JPS6156075A - ヒト・ヒトハイブリド−マの培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト・ヒトハイブリドーマを培養増殖させるた
めの培養方法に関するものでめる。更に詳しくはヒト・
ヒトハイブリドーマを無血清培地を用いて大愚に高密度
で培養する方法に１３！１するものである。

大規模による動物細胞大ｍ培養は、例えばウィルス、ワ
クチン、インターフェロンなどの抗ウィルス剤、あるい
はホルモンなどの生物薬品の製ｌｉに必須である。殊に
近年特定タンパク質などを標的とするモノクローナル抗
体の生産は抗体産生細胞とミエローマによるハイプリド
ーマ大ｆｆ１１８ｆｆｉによるものでおり、その技術の
解決は工業的に重要なテーマでおる。

従来、細胞培養は一般にシャーレ、試験管、培養びんな
どを用いて実験７的規模で行なわれている。近年動物細
胞の六ｍ培養法及びそのための装買として、いくつかの
提案がなされている。

一般に動物細胞の培養に当っては、子牛或い（ユ牛脂児
等から得られる血清を培地として使用されているが、こ
の血清は、高価であるのみならず、品質の不均一性、不
安定性、大量入手の困九から、動物細胞を大ｍに培養し
、有用生理活性物質を大量に得るための培地としては、
適したものとは云えない。

一方、これらの血清を用いないで、人為的に合成された
所謂無血清培地の開発も盛んに行なわれている。無血清
培地は、種々の無線塩類、アミノ酸類、ビタミン類、糖
類、抗生物質、時には成長促進物質などを人為的に種類
と割合を組合せて合成したものであり、品質の安定性、
六ｍ供給性、価格の安さ、培養物の精製・回収の容易性
など優れた利点がある。

そこで本発明者らは、有用な抗体を産生ずるヒト・ヒト
ハイブリドーマを無血清培地中で大口に、高密度で培養
することが可能な方法について研究を進めた結果、本発
明に到達した。

すなわら、本発明１よ、ヒト・ヒトハイブリト−マを無
血清培地を用いて、培貴容器中でリンペンション状態に
て連続的或いは間歇的に、該￥ｊＺ　（こ新しい無血清
培地を供給すると共に古い培地を容器外へ排出すること
によって培養することを特徴とするヒト・ヒトハイブリ
ドーマの培養方法である。

かかる本発明により、ヒト・ヒトハイブリドーマを無血
清培地中にて高密度で増殖することが可能になり、有用
な抗体を経演的にイ１刊に生産することが可能となるこ
とが期待される。

本発明の無血清培地を用いる培養方法に適用されるヒト
・ヒトハイブリドーマは、種々のごト由来のｌｌｌ胞の
融合によって得られたハイブリドーマであればよいが、
殊にヒトリンパ腫細胞とヒ（・抗体産生性正常細胞とを
融合して得られたヒト・ヒトハイブリドーマであること
が有利である。またヒトバーキットリンパ腫由来の細胞
とヒト抗体産生性正常細胞とを融合させたハイブリドー
マが特に望ましい。

特にヒト・リンパ腫細胞、例えばヒトリンパ腫［１１１
、ヒト骨１ｌｌｌｉＩＩｉ１！細胞、ヒトメラノーマな
どのガン細胞で且つヒポキサンチン−グアニン−ホスホ
リボシルトランスフェラーゼ（ＨＧ　Ｐ　ＲＴ’　）欠
損株とヒトＢ５１１１胞との融合細胞が本発明のヒト・
ヒトハイブリドーマとして利用される。

ヒト・リンパ腫細胞としては、例えばＮＡＴ−３０、Ｎ
ＡＴ−３０−８，Ｌ　ＩｃＲ−ＬＯＮ−ｔ−ＩＭｙ２゜
Ｇ１ｙ１４６７２などを具体例として挙げることが出来
、これらをハイブリドーマの親株として用い、これらと
、ガン患者、例えば肺ガン、胃ガンなどの患者から採取
したリンパ球とを融合してヒト・ヒトハイブリドーマを
得ることができる。

本発明において無血清培地としては、通常動物細胞の培
養のために開発され、或いは使用される血清を含まない
培地であればよい。

無血清培地を形成する基礎培地としては、前述したよう
に動物細胞の培養に使用されるものであればよいが、具
体的には、中井準之助ら編集による「組織培養」　（朝
０８店発行：　１９８１年）の７〜２４頁に記載されて
いる合成培地を基礎培地として使用することが出来る。

またこれら基礎ｊ８地にエタノールアミン（５〜３０μ
Ｍ）、ボス７Ｉ＜リビド（１０〜１００μ９／ｄ）、イ
ンシュリン（２〜１０μＣＪ／ｄ）、　トランスフェリ
ン（１０へ・３５μ９／ｄ）。

セレニウム（１０−Ｉｔ〜１０”Ｍ）、ビルごン酸（０
，５〜５７ｒＬＭ）、チミジン（ｌ　Ｘ１０−７〜１　
Ｘ１０−５Ｍ）　。

ヒボキサンチン（１Ｘ　１０−’〜１ｘ１０−Ｍ）など
の一種又はそれ以上を添加すると一層望ましい。具体的
培地としてはＴＥＳ、ＩＴＥＳ、ＭＩＴＥＳ［（ｉ）　
　Ｈ，Ｍｕｒａｋａｍｉ　ｅｔ、　ａｔ、　Ｐｒｏｃ、
　　Ｎａｔｌ。

Ａ　ｃａｄ、　　Ｓ　ｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　、　Ｖ　ｏ
ｌ、７９．　　ｐｐＨ５８−１１Ｇ２゜Ｆ　ｅｂｒｕａ
ｒｙ　１９８２．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏａｙ、　（ｉ
）　Ｈ、Ｍｕｒａｋａｍｉ　ｅｔ、　ａｔ、　ＡＢｉＣ
，Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　４６（７）　　１８３１−
１８３７　（１９８２）　、　＠　　村上、下材、゛′
組械ｊ８養゛′９０３１、５１５−５１９　（１９８３
）参照］などを挙げることが出来る。これらのうちエタ
ノールアミンを添加したものがより好ましいものとして
挙げることが出来る。

また上記培地にリボ蛋白質を添加したものは、ｊ曽舶能
力が一層１曽大するので望ましい。リポ蛋白質は複合タ
ンパクの一杯として生体から分画されるものであり、そ
れ自体知られている物質である。

リボ蛋白質は、蛋白質の口として無血ｌ′ｌ′Ｊ培地１
〃認当り５〜１００μ３．好ましくは１０〜８０μ３添
加するのが有利である。

かくして本発明方法においては、ヒト・ヒトバイブリド
ーマを前記無血清培地を用いて、培養容器中でサスペン
ション状態にて、連続的或いは間歇的に該容器中に新し
い無血清培地を供給すると共に古い培地を容器外へ排出
することによって培養が行なわれる。

培養容器中への新しい培地の供給と古い培地の容器外へ
の排出は、それぞれ独立して連続的或いは間歇的に行う
ことが出来るが、一般には容器内の液面がほぼ一定に維
持できるように、供給と排出の塁を制御するのが好まし
い。

培養容器中のサスペンション液からの古い培地の容器外
への排出は、好ましくは無血清培地の如き液状分は透過
するが、ハイブリドーマは実質的に透過しない堅膜を介
して行なわれる。

その堅膜は、所謂フィルターとして低能するのであり、
その構造は平模状１円筒状、中空糸状或いはその他種々
の形状であることが出来る。本発明方法の実施において
は古い培地とｍ胞とを分！１４１１するフィルターとし
ての堅膜を有するユニットを、培養容器中に設置して古
い培地を容器外へ排出するようにしてもよく、また培養
容器外へ設置して古い培地を排出すると共に細胞を容器
中へ戻すような方式であってもよい。またユニットは培
養容器の一部に組み込まれた形状、例えば堅膜が該容器
の底部或いは側壁に設けられた構造であることも出来る
。

本発明の実施に当っては、培養容器中へ新しい培地を供
給する一方堅膜を通して古い培地を容器外へ排出して培
養することも出来るが、該堅膜を介して古い培地の排出
のみを行うと、その片面の表面における微細孔にハイブ
リドーマが塞より、フィルター礪能を低下させることが
ある。従って、この堅膜は古い培地の排出のみを行なわ
ずに古い培地の排出と新しい無血清培地の供給とを交互
に行うように操作することが、堅膜の微■１孔の閉塞を
防止するために好ましい。

上記した操作を効果的に行ない且つ堅膜の面積を多くし
かもその面積を培養条件に適合ざヒて任意に変え１９る
方式として、中空糸を用いたユニットを培養容器のサス
ペンション中に設けて培養を行うことは、本発明方法の
実施に好ましい具体的方法の一つであり、以下この方法
について詳しく説明する。

寸なわら、前記堅膜より形成された中空糸の多数よりな
る毛管束であって、その毛管束の両端は固着口により固
着されたユニットの少くとも１個が収納され、（ｉ）サ
スペンション液中の培地をユニットの中空糸の’ＩＩＵ
を介してユニットの両端又は一端から導管を通じて培養
容器外へ排出し、（ｉｉ）　シかる後、培養容器外から
新しい培地を導管を通じて該ユニットの両端又は一端へ
供給して培地を中空糸の堅膜を介してサスペンション液
中へ流入し、前記排出と流入とを交互に繰返すことによ
り、ヒト・ヒトハイブリドーマ無血清培地を用いて１８
　育する方法である。

さらに前記方法は、培養容器の９スベンジヨン液中に、
少くとも２個の該ユニットが収納され、それぞれのユニ
ットは前記排出と流入が交互に繰返されるように作動さ
れ、且つ該培五容器中のサスペンション液中の培地の排
出が停止しないように各ユニットの排出と流入の間隔を
互に制御することによって一層有利に培養することがで
きる。

かくして前記培養方法によれば、ザスベンジコン培ｆｆ
ｉ’ｔＢｓにおけるサスペンション液中に、少くとも１
個の前記毛管束よりなるユニットが沈められており、ハ
イブリドーマが産出した老廃物１代謝産物、その他生前
阻害物質を含んだ古い培地が、サスペンション液から中
空糸の堅膜を介して中空糸中へ流れユニットの両端又は
一端から心室を経て培養容器外へ排出され、成る時間経
過するとこの排出を停止し、次いで培養容器外から新し
い無血清培地を導管を通じてユニットの両端又は一端へ
供給して該培地を中空糸の堅膜を介してザスベンジョン
液へ流入ヒしめられる。

従って、前記方法においては、−ナスペンション液中に
沈められたユニットによって、それに設けられた多数の
中空糸の堅膜を介して新しい培地のサスペンション液中
への供給と、サスペンション液中からの古い培地の排出
とが交互に繰返されるので、中空糸の堅膜の微細孔にハ
イブリドーマやその他ｇＡ型物が詰り実質的な壁面槓の
効率低下を来すことはなく、有利に培地の供給と、古い
培地の排出とをスムースに行うことができ、極めて高密
度の培養が可能となる。

特にユニット２［！１以上別々に或いは適当に組合せて
サスペンション液中に浸入することもでき、また簡単に
２個以上を直列又は並列に連結して使用することもでき
るので、ハイブリドーマのｌ！ｌｉ類と密度、培養条件
、培養の規枳の変化に応じて容易に中空糸の堅膜の面積
を適応させることが可能である。　　。

また少くとも２個のユニットを組合せて使用し、それぞ
れのユニットは、培養容器のサスペンション液中にＪ５
いて新しい培地の供給と古い培地の初出が繰返されるよ
うに作動され、且つ少くとも１個のユニットは古い培地
の排出が常時行なわれるように、つまり培養容器中のサ
スペンション液中の培ｉｌ！ｌｉＩの排出が停止しない
ように各ユニットにおける培地の排出と流入の間隔を互
いにａｉｌ＋陣丈ることが好ましい。

前記ユニットを構成している中空糸毛管は、種々の重合
体よりなるものであればよく、その１合体としては例え
ばヒルロースアセテート、ポリスルホン、ポリアクリロ
ニトリル、弗素系ポリマーなどが好ましい例として挙げ
られる。

中空糸毛管堅膜には多数の微１１１孔を有しており、そ
の毛管の堅膜は、栄養分及び細胞の老廃物１代謝生産物
などを透過するが、ハイブリドーマは透過しない大きさ
の細孔が多数設けられている。細孔の大きさは一般に平
均孔径が１０μ以下、好ましくは８μ以下が適当である
。

また、該毛管の堅膜は、水を成る程度透過する能力を有
することが望ましい。すなわち、該堅膜は水の透過係数
（ｄ／ゴ・ｈｒ−繍Ｈ１が１０以上、好ましくは１００
以上であるのが有利である。一方上限は特にないが、２
０．０００以下、好ましくは１０．０００以下が望まし
い。

さらにｉｔ膜としては、栄養分や細胞の老廃物。

代謝生産物などの如き分子ｍの小さい化合物は透過する
が、分子ｍの大きい化合物（例えば１０００以上、好ま
しくは５０００以上）は透過しない膜、例えば限外辿過
膜を使用することも可能である。

以下添付図面により、本発明方法を実施する方法の一例
を示す。

図面は、２つのユニット３−ａ及び３−ｂを一対として
作動させて培養する場合を示したものであり、図面にお
いて、１はサスペンション型培養容器における培養本体
であり、栄養物などを含む水性媒体は、その供給槽６か
らポンプ７により供給６管８を通り切り換え弁１２又は
１４を経て一つのユニットへ送られる。一方他のユニッ
トからは古い培地が排出され切り換え弁１３又は１５を
経て排出専管１１を通ってポンプ１０により古い培地の
貯＋”　９へ送られる。

図面に示されている２つのユニット３−ａ及び３−ｂは
、多数の中空糸よりなる毛管末の両端は固着層により固
着されている。そしてその上部は液の流出入口になって
おり、その下部は封止されている構造を有している。

培養容器１には、ハイブリドーマがサスペンショク液中
を効果的に浮Ｔ１１′るように尻拌Ｈ１６２が図面に示
すように備え付けられていてもよい。１１拌２のように
回転型撹拌翼に限らずマグネットスターラーであっても
よい。さらにサスペンション液中のハイブリドーマを効
果的に浮遊されることができる他の撹拌効果を秦する手
段であってもよい。

図面の培養容器においては２つのユニットが一対となっ
ている一つの組の場合について示されているが、この一
対の組は一つに限らず複数組使用することもできる。ま
たユニットは一対の組として使用しないで、−個の独立
したユニットを入れこのユニットに古い培地の排出と新
しい培地の供粕とを繰返して操作するようにしてあって
もよい。

この独立したユニットを多数使用することができること
は云うまでもない。

さらに培養容器には、波索、二鼓化戻素や栄益素の濃度
、ｐＨの値を測定し、それらを成る範囲に維持するｉｌ
！置が一般に設置されているが、前記図面の装置にもこ
れらのＶ＆置が備えられてもよいことは云うまでもない
。しかし図面にはこれらの付属装置は省略されている。

また酸素供給のために人工血液として知られている弗化
炭化水素を用いることもできる。

前記図面において１つのユニットは、いずれも新しい培
地の供給と古い培地の排出とを交互に繰返しながら操作
されるが、その間隔は、ハイブリドーマの種類、密度、
培養条件などによって左右されるが、一般には１分乃至
１日、好ましくは５分乃至１０時間の範囲で切り換える
ことが出来る。

１つのユニットをサスペンション液中に沈めて前述のよ
うに培地の供給と排出を交互に繰返しながら操作するこ
ともでき、またこのように操作されるユニットを２個以
上沈めてそ杭ぞれ独立して操作しもよい。

しかしながら一般には２個又はそれ以上のユニットを使
用するのが好ましく、その場合複数のユニットを互いに
連動させて操作するのが有利である。

複数のユニットを互いに連動させて操作１“るのが有利
である。

複数のユニットを互いに連動させて操作する場合、培養
容器におけるサスペンシコン液の培地の容器外への排出
が一時期においても停止することかないように（つまり
常時古い培地の容器外への排出が行われるように）各ユ
ニットの培地の排出と流入の間隔を互に制御するのが一
層望ましい。

また２個のユニットを一対としてサスペンション液中へ
沈め、その一方は新しい培地がサスペンション液中へ供
給され、他のユニットは古い培地が排出されるように作
動しており、それらの流れが交互に逆になるように切り
換え弁を切り換えるように操作してこのように一対のユ
ニットを交互に作動させることにより新しい培地の供給
と、古い培地の排出とを常時連続的に行い、かくして、
しかも培養容器中のサスペンションの液面を一定の水準
に維持することが容易に可能となる。

前記図面の方法を実施するに当って、成るユニットにお
ける新しい培地の供給と古い培地の排出との間隔は任意
に決定することが出来る。

゛かくして前述の如き方法によれば、新しい培地と古い
培地の排出を連続的或いは間歇的に行うので高密度でし
かも大口にハイブリドーマの培養を行うことが可能とな
る。

以下実施例を掲げて本発明方法を詳述する。

実施例 （１）　　ユニットの性状； セルローズアセテート、アクリル酸ポリマー及び硝酸セ
ルロースよりなるポリマーアロイより形成された中空糸
の多数を用いて、添付図面に示されるような片側が封止
されたユニットを作った。

各中空糸の内径は３２０μであり外径は４６０μであり
て、その堅膜は平均孔径が０，２μの多数の黴■１高を
有していた。ユニットにおける中空糸の右効艮は３６＃
ｌｌｌ＋であり、中空糸の総有効面積（外ＩＭ　ｓ３＋
ｌ’−＞は８０ｃ＋ｇ’であった。なお使用した中空糸
の透水率は４Ｊ１／Ｔｄ−ｈｒ−ａｎＨｇであった。

（ａ　培養容器の形状： 添付図面に示したような構造をした内容積が５００ｄの
ガラス容器を培養容器として使用した。

この培養容器には、図面に示されているように２つのユ
ニットの組合せが２組収納されており（図面では１１Ｉ
）、またマリン型撹拌子が装ｆＪされている。

また、培ｆｆｉ容器内には二酸化炭素及び醒累の供給導
管が挿入されているが、これは図面の５に該当する。

（３）無血清培地 ＩＴＥＳを基本培地とし、ＲＤＦ（ＲＰＭＩ−１６４０
、ダルベツコ改変ＭＥＭ及びハムＦ１２を２：１：１で
混合したもの）を加え、更にリボ蛋白質を１０Ｉｇ／−
の濃度で加えたものを使用した。

（４）培養方法： ｉ１４記培養容器に液容積が３５０／−となるように新
しい培地を入れその中に２つのユニットの組を２組を挿
入した。それぞれの組のユニットは図面の６に示すよう
な新しい培地供給槽と、古い培地の貯槽９とに切り換え
弁を介して、それぞれ導管で結合されている。それぞれ
の８；Ｌ管の途中には、ポンプが設けられており、２つ
のユニットは切り換え弁によって一方のユニットが新し
い培地を培養容器に供給している時には、他のユニット
は古い培地が容器外へ排出されるように互に逆の流れを
するようになっている。

一方培養容器においてはＣＯ２ガス及び０２ガスがサス
ペンション液中へ供給され、それらの供給はそれぞれ系
内のＤＨ６，５〜７、溶存酸素口が３〜４１）Ｉ）ＩＩ
Ｉの一定となるように制御された。

培養容器の培地中にヒト・リンパｌ［ｌ１ＩＮＡＴ−３
０と肺ガンの患者から採取した細胞との融合によって得
られた肺ガンに対するモノクローナル抗体を産生ずるハ
イブリドーマ（ＨＦ　１０−　Ｆ　７　）を１、Ｇｘ　
１０５１１１ｊ　／　ｔｎｌ！となるようにＪ＋０えた
。このハイブリドーマは免疫グロブリン（＋（ｌ　Ｍ）
生産型の株である。

容器中のサスペンション液は３７℃に保持され、またマ
リン型撹拌子はｅｏｒｐｍの速度で回転させた。

培養開始後、ハイブリドーマ密度がｌＸｌｏＧ個／ｉに
なってから２つのユニットの作動を開始し、新しい培地
の供給と古い培地の排出を行った。１つのユニットにお
ける供給と排出の間隔はほぼ６時間単位で行い、１日に
おける新しい培養液のＪＱ養器への供給は約３５０−で
あった。

（５）培養結果 かくして約１６日間培養を行った結果は下記の通りであ
った。

（以下余白） （以下余白）

【図面の簡単な説明】

添付図面は、本発明のハイブリドーマ培養方法を実施す
るための概略図の一例を示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト・ヒトハブリドーマを無血清培地を用いて、培
   養容器中でサスペンション状態にて連続的或いは間歇的
   に、該容器に新しい無血清培地を供給すると共に古い培
   地を容器外へ排出することによって培養することを特徴
   とするヒト・ヒトハイブリドーマの培養方法。 ２、該ヒト・ヒトハイブリドーマがヒト・リンパ腫細胞
   とヒト抗体産生性正常細胞を融合したハイブリドーマで
   ある特許請求の範囲第１項記載の培養方法。 ３、該無血清培地は、エタノールアミンを含有している
   ものである特許請求の範囲第１項記載の培養方法。 ４、無血清培地は透過するがヒト・ヒトハイブリドーマ
   は透過しない堅膜を介して、培養容器中への新しい無血
   清培地の供給と古い培地の排出とを交互に行うことによ
   る特許請求の範囲第１項記載の培養方法。