，玉米增产3.18%。
序列表
<110> 华翔(吉林)生物科技有限公司
<120> 一株布氏乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1480
<212> DNA
<213> 布氏乳杆菌(Lactobacillus buchnen )
<400> 1
acgtccccga aggttacctc accggctttg ggtgttacaa accctcatgg tgtgacgggc 60
ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgtggcatgc tgatccacga ttactagcga 120
ttccaacttc atgtaggcga gttgcagcct acaatccgaa ctgagaacgg ctttaagaga 180
ttagcttgac ctcgcggttt cgcgactcgt tgtaccgtcc attgtagcac gtgtgtagcc 240
caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg 300
cagtcttgct agagtgccca actgaatgct ggcaactaac aataagggtt gcgctcgttg 360
cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc acctgtcatt 420
ctgtccccga agggagagcc taatctctta ggttggcaga agatgtcaag acctggtaag 480
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ttcctttgag tttcaacctt gccgtcgtac tccccaggcg gagtgcttaa tgcgttagct 600
gcagcactga agggcggaaa ccctccaaca cttagcactc atcgtttacg gcatggacta 660
ccagggtatc taatcctgtt cgctacccat gctttcgagc ctcagcgtca gttacagacc 720
agacagccgc agtcgccact ggtgttcttc catatatcta cgcatttcac cgctacacat 780
ggagttccac tgtcctcttc tgttctcaag tctcccggtt tccgatgcac ttctccggtt 840
aagccgaagg ctttcacatc agacctaaaa aaacgcctgc gctcgcttta cgcccaataa 900
atccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag ttagccgtgg 960
ctttctggtt ggataccgtc aagatgtcaa cagttactct tgcacctgtt cttctccaac 1020
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cgtccattgt ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtttgggcc gtgtctcagt 1140
cccaatgtgg ccgattaccc tctcaggtcg gctacgtatc atcgccttgg taagccgtta 1200
ccttaccaac aagctaatac gccgcgggtc catcctaaag tgacagccga agccgtcttt 1260
taaaccaaaa ccaggtggtt ttggttgtta tacggtatta gcacctgttt ccaagtgtta 1320
tcccctactt caagggcagg ttacccacgt gttactcacc agttcgccac tcgtctcaat 1380
gttaaatctt tcaagtgcaa gcacctaaaa tcattaacgg agacgcgttc gacttgcatg 1440
tattaggcag ccgccagcgt tcgtcctgag ccaggattaa 1480

Claims (7)

1. 一株布氏乳杆菌Lactobacillus buchnen jlau 2020-5，它的保藏编号为CGMCCNo. 22580。
2.一种液体菌剂，其特征在于：所述的液体菌剂包括如权利要求1所述的布氏乳杆菌jlau 2020-5，所述的布氏乳杆菌jlau 2020-5的浓度至少为2.0×108CFU/mL。
3.根据权利要求2所述的一种液体菌剂，其特征在于，它是由以下方法制备的：
1）种子液的制备：将活化后的布氏乳杆菌jlau 2020-5接种至种子培养基中培养；接种量为1%，培养温度为30℃，转速为200rpm/min，培养12h；
2) 发酵培养：将培养好的种子液按照10%v/v比例接种到发酵罐内的发酵培养基中，装液量70%，发酵温度37℃，搅拌速度200rpm/min，发酵时间36h，得布氏乳杆菌jlau 2020-5发酵液；
3）菌剂制备：将2）所得发酵液用无菌水按1:5比例稀释后，无菌灌装，制备成液体菌剂。
4.根据权利要求3所述的一种液体菌剂，其特征在于，所述的种子培养基组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖5 g/L，乙酸钠5 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，吐温80 1 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，硫酸锰0.05 g/L, 121℃，灭菌20min，灭菌后用碳酸钠将pH调至7.5。
5.根据权利要求3所述的一种液体菌剂，其特征在于，所述的发酵培养基的组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，红糖10g/L，乙酸钠5 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，吐温80 1 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，121℃，灭菌20min，灭菌后用碳酸钠将pH调至7。
6.如权利要求2所述的一种液体菌剂在盐碱地水稻和玉米栽培中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的液体菌剂施用量100kg~150kg /公顷，按1:150~1:200稀释后，贴地喷施。
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