WO2020053060A1 - Reaktor und verfahren zur kontinuierlichen gewinnung amphiphiler siderophore aus einer mikroorganismenkultur - Google Patents

Reaktor und verfahren zur kontinuierlichen gewinnung amphiphiler siderophore aus einer mikroorganismenkultur Download PDF

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WO2020053060A1
WO2020053060A1 PCT/EP2019/073676 EP2019073676W WO2020053060A1 WO 2020053060 A1 WO2020053060 A1 WO 2020053060A1 EP 2019073676 W EP2019073676 W EP 2019073676W WO 2020053060 A1 WO2020053060 A1 WO 2020053060A1
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foam
siderophores
culture medium
outlet
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Sylvi Schrader
Sabine Kutschke
Katrin Pollmann
Martin Rudolph
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Helmholtz-Zentrum Dresden - Rossendorf E.V.
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom

Definitions

  • Payne 1994 discloses reprocessing processes consisting, for example, of centrifugation, extraction with organic solvents or, in the case of charged complexes with iron, for example ion-exchange chromatography, crystallization, recrystallization and precipitation.
  • Various cultivation media for siderophores of the catechol type and of the hydroxamate type are disclosed.
  • Payne also deals with detection methods and the characterization of the siderophores.
  • IMAC immobilized metal ion affinity chromatography
  • the well-known flotation process is a process in which dispersed particles are physically and chemically separated from solutions with the help of foam. This is done by attaching these hydrophobic, difficult-to-wet particles to gas bubbles (foams), which gives them buoyancy and can be separated. The prerequisite is that the gas used is difficult to dissolve in the liquid phase of the dispersion.
  • a disadvantage is that when the foam rises, so much force is exerted on the foam bubbles (swirling and shear forces) that many foam bubbles burst and flow back into the reactor as a liquid.
  • the foaming behavior differs and the reactor structure cannot be used universally for a wide variety of such amphiphilic substances.
  • Surfactin was used as an example.
  • Yeh aims to suppress the intensive foam formation that is problematic in biotechnological production processes.
  • An otherwise usual addition of so-called anti-foaming agents is not an option at Yeh, so that i.a. the stirring and ventilation processes had to be optimized.
  • the lipopeptide surfactin binds to the foam fraction and is concentrated there. To do this, they developed a bioreactor for batch operation with a foam collection vessel integrated at the gas outlet, a cell recycler and a surfactin precipitation unit.
  • the foam is, similar to Davis et al.
  • One disadvantage is the design of the reactor in such a way that the foam is transferred through the gas outlet, the gas outlet usually and, as indicated in the figure, having a comparatively small diameter in the sense of conventional gas lines. Further information on the design of this gas outlet, through which the foam is transferred, is not disclosed.
  • a reference batch reactor in which gassing was carried out in the usual way, collected the foam, as in the abovementioned publications, via an outlet on the lid.
  • a disadvantage of the hollow fiber membrane was that the siderophore produced, here surfactin or fengycin, partially adsorbed on the membrane
  • Foam suppressants anti-foaming agents
  • the object of the invention is to provide an improved reactor structure for the production of amphiphilic siderophores from microorganism culture.
  • the foam formed should be able to be collected continuously in the form of stable bubbles without having to add additional surfactants.
  • the invention is intended to be universally applicable for all amphiphilic siderophores, including those which have only a low foaming behavior. According to the invention the object is achieved with the features of the independent claims. Preferred embodiments of the invention are the subject of the respective dependent claims.
  • the invention relates to a reactor for obtaining amphiphilic siderophores from a microorganism culture, comprising:
  • the drain for foam runs horizontally outwards or downwards outside or is designed as an overflow.
  • amphiphilic siderophores produced by fermentation i.e. by degradation of organic substances by microorganisms
  • the culture solution is homogeneously mixed during the fermentation and / or the necessary gas is flowed through (gassed).
  • the gassing regulates, on the one hand, the conditions necessary depending on the microorganism, such as, for example, oxygen content in the culture medium (by means of the gas O2) and / or pH value of the culture medium (for example using CO2).
  • the amount of foam formed is regulated by the strength of the gassing.
  • the outlet for foam means the point on the reactor wall at which the foam overflows in the direction of a collecting area, ie is removed.
  • the drain for foam can run horizontally outwards or downwards or be designed as an overflow. Overflow includes both the design, in the simplest case, as a hole in the reactor wall and as an overflow edge.
  • the removal of the foam includes both an independent overflow of the foam and a drainage of the foam supported by technical aids such as a slide or gas flow.
  • the energy impact on the foam is kept as low as possible to minimize the bursting of the foam bubbles before draining into a collection area.
  • This collection area is in particular designed to be open or closed.
  • the total height of the reactor in the sense of the invention is measured from the reactor floor to the top edge of the lid, without connections, without lines and without pipes in the lid.
  • the advantage of the height of the lower edge of the drain for foam (b) according to the invention is that the foam formed, which contains the siderophores, can be removed where it arises. In this way, the energy that acts on or inside the foam above the surface of the culture medium in the reactor is minimized (e.g. when the foam rises too far to a lid opening or at an angle upwards, or when the foam is pushed too quickly with a slide).
  • the advantage of the course of the drain for foam (b) according to the invention is, on the one hand, the same as above, namely a minimized energy input between the bubbles, because the foam does not have to rise unnecessarily upward due to the shape. It runs directly at the lower edge (lower vertex) of the drain for foam (b) according to the invention or to the side or downwards. This keeps the energy impact between the bubbles small.
  • this course of the process means that the head area of the reactor, ie the lid and areas directly next to it, remains free for the other connections (for example valves, openings, hoses, cooling jacket inlet / outlet etc.) that are necessary in the fermentation are.
  • the reactor expediently consists of a lid and a basic vessel.
  • the lid closes the base vessel at the top and usually has, among other things. also other supply and discharge lines in the form of openings or valves. In particular, it is removable.
  • the drain according to the invention for foam (b) is preferably located on the main vessel.
  • Siderophores are a group of complexing agents.
  • Siderophores are water-soluble, low-molecular organic substances synthesized by microorganisms and plants that are biodegradable. They bind Fe (III) ions with high specificity and affinity to form stable chelate complexes and are responsible for the transport of iron into the cell.
  • the group of amphiphilic siderophores includes those siderophores that have both hydrophilic and hydrophobic components.
  • marine siderophores such as Marinobactine, Aquacheline, Amphibactine, Ochrobactine, Synechobactine, Imaqobactin, or Loihicheline, the Acinetoferrin, Cupriachelin, Variocheline, Imaqobactin, Variobactin and many more.
  • the marine siderophore petrobactin for example, is not or only barely amphiphilic without fatty acid residues.
  • the following structures show some representatives of the super group of siderophores.
  • siderophores contain several polar (hydrophilic) groups, in particular carbonyl, hydroxyl, amino, amide or hydroxam.
  • the amphiphilic siderophores now also contain apolar (hydrophobic) hydrocarbon chains with or without double bonds (fatty acid residues).
  • the comparative example petrobactin does not have such a hydrophobic fatty acid residue and is not amphiphilic.
  • Microorganisms in the sense of the invention denotes fungi, bacteria and algae.
  • Continuous removal in the sense of the invention means that, after a starting phase, the foam formed is collected during the complete fermentation period.
  • the start phase is necessary so that the microorganisms can form enough amphiphilic siderophore and that enough foam can form to reach the lower edge of the drain for foam (b).
  • fermentation describes processes in which microorganisms that have been cultivated on a large scale under aerobic or anaerobic conditions convert a substrate into a useful product.
  • the reactor according to the invention is advantageously suitable for the continuous extraction of the amphiphilic siderophores, in particular for a period of at least 2 weeks. Another advantage is that the design of the reactor according to the invention keeps the energy impact on the foam bubbles formed or between them as low as possible up to the overflow at the "outlet for foam " (b), and that the foam bubbles are therefore premature Bursting and running back into the culture medium as a liquid are prevented.
  • the not too small diameter, the arrangement at the height of the reactor according to the invention and the course of the drain for foam are particularly advantageous.
  • the drain for foam (b) is advantageously attached to the reactor in such a way that it primarily removes foam and not "overflowing" culture medium.
  • the head area remains free for other connections that are necessary in the fermentation.
  • Another advantage is that the fermentation process does not require the addition of chemically produced surfactants, since the amphiphilic siderophores foam themselves.
  • the invention consequently enables more ecological processes to be carried out. Due to the absence of additional surfactants, the purification of the siderophores is also less complex in this context.
  • foam suppression chemicals anti-foaming agents
  • foam suppressing chemicals are also no longer necessary, since the intensive foam formation no longer interferes with the invention, but is even desired.
  • the absence of such foam suppressing chemicals also leads to less elaborate purification of the siderophores compared to the prior art.
  • the method according to the invention is less expensive than other methods, since the purification of biotechnologically produced products normally causes great costs.
  • the microorganism is the bacterial strain Marinobacter sp.
  • the reactor is made of a non-metallic, inert material, in particular selected from glazed ceramic, Teflon, glass and enamel. It is preferably made of glass or enamel, particularly preferably made of glass.
  • the basic vessel of the reactor is made of this material.
  • the reactor additionally comprises a “feed opening for culture medium and / or nutrients” (d) and / or a “discharge opening for old culture medium” (e).
  • the culture medium and / or nutrients are fed into the reactor through the feed opening (d) and old medium is discharged through the discharge opening (e).
  • more than one such opening is also included.
  • correction means are added through the feed opening (d) or that measuring probes are inserted / hung in.
  • both openings are also suitable for taking samples.
  • this discharge opening for old culture medium is arranged in the lower third of the reactor, in particular below the limit 1/3 of the total height of the reactor, particularly preferably in the lower 1/5.
  • the reactor is a single-use reactor.
  • This reactor is designed as a bag, which combines the reactor and lid (c), and can be used in a holder that can be used multiple times.
  • this bag is to be understood as a reactor according to the invention and is made from a disposable material.
  • the culture medium only comes into contact with the bag during fermentation.
  • the disposable material is preferably polyethylene.
  • a “bag” made of the disposable material is brought into the holder and all connections between the bag and the holder / connections are sealed, if necessary with seals, so that the actual space where the fermentation takes place is the inside of the bag made of disposable material .
  • the openings of the bag are matched to the openings of the holder in this embodiment.
  • the reactor is approximately cylindrical.
  • the reactor is designed such that it is gas-tight. This means that any supply openings (d) or discharge openings (e) are equipped with valves and that the outlet for foam (b) opens into a closed vessel or part of the reactor (both called a collection area), and that the reactor has no other openings to the outside environment, unless they are secured against the ingress of substances, gases or microorganisms by a permanent gas flow from the inside of the reactor through an opening, for example in the lid.
  • the cover preferably has a seal.
  • the reactor according to the invention can be sterilized and is sterilized prior to fermentation using methods from the prior art, i.e. brought up to sterility inside. This is done in particular through steam or chemicals such as ethylene oxide, hydrogen peroxide or NaOH.
  • the measuring probes are preferably selected from pH, p ( ⁇ 2) and / or T probes. It is also included in this embodiment to arrange several of these probes in the form of a bypass line with a pump. The contents of the reactor circulate in a circle and pass through the probes.
  • the supply lines are, for example, supply lines for correction agents such as acid or alkali.
  • these correction agents are not supplied via separate feed lines, but rather directly via an additional supply opening (d) or, if necessary, also via an additional discharge opening (e).
  • this feed opening (d) and / or the discharge opening (e) it is also possible to use this feed opening (d) and / or the discharge opening (e), if the size and position in the design allow it, for inserting / hanging in such measuring probes.
  • the “device for stirring and / or gassing” is designed such that the speed of stirring and / or the strength of the gassing can be regulated, in particular that it can be changed during the fermentation.
  • the amount of foam formed can advantageously be controlled in this way.
  • the stirring speed can preferably be regulated in at least 3 stages, particularly preferably continuously.
  • the fumigation strength can also be regulated in at least 3 stages, preferably continuously.
  • the device for stirring (a) is a magnetic stirrer.
  • the reactor in addition to the magnetic stirrer, also has at least one device for gassing (a).
  • the reactor according to the invention comprises at least two devices for stirring and / or gassing (a), one of which is intended for stirring and the other for gassing.
  • the device for gassing is preferably selected from an aeration ring near the bottom of the reactor interior and a membrane aeration.
  • the lower edge of the drain for foam (b) is at a height of the reactor which is in the range of 50-75%, the total height of the reactor, measured from below; preferably 55-75%, more preferably 60-75%, particularly preferably 65-75%, in particular 70%.
  • the outlet for foam (b) runs horizontally outwards in a nozzle-like manner or bent downwards outwards or obliquely downwards, particularly preferably horizontally outwards in a nozzle-like manner or curved downwards outside, in particular only horizontally outwards in a nozzle-like manner.
  • the upper opening of the double jacket for heating or cooling medium preferably provided as an outlet opening, more rarely as an inlet opening, is preferably located above the outlet according to the invention for Foam (b).
  • the foam drain (b) consequently pierces the double jacket.
  • this opening of the double jacket for heating or cooling medium is below the outlet for foam (b)
  • the outlet for foam (b) is selected from:
  • the procedure for foam (b) is selected from:
  • the mean diameter of the opening is preferably at (4) and / or the height of the horizontally oval opening at (5) is in the range from 20-45%, particularly preferably 25-30% of the height of the lower edge of the outlet for foam (d).
  • the foam can advantageously drain off by itself with an enlarged / widened drain. This advantageously prevents the foam bubbles from bursting due to turbulence at an opening that is too small.
  • the drain according to the invention for foam (b) is preferably designed so wide that it is circumferential.
  • the reactor can still be closed by the cover.
  • the reactor is provided with a device which supports the drainage of the foam through the outlet for foam (b), in particular a slide at the level of the outlet (b) according to the invention.
  • the slide is preferably fastened to the axis of the stirrer (a) according to the invention, so that it moves in a circle around the axis above or through the foam.
  • the reactor is additionally provided with a drain valve on the reactor base through which the reactor contents can be drained down after the fermentation has ended, in particular also by means of an excess pressure in the reactor.
  • a drain valve on the reactor base through which the reactor contents can be drained down after the fermentation has ended, in particular also by means of an excess pressure in the reactor.
  • the collection area and the connection of the outlet for foam (b) to the collection area is closed, i.e. designed gas-tight.
  • the collection area is equipped with a valve, so that it is possible to apply a gas flow from the inside of the reactor to the outside via the outlet for foam (b) through the collection area.
  • a preferably controllable gas stream is passed from the inside of the reactor via the outlet for foam (b) if required.
  • the collecting area following this process must either be designed to be open or, if the construction is closed, have a valve for pressure equalization.
  • the movement of the foam can advantageously be supported by the outlet for foam (b) in the collecting area with the aid of a gas stream.
  • the gas flow can be regulated particularly preferably, the bursting of the gas bubbles can advantageously be controlled for foam before the outflow, which in the case of intensive foaming, i.e. if the foam fraction in the reactor grows over the foam outlet, it may be necessary to cause the bubbles to burst and prevent the foam fraction from growing up to the lid.
  • the lid preferably has a diameter similar to (+/- 30%) the maximum inner diameter (measured below the outlet for foam (b)) of the reactor, particularly preferably very similar (+/- 10%), so that the The lid can be clearly distinguished from other, smaller closures (such as viewing windows).
  • the lid is made of the same material as the main vessel of the reactor.
  • it is made of a non-metallic, inert material, in particular selected from glazed ceramic, Teflon, glass and enamel. It is preferably made of glass or enamel, particularly preferably made of glass.
  • the invention also relates to a process for obtaining amphiphilic siderophores from a microorganism culture in a reactor according to the invention, comprising the steps:
  • step (II) it is explicitly included that the mixing and gassing is carried out only by a gas flowing through the culture medium and also the case that the mixing is carried out by an additional stirrer.
  • the removal of the foam (III) includes both an independent overflow of the foam and a drainage of the foam supported by technical aids such as a slide or gas flow.
  • the energy impact on the foam is kept as low as possible to minimize the bursting of the foam bubbles before draining into a collection area.
  • a surfactant is additionally added when contacting in step (I) in order to increase foam formation if necessary.
  • old culture medium is discharged through a “discharge opening for old culture medium” (e) and fresh culture medium is fed through a “feed opening for culture medium and / or nutrients” (d).
  • this old medium is discarded and the fresh medium that is supplied is new, as well as the variant that the old medium is freed from, for example, filtration of dead cells and / or harmful metabolites, among other things, and thus is fed back into the reactor as a purified (fresh) culture medium.
  • new nutrients are added to the cleaned culture medium if necessary.
  • the volume of liquid reactor content (culture medium during the fermentation) is particularly preferably kept constant.
  • the level of the reactor is kept approximately constant over the duration of the fermentation, so that advantageously the height of the foam layer up to the lower edge of the outlet for foam (b) also remains constant and the amount of foam that runs off is not unnecessarily impaired.
  • this removal of old culture medium and the supply of fresh culture medium take place simultaneously, in particular continuously. This continuous process takes place only after a start phase, which is necessary to approximately achieve the steady state.
  • a cell recycler is particularly preferably used which separates vital microorganisms from, for example, the old culture medium removed and / or from culture medium removed with the foam, and these microorganisms are subsequently returned to the reactor.
  • step (II) In a preferred embodiment of the method, in step (II) the speed of mixing by means of a stirrer and / or the strength of the gassing during the fermentation is varied so that the amount of foam formed can be controlled and continuous removal of the foam in step (III).
  • gases are selected which are selected from oxygen, carbon dioxide, nitrogen and mixtures of some or all of them.
  • the discharged foam enriched with siderophore, discharged in step (III) is left to stand for a time, so that the bubbles burst.
  • This resting time is preferably 30 minutes to 24 hours, particularly preferably 30 minutes to 5 hours.
  • An anti-foaming agent which accelerates the bursting of the foam bubbles is particularly preferably added to the foam before this rest period.
  • the foam removed in step (III) according to the invention is subjected to common purification methods in order to purify the siderophore. Chromatography, such as FPLC, IMAC (immobilized metal ion affinity chromatography), HIC (hydrophobic
  • the invention also relates to the use of the reactor according to the invention for obtaining amphiphilic siderophores from a microorganism culture, in particular in the process according to the invention.
  • the reactor 10 according to the invention in an embodiment made of glass with feed opening 20, discharge opening 30, device 40 for stirring and / or gassing, outlet 70 and collecting area 80 for foam and cover 90, in a specific embodiment.
  • the corresponding microorganism strain is cultivated with the aid of adapted cultivation parameters and culture medium in the bioreactor, so that amphiphilic siderophores are generated with the help of bacteria. These are excreted directly from the cell and are in the culture supernatant - step 1.
  • gas bubbles enter the system, to which the siderophores can bind and are carried to the culture surface
  • Foam is formed on which the siderophores concentrate - step 2.
  • This foam concentrate is specifically transferred to a collecting bottle via an additional connection - steps 3 and 4.
  • the cultivation and siderophores production can also be done as continuous process.
  • FIG. 2 shows the reactor 10 (representation of not all components according to the invention for better illustration) in one embodiment with the outlet 70 for foam in the configuration as a circumferential overflow ((A) and (B)) and as a horizontal oval opening (C) and as a round opening (D).
  • 3 shows the course of growth of the exemplary microorganism culture Marinobacter sp. and the amount of foam expired as a function of time. Foam production begins with the onset of the exponential phase of the culture and then takes place continuously.
  • 4 shows the course of the formation of the amphiphilic siderophore marinobactin by way of example during the fermentation in the culture medium and in the expired foam fraction. It can be seen that, except for a small amount, the marinobactin is completely removed from the reactor with the aid of the foam. Since the start of foam formation and siderophore production are very close together, it can be assumed that the marinobactin itself contributes to the foam formation.
  • the corresponding bacterial strain is dissolved in two liters of artificial seawater medium (15.5 g / l NaCl; 0.75 g / l KCl; 0.2 g / l MgS0 4 - H 2 0; 0.1 g / l CaCl 2 ' 2H 2 0; 1.0 g / l NH 4 CI; 5 g / l succinic acid; 3 g / l Na 2 HP0 4 ; pH 7.0) in the glass version of the reactor as in FIG. 1 at 22 ° C.
  • the pH should be 7 during cultivation and is regulated during the process by adding 2 M HCl.
  • the inoculation of the bioreactor is carried out with a volume of a three day old shaking preculture that the optical density in the reactor (OD measured at 600 nm) is 0.02 at the beginning of the cultivation. Air is introduced at a flow rate of 550 ml / min via an aeration ring for the gas entry.
  • the culture is mixed using a magnetic stirrer at 250 rpm.
  • sufficient fresh culture medium is automatically fed to the bioreactor so that the fill level is always kept at 2 L.
  • the optical density is also determined during the cultivation using a spectrophotometer at a wavelength of 600 nm.
  • the siderophore concentration is determined by performing the CAS assay according to Alexander and Zuberer 1991 and calibration using the commercially available siderophore desferrioxamine E (DFOE) (Schmple et al. 2017). Andrewas et al. (2016) describe this measurement method in detail, which is based on the measurement of the colorimetric shift of an Fe complex due to competing Fe complexation by siderophores. The sample is centrifuged both from the culture and from the foam before carrying out the assay (Schmple et al. 2017).
  • DFOE siderophore desferrioxamine E

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Reaktor, ein Verfahren und die Verwendung dieses Reaktors in dem Verfahren zur Gewinnung amphiphiler Siderophore aus einer Mikroorganismenkultur. Der Reaktor umfasst die Bauteile: (a) Vorrichtung (40) zum Rühren und/oder Begasen, und (b) Ablauf (70) für Schaum, enthaltend die amphiphilen Siderophore, in der Seitenwand des Reaktors, (c) Deckel (90) wobei die Unterkante des Ablaufs (70) für Schaum als Überlauf in einer Höhe liegt, die im Bereich von 40-75% der Gesamthöhe des Reaktors (10), von unten gemessen, liegt, und wobei der Ablauf (70) für Schaum horizontal nach außen oder schräg nach unten außen verläuft oder als Überlauf ausgestaltet ist.

Description

Reaktor und Verfahren zur kontinuierlichen Gewinnung amphiphiler Siderophore aus einer Mikroorganismenkultur
Die biotechnologische Produktion von Siderophoren ist bekannt und beispielsweise beschrieben von Payne 1994. Payne offenbart Aufarbeitungsverfahren bestehend aus beispielsweise Zentrifugation, Extraktion mit organischen Lösungsmittel oder bei geladenen Komplexen mit Eisen beispielsweise die lonenaustauschchromatographie, Kristallisation, Umkristallisation und Ausfällung. Verschiedene Kultivierungsmedien für Siderophore des Catechol-Typs sowie des Hydroxamat-Typs werden offenbart. Payne beschäftigt sich auch mit Detektionsmethoden und der Charakterisierung der Siderophore.
Braich et al. (2008) nutzen Immobilisierte-Metallionen-Affinitätschromatography (IMAC) zum Abfangen der Siderophore direkt aus dem Bakterienkulturüberstand. Nachteilig kommen giftige Metalle wie Nickel gebunden am Harz zum Einsatz und die Kosten solcher Metall- Komplex-harze sind sehr hoch. Des Weiteren sind Chromatographiemethoden im großtechnischen Betrieb eher wenig favorisiert.
Schräder et al. (2017) offenbaren den Einsatz des Marinobactins als Reagenz im industriellen Flotationsprozess, bei dem mineralische Partikel mithilfe amphiphiler Siderophore an Schaum gebunden werden. Sie optimierten einzelne Parameter der Fermentation im klassischen Batch-Verfahren im Labormaßstab.
Der bekannte Flotationsprozess ist ein Prozess, bei dem dispergierte Partikel physikalisch- chemisch mit Hilfe von Schaum aus Lösungen abgetrennt werden. Dies geschieht, indem diese hydrophoben, schwer benetzbaren Teilchen an Gasblasen (Schäume) anlagern und dadurch Auftrieb bekommen und abgetrennt werden können. Voraussetzung ist, dass das verwendete Gas sich selbst schwer in der flüssigen Phase der Dispersion löst. Der Flotationsprozess findet beispielsweise Anwendung in der Abwasserreinigung oder der Papierherstellung. In der letztgenannten, genauer im De-Inkingprozess, entfernt die Flotation die Druckfarbe (hydrophob) aus dem eingesetzten Altpapier (Fasern=hydrophil).
Nachteilig werden in den großtechnischen Flotationsprozessen sehr aggressive Chemikalien eingesetzt. Die Flotationsanlagen sind größtenteils offen, d.h. die Becken/Reaktoren haben keine Abdeckung. Ein kontrolliertes und gezieltes Zellwachstum ist in diesen Prozessen kaum bzw. nur sehr eingeschränkt möglich. Das Konzept, mittels Schaum oberflächenaktive, gelöste Stoffe aus einer Lösung abzutrennen, ist lange bekannt und wurde beispielsweise von Davis et al. (2001 ) in Form der Schaumfraktionierung zur Anreicherung des amphiphilen Lipopeptids Surfactin angewendet. U.a. wurde der Einfluss der An- und Abwesenheit von Zellen in der Schaumfraktion untersucht. Nachteilig funktioniert das Konzept nur bei den antimikrobiellen, antiviralen und anti-inflammatorischen Surfactinen. In dem von Davis offenbarten Reaktoraufbau wird der Schaum über den Reaktorkopf nach oben abgeführt. Nachteilig werden dabei beim Aufsteigen des Schaumes so viel Kräfte auf die Schaumblasen ausgeübt (Verwirbelung und Schubkräfte), dass viele Schaumblasen zerplatzen und als Flüssigkeit zurück in den Reaktor fließen. Je nach den amphiphilen Eigenschaften der produzierten Substanz unterscheidet sich das Schäumungsverhalten und der Reaktoraufbau ist nicht universell für verschiedenste solcher amphiphiler Substanzen einsetzbar.
Yeh et al. (2006) befassen sich mit der Optimierung der biotechnologischen Produktion amphiphiler, oberflächenaktiver Moleküle (Biosurfactantants) zur Reduktion der Produktionskosten. Exemplarisch wurde dafür Surfactin verwendet. Yeh zielt darauf ab, die bei biotechnologischen Produktionsverfahren problematische, intensive Schaumbildung zu unterdrücken. Eine sonst übliche Zugabe sogenannter Antischaummittel (anti-foaming agents) kommt bei Yeh nicht in Betracht, so dass u.a. die Rühr- und Belüftungsvorgänge optimiert werden mussten. Das Lipopeptid Surfactin bindet an der Schaumfraktion und wird dort konzentriert. Sie entwickelten dazu einen Bioreaktor für den Batchbetrieb mit einem am Gasauslass integrierten Schaumsammelgefäß, einem Zellrecycler und sowie Surfactin- Fällungseinheit. Der Schaum wird dabei, ähnlich wie bei Davis et al. (2001 ), am Deckel über den Gasauslass in das Schaumsammelgefäß überführt. Maximale Produktionsraten lagen bei 190 mg/L/h. Es wird der Teil des Mediums, der mit dem Schaum abgeführt wird, recycelt und zurück in den Reaktor geführt; aber kein frisches Medium zugeführt, um verbrauchte Medienkomponenten zu ersetzten und den Prozess kontinuierlich führen können.
Nachteilig ist zum einen die Ausgestaltung des Reaktors in der Form, dass der Schaum durch den Gasauslass überführt wird, wobei gewöhnlicherweise und wie in der Abbildung angedeutet der Gasauslass einen vergleichsweise kleinen Durchmesser im Sinne von üblichen Gasleitungen aufweist. Weitere Hinweise zur Ausgestaltung dieses Gasauslasses, über den der Schaum überführt wird, werden nicht offenbart.
Nachteilig ist zum anderen die Anordnung dieses Auslasses im Deckel. Der offenbar kleine Durchmesser im Sinne üblicher Gasleitungen sowie das Aufsteigen des Schaumes bis zum Deckel bewirken relativ große mechanische Kräfte, die ein Zerplatzen der Schaumblasen bewirken, bevor der Schaum das Schaumsammelgefäß erreicht.
Auch Coutte et al. (2010) zielen in ihren Arbeiten auf eine Schaumunterdrückung ab, benötigen auf der anderen Seite aber für den eingesetzten Bakterienstamm Bacillus subtilis hohe 02-Gehalte. Sie modifizierten dafür einen konventionellen Fermenter und integrierten eine Hohlfaser-Membran als gas-flüssig-Kontaktor, der als Begasungssystem diente. Die Schaumbildung wurde so auf Null unterdrückt.
Ein Referenz-Batchreaktor, bei dem auf gewöhnliche Weise begast wurde, sammelte den Schaum, wie in den vorgenannten Publikationen auch, über einen Auslass am Deckel. Nachteilig an der Hohlfaser-Membran war, dass das hergestellte Siderophor, hier Surfactin bzw. Fengycin, teilweise an der Membran adsorbiert
Andere bekannte Verfahren, die auch auf der Unterdrückung der Schaumbildung basieren, sind beispielsweise die von Lee et al. (2004) offenbarte Begasung der Kulturlösung durch Zusatz von Wasserstoffperoxid, der sich, u.a. durch den Metabolismus der Mikroorganismen, zu Sauerstoff zersetzt, mit dem Ziel den Gaseintrag und damit die Verwirbelung im Medium so zu verringern, dass sich kaum mehr Schaum bildet. Die Verfahrenskosten sind allerdings hoch.
Der größte Teil der biotechnologischen Verfahren zur Fermentation unterdrücken die Schaumbildung, da das Risiko für Kontaminationen vorrangig über beispielsweise Ventile und Schlauchansätze im Kopfbereich der Reaktoren und damit einhergehend den Verlust der sterilen Bedingungen im Reaktor steigt. Dafür werden meist Schaumunterdrücker (anti- foaming agents) zugesetzt.
Andere, übliche Methoden zur Schaumunterdrückung sind rotierende Scheiben im Reaktor, die den Schaum zerschlagen oder Luft- oder Flüssigkeitsduschen, d.h. dass über dem Schaum innerhalb des Reaktors Luft oder Flüssigkeit möglichst breit über den Schaum ergossen wird, so dass die Schaumblasen dadurch zerplatzen.
Aufgabe der Erfindung ist es, einen verbesserten Reaktoraufbau bereitzustellen zur Gewinnung amphiphiler Siderophore aus Mikroorganismenkultur. Der gebildete Schaum soll kontinuierlich in Form stabiler Blasen gesammelt werden können, ohne zusätzliche Tenside zugeben zu müssen. Die Erfindung soll universell für alle amphiphilen Siderophore einsetzbar sein, auch für solche, die nur ein schwaches Schäumungsverhalten aufweisen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche. Vorzugsweise Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der jeweils rückbezogenen Unteransprüche.
Die technische Aufgabe wird durch die folgende Erfindung gelöst:
Gegenstand der Erfindung ist ein Reaktor zur Gewinnung amphiphiler Siderophore aus einer Mikroorganismenkultur, umfassend:
(a) Vorrichtung zum Rühren und/oder Begasen, und
(b) Ablauf für Schaum, enthaltend die amphiphilen Siderophore, in der Seitenwand des Reaktors,
(c) Deckel
- wobei die Unterkante des Ablaufs für Schaum (b) als Überlauf in einer Höhe liegt, die im Bereich von 40-75% der Gesamthöhe des Reaktors, von unten gemessen, liegt, und
- wobei der Ablauf für Schaum horizontal nach außen oder nach unten außen verläuft oder als Überlauf ausgestaltet ist.
Erfindungsgemäß werden mit dem Reaktor durch Fermentation (d.h. durch Abbau organischer Stoffe durch Mikroorganismen) hergestellte amphiphile Siderophore gewonnen.
(a) Mit der Vorrichtung zum Rühren und/oder Begasen wird die Kulturlösung während der Fermentation homogen durchmischt und/oder mit dem notwendigen Gas durchströmt (begast). Durch die Begasung werden zum einen die je nach Mikroorganismus notwendigen Bedingungen wie beispielsweise Sauerstoffgehalt in dem Kulturmedium (mittels des Gases O2) und/oder pH-Wert des Kulturmediums (beispielsweise mit CO2) reguliert.
Zum anderen wird durch die Stärke der Begasung die Menge des gebildeten Schaumes reguliert.
Es ist explizit umfasst, dass mindestens zwei oder mehr separate Vorrichtungen vorliegen, wovon meist nur eine zum Rühren und die anderen zum Begasen vorgesehen sind. (b) Erfindungsgemäß bedeutet Ablauf für Schaum, die Stelle an der Reaktorwandung, an der der Schaum in Richtung eines Sammelbereiches überläuft, d.h. abgeführt wird. Der Ablauf für Schaum kann horizontal nach außen oder nach unten außen verlaufen oder als Überlauf ausgestaltet sein. Überlauf umfasst sowohl die Ausgestaltung, im einfachsten Fall, als Loch in der Reaktorwand als auch als Überlaufkante.
Das Abführen des Schaumes beinhaltet sowohl ein selbstständiges Überlaufen des Schaumes als auch ein mit technischen Hilfsmitteln wie Schieber oder Gasstrom unterstütztes Ablaufen des Schaumes. Die Energieeinwirkung auf den Schaum wird dabei möglichst gering gehalten um das Zerplatzen der Schaumblasen vor dem Ablaufen in einen Sammelbereich zu minimieren. Dieser Sammelbereich ist insbesondere offen oder geschlossen ausgestaltet.
Die Position des Ablaufes definiert sich durch die Höhe der Unterkante (=unterer Scheitelpunkt) des Ablaufs für Schaum (b). Im Sinne der Erfindung ist diese Unterkante der tiefste Punkt zum Überlaufen des Schaumes. Er wird relativ zur Gesamthöhe des Reaktors angegeben. Die Gesamthöhe des Reaktors im Sinne der Erfindung wird gemessen vom Reaktorboden bis zur Oberkante des Deckels, ohne Anschlüsse, ohne Leitungen und ohne Rohre im Deckel.
Vorteil der erfindungsgemäßen Höhe der Unterkante des Ablaufs für Schaum (b) ist, dass so der gebildete Schaum, der die Siderophore enthält, dort abgeführt werden kann, wo er entsteht. Auf diese Art wird die Energie, die oberhalb der Oberfläche des Kulturmediums im Reaktor auf oder innerhalb des Schaumes wirkt, minimiert (z.B. beim weiten Aufsteigen des Schaumes zu einer Deckelöffnung oder schräg nach oben, oder beim zu schnellen Schieben des Schaumes mit einem Schieber).
Vorteil des erfindungsgemäßen Verlaufs des Ablaufs für Schaum (b) ist zum einen der gleiche wie oben, nämlich ein minimierter Energieeintrag zwischen den Blasen, dadurch dass der Schaum formbedingt nicht unnötig weiter nach oben aufsteigen muss. Er läuft direkt an der Unterkante (unterer Scheitelpunkt) des erfindungsgemäßen Ablaufs für Schaum (b) seitlich oder nach unten ab. Dadurch wird die Energieeinwirkung zwischen den Blasen klein gehalten. Zum anderen bewirkt dieser Verlauf des Ablaufs, dass der Kopfbereich des Reaktors, d.h. der Deckel und Bereiche direkt daneben, frei bleibt für die anderen Anschlüsse (beispielsweise Ventile, Öffnungen, Schläuche, Kühlmantelzu-/-ablauf etc.), die in der Fermentation notwendig sind.
(c) Zweckmäßigerweise besteht der Reaktor aus einem Deckel und einem Grundgefäß. Der Deckel verschließt das Grundgefäß an der Oberseite und weist üblicherweise u.a. auch andere Zu- und Ableitungen in Form von Öffnungen bzw. Ventilen auf. Insbesondere ist er abnehmbar. Bevorzugt befindet sich dabei der erfindungsgemäße Ablauf für Schaum (b) am Grundgefäß.
Siderophore sind eine Gruppe der Komplexbildner. Als Siderophore (gr. sideros = Eisen, gr. phorein = tragen) bezeichnet man von Mikroorganismen und Pflanzen synthetisierte, wasserlösliche, niedermolekulare, organische Substanzen, die biologisch abbaubar sind. Sie binden Fe(lll)-lonen mit hoher Spezifität und Affinität unter Bildung stabiler Chelatkomplexe und sind für den Eisen-Transport in die Zelle verantwortlich. Zu der Gruppe der amphiphilen Siderophore gehören solche Siderophore, die sowohl hydrophile als auch hydrophobe Bestandteile besitzen. Das sind beispielsweise viele der marinen Siderophore, wie beispielsweise Marinobactine, Aquacheline, Amphibactine, Ochrobactine, Synechobactine, Imaqobactin, oder Loihicheline, das Acinetoferrin, Cupriachelin, Variocheline, Imaqobactin, Variobactin u.v.m.
Dagegen ist beispielsweise das marine Siderophor Petrobactin ohne Fettsäurereste nicht oder nur kaum amphiphil. Die folgenden Strukturen zeigen einige Vertreter der Übergruppe der Siderophore.
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Mycobactin T
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Wie aus den Strukturformeln der Siderophore hervorgeht, enthalten Siderophore mehrere polare (hydrophile) Gruppen, insbesondere Carbonyl, Hydroxyl, Amino, Amid oder Hydroxam. Die amphiphilen Siderophore enthalten nun zusätzlich auch apolare (hydrophobe) Kohlenwaserstoffketten mit oder ohne Doppelbindungen (Fettsäurereste). Das Vergleichsbeispiel Petrobactin dagegen besitzt keinen solchen hydrophoben Fettsäurerest und ist nicht amphiphil.
Mikroorganismen im Sinne der Erfindung bezeichnet Pilze, Bakterien und Algen.
Kontinuierliches Abführen im Sinne der Erfindung bedeutet, dass, nach einer Startphase, während der vollständigen Fermentationsdauer der gebildete Schaum gesammelt wird. Die Startphase ist nötig, damit die Mikroorganismen genügend amphiphiles Siderophor bilden konnten und damit sich genügend Schaum bilden konnte, um die Unterkante des Ablaufs für Schaum (b) zu erreichen.
Fermentation beschreibt in der Biotechnologie Prozesse, bei denen Mikroorganismen, die in großem Maßstab unter aeroben oder anaeroben Bedingungen kultiviert wurden, ein Substrat in ein nützliches Produkt umwandeln.
Der erfindungsgemäße Reaktor eignet sich vorteilhaft zur kontinuierlichen Gewinnung der amphiphilen Siderophore, insbesondere für einen Zeitraum von mindestens 2 Wochen. Ein weiterer Vorteil ist, dass durch die erfindungsgemäße Ausgestaltung des Reaktors die Energieeinwirkung auf die gebildeten Schaumblasen oder zwischen ihnen bis zum Überlauf am „Ablauf für Schaum...“ (b) so niedrig wie möglich gehalten wird und dass die Schaumblasen somit an einem vorzeitigen Zerplatzen und Zurücklaufen ins Kulturmedium als Flüssigkeit gehindert werden. Vorteilhaft in diesem Zusammenhang sind insbesondere der nicht zu kleine Durchmesser sowie die Anordnung in der erfindungsgemäßen Höhe des Reaktors und der Verlauf des Ablaufs für Schaum.
Vorteilhaft ist der Ablauf für Schaum (b) so am Reaktor angebracht, dass damit vorrangig Schaum abgeführt wird und nicht„überlaufendes“ Kulturmedium.
Des Weiteren bleibt der Kopfbereich frei für andere Anschlüsse, die in der Fermentation notwendig sind.
Ein weiterer Vorteil ist, dass bei der Fermentation auf die Zugabe von chemisch hergestellten Tensiden verzichtet werden kann, da die amphiphilen Siderophore selbst schäumen. Die Erfindung ermöglicht folglich die Durchführung ökologischerer Prozesse. Aufgrund der Abwesenheit zusätzlicher Tenside ist in diesem Zusammenhang auch die Aufreinigung der Siderophore weniger aufwendig.
Vorteilhaft sind auch keine kostenintensiven Schaumunterdrückungs-Chemikalien (anti- foaming agents) mehr nötig, da die intensive Schaumbildung bei der Erfindung nicht mehr stört, sondern sogar gewünscht ist. Analog obiger Ausführungen führt auch die Abwesenheit solcher Schaumunterdrückungs-Chemikalien zu einer weniger aufwendigen Aufreinigung der Siderophore im Vergleich zum Stand der Technik.
Vorteilhaft ist ebenfalls, dass durch die Erfindung weniger Aufreinigung als bei anderen biotechnologischen Herstellungsvarianten oder -Vorrichtungen notwendig ist, da die hergestellten Siderophore bereits im Schaum angereichert sind und damit prozentual mit weniger Verunreinigungen wie Mikroorganismen, abgestorbene Zellbestandteile, Nährstoffe oder Vitamine verunreinigt sind.
Des Weiteren ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch günstiger als andere Methoden, da die Aufreinigung biotechnologisch hergestellter Produkte normalerweise große Kosten verursacht. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Mikroorganismus der Bakterienstamm Marinobacter sp.
In einer Ausführungsform ist der Reaktor aus einem nicht-metallischen, inerten Material, insbesondere ausgewählt aus glasierter Keramik, Teflon, Glas und Emaille. Bevorzugt ist er aus Glas oder Emaille, besonders bevorzugt aus Glas. Insbesondere das Grundgefäß des Reaktors ist aus diesem Material.
(d) und/oder (e) In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Reaktor zusätzlich eine „Zuführöffnung für Kulturmedium und/oder Nährstoffe“ (d) und/oder eine„Abführöffnung für altes Kulturmedium“ (e).
Durch die Zuführöffnung (d) werden das Kulturmedium und/oder Nährstoffe in den Reaktor geführt und durch die Abführöffnung (e) wird altes Medium abgeführt. Insbesondere sind dabei auch mehr als je eine solcher Öffnungen umfasst. Es ist auch umfasst, dass Korrekturmittel durch die Zuführöffnung (d) zugegeben werden oder dass Messsonden eingeführt/eingehangen werden. Insbesondere sind beide Öffnung auch geeignet, Proben zu entnehmen.
In einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform ist diese Abführöffnung für altes Kulturmedium im unteren Drittel des Reaktors angeordnet, insbesondere unterhalb der Grenze 1/3 der Gesamthöhe des Reaktors, besonders bevorzugt im unteren 1/5.
In einer anderen Ausführungsform ist der Reaktor ein Einwegreaktor (Single-Use-Reactor). Dieser Reaktor ist als Beutel ausgeführt, der Reaktor und Deckel (c) in sich vereint, und kann in eine mehrfachfach nutzbare Halterung eingesetzt werden. In dieser Ausführungsform ist somit dieser Beutel als erfindungsgemäßer Reaktor zu verstehen und ist aus einem Einwegmaterial hergestellt. Das Kulturmedium kommt bei der Fermentation nur mit dem Beutel in Berührung. Das Einwegmaterial ist bevorzugt Polyethylen. Insbesondere wird dabei ein „Beutel“ aus dem Einwegmaterial in die Halterung gebracht und alle vorgesehenen Verbindungen zwischen Beutel und Halterung/Anschlüssen dicht hergestellt, wo nötig mit Dichtungen, so dass der eigentliche Raum, wo die Fermentation stattfindet, das Innere des Beutels aus Einwegmaterial ist. Die Öffnungen des Beutels sind in dieser Ausführungsform auf die Öffnungen der Halterung abgestimmt.
In einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform ist der Reaktor annähernd zylinderförmig. In einer Ausführungsform ist der Reaktor so ausgestaltet, dass er gasdicht ist. Das heißt, dass evtl vorhandene Zuführöffnungen (d) bzw. Abführöffnungen (e) mit Ventilen ausgestattet sind und dass der Ablauf für Schaum (b) in ein abgeschlossenes Gefäß oder einen abgeschlossenen Teil des Reaktors (beides Sammelbereich genannt) mündet, und dass der Reaktor keine anderen Öffnungen zur Außenumgebung besitzt, außer wenn sie durch einen permanenten Gasstrom vom Reaktorinneren durch eine Öffnung beispielsweise im Deckel nach außen gegen ein Eindringen von Substanzen, Gasen oder Mikroorganismen gesichert sind. Der Deckel besitzt in dieser Ausführungsform vorzugsweise eine Dichtung.
In einer Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Reaktor sterilisierbar und wird vor der Fermentation mit Methoden aus dem Stand der Technik sterilisiert, d.h. im Innern auf Keimfreiheit gebracht. Dies geschieht insbesondere durch Dampf oder Chemikalien wie Ethylenoxid, Wasserstoffperoxid oder NaOH.
In einer Ausführungsform sind zusätzlich zu den erfindungsgemäßen Merkmalen (a) bis (c) noch weitere separate Zuleitungen und/oder Messsonden vorhanden. Die Messsonden sind vorzugsweise ausgewählt aus pH-, p(Ö2)- und/oder T-Sonden. Es ist in dieser Ausführungsform auch umfasst, mehrere dieser Sonden in Form einer Bypassleitung mit Pumpe anzuordnen. Der Reaktorinhalt zirkuliert dabei im Kreis und passiert die Sonden. Die Zuleitungen sind zum Beispiel Zuleitungen für Korrekturmittel wie Säure oder Lauge.
In einer alternativen Ausführungsform werden diese Korrekturmittel wie beispielsweise Säure oder Lauge nicht über separate Zuleitungen zugeführt, sondern direkt über eine zusätzlich vorhandene Zuführöffnung (d) oder wenn nötig auch über eine zusätzlich vorhandene Abführöffnung (e). Es ist in diesem Zusammenhang auch möglich, diese Zuführöffnung (d) und/oder die Abführöffnung (e), wenn es die Größe und Position in der Ausführung erlauben, für das Einführen/Einhängen solcher Messsonden zu nutzen.
(a) In einer vorteilhaften Ausführungsform ist die „Vorrichtung zum Rühren und/oder Begasen“ so ausgestaltet, dass die Geschwindigkeit des Rührens und/oder die Stärke des Begasens geregelt werden kann, insbesondere, dass sie während der Fermentation verändert werden können. Vorteilhaft kann so die gebildete Menge des Schaumes gesteuert werden.
Bevorzugt ist die Rührgeschwindigkeit in mindestens 3 Stufen regelbar, besonders bevorzugt stufenlos. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Begasungsstärke ebenfalls in mindestens 3 Stufen regelbar, bevorzugt stufenlos.
In einer Ausführungsform ist die Vorrichtung zum Rühren (a) ein Magnetrührer. In dieser Ausführungsform weist der Reaktor neben dem Magnetrührer noch mindestens eine Vorrichtung zum Begasen (a) auf.
In einer Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße Reaktor mindestens zwei Vorrichtungen zum Rühren und/oder Begasen (a), wovon eine zum Rühren und die andere zum Begasen vorgesehen ist.
In dieser Ausführungsform ist die Vorrichtung zum Begasen bevorzugt ausgewählt aus einem Belüftungsring in Bodennähe des Reaktorinneren und einer Membranbelüftung.
(b) In einer Ausführungsform liegt die Unterkante des Ablaufs für Schaum (b) in einer Höhe des Reaktors, die im Bereich von 50-75 %, der Gesamthöhe des Reaktors, von unten gemessen, liegt; bevorzugt 55-75%, weiter bevorzugt 60-75%, besonders bevorzugt 65-75%, insbesondere bei 70%.
In einer bevorzugten Ausführungsform verläuft der Ablauf für Schaum (b) stutzenartig horizontal nach außen oder gebogen nach unten außen oder schräg nach unten außen, besonders bevorzugt stutzenartig horizontal nach außen oder gebogen nach unten außen, insbesondere nur stutzenartig horizontal nach außen.
In einer alternativen Ausführungsform, in der der Reaktor mittels eines Mediums in einem außen liegenden Doppelmantel des Reaktors temperiert wird, befindet sich die obere, größtenteils als Auslauföffnung, seltener als Einlauföffnung vorgesehene Öffnung des Doppelmantels für Heiz- bzw. Kühlmedium bevorzugt oberhalb des erfindungsgemäßen Ablaufs für Schaum (b). In dieser Ausführungsform durchstößt der Schaumablauf (b) folglich den Doppelmantel. In einer alternativen Ausführungsform, in der diese Öffnung des Doppelmantels für Heiz- bzw. Kühlmedium unterhalb des Ablaufs für Schaum (b) liegt, ist es vorteilhaft möglich, nur das Kulturmedium im Reaktorinneren zu temperieren, nicht aber den Schaum. In einer bevorzugten Ausführungsform des Reaktors ist der Ablauf für Schaum (b) ausgewählt aus:
(1 )einer runden Öffnung mit einem mittleren Durchmesser im Bereich zwischen 5% bis 25% der Gesamthöhe des Reaktors,
(2)einer horizontal ovalen Öffnung
mit horizontaler Ausdehnung von mindestens 1/8 des Umfangs des Reaktors und einer Höhe von 5% bis 25% der Gesamthöhe des Reaktors, und
(3)einem Überlauf, insbesondere einem umlaufenden Überlauf.
Insbesondere ist er ausgewählt aus (1 ) und (2), besonders bevorzugt ist er (1 ).
In einer anderen Ausführungsform ist der Ablauf für Schaum (b) ausgewählt aus:
(4)einer runden Öffnung mit einem mittleren Durchmesser im Bereich zwischen 20% bis 55% der Höhe der Unterkante des Ablaufs für Schaum (d),
(5)einer horizontal ovalen Öffnung
mit horizontaler Ausdehnung von mindestens 1/8 des Umfangs des Reaktors und einer Höhe von 20% bis 55% der Höhe der Unterkante des Ablaufs für Schaum (d), und
(6)einem Überlauf, insbesondere einem umlaufenden Überlauf.
Bevorzugt liegt der mittlere Durchmesser der Öffnung bei (4) und/oder die Höhe der horizontal ovalen Öffnung bei (5) im Bereich von 20-45%, besonders bevorzugt 25-30% der Höhe der Unterkante des Ablaufs für Schaum (d).
Insbesondere ist er ausgewählt aus (5) und (6), besonders bevorzugt ist er (6).
Vorteilhaft kann der Schaum in den zwei letztgenannten Ausführungsformen mit einem vergrößerten/verbreitertem Ablauf von selbst ablaufen. Ein Zerplatzen der Schaumblasen durch Verwirbelungen an einer zu kleinen Öffnung werden damit vorteilhaft verhindert.
In den letzten Variante (3) und (6) dieser Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Ablauf für Schaum (b) bevorzugt so breit ausgestaltet, dass er umlaufend ist. Dabei bleibt der Reaktor dennoch durch den Deckel verschließbar. In einer anderen Ausführungsform ist der Reaktor mit einer Vorrichtung versehen, die das Ablaufen des Schaumes durch den Ablauf für Schaum (b) unterstützt, insbesondere einem Schieber in Höhe des erfindungsgemäßen Ablaufs (b). Bevorzugt ist der Schieber an der Achse des erfindungsgemäßen Rührers (a) befestigt, so dass er sich kreisförmig um die Achse über bzw. durch den Schaum bewegt.
In einer besonderen Ausführungsform ist der Reaktor zusätzlich versehen mit einem Ablaufventil am Reaktorboden, durch den der Reaktorinhalt nach Abschluss der Fermentation nach unten abgelassen werden kann, insbesondere auch durch einen Überdruck im Reaktor. In dieser Ausführungsform ist es notwendig, dass der Reaktor gasdicht ausgestaltet ist, da sich sonst kein Überdruck aufbauen lässt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Sammelbereich und die Verbindung von Ablauf für Schaum (b) zum Sammelbereich geschlossen, d.h. gasdicht ausgestaltet. In dieser Ausführungsform ist insbesondere auch vorteilhaft, wenn der Sammelbereich mit einem Ventil ausgestattet ist, so dass es möglich ist, einen Gasstrom aus dem Reaktorinneren über den Ablauf für Schaum (b) durch den Sammelbereich nach außen anzulegen.
In einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform wird bei Bedarf ein vorzugsweise regulierbarer Gasstrom aus dem Reaktorinneren über den Ablauf für Schaum (b) geleitet. Dazu muss der an diesen Ablauf folgende Sammelbereich entweder offen ausgestaltet sein oder bei geschlossener Bauweise ein Ventil zum Druckausgleich besitzen.
Vorteilhaft kann in dieser Ausführungsform die Bewegung des Schaumes durch den Ablauf für Schaum (b) in den Sammelbereich mit Hilfe eines Gasstromes unterstützt werden. Ist der Gasstrom besonders bevorzugt regulierbar, so kann vorteilhaft das Zerplatzen der Gasblasen vor dem Ablauf für Schaum gesteuert werden, was bei intensiver Schäumung, d.h. wenn die Schaumfraktion im Reaktor über den Ablauf für Schaum wächst, nötig sein kann, um das Zerplatzen der Blasen herbeizuführen und ein Anwachsen der Schaumfraktion bis zum Deckel zu verhindern.
(c) Bevorzugt weist der Deckel einen Durchmesser ähnlich (+/- 30%) dem maximalen Innendurchmesser (gemessen unterhalb des Ablaufs für Schaum (b)) des Reaktors auf, besonders bevorzugt sehr ähnlich (+/-10%), so dass der Deckel deutlich von anderen, kleineren Verschlüssen (wie Sichtfenstern) unterschieden werden kann. In einer Ausführungsform ist der Deckel aus dem gleichen Material wie das Grundgefäß des Reaktors. In einer anderen Ausführungsform ist er, unabhängig vom Grundgefäß, aus einem nicht-metallischen, inerten Material, insbesondere ausgewählt aus glasierter Keramik, Teflon, Glas und Emaille. Bevorzugt ist er aus Glas oder Emaille, besonders bevorzugt aus Glas.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Gewinnung amphiphiler Siderophore aus einer Mikroorganismenkultur in einem erfindungsgemäßen Reaktor, mit den Schritten:
(I) Kontaktieren eines Kulturmediums mit einer Mikroorganismenkultur in dem erfindungsgemäßen Reaktor,
(II) Durchmischen und Begasen des Kulturmediums in diesem Reaktor, und
(III) Kontinuierliches Abführen eines Schaumes, enthaltend die amphiphilen Siderophore, nach einer Startphase.
In Schritt (II) ist explizit umfasst, dass das Durchmischen und Begasen nur durch ein durch das Kulturmedium strömendes Gas erfolgt und auch der Fall, dass das Durchmischen durch einen zusätzlichen Rührer erfolgt.
Das Abführen des Schaumes (III) beinhaltet sowohl ein selbstständiges Überlaufen des Schaumes als auch ein mit technischen Hilfsmitteln wie Schieber oder Gasstrom unterstütztes Ablaufen des Schaumes. Die Energieeinwirkung auf den Schaum wird dabei möglichst gering gehalten um das Zerplatzen der Schaumblasen vor dem Ablaufen in einen Sammelbereich zu minimieren.
(I) In einer Ausführungsform wird beim Kontaktieren in Schritt (I) zusätzlich ein Tensid zugegeben, um bei Bedarf die Schaumbildung zu verstärken.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird zusätzlich an beliebiger Stelle des Verfahrens nach Schritt (I) altes Kulturmedium durch eine„Abführöffnung für altes Kulturmedium“ (e) abgeführt und frisches Kulturmedium durch eine„Zuführöffnung für Kulturmedium und/oder Nährstoffe“ (d) zugeführt. Es ist dabei explizit sowohl umfasst, dass dieses alte Medium verworfen wird und das frische Medium, welches zugeführt wird, neu ist, als auch die Variante, dass das alte Medium durch beispielsweise Filtration von u.a. toten Zellen und/oder schädlichen Metaboliten befreit wird und somit als gereinigtes (frisches) Kulturmedium wieder in den Reaktor zugeführt wird. Im letzteren Fall werden bei Bedarf dem gereinigten Kulturmedium neue Nährstoffe zugegeben. Besonders bevorzugt wird in dieser Ausführungsform das Volumen an flüssigem Reaktorinhalt (Kulturmedium während der Fermentation), konstant gehalten. Der Füllstand des Reaktors wird so über die Dauer der Fermentation ungefähr konstant gehalten, so dass vorteilhaft auch die Höhe der Schaumschicht bis zur Unterkante des Ablaufs für Schaum (b) konstant bleibt und die Menge des ablaufenden Schaumes nicht unnötig beeinträchtigt wird.
In einer besonders bevorzugten Variante dieser Ausführungsform findet dieses Abführen alten Kulturmediums und das Zuführen frischen Kulturmediums gleichzeitig, insbesondere kontinuierlich statt. Dieser kontinuierliche Verlauf findet dabei erst nach einer Startphase statt, die notwendig ist, um den stationären Zustand näherungsweise zu erreichen.
Insbesondere ist es in dieser Ausführungsform möglich, auch die Menge an Kulturmedium, die durch den abgeführten Schaum verloren geht durch Hinzufügen frischen oder recycelten Mediums im Reaktor wieder auszugleichen. Besonders bevorzugt wird in dieser Ausführungsform ein Zellrecycler verwendet, der vitale Mikroorganismen aus beispielsweise dem abgeführten alten Kulturmedium und/oder aus mit dem Schaum abgeführtem Kulturmedium abtrennt und anschließend werden diese Mikroorganismen wieder in den Reaktor zurücküberführt.
(II) In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird in Schritt (II) die Geschwindigkeit des Durchmischens mittels eines Rührers und/oder die Stärke des Begasens während der Fermentation variiert, so dass die Menge des gebildeten Schaumes gesteuert werden kann und ein kontinuierliches Abführen des Schaumes in Schritt (III) ermöglicht.
In einer Ausführungsform wird mit Gasen begast, die ausgewählt sind aus Sauerstoff, Kohlenstoffdioxid, Stickstoff und Mischungen einiger oder aller davon.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der abgeführte, mit Siderophor angereicherte Schaum, abgeführt in Schritt (III), für eine Zeit unter Ruhe stehen gelassen, so dass die Blasen zerplatzen. D.h. der Schaum fällt in sich zusammen und es verbleibt größtenteils eine Lösung aus altem Kulturmedium, die mit dem amphiphilen Siderophor angereichert ist. Diese Zeit unter Ruhe ist bevorzugt 30 min bis 24 h, besonders bevorzugt 30 min bis 5 h. Besonders bevorzugt wird dem Schaum vor dieser Ruhezeit ein Anti-Schaummittel zugegeben, welches das Zerplatzen der Schaumblasen beschleunigt. In einer wiederum bevorzugten Ausführungsform wird der im erfindungsgemäßen Verfahren in Schritt (III) abgeführte Schaum gängigen Aufreinigungsmethoden unterzogen um das Siderophor aufzureinigen. Bevorzugt sind das Chromatographie, wie FPLC, IMAC (Immobilisierte-Metallionen-Affinitätschromatographie), HIC (Hydrophobe
Interaktionschromatographie) oder IEX (lonenaustauschchromatograqphie), oder Fällung oder Solventextraktion.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Reaktors zur Gewinnung amphiphiler Siderophore aus einer Mikroorganismenkultur, insbesondere in dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Es ist möglich, alle Ausführungsformen der Erfindung miteinander zu kombinieren.
Ausführungsbeispiele
Die Erfindung wird durch die folgenden konkreten Abbildungen und Ausführungsbeispiele beispielhaft dargestellt:
Fig. 1 zeigt den erfindungsgemäßen Reaktor 10 in einer Ausführungsform aus Glas mit Zuführöffnung 20, Abführöffnung 30, Vorrichtung 40 zum Rühren und/oder Begasen, Ablauf 70 und Sammelbereich 80 für Schaum sowie Deckel 90, in einer konkreten Ausführungsform. Diese und weitere Ausführungsformen werden im Folgenden aufgeführt. Die Kultivierung des entsprechenden Mikroorganismenstammes erfolgt mit Hilfe von angepassten Kultivierungsparametern und Kulturmedium im Bioreaktor, so dass amphiphile Siderophoren mit Hilfe von Bakterien erzeugt werden. Diese werden direkt aus der Zelle ausgeschieden und befinden sich im Kulturüberstand - Schritt 1. Durch den Gaseintrag in den Bioreaktor, zur Versorgung der Bakterien, gelangen Gasblasen in das System, an die sich die Siderophoren binden können und zur Kulturoberfläche getragen werden Dort wird ein stabiler Schaum gebildet, an dem sich die Siderophoren aufkonzentrieren - Schritt 2. Dieses Schaumkonzentrat wird gezielt über einen zusätzlich angebrachten Anschluss in eine Sammelflasche überführt - Schritt 3 und 4. Durch die Zufuhr von neuem oder aufgearbeitetem Kulturmedium, kann die Kultivierung und Siderophoren-Produktion auch als kontinuierlicher Prozess durchgeführt werden.
Fig. 2 zeigt den Reaktor 10 (Darstellung nicht aller erfindungsgemäßen Bauteile zur besseren Veranschaulichung) in einer Ausführungsform mit dem Ablauf 70 für Schaum in der Ausgestlatung als umlaufenden Überlauf ((A) und (B)) sowie als horizontal-ovale Öffnung (C) und als runde Öffnung (D).
Fig. 3 zeigt den Wachstumsverlauf der beispielhaften Mikroorganismenkultur Marinobacter sp. und die Menge des abgelaufenen Schaumes in Abhängigkeit der Zeit. Die Schaumproduktion beginnt mit Einsetzen der exponentiellen Phase der Kultur und erfolgt ab dann kontinuierlich. Fig. 4 zeigt den Verlauf der Bildung des amphiphilen Siderophors Marinobactin exemplarisch während der Fermentation im Kulturmedium und in der abgelaufenen Schaumfraktion. Man sieht, dass während des Verfahrens das Marinobactin bis auf eine geringe Menge, vollständig mit Hilfe des Schaumes aus dem Reaktor hinausgetragen wird. Da der Zeitpunkt des Beginns der Schaumbildung und der Siderophorproduktion sehr eng beieinanderliegen, lässt sich vermuten, dass das Marinobactin selbst zu der Schaumbildung beiträgt.
Als Ausführungsbeispiel dient die Produktion der amphiphilen Siderophore Marinobactin mit Hilfe des marinen Bakterienstammes Marinobacter sp. DS40M6. Der entsprechende Bakterienstamm wird in zwei Liter Artificial Seawater Medium (15,5 g/l NaCI; 0,75 g/l KCl; 0,2 g/l MgS04- H20; 0,1 g/l CaCl2'2H20; 1 ,0 g/l NH4CI; 5 g/l Bernsteinsäure; 3 g/l Na2HP04; pH 7,0) in der Glas-Ausführung des Reaktors wie in Figur 1 bei 22 °C kultiviert. Der pH soll während der Kultivierung 7 betragen und wird während des Prozesses durch die Zugabe von 2 M HCl reguliert. Das Beimpfen des Bioreaktors erfolgt dabei mit so viel Volumen einer drei Tage alten Schüttelvorkultur, dass die optische Dichte im Reaktor (OD gemessen bei 600 nm) zu Beginn der Kultivierung 0,02 beträgt. Für den Gaseintrag wird Luft mit einer Flussrate von 550 ml/min über einen Belüftungsring eingetragen. Zusätzlich erfolgt die Durchmischung der Kultur unter Verwendung eines Magnetrührers bei 250 rpm. Für die Durchführung eines kontinuierlichen Prozesses wird automatisch so viel frisches Kulturmedium dem Bioreaktor zugeführt, dass der Füllstand immer bei 2 L gehalten wird. Zur Überprüfung des Zellwachstums wird auch während der Kultivierung die optische Dichte mit einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 600 nm bestimmt. Die Ermittlung der Siderophorenkonzentration erfolgt durch Durchführung des CAS Assay nach Alexander und Zuberer 1991 und einer Kalibrierung mit Hilfe des kommerziell erhältlichen Siderophors Desferrioxamin E (DFOE) (Schräder et al. 2017). U.a. Andrewas et al. (2016) beschreiben diese Messmethode ausführlich, die über die Messung der kolorimetrischen Verschiebung eines Fe-Komplexes aufgrund konkurrierender Fe-Komplexierung durch Siderophore beruht. Dabei wird die Probe sowohl aus der Kultur, als auch aus dem Schaum vor Durchführung des Assays zentrifugiert (Schräder et al. 2017).
Bei der Durchführung der Kultivierung von Marinobacter sp. und der Produktion von Marinobactin in einem kontinuierlichen Prozess, lässt sich feststellen, dass die Schaumbildung mit Beginn der exponentiellen Phase der Kultur einsetzt. Es wird angenommen, dass zu diesem Zeitpunkt die Adaption der Kultur an die Kultivierungsbedingungen erfolgt ist und der vorliegende Eisenmangel in der Kultur die Siderophorenproduktion bedingt. Allerdings muss verzögert erst eine kritische Menge Schaum gebildet werden, dass die Überführung dessen aus dem Bioreaktor in ein Sammelgefäß erfolgt. Ist dieser Punkt allerdings einmal Überschritten, erfolgt die Schaumgewinnung sehr kontinuierlich (Figur 3), was auch eine kontinuierliche Zufuhr neuen Kulturmediums nach sich zieht.
Literatur
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Bezugszeichenliste
1 Bildung amphiphiler Siderophore beim Kontaktieren des Kulturmediums mit Nährstoffen und einer Mikroorganismenkultur durch die Mikroorganismen
2 Bindung der amphiphilen Siderophore an Blasen und Konzentration im Schaum
3 Kontinuierliches Abführen des Schaumes, der die amphiphilen Siderophore enthält
4 Sammlung an Schaum gebundener Siderophore im Sammelbereich 10 Reaktor
20 Zufuhröffnung für Kulturmedium und/oder Nährstoffe
30 Abführöffnung für altes Kulturmedium
40 Vorrichtung zum Rühren und/oder Begasen
50 Luftblasen
60 Schaum
70 Ablauf für Schaum
80 Sammelbereich für Schaum
90 Deckel

Claims

Patentansprüche
1. Reaktor (10) zur Gewinnung amphiphiler Siderophore aus einer Mikroorganismenkultur, umfassend:
(a) Vorrichtung (40) zum Rühren und/oder Begasen, und
(b) Ablauf (70) für Schaum, enthaltend die amphiphilen Siderophore, in der Seitenwand des Reaktors,
(c) Deckel (90)
wobei die Unterkante des Ablaufs (70) für Schaum als Überlauf in einer Höhe liegt, die im Bereich von 40-75% der Gesamthöhe des Reaktors (10), von unten gemessen, liegt, und
wobei der Ablauf (70) für Schaum horizontal nach außen oder schräg nach unten außen verläuft oder als Überlauf ausgestaltet ist.
2. Reaktor (10) gemäß Anspruch 1 , zusätzlich umfassend:
(d) Zufuhröffnung (20) für Kulturmedium und/oder Nährstoffe, und/oder
(e) Abführöffnung (30) für altes Kulturmedium.
3. Reaktor (10) gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der Ablauf (70) für Schaum ausgewählt ist aus:
- einer runden Öffnung mit einem mittleren Durchmesser im Bereich zwischen 5% bis 25% der Gesamthöhe des Reaktors,
- einer horizontal ovalen Öffnung
mit horizontaler Ausdehnung von mindestens 1/8 des Umfangs des Reaktors und einer Höhe von 5% bis 25% der Gesamthöhe des Reaktors, und
- einem umlaufenden Überlauf.
4. Verfahren zur Gewinnung amphiphiler Siderophore aus einer Mikroorganismenkultur in einem Reaktor (10) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, mit den Schritten:
I) Kontaktieren eines Kulturmediums mit einer Mikroorganismenkultur in dem Reaktor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2,
II) Durchmischen und Begasen des Kulturmediums in diesem Reaktor, und
III) Kontinuierliches Abführen eines Schaumes, enthaltend die amphiphilen Siderophore, nach einer Startphase.
5. Verwendung eines Reaktors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Gewinnung amphiphiler Siderophore aus einer Mikroorganismenkultur.
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