DE1807185A1 - Verfahren zur Herstellung von proteolytische Enzyme enthaltenden Aufbereitungen - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von proteolytische Enzyme enthaltenden Aufbereitungen

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DE1807185A1 DE19681807185 DE1807185A DE1807185A1 DE 1807185 A1 DE1807185 A1 DE 1807185A1 DE 19681807185 DE19681807185 DE 19681807185 DE 1807185 A DE1807185 A DE 1807185A DE 1807185 A1 DE1807185 A1 DE 1807185A1
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Description

PATENTANWALT
Dr. DlFTER LOUIS NURMBERQ KESSLERPLATZi 1807185
9565
NOVO TERAPEUIISK LABORATORIUM A/S
Verfahren zur Herstellung von proteolytische Enzyme enthaltenden Aufbereitungen
Die Erfindung bezieht aioh auf ein Verfahren zur Herateilung neuer Aufbereitungen mit proteolytischen Enzymen für industrielle Zwecke.
Ea ist bekannt, daaa eine Anzahl von Bakterien wahrend ihres Stoffwechaels proteolytisohe Enzyme erzeugen und dass einige dieser Bakterien in industriellem Umfange kultiviert worden sind zum Zwecke der Gewinnung der erzeugten proteolyitschen Enzyme.
In der holländischen Zeitschrift "Antonie van Leeuwenhoek", 1_, 141-147 (1934) hat A.Vedder seine Versuche zur Iaolierung gewisser Bakterien aus dem Fäzes beschrieben.Durch eine Anreicherung in alkalischem Peptonwasser und Kultivierung auf "Glykokoll Platten", welche Hämoglobin, KOH, Glykokoll und Peptonagar ei:Vbalten oder noch besser auf "Karbonat Platten" (diese Platten s-i.vi von Vedder so genannt worden.),welche Hämoglobin, ^CC ,KHCO3 und Peptonagar enthalten,gelang es Vedder 16 Stämme eines Bakteriums zu isolieren, das zur Gattung Bacillus gehört und
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nach Vedder als einer neuen Spezies zugehörend angesehen werden kann, die er Bacillus Alcalophilus nannte, weil diese Spezies nur bei pH-Werten oberhalb 7, vorzugsweise im Bereich von 8,6 bis 1G^ wächst. Die Spezies Bacillus Aloalophilua wurde in die 6. Ausgabe von Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, jedoch nicht in die 7. Ausgabe aufgenommen.
Ein Stamm von Bacillus Alcalophilus wurde beim National Collection of Type Cultures in London unter der NCTC-Nummer 4553 und beim National Collection of Industrial Bacteria in Edinburgh unter der NCIB-Nummer 8772 hinterlegt, wo der Stamm durch ein Versehen als ein Bacillus Subtilis angesehen wurde.
Ea wurde nun gefunden, dass die Stämme der Spezies Bacillus Alcalophilus während ihres Stoffwechsels neue proteolytische Enzyme extrazellular erzeugen, dass derartige Enzyme aus dem Kultivierungsmedium gewonnen werden können und dass sie eine ausgeprägte Aktivität bei hohen Alkalitätsgraden zeigen, wodurch sie auf verschiedenen industriellen Gebieten Bedeutung erlangen.
Das erfindungsgemasse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Stamm von Bacillus Alcalophilus unter submersen, aeroben Bedingungen in einem Nährmedium mit assimilierbaren kohlenstoff- und Stickstoffquellen kultiviert, der pH-Wert des ^hrmediums auf einen Wert zwischen 7,5 und 11 gehalten und das während der Kultivierung extrazellular erzeugte
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proteolytieohe Enzym gewonnen bzw. aufbereitet wird.
Das Hahrmedium ist nach den hierfür bekannten Grundsätzen zusammengesetzt. Geeignete assimilierbare Kohlenstoff quellen sind Kohlehydrate, wie z.B. Saccharose, Glukose, Stärke, Getreidekörner, Malz, Reis, Zuckerhirse usw. Die Kohlehydratkonzentration kann in weiten Grenzen variieren, z.B. nach oben bis zu 2596 und nach unten bis 1 - 5 #. Im allgemeinen erweist eich eine Konzentration von 8 - 10 Ji als zweckmässig, wobei der Prozentsatz auf Dextrose bezogen ist. Es wurde festgestellt, dass die Anwesenheit von Kohlehydraten im Nährmedium den Anlass zur Bildung von sauer reagierenden Verbindungen gibt, wae sich in oiner Abnahme dee pH-Wertes während der Kultivierung äussert. Da es wesentlich ist, einen pH-Wert im Währmedium im Bereich von 7,5 - 11, vorzugsweise 8 - 10, aufrechtzuerhalten, sollen während der Kultivierung Massnahmen dagegen getroffen werden, dass der pH-Wert während der Kultivierung während einer nennenswerten Zeitdauer auf einen unterhalb des vorgenannten Bereichs liegenden Wert abfällt. Uta den pH-Wert innerhalb des gewünschten Bereichs zu halten, kann eine begrenzte Kenge an Kohlehydraten zusammen mit einer Puffersubstanz verwendet werden, die in der Lage ist, den gewünschten pH-Wert ei., as-cellen. Karbonate und insbesondere Sesquikarbonate iv. einer Konzentration bis zu 0,2 M im Medium können einen prl-Wert von etwa 9,3 bis 10,5 herbeiführen.
Ss können natürlich auch andere Puffersysteme, wie z.B.
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BAD
- 4 - . Phosphatpuffer, eingesetzt werden.
Es ist auch möglich, die Kultivierung mit einem niedrigen Kohlehydratgehalt zu beginnen und während der Kultivierung nach und nach kleine Mengen an Kohlehydrat zuzusetzen.
Eine dritte Möglichkeit besteht in der Anwendung einer automatischen pH-Kontrolle duroh Zusatz von verschiedenen basisch reagierenden Substanzen wie sie auf diesem Gebiet verwendet werden.
Die Verwendung von Karbonaten, upd Sesquikarbonaten als pH-regelnde Substanzen erweiet eioh ale §ehr csweokmäeaig. Ee iet überraschend, dass es während der Kultivierung in einem industriellen Umfange möglich ist, diese Substanzen in den vorerwähnten Konzentrationen einzusetzen.
Bei der Stickstoffquelle des Nährmediums kann es sich um eine ' solche von anorganischer und/oder organischer Natur han'deln. Geeignete anorganische Stickstoffquellen sind Nitrate und Ammoniumsalze. Unter den organischen Stickstoffquellen gibt es eine ganze Anzahl, die als für Permentationsprozesse und für die Kultivierung von Bakterien geeignet bekannt sind. In diesem Zusammenhang sei beispielsweise auf Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Erdnussmehl, Kasein, eine Aufschlämmung von gequollenem Mais, Hefeextrakte, Harnstoff, Albumin usw. hingewiesen.
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Ausserdem sollte das Nährmedium die üblichen Spurensubstanzen enthalten.
Die Temperatur, bei der die Kultivierung durchgeführt wird, liegt normalerweise in demselben Bereich wie die bekannte
1 *
Kultivierung von bekannten Spezies der Gattung Bacillus. Im allgemeinen sind Temperaturen zwischen 25 und 40° C zweckentsprechend. Vorzugsweise liegt die Temperatur zwischen 30 und 37° C.
Da die Kultivierung unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden muss, ist es bei Einsatz von Permentationstanks notwendig, eine künstliche Belüftung vorzusehen. Die Luftmenge entspricht derjenigen bei den bekannten Kultivierungsprozessen.
Im allgemeinen werden maximale Ausbeuten der proteolytischen Enzyme nach einer Kultivierungszeit von 1 bis 5 Tagen erhalten.
Pur die auf eine Erzeugung proteolytischer Enzyme abzielende Kultivierung und fur die spätere Aufbereitung der Enzyme wurde vor. dem hinterlegten Stamm der beiden vorerwähnten Proben G-e-jrauch gemacht, nämlich dem Stamm NCTC 4553 und NCIB 8772. Diese Stämme zeigten ein optimales Wachstum bei einem pH-Wert zwischen 7,8 und 9,0. Die Kultivierung wurde sowohl in Schüttel- ^laschen als auch in Permentationseinrichtungen von Versuchsanlagen mit künstlicher Belüftung durchgeführt. Die erhaltenen
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■ '■ BAD
Ausbeuten wurden nach der bekannten Ansonhämoglobinmethode bestimmt (Journal of General Physiology, 22, 79-89 (1939)). In dieser Beschreibung bedeutet eine Anson-Einheit die Menge an proteolytischem Enzym, welche Hämoglobin bei einem pH-Wert von 10,1 und einer Temperatur von 25° 0 während einer Reaktionszeit von 10 Minuten mit einer aolchen Anfangsgeschwindigkeit aufschliesst,dass pro Minute eine solche Menge an Spaltprodukten gebildet wird, die mit Trichloressigsäure nicht ausgefällt werden kann und Wobei dieae Spaltprodukte mit Phenolreagenz dieselbe Farbe ergeben wie ein Milliäquivalent von Tyrosin.
Pur die Kultivierung wurden die folgenden beiden Medien eingesetzt:
1) Medium BPFA folgender Zusammensetzung:
Kartoffelmehl 50 g pro Liter It Leitung
Saccharose 50 g ti Il It
Gerstenmehl 50 g ti ■ Il ti
Sojabohnenmehl 20 g Il Il Il
Natriumkaseinat 10 g It It Il
Na2HPO;, . 12H2O 9 g Il Il
2) Medium BSX folgender Zusammensetzung:
Gerstenmehl 100 g pro Liter Leitungswasser Sojabohnenmehl 30 g " " "
3iese beiden Medien wurden auf den gewünschten pH-Wert durch Zugabe von Sesquikarbonat oder Soda unter sterilen Bedingungen eingestellt.
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Für die mit Schlittelflaachen durchgeführten Versuche wurden 500 mm Söhüttelflaschen eingesetzt, wobei jede Flasche 100 ml des Nährmediums BPI1A und BSX enthielt, das vorher im Autoklaven während 90 Minuten bei 120° 0 sterilisiert und hiernach durch Zugabe von Natriumkarbonat oder Natriumeesquikarbonat in einer Konzentration von 0,2 M bzw. 0,1 M auf einen pH-Wert zwischen 9,3 und 10,3 eingestellt wurde. Für jedes Bakterium wurden vier Flaschen verwendet. Die von den Kulturmedien für die Bestimmung des Ezymgehalts in Ansoneinheiten benötigten Proben wurden nach einer Kultivierung von 3, 4, 5 und 6 Tagen abgezogen. Die Flaschen wurden während der Kultivierung auf einem rotierenden Tisch mit 220 U/Min, abgestellt. Während der Kultivierung lag die Temperatur bei 30° C.
Die in Ansoneinheiten pro kg Nährmedium gemessene maximale proteoIytische Aktivität geht aus der nachstehenden Tabelle I hervor:
Tabelle I
Bacillus
Alcalophilus
Nährmedium Maximale proteolytische End-pH-. Aktivität f Wert
Ansoneinheiten pro Kg j
NCIB 8772
BPFA BSX
6
2,5
NCTC 4553
BPFA
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Bei einer fraktionierten Fällung mit Äthylalkohol wurden pulverförmige Aufbereitungen erhalten. Wie hierbei verfahren wurde, ergibt sich aus der nachfolgenden Tabelle II:
Tabelle II
Bacillus Alcalophilus Kulturbrühe
in kg
Ansoneinheiten
pro kg
Ansoneinheiten
insgesamt		 NCIB 8772 NCTC 4553
Ausgangs-
material		 g Kieselgur 0,10 ■
7,6
0,76		 0,25
12
3
1. Fällung ml C2H5OH 3 0,75
g Kieselgur 150 385
2. Fällung ml O2H5OH 2,5 - 3
Pulver in g 370 770
Ausbeute Ansoneinheit pro g 4,4 5,3
(gemessen bei pH
10.1)
Ansoneinheit insge
samt		 0,14 0,3
0,62 1,6
81 . 53
Der Stamm NCIB 8772 wurde ebenfalls in 550 1 Tanks aus rostfreiem Stahl unter submersen Bedingungen und bei künstlicher Belüftung und Verv/endung von 250 1 des vorerwähnten BPFA Nähr-
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mediums kultiviert. Der pH-Wert des Mediums wurde duroh sterile Zugabe von 15 1 einer-2 M Sodalösung auf 10,2 eingestellt. Während der Kultivierung betrug die Temperatur 30° C, die Geschwindigkeit des Rührers 570 Drehungen pro Minute und die Belüftung 0,25 m luft pro Minute. Nach einer Kultivierungszeit von 110 Stunden lag der pH-Wert der Kultivierungsbrühe bei 8,9 und die proteolytische Aktivität betrug 17 Ansoneinheiten pro kg, gemessen.bei pH 10,1.
Dienach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellten Enzymaufbereitungen wurden in bezug auf die proteolytische Aktivität gegenüber Hämoglobin· bei verschiedenen pH-Werten und verschiedenen Temperaturen untersucht.
Die Aktivität wurde bei pH 7, 7.5, 8, 9, 10, 11 und 12 bei 25 C gemessen und in dem Prozentsatz der maximalen Aktivität ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle III zusammengestellt:
Tabelle III
7 7.5 pH-Wert 67 10 11 12
KOIB 8772 33 50
44		 j
8 9
ί		 64 75
71
70 		85
85
80		 100
100
100
XCTC 4553 34 54 72 79 100
52
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- ίο -
Die Aktivität wurde ebenfalls bei einem konstanten pH-Wert von 10,1 und unterschiedlichen !Temperaturen, nämlich 25 » 37°, 50°, 60°, 66° und 75° C gemessen. Die bei diesen Messungen erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle IY zusammengestellt:
Tabelle 17
NOTC 4553
ia Aktivität
bei pH 10,1		 Temperatur 0C 25 37 50 .60 66 75
14 32 65 100 26 2
Im allgemeinen bestehen die,nach der Erfindung hergestellten Enzymaufbereitungen aus einer festen oder flüssigen Mischung der erfindungsgemäss erhaltenen proteolytischen Enzyme mit anderen Substanzen, deren Menge und Zusammensetzung von dem Zweck und dem technischen oder wissenschaftlichen Gebiet abhängt, auf dem die Enzymaufbereitungen eingesetzt werden sollen, liegen die Enzymaufbereitungen in fester "Form vor, dann können sie aus Körnern entstehen, in welche die Enzyme einverleibt sind. Dabei können beispielsweise noch andere Enzyme oder solche Substanzen vorliegen, die eine von einer enzymatischen Aktivität unterschiedliche Wirkung besitzen, die für die Brauchbarkeit der Enzymaufbereitung von Bedeutung ist. Wenn die Enzyme nicht in kristalliner Form verwendet werden, dann können sie organische
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Verunreinigungen, beispielsweise Proteine und Kohlehydrate aua dem Kulturmedium, enthalten. Die Enzympulver können Stabilisatoren enthalten.
Bei den Enzymaufbereitungen in flüssiger Form kann es sich um Lösungen oder Suspensionen handeln, die,falls erforderlich, Stabilisatoren enthalten können.
Im allgemeinen werden die durch die Erfindung erhältlichen neuen Enzyme in kleinen Mengen eingesetzt. Im Hinblick hierauf besitzen die Enzymaufbereitungen für industrielle Zwecke normalerweise einen Enzymgehalt von nicht mehr als etwa 10 Gew$. In einigen Fällen kann jedoch der Enzymgehalt beträchtlich höher sein.
Die nach der Erfindung erhaltenen Enzyme können beispielsweise in Waschmitteln, Enthaarungsmitteln, in Aufbereitungen für die Hydrolyse von Proteinen, in Geschirrspülmitteln, enthalten sein und auch als Zusätze zu Faulbehältern und Installationen zur Reinigung von Abwässern verwendet werden.
Das in der oben beschriebene Weise vom Stamm 8772 erhaltene Snzyopulver wurde bei V/aschversuchen eingesetzt, die unter Verwendung von SKPA-Teststreifen oder -stücken 17o.1i6 durchgeführt v.urden, die mit Blut, Milch und Russ beschmutzt waren.
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ORIGINAL INSPECTED
Das verwendete Detergenz hatte die folgende Zusammensetzung:
Dodecylbenzolsulfonat (50 $>) 20 g
, Nonylphenol 9,5 EO .'5g Natriumtripolyphosphat 30 g
Natriumkarbonat, anhydr. 15 g
CMC (45 1o) 2 g ·
Natriumsulfat, anhydr. 28 g
Der Waschversuch, wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Wasserhärte in deutschen Einheiten '10° Paser/Wasserverhältnis 1 : 20
Versuchsdauer 30 Minuten
pH-Wert etwa
Konzentration des Detergenz 4,8 g/l der Waschlösung
Proteolytische Aktivität 0,04 Ansoneinheiten
gemessen "bei pH 7,5 pro liter Waschlösung
Waschtemperatur 60 und 70° C.
Der Waschprozess wurde bei 60° C wie folgt durchgeführt:
Mit einer Pipette wurden 20 ml einer aus dem vorerwähnten Enzympulver hergestellten lösung, die eine Temperatur von 200C, einen pH-Wert von 11,2 und eine proteolytische Aktivität von cd 0,24 Ansoneinheiten pro Liter besass, in ein 200 ml Be'cherglas
<£> gegeben. Gleich zu Beginn, also zum Zeitpunkt 0, wurden 100 al £J der Detergenzlösung zugesetzt, die auf einen pH-Wert von 11,3 -χ and auf eine Temperatur von 68 C eingestellt war. Die Mischung w wurde sofort in eine langhalsige Erlenmeyer-Flasche mit einem piG3unTovermÖgen von 200 ml überführt, die auf einem .Schutto~;-
ORIGINAL IMSPECTED
tisch abgestellt und in Wasser von 60° C eingetaucht war. Die Erlenmeyer-Plasche enthielt schon vorher 6 EMPA-Streifen 116, die insgesamt 5,0 g wogen. Das Schütteln wurde während des 30-minütigen Waschvorganges fortgesetzt. Dann wurde die Wasohlösung abgetrennt und der pH-Wert nach ,dem Abkühlen gemessen. Die Teststreifen wurden abgespült und zwischen den Fingern unter der Wasserleitung entnommenem heissen Wasser gerieben. Sämtliche Teststreifen wurden in einem Beckmann Spektrophotometer bei 460 m/U Remissionsmessungen unterworfen.
Bei de.n bei 70° G durchgeführtes Untersuchungen hatte die Detergenzlösung eine Temperatur von 80° 0.
Neben diesen Versuchen wurden noch Kontrollversuche durchgeführt, bei denen die Enzymlösung durch V/asser ersetzt wurde.
Darüberhinaus wurden alle Versuche auch mit einem Zusatz von 1 g Perborat (NaBO,, 4H2O) pro liter Waschlösung ausgeführt .
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der nachfolgenden iabelle V zusammengestellt:
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- 14 Tabelle V
ohne Perborat mit Perborat
En ζ y rap ul ve r
NCIB 8772		 60° C 70° C 60° C
Kontrolle
ohne Enzym		 54,7 49,2 ■ 41,5"
46,7 46,2 31,5
Die Remissionswerte stellen Durchschnittszahlen der bei jedem der s.e,c.hs £§§ts.tre.ife,n. jede.s Verguchs durchgeführten Messungen
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Claims (2)

■■'.'■■■■'( ·■!!! W'> - 15 Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung proteolytischer Enzymaufbereitungen, dadurch gekennzeichnet, dass ein Stamm von Bacillus Alcalophilus unter aeroben Bedingungen in einem Rahrmedium kultiviert wird, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, wobei der pH-Wert des Nährmediums auf einen Wert zwischen 7,5 und 11 eingestellt wird, und dass anschliessend das während der Kultivierung extrazellular erzeugte proteolytische Enzym abgetrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung unter submersen Bedingungen durchgeführt wird.
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