NO790100L - Anvendelse av xanthomonas-polysakkarider for fremstilling av vandige geler med forbedret filtrerbarhet - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av polysakkarider fremstilt ved gjæring av sakkarider ved hjelp av en mikro-orga-nisme av slekten Xanthomonas, for ved tilsetning av vann og fremstille geler med god filtrerbarhet.

Man vet at for fremstilling av ekstracellulære polysakkarider ved hjelp av mikro-organismer av slekten Xanthomonas at gjæringsmiljøet vanligvis må omfatte en kilde for sakkarider, en kilde for fosfor, en kilde for magnesium som er en enzymaktiyator og en kilde for nitrogen som vanligvis utgjøres av såkalte "gjæringsekstrakter"

(US patentskrift 3.000.790), videre kli eller mel av hele korn som f.eks. sorghum, soya eller mais (US patentskrift 3.271.267) eller såkalt "kornstøpevæske" (US patentskrift 3.355.447).

De produkter som tilfører assimilerbart nitrogen frembyr imidlertid den ulempe at de innfører uoppløselige forurensninger som gjenfinnes i det polysakkarid som ekstraheres fra gjæringsmosten. Disse forurensninger, som blant annet meddeler en viss farge til de rekonstituerte vandige geler fra ekstraksjonsproduktet, er et brysomt forhold, på grunn av at gelen ikke er anvendelig for visse formål som f.eks. utvinning av olje. Nærværet av lite oppløselige forurensninger nedsetter filtrerbarheten av gelene oppnådd ved å gå

ut fra disse polysakkarider og gjør deres inntrengning i fjell-

sprekkene vanskelig.

Man har foreslått forskjellig teknikk for å rense bestående f.eks. i å underkaste gjæringsmosten, eller bedre den rekonstituerte vandige gel fra polysakkarider ekstrahert fra mosten for filtrer-ingsoperasjoner gjennom diatoméjord, innvirkning av enzymer av typen protease eller NaOH, men disse rensemetoder har vist seg dyre og dertil lite tilfredsstillende.

Man har videre foreslått for fremstilling av polysakkarider ved hjelp av Xanthomonas-bakterier å anvende et gjæringsmiljø som inneholder en fullstendig oppløselig uorganisk nitrogenkilde, men heller ikke her var resultatene tilfredsstillende. Man har faktisk kon-statert at når gjæringen foregår i et miljø som ikke er fullstendig sterilt, som i vanlige tilfeller med industrielle operasjoner i middels eller stor målestokk, at anvendelse av en næring hoved-sakelig på basis av uorganisk nitrogen begunstiger utvikling av forurensninger til skade for selve Xanthomonas-bakteriene, og likeledes medfører forurensningen et merkbart fall i innholdet av polysakkarid i gjæringsblandingen.

Det er i samsvar med den foreliggende oppfinnelse funnet at det er mulig å oppnå geler av polysakkarider med vesentlig forbedrede fil-treringsegenskaper på betingelse av at man anvender polysakkarider av Xanthomonas spesielt tilpasset som produkter fra gjæringen i nærvær av et nitrogenholdig organisk næringsmiddel hvor mengden er bestemt innen et nøyaktig område.

Oppfinnelsen vedrører således anvendelse av polysakkarider som oppnådd ved å anvende en fremgangsmåte som går ut på følgende trinn:

a) fremstilling av et kimprodukt fra en Xanthomonas-kultur,

b) eventuelt etterfulgt av et mellomliggende trinn med vekst av mikro-organismene, og c) fremstilling av polysakkarid ved inokulering, ved hjelp av kulturen fra trinn a) eller i tilfellet med trinn b) av et miljø omfattende et sakkarid og en passende nitrogenkilde og gjæring av dette miljø,

idet nitrogenkilden omfatter i det minste et nitrogenholdig produkt av organisk opprinnelse, idet mengden av det nevnte organiske nitrogenprodukt, uttrykt i gram elementært nitrogen pr. liter gjæringsblanding, utgjør mellom 0,01 og 0,3 g/l.

Som organisk nitrogenkilde kan man anvende produkter som vanligvis anvendes innenfor denne teknikk, for gjennomføring av lignende gjær-inger, og man kan her nevne peptoner, gelatin, kasein, kjøtt-ekstrakt og gjærekstrakt.

De mengder som foretrekkes av det organiske nitrogenholdige produkt, uttrykt som gram elementært nitrogen pr. liter gjæringsblanding, utgjør mellom 0,02 og 0,2 g/l.

Man har fastslått at det kan være fordelaktig for gjennomføring

av fremstillingstrinnet c) blant .annet til gjæringsblandingen å tilsette et nitrogenholdig næringsstoff av uorganisk opprinnelse. Denne foranstaltning tillater merkbar økning av gjæringstakten.

Som uorganisk nitrogenkilde som passer ved utøvelse av oppfinnelsen kan man f.eks. nevne ammoniumsalter som ammoniumklorid, ammonium-nitrat, mono- eller diammoniumkarbonater, samt mono- eller di-ammoniumsulfater, mono- eller diammoniumfosfater, nitrater som natriumnitrat og kaliumnitrat.

Nitrogenproduktet av uorganisk opprinnelse, når man velger å anvende dette, innføres i gjæringsblandingen i variable mengder som bestemmes ut fra den totale mengde av nitrogenholdig organisk produkt og nitrogenholdig uorganisk produkt, uttrykt i gram elementært nitrogen pr. liter gjæringsblanding, slik at denne er høyest 0,5 g/l.

Gjæringen av sakkaridet i fremstillingstrinnet for polysakkaridet gjennomføres i vandig miljø inneholdende opptil 60 g/l av det nevnte sakkarid.

De foretrukne mengder av sakkarid er mellom 10 og 40 g/l. De sakkarider som kan anvendes omfatter blant annet glukose, rør-sukker, cerelose, fruktose, maltose, laktose, stivelse fra hvete eller mais og hydrolysater derav.

Gjæringsblandingen i fremstillingstrinnet for polysakkaridet kan videre inneholde magnesiumioner. Den mengde som anvendes, uttrykt i gram elementært magnesium pr. liter gjæringsblanding, utgjør f.eks. mellom 0,001 og 0,05 g/l og som kilder for magnesiumioner kan nevnes magnesiumsulfat-heptahydrat, magnesiumacetat, magnesium-klorid.

En annen bestanddel som er nyttig for gjennomføring av gjæringen består i en kilde for fosfor og den mengde som anvendes, uttrykt i gram fosfor pr. liter gjæringsblanding, kan f.eks. utgjøre mellom 0,01 og 1,5 g/l. Fordelaktig kan fosforet innføres i form av di-natriumfosfat eller dikaliumfosfat som samtidig, hvis de anvendes i overskudd i forhold til de tidligere nevnte mengder, kan utgjøre en buffersubstans egnet for regulering av pH. I dette henseende foregår gjæringen som man vet når pH holdes i området 6 til 7,5, foretrukket mellom 6,5 og 7,2. Hvis blandingen ikke er bufret kan man anvende en automatisk regulator for pH som i blandingen inn-fører nødvendige mengder av et alkalisk reagens, som soda, pottaske eller kalk.

Fosforet kan tilsettes i gjæringsblandingen i form av mono- eller diammoniumfosfater som samtidig, helt eller delvis, kan utgjøre kilden for uorganisk nitrogen anvendelig i det siste trinn av oppfinnelsen .

Et antiskummemiddel kan likeledes innføres i gjæringsblandingen.

Etter gjennomført gjæring, men før man går videre med utvinning av polysakkaridet fra mosten, er det fastslått at det er interessant å underkaste .den gjærede most en oppvarming i et temperaturområde fra 80 til 13 0°C i 1 til 40 minutter. Foretrukket er temperaturen 100 - 110°C og varigheten av oppvarmingen er 10 til 15 minutter. Man isolerer polysakkaridet fra mosten, eventuelt oppvarmet på forhånd som angitt ovenfor, ved å anvende vanlige metoder, f.eks. utfelling ved tilsetning til mosten av en lavere alkohol som metanol, etanol, isopropanol, tertiærbutanol eller aceton, eller en blanding. :av disse fellingsmidler. Man kan også anvende et uorganisk salt som kaliumklorid, natriumklorid eller natrium-

sulfat for å gjennomføre en lønnsom utfelling av polysakkaridet.

Som nevnt fraskilles polysakkaridet, vaskes med utfellingsvæsken

og tørkes og males.

Det produkt som oppnås på denne måte kan anvendes for ved tilsetning av vann å danne geler. De konsentrasjoner av polysakkarider som vanlig anvendes utgjør mellom 0,0 05 og 2 vektprosent. Gelene kan underkastes en.sluttbehandling ved filtrering, f.eks. gjennom di-atomé jord, eller ved sentrifugering. Oppløsningen av polysakkarid, oppnådd på denne måte og eventuelt behandlet, har vist seg å ha utmerkede egenskaper med hensyn til filtrerbarhet og frembringer ikke tilstopning av poremiljøet. Under de samme forsøksbetingelser frembyr geler av polysakkarider, oppnådd ved hjelp av gjæring med en organisk nitrogenkilde anvendt i en mengde større enn den som tilsvarer konsentrasjonsområdet ved den foreliggende oppfinnelse, ikke de samme fordeler og spesielt strømmer de vanskeligere i de porøse miljøer som de tilstopper. De typer bakterier som er rep-resentative for slekten Xanthomonas kan tjene til fremstilling av polysakkaridene i samsvar med oppfinnelsen omfatter f.eks. Xanthomonas begoniae, Xanthomonas campestris, Xanthomonas carotaen, Xanthomonas hederae, Xanthomonas incanae, Xanthomonas malvacearum, Xanthomonas faseoli, Xanthomonas pisi, Xanthomonas vasculorum, Xanthomonas vesicatoria, Xanthomonas vitians og Xanthomonas pelargonii. Den type som anvendes foretrukket er Xanthomonas campestris.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1.

Eksempel på fremstilling av polysakkarid som inngår i rammen for oppfinnelsen.

a) Fremstilling av podekultur:

Man xjår ut fra en kultur av Xanthomonas campestris opprettholdt på agar i rør og poder ved suspensjon i en erlenmeyerkolbe på 1 liter, 100 cm 3 oppløslig soyaekstrakt. Denne laboratoriefremstilte dyrk-ningblanding har følgende sammensetning pr. liter:

Blandingen har en naturlig pH på 7,3 og steriliseres i autoklav i 1 time 30 min. ved 1,3 bar. Inkubasjonstiden ved 28°C er 72 timer. Operasjonen.gjennomføres under stadig omrøring.

b) Mellomliggende veksttrinn:

Man anvender 0,15. vektprosent av denne dyrkningskultur for i et laboatoriegjæringskar på 20 liter å pode 15 liter av en steril blanding med følgende sammensetning pr. 1 liter:

Blandingen har en pH på 7,2 og steriliseres på stedet ved inn-føring av vanndamp i 45 minutter ved 1 bar, volumet stiger da fra 9 liter til 15 liter. Etter 24 timers inkubasjon ved 28°C under omrøring og lufting har blandingen en viskositet (målt i Brookfield- viskosimeter LVT på 30 o/mn med rotasjonslegeme nr. 4) på 600 centipoise og en pH på 7,10.

c) Fremstilling av polysakkarid:

Man anvender 1,5% av den ovennevnte vekstblanding for poding av et gjæringskar på 1,4 m 3 forsynt med 0,8 m 3 av en steril blanding med følgende sammensetning pr. 1 liter:

Sterilisering av blandingen gjennomføres to ganger, nemlig første gang i 350 liter vann oppløses cerelosen og steriliseringen gjen-nomføres i en autoklav i 3 0 minutter ved 1 bar, og den annen gang i 320 liter vann hvor man oppløser resten av bestanddelene og sterilisering foretas ved injeksjon av vanndamp i 1 time 30 min. ved 1,3 bar. Blandingen av de to steriliserte deleblandinger har en pH på 7,37 og et volum på 0,8 m 3. Gjæringen varer omtrent 75 timer under omrøring og lufting og pH reguleres til mellom 6,7 og 6,9 ved tilsetning av en vandig løsning av soda på 300 g NaOH pr. liter. Ved slutten av dette tidsrom forefinnes ikke mer cerelose og viskositet Brookfield igjæringsblandingen er 7400 centipoise.

Man arbeider videre med en termisk behandling av mosten ved å bringe denne til å sirkulere i et rørsystem med dobbelte vegger hvori det sirkulerer en oppvarmingsvæske bragt til en passende temperatur og mosten oppvarmes ved 120°C i 30 minutter.

Den avkjølte most tilsettes deretter isopropanol på klassisk måte for å felle ut polysakkaridet som vaskes, tørkes og males. Det tørre material utfelt ved hjelp av isopropanol utgjør 15,7 g/kg, tilsvarer et vektmessig utbytte på 71,4%.

EKSEMPEL 2.

Fremstilling av polysakkarid i henhold til oppfinnelsen.

Man går frem som i eksempel 1 og poder et gjæringskar på 1,4 m<3>fylt med 0,8 m 3 av en steril blanding med følgende sammensetning pr. liter:

Sterilisering av blandingen gjennomføres som beskrevet i eksempel

1 to ganger. Samling av de to steriliserte blandinger gir en pH på 7,24 og et volum på 0,8 m 3. Gjæringen varer omtrent 41 timer under omrøring og lufting, idet pH reguleres mellom 6,7 og 6,9

ved tilsetning av NaOH-løsning 300 g NaOH pr. liter. Etter denne tid finnes ikke lenger cerelose i blandingen og Brookfield-viskositet er 5400 centipoise.

Man går deretter frem med en termisk behandling av mosten ved oppvarming av denne ved 110°C i 15 minutter. Etter avkjøling utfelles polysakkaridet som angitt i eksempel 1 og det isoleres 14,6 g/kg tørt polysakkarid som fører til et vektmessig utbytte på 66,4%.

EKSEMPEL 3.

Fremstilling av polysakkarid ved gjæring i nærvær av en organisk nitrogenkilde anvendt i mengder større enn tilsvarende oppfinnelse.

Man går frem som i eksempel 1 og poder et gjæringskar med volum

3 3

1,4 m fylt med en blanding på 1 m av en steril blanding med følgende sammensetning pr. liter:

Den samlede blanding har en pH på 7,3 og steriliseres ved injeksjon av damp i 1 time 30 min. ved 1,3 bar hvor volumet stiger fra 0,74 m 3 til 1 m 3. Gjæringen tar omtrent 52 timer under omrøring og lufting idet pH reguleres mellom 6,7 og 6,9 ved tilsetning av NaOH-løsning anvendt i de foregående eksempler. Etter denne tid forefinnes ikke lenger sakkarose og viskositeten under de angitte betingelser måles til 6900 centipoise. Etter en termisk behandling av mosten og utfelling under de angitte betingelser i eksempel 1 isoleres 15,6 g/kg av tørt material tilsvarende et ubytte på 78%.

EKSEMPEL 4.

Man anvender de polysakkaridpulvere som er oppnådd i eksemplene 1 - 3 for å teste filtrerbarheten. Filtrerbarhetsforsøkene består i følgende operasjoner: - 3,2 g polysakkaridpulver dispergeres ved vanlig teknikk i 2 liter saltholdig vann inneholdende 5 g NaCl pr. liter, med pH nøyaktig 7, og forhåndsfiltrert gjennom et filter "Millipore" på 0,22 y;

- konsentrasjonen av polysakkarid i denne oppløsning (eller gel)

på 0,16 vektprosent nedsettes til 0,04% ved fortynning ved hjelp av den samme vandige saltløsning; - man fortsetter så med en filtreringsbehandling gjennom diatoméjord av oppløsningen med konsentrasjon 0,04% i mengde 0,05 g diatomejord for 100.cm 3 av den nevnte oppløsning; - man måler deretter volum av filtrert løsning 0,04% som er filtrert ved å ha gått gjennom et filter "Millipore" med porøsitet 3 u og 47 mm diameter, under et trykk frembragt av en nivåfor-skjell på 10 cm vann mellom inngang og utgang i filtrerings-apparatet.

De oppnådde resultater fremgår av vedføyde fig. 1 som viser de volum som er filtrert som funksjon av tiden: - oppløsninger av polysakkarider fremstilt som angitt i eksemplene 1 og 2 vises som kurve A henholdsvis B; - oppløsningen av polysakkarid fremstilt i eksempel 3 vises som kurve C; - den vandige saltløsning, med 5 g pr. liter NaCl, har tjent som kontroll ved filtrerbarhetstesten vises som kurve D.

Det sees av disse filtrerbarhetsforsøk at det opptrer en hurtig tilstopning av filteret "Millipore" på 3 y med en oppløsning av polysakkarid oppnådd ved gjæring i et miljø rikt på organisk nitrogen, til tross for en forhåndsklaring av polysakkaridløsningen (kurve C). Derimot frembringer ikke oppløsningen av polysakkarid oppnådd ved gjæring i et miljø tilsvarende oppfinnelsen, dvs. fattig på organisk nitrogen, ikke noen tilstopning av det porøse miljø og oppløsningen strømmer lett (kurvene A og B).

Claims (6)

1. Anvendelse av Xanthomonas-polysakkarider spesielt egnet for ved tilsetning av vann å fremstille geler med vesentlig forbedret f iltrerbarhet, karakterisert ved at de nevnte polysakkarider er oppnådd ved hjelp av en fremgangsmåte som består i å gjennom-føre følgende operasjoner: a) fremstilling av podekultur fra en Xanthomonaskultur; b) eventuelt etterfulgt av et mellomliggende trinn for å formere mikro-organismene; c) fremstilling av polysakkarid ved poding ved hjelp av dyrkings-kulturen fra trinn a) eller eventuelt fra trinn b) av en blanding omfattende et sakkarid og en passende nitrogenkilde og gjæring av denne blanding, idet nitrogenkilden omfatter i det minste et nitrogenholdig produkt av organisk opprinnelse, idet mengden av det nevnte nitrogenholdige produkt av organisk opprinnelse, uttrykt som gram elementært nitrogen pr. liter gjæringsblanding, er mellom 0,01 og 0,3 g/l.

2. Anvendelse som angitt i krav 1, karakterisert ved at mengden av nitrogenholdig organisk produkt som anvendes i fremstillingstrinnet c), uttrykt som gram elementært nitrogen pr. liter gjæringsblanding, er mellom 0,0 2 og 0,2 g/l.

3. Anvendelse som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at i fremstillingstrinnet c) inneholder gjæringsblandingen blant annet et nitrogenholdig produkt av uorganisk opprinnelse.

4. Anvendelse som angitt i krav 3, karakterisert ved at mengden av nitrogenholdig produkt av uorganisk opprinnelse som innføres i gjæringsblandingen bestemmes slik at den totale mengde av det nitrogenholdige organiske produkt og det nitrogenholdige uorganiske produkt, uttrykt som gram elementært nitrogen pr. liter gjæringsblanding, er høyst 0,5 g/i.

5. Anvendelse som angitt i krav 1-4, karakterisert ved at etter gjennomført gjæring underkastes den gjærede most inneholdende polysakkaridet for en oppvarming i temperaturområdet 80 til 130°C i 1 til 40 minutter.

6. Anvendelse som angitt i krav 1-5, karakterisert ved at gelene har en konsentrasjon av polysakkarid på mellom 0,0 05 og 2 vektprosent.