DE19711114A1 - Kultursystem Mikrokapillare - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Kultursystem zur Modellierung von kapillären Gefäßen auf der Grundlage poröser, mit biologischen Grenzflächen, wie Membranen oder Zellen, besiedelter polymerer hohler Fasern in einem Kulturmedium. Das System eignet sich zur Simulierung, körpereigener biologischer Vorgänge, wie Angiogenese, Entzündung oder Metastasierung.

Es ist bekannt, daß sich körpereigene biologische Vorgänge, wie Angiogenese, Entzündung oder Metastasierung auch in vitro an porösen, zweidimensionalen Membranen untersuchen lassen (Snyderman, R., Science 213, 1981, 230-237). Diese Membranen vermitteln die Zelladhäsion und ermöglichen eine Migration von biologischen Substanzen und Zellen durch die Poren.

Die genannten biologischen Vorgänge treten im Körper in bzw. an dreidimensionalen beströmten Gefäßen auf. Für eine korrekte Modellierung dieser Vorgänge ist deshalb auch in vitro eine dreidimensionale Anordnung der Zellen (Williams, S., Lab. Invest 69, 1993, 491-493; Goto, F. u. a., Lab. Invest. 69, 1993, 508-517) sowie eine Beströmung (Lasky, L., Science 258, 1992, 964-969) notwendig. Derzeit ist jedoch kein in vitro Modell bekannt, das eine dreidimensionale, beströmbare und gefäßähnliche Anordnung poröser Membranen zum Inhalt hat.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Simulierung körpereigener biologischer Vorgänge zu ermöglichen. Die Aufgabe wurde mit Hilfe kapillärer Gefäße gelöst, die aus porösen, mit biologischen Grenzflächen besiedelten polymeren hohlen Fasern, dem intrakapillären Raum, bestehen und die sich in einem Kulturraum, dem extrakapillären Raum, befinden. Als Grenzflächen sind biologische Materialien, wie Membranen oder Zellen eingesetzt worden. Erfindungsgemäß werden die zu modellierenden kapillären Gefäße innen- und außenseitig von beweglichen Medien umgeben oder durchströmt. Die Poren in den hohlen Fasern sind für Zellen, Viren oder biologische Substanzen durchlässig.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Fasern in dem Kultursystem ist es überraschenderweise gelungen, körpereigene biologische Vorgänge, wie Angiogenese, Entzündung oder Metastasierung zu simulieren.

Unter biologischen Grenzflächen werden solche Flächen verstanden, die aus einer oder aus mehreren biologischen Substanzen gebildet werden, wie biologische Membranen oder konfluente Zellmonolayer. Als biologische Substanzen werden Zellen und ihre Bestandteile, Mikroorganismen und ihre Bestandteile oder Viren und ihre Bestandteile bezeichnet, ferner Biomoleküle, wie Eiweiße, Lipide, Zucker und ihre biologischen Zusammensetzungen, Glykoproteine, Glykolipide oder Lipoproteine und ihre in biologischen Systemen erzeugten niedermolekularen Substanzen, wie Aminosäuren, Fettsäuren oder Mono- und Oligosaccharide.

Mit dem erfindungsgemäßen Kultursystem ist ein Modell geschaffen worden, das die Gefäß-Gewebcharakteristik widerspiegelt. Das Kultursystem besteht aus einer oder aus mehreren porösen polymeren Kapillaren, Intrakapillärer Raum (IR) genannt, die in einem zylindrischen Kulturraum, Extrakapillärer Raum (ER) genannt, eingebettet sind. Der IR steht z. B. für ein kapilläres Blutgefäß, der ER modelliert das Gewebe. Das Kultursystem gestattet damit eine dreidimensionale Anordnung von Zellen in einem intrakapillären und extrakapillären Raum und wird so der räumlichen Anordnung von Zellen in vivo gerecht.

Die porösen hohlen Fasern (Hohlfasermembranen) werden durch Modifikation unporöser Polycarbonatfasern hergestellt. Dazu werden durch Bestrahlung mit I⁻, Cl⁻ und Br⁻-Ionen Poren in die Fasern gebracht. Die Porendichte wird über die Bestrahlungsdauer gesteuert. Durch Behandlung mit einer Ätzlösung erfolgt anschließend eine hydrolytische Degradation der Polymerstränge, was zu einer definierten Erweiterung der Poren führt. Der Porendurchmesser entspricht der linearen Funktion der Ätzzeit (Lück, H.B. u. a., Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B50, 1990, 395-490).

Derart vorbereitete Fasern werden nach ihrer Besiedelung mit menschlichen oder tierischen Zellen so in einem Kulturraum angeordnet, daß sie, wie Kapillaren des Organismus, von Flüssigkeiten durchströmt werden können und ferner, daß die Konfluenz des Monolayers mit Hilfe physikalischer Methoden meßbar ist. Die Kapillaren befinden sich in einem Kulturraum, dem extrazellulären Raum (ER), der zum einen mit beliebigen Zellen besiedelt und zum anderen optimal versorgt werden kann. Der extrazelluläre Raum stellt einen Kulturraum dar, der mit Kulturmedium gefüllt ist. Intra- und extrazellulärer Raum (IR und ER) können separat versorgt werden. Aus ihnen lassen sich auch separat Proben entnehmen. Im extrazellulären Raum befinden sich Animpf-Ports für die lokale Applikation von Mikromengen an Wirkstoffen. Durch den Einsatz von semisoliden Medien ist eine verzögerte Ausbreitung der Wirkstoffe unter Bildung eines Konzentrationsgradienten an dem Kapillargefäß gewährleistet.

Unter polymeren hohlen Fasern werden solche aus organischen synthetischen polymeren Materialien verstanden, wie z. B. aus Polyalkenen bzw. -alkinen, wie Cupren, Poly­ carbonaten bzw. anderen Polyestern, wie Polyethylentherephthalat, ferner Polyamiden, Polyimiden oder Polysulfonen.

In einem erfindungsgemäßen Modell für ein kapilläres Blutgefäß in vitro wird eine polymere hohle Faser, deren Wand Poren mit einem Durchmesser von 3 und mehr Mikrometern aufweist, lumenseitig mit menschlichen oder tierischen Endothelzellen - vorzugsweise isoliert aus aus Hautkapillaren oder aus der Nabelschnurvene - bis zum konfluenten Monolayer (abgeschlossene Einzelschicht) besiedelt (Intrakapillärer Raum, IR). Davor wird die polymere Hohlfasermembran zur Verbesserung der Besiedelungseigenschaften mit Bestandteilen der extrazellulären Matrix, vorzugsweise mit Kollagen I oder Matrigel, beschichtet.

In einem weiteren Modell sind Endothelzellen in einer porösen, mikroskopierbaren Polycarbonat-Mikrokapillare dreidimensional angeordnet. Diese Kapillare stellt das kapilläre Blutgefäß-Modell dar. Sie ist von einem Hohlzylinder (Kulturraum) umgeben, der das Gewebe modelliert. Durch die Kapillarporen können Zellen migrieren. Damit lassen sich an einem Endothelzellmonolayer die Metastasierung (Migration von Tumorzellen), Angiogenese (Proliferation und Migration von Endothelzellen) und Entzündung (Migration von Leukozyten) simulieren.

Eine bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung in Form einer Polycarbonatmatrix hat sich in Tests der Cytotoxizität und Besiedelbarkeit als besonders geeignet für die Kultur von Endothelzellen erwiesen. In diesem Modell wurden kollagengesättigte Polycarbonatkapillaren konfluent mit primären Endothelzellen - gewonnen aus Nabelschnurvenen - besiedelt.

Das erfindungsgemäße in vitro Modell wird durch Oberflächenbegasung mit Sauerstoff versorgt und der Medien pH Wert durch Puffersysteme reguliert.

Das konzipierte in vitro Modell läßt sich als Entzündungsmodell einsetzen. Mit den Entzündungsmediatoren IL1β und TNFα wird eine frühe akute Entzündung simuliert - wie die migrierten Granulozyten und das Cytokinmuster belegen. Das Modell schließt dabei Adhärenz, Migration (Diapedese) und Chemotaxis von Leukozyten, wichtige Schritte einer in vivo ablaufenden Entzündung, ein.

Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1: Das Kultursystem Mikrokapillare

Das Kultursystem Mikrokapillare besteht aus einem Hohlzylinder, in dem eine Polymerkapillare eingeklebt ist. Der in der Kapillare eingeschlossene Raum wird als Intrakapillärer Raum (intracapillary, IC) bezeichnet, der im Hohlzylinder eingeschlossene Raum als Extrakapillärer Raum (extracapillary, EC).

Die Zugänge (Ports) zu IC und EC werden durch Luerstecker, einem in der Medizintechnik gebräuchlichen Stecker-Buchsen-System aus Polypropylen, geschaffen. Sie sind über das Luer-System mit Schläuchen verbindbar, so daß ein intrakapillärer Kreislauf und ein extrakapillärer Kreislauf entsteht. Die Größe der Ports des EC werden so gewählt, daß Mikroelektroden in den extrakapillären Raum integriert werden können. Durch die Ports des EC können mit einer Pipette Volumina entnommen oder zudosiert werden. Dadurch ist ein Füttern der Zellen und das Entnehmen selbst kleinster Volumina problemlos möglich.

Beispiel 1.1.: Polycarbonatkapillaren

Bei den in den Hohlzylinder eingeklebten Kapillaren handelt es sich um poröse Polycarbonatkapillaren.

Es wurden Kapillaren von durchschnittlich 60 mm Länge verwendet. Daran wurden die Maße des Hohlzylinders angepaßt:

Für den Hohlzylinder wurden 2 ml Pipetten aus Polyethylen verwendet. Diese sind leicht und preiswert verfügbar, mikroskopierbar und biokompatibel.

Die Parameter des Kultursystems sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

Beispiel 1.2.: Besiedelung des Kultursystems

Das Kultursystem Mikrokapillare wird in einem CO₂-Inkubator betrieben, der mit einem Gasgemisch aus Luft und 5% CO₂ versorgt wird. Die Messung und Regelung der CO₂-Kon­ zentration in der Gasphase des Inkubators erfolgt über die Inkubatorregelung. Die Luftfeuchtigkeit im Inkubator beträgt mehr als 90%. Die Temperatur wird durch die Inkubatorregelung auf 37°C gehalten. Während der Besiedelung mit Endothelzellen wird das Kultursystem nicht perfundiert.

Das Kultursystem wird durch Oberflächenbegasung mit Sauerstoff versorgt. Der im Kultursystem vorherrschende pO₂ wird mit der im EC integrierten faseroptischen Sauerstoffsonde (MOPS) on-line erfaßt. Über eine R5232 Schnittstelle ist der MOPS mit dem Prozeßrechner verbunden. Die Datenerfassung erfolgt mit einer Abtastrate von 1 min. Eine Regelung des pO₂ wird nicht vorgenommen.

Der pH-Wert wird nur über die Medienpufferung geführt. Dazu muß ein Puffersystem mit hohem Pufferwert verwendet werden. Es wurde zuvor der Pufferwert verschiedener Medienformulierungen mit den Pufferkomponenten Natriumhydrogenkarbonat und HEPES bestimmt.

Das Kultursystem erlaubt eine Proliferation der Endothelzellen mit hoher Vitalität bis zur überwiegend konfluenten Anordnung in einem dreidimensional ausgerichteten Monolayer. Damit kann eine den Verhältnissen in vivo gerechte Anordnung der Zellen geschaffen werden.

Der IC wird mit 1E5 Zellen/cm² besiedelt. Das Rollen in der Besiedelungsvorrichtung bewirkt eine gleichmäßige Adhäsion der Zellen. Solche Zelldichten werden von Zilla für ein schnelles Erreichen der Konfluenz auf dreidimensionalen Matrizen empfohlen (Zilla, P., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 101, 1991, 671-680).

Beispiel 2: Simulation einer Entzündung Beispiel 2.1.: Entzündung im Kultursystem Mikrokapillare

Die Entzündung wird unter statischen Bedingungen simuliert. Dazu werden Cytokine lokal in den mit Methylcellulose befüllten EC gegeben. Bezogen auf das Volumen des EC werden Cytokinkonzentrationen von 10 U/ml IL1β und 100 U/ml TNFα eingesetzt. Gleichzeitig wird der IC mit einer Granulozytensuspension der Zelldichte 5E6 Zellen/ml gefüllt. Damit befinden sich zu Beginn des Versuches 6500 Leukozyten im IC.

Im Kultursystem Mikrokapillare können wie in vivo Konzentrationsgradienten bzw. Druckgradienten zwischen dem IC und EC aufgebaut werden, so daß diffusiver Stofftransport und Filtration bzw. Resorption simuliert werden können. Dabei steht jedoch für den Transport von Flüssigkeiten nur die poröse Länge des IC zur Verfügung, da sonst die Polycarbonatkapillare inpermeabel ist. Das Flächenverhältnis poröse/unporöse Fläche auf der Innenseite des IC entspricht mit 1/103 ungefähr dem Anteil der interzellulären Räume des Kapillarendothels, durch die in vivo der Stofftransport von hydrophilen Substanzen und Wasser erfolgt (Thews, G. u. a.: Anatomie, Physiologie und Pathophysiologie des Menschen, Wissenschaftliche Verlagsanstalt, Stuttgart, 1989).

Beispiel 3: Simulation einer Angiogenese.

Beispiel 4: Simulation einer Metastasierung.

Beispiel 5: Tierische Zellen.

Beispiel 6: Andere Polymere.

Claims (7)

1. Kultursystem zur Modellierung von kapillären Gefäßen, das aus porösen, mit biologischen Grenzflächen besiedelten polymeren hohlen Fasern, dem intrakapillären Raum, in einem Kulturraum, dem extrakapillären Raum, besteht.

2. Kultursystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Grenzflächen aus biologischem Material, wie Membranen, Zellen, Mikroorganismen bzw. deren Bestandteilen oder aus Biomolekülen, wie Eiweißen oder Lipiden, bestehen.

3. Kultursystem nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zu modellierenden kapillären Gefäße innen- und außenseitig von beweglichen Medien umgeben oder durchströmt werden.

4. Kultursystem nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Poren in den hohlen Fasern für Zellen, Viren oder Biomoleküle durchlässig sind.

5. Kultursystem nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Simulierung körpereigener biologischer Vorgänge, wie Angiogenese, Entzündung oder Metastasierung Verwendung findet.

6. Kultursystem nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Porengröße in den Fasern 3 bis 30 µm beträgt.

7. Kultursystem nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß poröse Hohlfasern aus Polycarbonat innen- oder/und außenseitig in einem Kulturmedium mit Endothelzellen besiedelt werden und dieses System zur Simulierung biologischer Vorgänge Verwendung findet.