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Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von Enzymen und Toxinen im Grossen durch oxydierende Bakterien.
Die Erfindung löst die Aufgabe, Enzyme und Toxine mit Hilfe von oxydierenden Bakterien in grossem Massstabe herzustellen und betrifft insbesondere die Erzeugung von Diastase mit Hilfe von Bakterien aus der Gruppe des Mesentericus und aus verwandten Gruppen.
Versuche, stärke-und stickstoffhaltige Substanzen auf bakteriellem Wege unter Erzielung alkalischer Lösungen im Grossbetrieb zu verflüssigen, stiessen auf sehr erhebliche Schwierigkeiten : Bakterien, welche in den kleinen Laboratoriumsapparaten genügend aktive Lösungen gaben, weigerten sich, Enzyme abzusondern, wenn man sie in Kulturapparate von grösseren Abmessungen übertrug. Das Studium dieser Misserfolge hat dazu geführt, die Ursachen zu erkennen, und zugleich die Regeln festzustellen, welche man beobachten muss, um eine reichliche Absonderung von Enzymen und eine enzymatische Aktivität hervorzurufen, wie sie vorher niemals erreicht werden konnte.
Im Sinne der Erfindung wird dies zunächst dadurch erreicht, dass man die Bakterien an der Oberfläche einer Würze von stickstoffhaltigen Substanzen züchtet, welche mindestens 4% Stickstoff enthält. Es war schon früher bekannt, dass bei verschiedenen Arten von Bakterien Eiweissstoffe im Nährboden vorhanden sein müssen, um die Bildung von Enzymen zu ermöglichen.
Dass es für die Gewinnung von Enzymen aus Bakterien vorteilhaft ist, Substanzen mit hohem Stickstoffgehalt zur Ernährung der Bakterien heranzuziehen, musste aber erst gefunden werden, um dieses vom technologischen Gesichtspunkte aus neue Problem einer befriedigenden Lösung zuzuführen. Dabei kommt es ferner überraschenderweise für die maximale Ausbeute nicht bloss darauf an, dass der Nährboden einen gewissen Prozentsatz Stickstoff enthält, sondern dass der Stickstoffgehalt in einem gewissen Verhältnis zum Kohlehydratgehalt steht. So geben z. B. Ausgangsstoffe, die nur einen Teil Stickstoff auf höchstens 35 bis 40 Teile Kohlehydrate enthalten, wenig aktive Lösungen von Enzymen, während aus Ausgangsstoffen, die bei absolut gleichem Stickstoffgehalt einen Teil Stickstoff auf lo-bis 15% Kohlehydrate enthalten, sehr enzymreiche Lösungen entstehen.
Als solche Ausgangsstoffe sind anzuführen : Eiweiss pflanzlichen und tierischen Ursprungs, Kaseine, Maisfibrin, gekochte Hefe, die Soja und insbesondere die Kuchen der ent- ölten Sojabohne. Auf Grund dieser Gesetzmässigkeit kommt insbesondere der Anwendung von Soja bzw. Sojakuchen wegen des bei diesem Material bestehenden Verhältnisses von Stickstoff zu Kohlehydraten im Rahmen der Erfindung eine besondere Bedeutung zu. Sojakuchen wurden bisher nur als Nährboden für Schimmelpilze verwendet, niemals zum Züchten von Bakterien.
Ihre besondere Brauchbarkeit für diesen Zweck beleuchtet der Umstand, dass eine Würze von Soja acht-bis zehnmal mehr Enzyme gibt, als eine gleichprozentige Würze von Reis, Mais, Kartoffeln oder Gerste.
Es hat sich ferner gezeigt, dass neben der Beschaffenheit des Nährbodens auch die Art der Züchtung für die technische Erzeugung von Enzymen auf bakteriellem Wege Bedeutung hat.
Die in Betracht kommenden aeroben Bakterien geben, wenn die Bakterie untergetaucht gehalten wird, saure Lösungen, die sehr wenig Enzyme enthalten, auch dann, wenn die Würze anhaltend durch einen starken Luftstrom gewendet wird. In unmittelbarer Berührung mit Luft gezüchtet,
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geben dieselben Bakterien dagegen, vorausgesetzt, dass der Nährboden genügend reich an Stickstoff ist, alkalische Lösungen, ¯die viel Enzyme enthalten. Um eine hohe enzymatische Wirksamkeit zu erzielen, sind daher die Bedingungen so zu wählen, dass die Bakterien ausserhalb der Flüssigkeit leben. Es ist wesentlich, dass die Kulturen auf der Oberfläche der Flüssigkeit bleiben und Schleier bilden.
Für diejenigen Arten, welche schwierig Schleier bilden, ist es vorteilhaft, auf konzentrierter Würze oder auf einer solchen, welche feste Bestandteile enthält, und auf der Oberfläche zu impfen.
Die Kulturen, welche der vollständigen Ruhe überlassen werden, scheiden ihre Enzyme langsam ab ; ihre Produktion wird beschleunigt, wenn man die Apparate vibiieren lässt oder ihnen eine schwache mechanische Bewegung erteilt, die aber derartig sein muss, dass ein Untersinken vermieden wird. Dies geschieht zweckmässig dadurch, dass dem ganzen Nährboden eine leichte Drehbewegung um eine vertikale Achse erteilt wird. Hierbei wird eine Trennung der Bakterienketten hervorgerufen, ohne dass diese in die Flüssigkeit eingetaucht werden. Man begünstigt auf diese Weise die Diffusion der aktiven Substanzen und das Zubringen von neuen Nährstoffen.
Am Anfang des Wachstums ist es zweckmässig, viel Luft zu geben, wenn aber der Schleier anfängt, sich zu verdichten, ist es angebracht, die Lüftung genau auf das Minimum einzustellen, damit der Gehalt an Enzymen sich nicht vermindert. Die Lüftung an der Oberfläche muss in der Weise geschehen, dass die Kohlensäure nach Bedarf entweichen kann, und der Apparat muss derart eingerichtet sein, dass man die Lüftung einstellen kann, wenn die Analyse des entweichenden Gases anzeigt, dass es. nicht zuviel Kohlensäure enthält. Um die Lüftung am Ende der Kultur vermindern zu können, drückt man die Luft von oben nach unten.
Als eine der wesentlichsten Bedingungen-für die industrielle Herstellung von Enzymen auf bakteriellem Wege ist die Beschaffenheit des Materials der Gefässe erkannt-worden, in denen die Kulturen gezogen werden. Das Studium des Einflusses von Metallen auf die Absonderung der Enzyme von Bakterien hat gezeigt, dass die Vermehrung der oxydierend wirkenden Bakterien, welche sich auf an stickstoffhaltigen Stoffcnreichen Nährboden entwickeln, durch die Anwesenheit von bestimmten Metallen um so mehr gehemmt wird, je bedeutender die Menge des den Bakterien gelieferten Sauerstoffes ist und dass bei sonst ganz gleichen Bedingungen die Produktion an Enzymen mit der Natur der Metalle wechselt, in deren Gegenwart die Kultur gezogen wird. So hat z.
B. eine Serie von Kulturen von 96 Stunden auf einer il% eigen Würze von Soja jeweils die folgende Verflüssigungskraft gezeigt :
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<tb> ioo <SEP> in <SEP> Glas,
<tb> 33"verzinntem <SEP> Eisen,
<tb> 25 <SEP> " <SEP> galvanisiertem <SEP> Eisen,
<tb> 25 <SEP> ; <SEP> j <SEP> verzinntem <SEP> Kupfer,
<tb> 14"Eisen,
<tb> 12"oxydierte <SEP> Kupfer,
<tb> 3 <SEP> bei <SEP> Gegenwart <SEP> von <SEP> feinen <SEP> Kupferdrahtnetzen,
<tb> ioo <SEP> in <SEP> emaillierten <SEP> Metallen,
<tb> 100 <SEP> " <SEP> Aluminium.
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Einen wichtigen Teil der Erfindung bildet daher die industrielle Herstellung der Kulturen in Gefässen aus Glas, Porzellan, emailliertem Metall oder Aluminium, welche Materialien keinen schädlichen Einfluss auf den in Rede stehenden Prozess ausüben. In der Gärungsindustrie sind Glas und Emaille bereits zur Herstellung von Gärbottichen verwendet worden ; ferner ist auch ein günstiger Einfluss des Aluminiums auf in Entwicklung befindliche Hefen festgestellt worden. Diese Materialien sind jedoch niemals zur Herstellung von Enzymen und Toxinen durch oxydierende Bakterien im Grossbetrieb verwendet worden und ihre überraschende Nützlichkeit für diesen Zweck konnte nicht vorausgesehen werden, da die Führung der alkoholischen Gärung und die Gewinnung von Enzymen Vorgänge ganz verschiedener Art sind, deren Bedingungen zum Teil geradezu entgegengesetzt sind.
Wenn bei der Propagation von Hefe in Aluminiumgefässen eine Reizwirkung festgestellt ist oder die Verwendung von Gärbottichen aus Glas bei einem bestimmten Brauverfahren als vorteilhaft empfohlen wird, so handelt es sich überdies nur um graduelle Verschiedenheiten ohne einschneidende Bedeutung. Im Rahmen der Erfindung spielt die Wahl des Materials aber eine ausschlaggebende Rolle. Wäre es nicht gelungen, dem sonderbar verschiedenen Verhalten der Bakterien gegen die verschiedenen Materialien (wie z. B. gegen Eisen und Aluminium) auf die Spur zu kommen, so hätte das im Laboratorium sorgfältig ausgearbeitete Verfahren wohl zur Bereicherung der Wissenschaft geführt, aber nicht in die Industrie übergehen können.
Die Anwendung der aufgefundenen, oben festgestellten Gesichtspunkte hat dazu geführt, industriell verwendbare Apparate zu konstruieren, welche ohne grosse Kosten für die Bedienung grosse Mengen verflüssigender Enzyme ergeben, da die Füllung, die Leerung und die Reinigung sich bei diesen Anordnungen mechanisch durch Zentrifugalkraft bewerkstelligen lassen.
Die'Zeichnung stellt eine bevorzugte Anordnung in Fig. i im Aufriss und teilweise im Schnitt und in Fig. 2 im Grundriss dar.
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1 ist ein Sterilisiergefäss mit einem Dampfrohr 2, welches gleichzeitig als Auslassrohr dienen kann, 3 ist ein Stutzen, welcher den Hahn für die Aussaat aufnimmt und 4 ein zweiter Stutzen, an den'das Sicherheitsventil 5, der Manometer 6 und ein Reinigungshahn 7 angeschlossen sind.
Der Autoklav enthält ein Rührwerk mit Handantrieb.
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zur Einfuhr des Dampfes. 13 ist ein Hahn, welcher abwechselnd für den Dampf und für die reine Luft dient ; er steht durch das Luftrohr 16 nrt dem Luftbefeuchter 14 und mit dem Kulturapparat 15 in Verbindung ; 17 und 18 sind zwei Hähne zur Sterilisation der Würze in 1. --
Der Kulturapparat 15 besteht aus einem Aluminiumgehäuse (von einem Durchmesser von i m bis r6om), welches unter einem Überdruck von einem Kilogramm sterilisiert werden kann ; in dieses mündet oben das Einlassrohr 2 und das Lufteinlassrohr 16. Am unteren Teil des Gefässes 15 befindet sich ein durch einen Hahn 20 absperrbare Rohr 21 das in einen Wasserbehälter 22 eintaucht.
Der Deckel ist mit einer Stopfbüchsendichtüng versehen, durch welche die lotrechte Achse 23 hindurchgeht. Oberhalb des Deckels befindet sich eine Antriebsvorrichtung zur Drehung der Achse 23, die in einem Zapfenlager 24 ruht.
Die Achse 23 trägt eine Reihe Scheiben 25, welche i bis 2 mm Abstand haben ; dieselben sind durch zentrale Distanzringe 26 und durch Klötze, die auf Stangen 27 angeordnet sind, im richtigen Abstand und in horizontaler Lage festgehalten. Jede Scheibe ist mit einem erhöhten Rand von 10 bis 20 mm versehen, je nach der Dicke der Flüssigkeitsschicht, welche man anzuwenden wünscht, und mit einem Überlauf 29 ausgestattet.
Um den Apparat zu füllen, verfährt man auf folgende Weise :
Durch das Mannloch des Kochers 1 führt man das Wasser und z. B. die Sojakuchen ein.
Man bringt das Wasser zum Kochen, indem man durch Rohr 2 Dampf eintreten lässt, während die Öffnungen 3 und 4 offen und der Hahn 17 leicht geöffnet ist, um die Sterilisierung des oberen Teils des Rohres 2 zu sichern. Zu gleicher Zeit lässt man bei geöffnetem Hahn 20 durch 13, 14 und 16 Dampf einströmen, der den Apparat 15 und den Behälter 22, welcher leer ist, reinigt.
Man erhitzt den Inhalt des Kochers mit Dampf von einem Kilogramm Überdruck ungefähr 30 Minuten lang, wobei man das Rührwerk dreht, um die vollkommene Sterilisation der Würze und ihre gleichmässige Durchmischung sicherzustellen.
Unterdessen hat man das Gehäuse 15 mit den Scheiben 25 unter Dampfdruck sterilisiert, wobei der untere Hahn 20 fest geschlossen ist. Hierauf dreht man die Scheiben, um bei 20 das kondensierte Wasser zu entfernen, mit dem sich die Scheiben bedeckt haben. Man ersetzt hierauf den Dampf durch Luft unter Beachtung von Vorschriften, welche jedem Fachmann für die Behandlung von Hefereinzuchtenapparaten geläufig sind.
Den Sterilisator 1 setzt man durch Ventil 70 unter Druck der reinen Luft. Durch Öffnung des Ventils 13 erzeugt man in 15 einen Überdruck von i kg. Den Autoklaven 1 kühlt man ab, indem man vermittelst eines gelochten Rohres 30 Wasser über den oberen Teil des Zylinders laufen lässt und führt sodann die Aussaat durch 3 unter Beachtung der gewöhnlichen aseptischen Vorsichtsmassregeln ein. Hierauf kühlt man bis 35 oder 400 C ab, setzt den Sterilisator unter einen Luftdruck von ungefähr 2 kg und lässt die Würze nach dem Kulturapparat 15 laufen, indem man das Ventil 7 leicht öffnet.
Um eiiie gute Verteilung der Würze auf den Scheiben zu sichern, erteilt man ihnen eine' leichte hin und her gehende Bewegung.
Wenn die Entleerung des Sterilisators bewirkt ist, hält man den Saal, in welchem sich der Apparat 15 befindet, auf einer solchen Temperatur, dass die optimalen'Temperaturgrenzen für die Entwicklung der in Betracht kommenden Bakterienart eingehalten sind. Man beginnt mit ziemlich kräftiger Lüftung,'die man fortsetzt, bis die Bakterie eine ununterbrochene Schichte auf der Oberfläche jeder Scheibe bildet. Um die Verbände der Bakterien zu trennen, erteilt man den Scheiben mehrmals im Tage eine hin und her gehende Bewegung. Hierauf beschränkt man die Luftzufuhr auf das äusserste Minimum ; die Analyse des bei 22 austretenden Gases gestattet, sich durch Bestimmung des Sauerstoffgehaltes zu überzeugen, ob man'den Bakterien eine genügende Menge Sauerstoff zuführt.
Wenn die Kultur das Maximum an enzymatischer Kraft erreicht *hat-. was man durch Proben feststellen kann, nachdem man die Platten mässig gedreht hat-leert man den Apparat durch Zentrifugalkraft unter Öffnung des Hahnes 20. Hierauf wäscht man den Apparat mit Wasser ; dieses Wasser verlässt ebenso wie die Lösung der Enzyme die Scheiben durch Zentrifugieren.
Dank der Vorrichtung erhält man in zwei bis drei-Tagen Enzymlösungen von grösster Wirksamkeit, von welchen 2 bis 300 1 genügen, um 100 t Getreide zu verflüssigen.
Die Vorteile des beschriebenen Apparates sind : die Einfachheit der Konstruktion, eine grosse Oberfläche bei beschränktem Volumen, Einfachheit der Handhabung und äusserst beschränkte Handarbeit.