JPS6015304B2 - 固形基質上で細胞を培養する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の分野 本発明は固形基質上の純粋培養で微生物株を生産する方
法と装置、特にキノコ菌糸の滅菌培養に関連する。

又本発明は他の微生物株から得られる代謝産物と抗生物
質の生産、及びテムべ（にｍｐｅｈ〉と味噌（ｍｉｓｚ
ｏ）の培養にも有用である。

本発明の背景 キノコ菌糸の生産は昔から公知である。

例えば乾燥毅粒を水と炭酸アルシウムと共にびんに入れ
て綿栓で閉鎖し、次にこれを滅菌する。滅菌後、びんを
冷却して穀粒に菌糸を接種し、再びびんを閉鎖して菌糸
培養期間放置する（米国特許第１８６９５１７号明細書
）。キノコ菌糸の培養では、栄養素と生育容器の滅菌は
キノコ菌糸の生育を抑制する他のバクテリア又はカビの
増殖を回避するために非常に必要である。又テムべの生
産は数百年間、特に東洋文化において知られている。

テムべはリゾパス（Ｒｈｙｚｏｐｕｓ）の数種で接種さ
れた大豆から発酵される。

最新の技術によればテムべはプラスチックの袋の中で急
速に発酵されるが、この袋の中でカピは大豆をケーキ状
生成物に結合している菌糸体塊を生成する。キノコ菌糸
の生育を改善する目的の米国特許第２５３０３１８号の
発明では、滅菌間のケーキ生成を阻止するため穀粒予備
加熱と膨潤工程を含み、米国特許第２６７７９１７号の
発明では、菌糸の生育に穀物基質被覆を有する木炭粒ベ
ースを使用し、又米国特許第２８５１８２１号の発明で
は菌糸の培養と出荷に滅菌可能なプラスチックの袋を使
用している。

米国特許第２８５１８２１号の方法では、細長いプラス
チックの袋に所望の基質を充填し、袋の口に呼吸可能な
炉過材料を入れて袋を閉鎖する。次にこの袋と内容物を
ガラスぴんとほぼ同じ方法、又は照射法で滅菌し、所望
の接種物を接種して培養する。この方法の利点は、高価
で脆く、かつ取り扱いが面倒なガラスびんを用せず又す
べての工程を袋のままで実施でき、培養後は中間容器に
培養菌又は菌糸を移すことないこ菌糸を生育場に輸送す
ることができる点である。培養菌の生育プラントは建造
と運営経費は比較的高価であるから、これらのプラント
は少数で遠距離位置にあるので菌糸をかなり遠距離輸送
する必要がある。プラスチック製の培養袋の出現でキノ
コ菌糸の培養と輸送に大きな改善が行われた。又菌糸の
輸送法の改善も提案された。例えば米国特許第３３３５
２１号の発明では優秀菌糸は氷を入れた気密容器で出荷
される。現在でも菌糸を接種し培養する好適方法は可操
性のあるプラスチック製容器で行われている。従って容
器の設計と構造の多くの進歩が英国特許第１１７６１８
８号明細書その他に示されており、この特許発明では炉
過要素が容器壁に組み込まれている。又米国特許第３９
３８６５８号の発明はプラスチック製の袋の壁に形成さ
れたスリット上に多孔性炉過材を使用することを示して
いる。又最近の米国特許第４０６３３８３号の発明では
、袋の紬孔ラィニングとして作用する徴孔性呼吸パネル
を有するプラスチック製の袋の中でキノコ菌糸を生育さ
せる。ガラスびん又はプラスチック製の袋を使用してキ
ノコ菌糸を培養する従来の方法では、栄養素、即ち基質
は通常容器内で滅菌された不要なバクテリャ又は他の望
ましくない微生物の増殖を阻止する。しかしこれらの方
法は多大の労働力を要する。栄養素を充填したびん又は
袋の滅菌、滅菌栄養素を入れた容器の接種及び培養間に
接種物を混合するための個々の容器内の栄養素の鷹梓は
多大の労力を必要とする。又以前、フランスのソミセル
社（ＳｏｍｙｃｅＩＣｏｍｐａｎｙ）が開発した方法、
即ちびんに充填する前に大形バッチで基質を滅菌してこ
れに接種する試みは汚染問題のため不成攻に終った。本
発明は従来の方法の問題を克服し、滅菌工程と接種工程
の労働力を減少すると共に接種と次の袋充填操作間の汚
染の可能性を最小にするものである。

又本発明の目的は栄養素を入れた容器の接種後、従来必
要とされた混合工程を省略することにある。又本発明の
目的は液体発酵法によらず、固形培地上で代謝物質を生
産する方法を提供することにある。又本発明はテムべの
ような食品の発酵用培養菌の製造に有用である。本発明
の方法のほかに、本発明の目的はこの工程を実施する装
置を提供することにある。又本発明は滅菌栄養素が大量
に接種され、混合されかつ滅菌培養容器内に汚染の恐れ
なく排出される装置を提供するものである。本発明の装
置と方法は滅菌状態下で固形基質上で微生物株を培養す
る際の多くの障害を克服するものである。本発明の要約 通常、本発明の方法は栄養素混合物を混合機、好適には
回転式混合機に導入する工程を含み、この混合機の混合
物の滅菌に必要な温度と圧力が得られ、これを維持する
性能を有するものである。

キノコ菌糸の場合の代表的な混合物は５０〜６の重量％
の穀粒又は穀物、４０〜５の重量％の水及び１重量％の
白亜からなる。この混合物を混合しかつ混合機を１２が
○又はそれ以上の温度に加熱して滅菌する。好適には滅
菌と混合間ゲージ圧１．０５ｋｇ／地の水蒸気を混合機
内に導入する。適当な滅菌を行うために上記の温度と圧
力を３０なし・し１２０分間、好適には４粉ふ間維持す
る。次に混合機と混合物を滅菌空気の正圧下で約２６℃
の温度に放冷し、接種物を混合機内に無菌的に移して栄
養素含有材料と充分に混合する。

混合後、混合機を滅菌連結器によって充填ステーション
に連結するが、この滅菌連結器は袋内に接種栄養素の所
望量を配分する定量装置を有する。充填ステーションは
滅菌空気の層流中に配置され、汚染物質が袋又は連結装
置に侵入するのを阻止する。滅菌された後にはそれぞれ
呼吸用ストリップが設けられ、袋は連結装置の排出端部
で充填される。充填された袋は培養と発送のため直ちに
密封される。本発明の好適方法によれば、キノコ菌糸の
培養に従来行われていた個々の袋又はびんに接種する厄
介な工程を省略できる。

又好適な装置を使用して実施する方法は栄養素と接種物
との混合に対して無菌環境を提供する。この方法はキノ
コ菌糸の製造、テムべのような発酵物の培養及び種々の
他の細胞列の生育に重要である。本発明の他の利点は添
付図面によるキノコ菌糸を培養する好適方法の次の詳細
な説明から明らかになろう。

本発明の説明 第１図には回転混合機１０が示される。

混合機１ ０は通常パターンンーケリー（ＰａｔｔｅＲ
ｏｎ−Ｋｅｌｌｙ）社製のＶ形混合機で、普通型式の流
体ジャケット（図示せず）を有する。他の型式の市販混
合機、例えば二重円錐型式の混合機も使用できるが、リ
ボン混合機等は洗浄と滅菌が面倒なため適当ではない。
混合機１川ま軸線１１上で回転し、かつ栄養素が導入又
は排出される装入／排出口１２を有する。第１図に示さ
れるように、混合機１０‘こは２つの開口部、装入−排
出口１２と水蒸気／空気管路３３が設けられ、これらを
経て接種物が導入される。

接種物が固形物又は粒状物質の場合には、重力によって
装入−排出口１２を経て混合機１０内に無菌的に移動さ
れる。この場合は装入−排出口１２は混合機１０の轍線
１１を通る水平面の上方一定角度傾斜した位置に置くこ
とが好適である。又液体接種物は管路３３を経て混合機
１０内に無菌的に移動される。これらの両接種法では、
すべての連結管と弁装置はバッチの汚染を阻止するため
栄養素の接種前に滅菌状態にしておかなければならない
。菱入−排出口１２はカムロック（Ｋａｍｌｏｋ：商品
名）迅速継手のような気密継手によって連結装置１３に
接続される。

この種の気密継手は滅菌されかつゲージ圧約１．０５ｋ
９／めで密封できるものでなければならない。連結装置
１３は接種された基質を定量しかつこれを培養袋に移動
する。連結装置１３はステンレス鋼管製がよく、第１弁
１４と第２弁１６、好適にはちよう形弁を有する。弁１
４と弁１６との間の空間は充填すべき培養袋の容積とほ
ぼ同じ容積を有する定量室１７を形成する。図示の連結
装置１３は充填ステーション２０の上方のフロア、即ち
床１８を貫通している。充填ステーション２０は米国連
邦調達局ＧＳＡ）制定のクラス１００の清浄室内に設け
られ、好適には滅菌空気の層流が送られる。充填ステー
ション２０１こは、連結装置１３の端部１９に鞍合され
るキャップ２１があり、このキャップで滅菌用水蒸気が
連結装置１３内に注入される。連結装置１３を滅菌後、
キャップ２１を除去して滅菌された袋２２（点線で図示
）を充填のため排出端部１９にかぶせる。連結装置１３
の排出端部に隣接して配置された加熱密封機２３は充填
後直ちに閉鎖した袋を密封する。本発明の方法は袋２２
をオートクレープ処理する必要がないから、ガス、電子
ビーム又は放射線で滅菌できるポリエチレンフィルムで
作るとよい。

この種の材料は従来のポリプロピレン又はナイロン製の
袋によりかるかに安価である。この袋にはチベック（Ｔ
ｙｖｅｋ：商品名）のような合成繊維材料製ストリップ
が設けられ、このストリップで細胞は呼吸できる。チベ
ックストリップは公知の方法で各袋に設けられる。第２
図はゲージ圧約１．０５ｋｇ／仇の空気源２７と水蒸気
源２８を有する滅菌空気−水蒸気装置２６を示す。

水蒸気源２８は蒸気トラップ２９を通って管路３１、弁
３２及び混合機１０の水蒸気入口３３を経て混合機１川
こ接続される。入口３３には混合機１０の鞠線上に回転
連結装置３４が配置される。空気供給源２７は弁３７を
経て管路３６に接続される。管路３６には空気源２７か
ら送られる空気の無菌化に使用されるフィル夕３８が設
けられる。好適にはこのフィル夕はドムニックハンター
バイオーエツクスフイル夕（ＤｏｍｎｉｃｋＨｕｎｔｅ
ｒＢｉｏ−ｘ Ｆｉｌｔｅｒ：商品名）、ポールウルテ
イポアフィルタ（Ｐａｌｌ Ｕ１ｔｉｐｏｒ Ｆｉｌｔ
ｅｒ：商品名）等のような無菌化用フィル夕である。フ
ィル夕３８の排出端部は管路３９に接続され、この管路
３９は弁４１を経て混合機入口管路３３に、又弁４２，
４３を経て定量室１７に接続される。又空気−水蒸気装
置２６には管路４４，４６とこれらの弁４７，４８があ
り、連結装置１３と空気フィル夕３８にそれぞれ滅菌用
水蒸気を供給する。この装置２６の一部として充填ステ
ーション２０のキャップ２１にはドレン５１と蒸気トラ
ツプ５２が設けられる。キノコ菌糸を培養する好適方法
では、混合機１０‘こ装入−排出口１２からラィムギ粒
、白亜のような固形基質と、通常比率の水を装入する。

装入時の混合機は低温又は子熱による高温状態にあるが
、混合が始まるとジャケットを加熱して混合物の温度を
最低１２〆０にする。同時に弁３２を開いてゲージ圧約
１．０５ｋ９／均の蒸気を混合機１０‘こ導入する。混
合は１２２０で３５ないし１２５分、好適には４５分、
継続する。公知のように、余分の滅菌は菌糸の生育を遅
くするから、栄養素含有混合物の滅菌に必要な最短時間
が望ましい。滅菌終了後、混合機に対する水蒸気導入を
中止し、混合物の温度が１０なし、し３かＣになるよう
に混合機のジャケットを冷却する。

好適には水蒸気を放出して混合機の冷却を促進する。水
蒸気を放出してから滅菌空気を空気源２７及びフィル夕
３８から入口３３を経て混合機内に導入し、混合機内の
正圧に維持する。冷却後、後鐘物を混合機内に導入する
。好適には、接種物が固体の場合には装入−排出口１２
から重力供給で、又接種物が液体の場合には管路３３を
経て混合機に接種物を無菌状態で菱入する。装入−排出
口１２を無菌状態で装入するには、この開口部を最初滅
菌しなければならず、又装入−排出口１２に滅菌空気の
流出が必要である。又袋入−排出口１２に取付けた滅菌
高圧ガスボンベによって、滅菌固形接種物を移動するこ
とも可能で、この場合には滅菌空気流は不要である。又
他の適当な移動方法も使用できる。接種物は滅菌栄養素
と充分に混合される。混合終了後、連結装置１３を装入
−排出口１２に連結して滅菌する。この滅菌は排出端部
１９をキャップ２１で閉鎖し、弁４３，４７と管路４４
を経て連結装置１３に水蒸気を導入することによって行
われる。滅菌終了後、キャップ２１を除去して袋を排出
端部１９にかぶせる。次に装入−排出ロー２を第１弁１
４と共に開放し、同時に第２弁１６を閉鎖する。接種基
質は定量室１７に充填され、第１弁１４を閉鎖する。次
に弁１６を開放して排出端部１９上の袋２２の中に定量
室１７の内容物を排出する。同時に第１弁１４を開き、
滅菌空気を定量室１７内に導入して基質が出たあとの空
間に充填する。又混合機から混合物が排出後、混合機１
０内に滅菌空気を導入して、この残留空間の圧力を小さ
い正圧に維持することが望ましい。上記のように清浄室
で袋２２の充填が行われるが、滅菌空気の層流中に充填
ステーション２０を設け、袋の中に汚染物質が侵入する
ことを阻止することも可能である。各袋を充填後、呼吸
用ストリップを遮る空気だけが、これに続く培養間に入
るように袋を密封する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の装置の略示立面図で、第２図は空気−
水蒸気供給装置の管路図である。 １０・・・回転混合機、１２・・・袋入−排出口、１７
・・・定量室、２０・・・充填ステーション、２３・・
・加熱密封装置、２６・・・空気−水蒸気装置、２７・
・・空気供給源、２８…水蒸気源、３４…回転式連結装
置。 Ｆ／Ｇ／ 打Ｇ２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 加熱と加圧が行われる混合機内の固形基質上で細胞
   を培養する方法で：ａ 水分を含む栄養粒子混合物を、
   全混合物を滅菌するのに充分な時間と温度で上記混合機
   内で大量に混合かつ滅菌して均一な滅菌固定基質を生成
   する工程；ｂ 該滅菌基質を冷却する工程； ｃ 混合機内の大量滅菌基質に接種物を大量接種する工
   程；ｄ 混合機内の上記接種物と滅菌基質を混合して接
   種混合物を作る工程；及びｅ 少くとも１個の滅菌培養
   容器に上記混合機から滅菌混合物を装入する工程；を含
   み、 上記の工程ｃ，ｄ及びｅが加圧下の滅菌状態で行
   われることを特徴とする、固定基質上で細胞を培養する
   方法。 ２ 上記第１項記載の方法で、接種混合物を複数部分に
   分割し、これらの各分割部分を複数の滅菌培養容器に装
   入する工程、を含む方法。 ３ 上記第２項記載の方法で、接種混合物を各滅菌培養
   容器に装入する間に各容器の周囲に滅菌空気の層流を流
   す方法。 ４ 上記第２項記載の方法で、栄養粒子が穀粒又は穀物
   及び白亜からなる方法。 ５ 上記第４項記載の方法で、又接種物がキノコ菌糸で
   ある方法。 ６ 上記第２項記載の方法で、滅菌した培養容器が、呼
   吸用ストリツプを有する可撓性プラスチツクの袋である
   方法。 ７ 上記第１項記載の方法で、混合と滅菌が１２２℃で
   ３５ないし１２０分間行われる方法。