DE3504715A1

DE3504715A1 - Verfahren und medium zur foerderung der proteinproduktion von saeugerzellen

Info

Publication number: DE3504715A1
Application number: DE19853504715
Authority: DE
Inventors: Scott Allston Mass. Geyer; Randall G. Medfield Mass. Rupp
Original assignee: Damon Biotech Inc
Current assignee: Abbott Biotech Inc
Priority date: 1984-02-13
Filing date: 1985-02-12
Publication date: 1985-09-05
Also published as: SE8500621D0; GB2153830B; GB2153830A; NO850533L; IT8567140A1; IT1184883B; FR2559501A1; DK65185A; US4724206A; DK65185D0; GB8503249D0; IT8567140A0; SE8500621L; DE3504715C2; BE901703A; FR2559501B1; JPS60188062A; NL8500350A; AU3856985A

Description

DAMON BIOTECH, INC. Needham Heights, MA o2 194 V.St.A.

Verfahren und Medium zur Förderung der Proteinproduktion von Säugerzellen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie ein Medium zur Erhöhung der Proteinproduktion und insbesondere der Antikörperproduktion in Kulturen von Säugerzellen, dh Zellen tierischen und menschlichen Ursprungs.

Herkömmliche Medien zur Kultivierung von Säugerzellen werden in Entsprechung zu zwei grundlegenden Publikationen von Eagle über den Einfluß der Ionenkonzentration auf Zellwachstumszyklen (Science 122 (1955) 501-504 und Arch. Biochem. Biophys 6± (1956) 356-366) formuliert. Diesen Publikationen liegt die Feststellung zugrunde, daß Medien mit 85 bis 115 mM Natrium und 1 bis 10 mM Kalium zum Wachstum von HeLa-Zellen und Mäuse-Fibroblasten optimal sind. Die Formulierung von Eagle's Grundmedium, das die Basis für nahezu sämtliche heute in Gebrauch befindlichen Wachstumsmedium für tierische Zellen darstellt, beruht auf diesen Ergebnissen.

O192-DBH457-SF-Bk

Einer späteren Publikation (Stubblefield und Mueller, Cancer Res. ^O (1960) 1646-1655) liegen Untersuchungen zum Einfluß der Natriumchloridkonzentration auf Wachstum, biochemische Zusammensetzung und Metabolismus von HeLa-Zellen zugrunde. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, daß höhere Konzentrationen an Natriumchlorid im Wachstumsmedium die Zellreplikation verhindern und entsprechend zu einer Abnahme der Zellzahl führen, während die RNA-Synthese sowie die Proteinsynthese in den überlebenden Zellen gesteigert wird. Als theoretische Erklärung wurde angegeben, daß durch den geänderten Salzgehalt die DNA-Replikation behindert wird, wodurch wiederum die Mitose verhindert wird und die überlebenden Zellen entsprechend größer werden können, als dies sonst der Fall wäre. Durch den Zusatz von Natriumchlorid wurde die Osmolarität des Mediums geändert; es wurde jedoch kein Versuch unternommen, diesbezüglich zwischen osmotischen und ionischen Wirkungen zu unterscheiden.

12 Jahre später wurde über die Kultivierung von Ehrlich-Ascitestumorzellen in einem durch Zusatz von Natriumchlorid hypertonisch gemachten Medium berichtet (Schachtschabel und Foley, Exp. Cell Res. 7J0 (1972) 317-324), wobei Versuche zugrundelagen, den Einfluß von Medien hoher Tonizität auf den Wachstumszyklus dieses Typs von Zellen zu ermitteln. Dabei wurde festgestellt, daß sich nach einer signifikanten Verringerung der Zellzahl in der Kultur eine salztolerante Population mit einem im wesentlichen normalen Lebenszyklus entwickelte.Diese salztoleranten Zellen besaßen jedoch gegenüber herkömmlichen ZeI-

len eine etwas abweichende Morphologie, da sie mehr Fibroblasten als Epithelzellen ähnelten. Die Generationsdauer (Zeit zur Verdoppelung der Zellzahl) nahm mit der Erhöhung der Tonizität der Medien drastisch zu, während die Anzahl der überlebenden Zellen abnahm.

Antikörper erzeugende Kulturen, beispielsweise Milzzellen und Hybridomzellen, werden normalerweise in Medien wie etwa Serum enthaltenden modifizierten Eagle-Medien kultiviert. Die Wachstumszyklen von Antikörper produzierenden Zellen in diesen Medien und die Menge an sezerniertem Antikörper liegen im Vergleich zu anderen Protein sezernierenden Zellen, die in diesen Medien kultiviert werden, im Erwartungsbereich. Die zunehmende Verwendung von Antikörpern als biologische Materialien für zahlreiche Verwendungszwecke, insbesondere aufgrund der Fortschritte bei der Erzeugung von Hybridomzellen und monoklonalen Antikörpern, führte jedoch zu einem entsprechend gestiegenen Bedarf für Antikörper aus speziellen Zellkulturen.

Myelomzellen werden ebenfalls normalerweise in isotonischen Medien kultiviert. Da diese Zellen Protein erzeugen und genetisch modifiziert werden können, wären hierfür Medien vorteilhaft, mit denen sich eine gesteigerte Proteinproduktion ohne Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen erzielen läßt.

Der Erfindung liegt entsprechend die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Kultivierung Protein produzierender Zellen anzugeben, mit dem sich die Proteinproduktion erhöhen läßt. Dabei sollen auch

Antikörper produzierende Zellen unter Bildung einer lebensfähigen, sich vermehrenden Kultur zur Produktion erhöhter Mengen an Antikörpern veranlaßt werden können. Das Verfahren soll ferner auch zur Steigerung des Wachstums von Hybridomzellen und der Produktion monoklonaler Antikörper ohne Zusatz von Feeding-Zellen zur Kultur geeignet sein. Das Verfahren soll ferner die Erzielung hoher Proteinausbeuten aus großvolumigen Zellkulturen mit hoher Zelldichte ermöglichen. Zugleich soll die Steigerung der Proteinproduktion von Zellen, beispielsweise Myelomzellen, unter Erhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen möglich sein.

Zu diesem Zweck soll auch ein geeignetes Medium angegeben werden.

Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst.

Vorteilhafte Ausführungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:

Fig.1: ein Diagramm zur Erläuterung des Einflusses von durch Zusatz von Aminosäuren hypertonisch gemachten Medien auf die Zellpopulation bei einer Kultur Antikörper produzierender Zellen;

Fig.2: ein Diagramm zur Erläuterung der Lebensfähigkeit von in den Medien von Fig. 1

gezüchteten Zellen;

Fig. 3: ein Diagramm zur Erläuterung der Antikörperproduktion bei in den Medien von Fig. gezüchteten Kulturen;

Fig. 4: ein Diagramm zur Erläuterung des Befunds, daß ein Medium mit Natriumchlorid ohne Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen hypertonisch gemacht werden kann, und

Fig. 5: eine Vorrichtung zur Proteinproduktion gemäß der Erfindung.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Förderung der Proteinproduktion und insbesondere der Antikörperproduktion in Säugerzellenkulturen beruht auf der überraschenden Feststellung, daß herkömmliche Medien, wie sie zur Kultivierung Protein erzeugender Zellen herangezogen werden, so modifiziert werden können, daß signifikant höhere Proteinausbeuten bei höherer spezifischer Aktivität erzielt werden, als dies bisher möglich war. Das erfindungsgemäße Medium eignet sich zu einer solchen Förderung der Proteinproduktion.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Proteinproduktion Protein erzeugender Zellen dadurch erhöht, daß die Zellen in einem hypertonischen Medium mit einer Osmolarität von mindestens 340 mosm/1 und vorzugsweise einer Osmolarität im Bereich von 340 bis 450 mosm/1 und noch bevorzugter von etwa 360 mosm/1 kultiviert werden. Bevorzugte Medien sind herkömmliche Wachstumsmedien, beispielsweise Eagle-Medien, die durch Zusatz erhöhter Mengen von Aminosäuren hypertonisch gemacht sind, vorzugsweise

mit dem zweifachen üblichen Aminosäuregehalt. Diese Aminosäuren können absatzweise oder kontinuierlich zum Medium zugegeben werden. Herkömmliche Medien können zur Erzielung von höheren Aminosäurekonzentrationen, als sie normalerweise angewandt werden, periodisch mit einem Aminosäureüberschuß versetzt werden. Alternativ dazu kann ein zuvor hergestelltes hypertonisches Medium kontinuierlich oder intermittierend durch die Kultur hindurchgeleitet werden. Eine Erhöhung der Proteinproduktion wird auch bei diskontinuierlich betriebenen Kulturen durch Verwendung hypertonischer Medien erzielt. Die Erfindungskonzeption ist dabei auf beliebige Protein produzierende Zellen anwendbar, wobei jedoch genetisch modifizierte Zellen bevorzugt sind.

Zusammengefaßt beruht die Erfindungskonzeption darauf, anstelle von isotonischen Medien für die Kultivierung hypertonische Medien einzusetzen. Hierdurch wird die Menge an pro Zelle erzeugtem Protein bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen erhöht. Derartige hypertonische Medien eignen sich insbesondere zur Kultivierung Antikörper erzeugender Zellen wie etwa von Hybridomzellen, da solche Zellen hierdurch zu einer erheblich höheren Antikörperproduktion veranlaßt werden, ohne daß sich hierbei ihre Lebensfähigkeit oder Wachstumsrate signifikant verändert.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich allgemein günstig zur Steigerung der Proteinproduktion herkömmlicher Kulturen Protein erzeugender Zellen. Die Erfindungskonzeption ist ferner besonders günstig auf Protein erzeugende Zellen anwendbar,

die in einer Vielzahl von Kapseln mit permeablen Membranen eingekapselt sind, die ein entsprechendes intrakapsuläres Volumen vorgeben. Die Kapselmembranen können beispielsweise ein Polymer aufweisen, das eine Vielzahl primärer Aminogruppen besitzt, die durch Salzbindungen an saure Polysaccharide gebunden sind. Bevorzugte saure Polysaccharide sind Alginate, während bevorzugte Polymere, die eine Vielzahl primärer Aminogruppen enthalten, Polypeptide darstellen, wobei Polylysin und Polyornithin am meisten bevorzugt sind.

Die Erfindung umfaßt ferner ein verbessertes Wachstumsmedium, das zur einer erhöhten Proteinproduktion führt. Die erfindungsgemäßen Medien enthalten essentielle Salze, Nährstoffe und Aminosäuren, die für das Zellwachstum und die Mitose förderlich sind, wie dies auch beispielsweise bei modifizierten Eagle-Medien der Fall ist; die erfindungsgemäßen Medien sind jedoch demgegenüber durch Zusatz eines Überschusses von Aminosäuren modifiziert, der zu einer Erhöhung der Osmolarität des Mediums auf mindestens etwa 340 mosm/1 und vorzugsweise zwischen etwa 340 und 450 mosm/1 und am bevorzugtesten auf etwa 360 mosm/1 ausreichend ist. Die erfindungsgemäßen Medien führen ohne nachteilige Beeinflussung der Lebensfähigkeit der Zellen oder ihrer Wachstumsrate zu einer gesteigerten Proteinproduktion.

Das erfindungsgemäße Verfahren und das Medium gemäß der Erfindung beruhen auf der Feststellung, daß, im Gegensatz zur fachmännischen Erwartungshaltung, hypertonische Medien zu einer gesteigerten

- ίο -

Proteinproduktion und insbesondere einer erhöhten Antikörperproduktion führen, ohne daß dabei die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigt wird. Aufgrund der Erfindungskonzeption sind außergewöhnlich hohe Ausbeuten an Antikörpern bei zugleich höherer spezifischer Aktivität oder Reinheit erzielbar, als dies bisher der Fall war, wobei sowohl kleine Kulturvolumina als auch große Kulturvolumina mit hoher Zelldichte und Kulturen unter großtechnischen Bedingungen verwendbar sind.

Frühere Untersuchungen zum Einfluß der Natriumchloridkonzentration auf HeLa-Zellen und Mäuse-Fibroblastenzellen führten zu dem Schluß, daß der optimale Tonizitätsbereich für das Wachstum tierischer Zellkulturen zwischen 290 und 330 mosm/1 liegt. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren sind jedoch Antikörperausbeuten von 50 % des sezernierten Proteins möglich undAusbeuten/zu 62 % erzielbar. Aufgrund der hohen Antikörperkonzentration im ausgeschiedenen Protein wird die Reinigung der betreffenden Antikörper erleichtert, was wiederum die Lösung zahlreicher Probleme im Zusammenhang mit der Reinigung von Antikörpern und der Verringerung der Kosten derartiger Reinigungsschritte leichter macht. Hypertonische Medien eignen sich insbesondere zur Kultivierung von Hybridomzellen, Myelomzellen und anderen kontinuierlichen Kulturen von Protein erzeugenden Zellen von Säugern; sie führen zu einer höheren Proteinproduktion bzw höheren Sekretionspegeln, als dies bei herkömmlichen Medien der Fall ist. Ferner können genetisch modifizierte Myelomzellen zur weiteren Erhöhung der Produktion spezifischer Proteine eingesetzt werden.

ORiGiNAL INSPECTED

Die erfindungsgemäß eingesetzten Protein erzeugenden Zellen können in großen Kulturen bei Zelldichten

von größenordnungsmäßig 10 Zellen/ml entsprechend dem Verfahren der US-PSen 4 352 883 und 4 409 331 sowie der DE-Patentanmeldung (unser Zeichen ol92-37.254P DBH-456) kultiviert werden, auf die hier Bezug genommen wird. Diese Druckschriften beschreiben Verfahren zur Einkapselung gesunder, lebensfähiger Zellen und Verfahren zur Gewinnung von durch diese Zellen produzierten Substanzen. In der DE-Patentanmeldung (u.Z. ol92-37.254P - DBH-456) ist angegeben, daß außerordentlich hohe Zelldichten unter Verwendung herkömmlicher Medien bei eingekapselten Kulturen erzielt werden können, wenn dem Sauerstoff- und Kohlendioxidbedarf durch direktes Durchleiten eines Gases mit definiertem Sauerstoff- und Kohlendioxidgehalt durch die eingekapselte Kultur entsprochen wird. Durch Anwendung dieser Techniken wurden Kulturen mit einem Volumen von größenordnungsmäßig

30 1 und einer Zelldichte von 10 Zellen/ml erzeugt. Unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erzeugten derartige Kulturen größenordnungsmäßig 3 bis 6 g monoklonale Antikörper.

In Fig. 5 ist eine Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen gemäß der Erfindung dargestellt. Die Vorrichtung umfaßt einen Kessel j_0 von 50 1 Fassungsvermögen aus rostfreiem Stahl (Stahl 316L, elektropoliert), der mit einer Deckelplatte J_2_ versehen ist. Die Vorrichtung weist ferner einen Motor j_4_ auf, der eine Rührwelle JjS mit Rührern j_8 und 2Ό antreibt, die in der Kultur 21_ angeordnet sind. Die Kultur 21_ umfaßt ein hypertonisches Medium, zB eines der im folgenden definierten Medien, sowie oino Vielz.ihl

BAD

darin suspendierter Kapseln mit Membranen, die für Aminosäuren, Gase, Vitamine, Ionen udgl, die im Medium enthalten sind, permeabel sind. Üblicherweise bevorzugtes hypertonisches Medium ist ein modifiziertes Eagle-Medium, das die doppelte Aminosäurekonzentration als entsprechende herkömmliche Medien aufweist und mit 5 Vol.-£ Serum, zB Rinderserum, ergänzt ist. Die Kapseln sind typischerweise kugelförmig oder sphäroidal und besitzen einen Durchmesser von größenordnungsmäßig weniger als etwa 2 mm. Kapseln mit einem mittleren Durchmesser von 0,8 mm sind günstig geeignet. Dem Gasbedarf der Zellen wird durch Hindurchleiten eines Sauerstoff und Kohlendioxid enthaltenden Gases durch ein Sterilfilter 2_4, ein Gaseinleitungsrohr ^6 und einen Sprudelkopf 2_8 entsprochen. Der Sprudelkopf 2J3 kann aus einem porösen Keramikfilter mit 2,5 μπι Porenweite bestehen. Das Gas kann aus 95 Vol.-I Luft und 5 Vol.-I CO- zusammengesetzt sein. Die Gasblasen treten aus dem Sprudelkopf ^8 aus und durchperlen das Medium um die Kapseln. Der Gasdurchsatz soll dabei ausreichend sein, um im Medium einen Sauerstoffpartialdruck zu erzielen, der im wesentlichen gleich dem Sauerstoffpartialdruck im Gas ist. Der Sauerstoffdruck im Medium kann dadurch auf einen Pegel oder etwas darüber eingestellt werden, den die Zellen für optimales Wachstum benötigen. Aufgrund der Anwesenheit der Serumbestandteile im Medium führt die Gaseinleitung zu einer Ansammlung von Schaum im oberen Gasraum !50 des Kessels 10. Die Kapseln schützen jedoch die Zellen auch dann vor einer Entwässerung, wenn sie zeitweise in den Schaum gelangen sollten; die Zellen sind durch die Kapseln ferner auch vor mechanischer Beschädigung

geschützt. Durch das Hindurchleiten von Gas durch eine eingekapselte Zellkultur kann der Bedarf der wachsenden Zellpopulation an Sauerstoff befriedigt werden, was wiederum die Erzielung extrem hoher Zelldichten erlaubt. Das aus der Kultur austretende Gas gelangt durch die Auslaßöffnung 3_^ und ein Filter 3_4_ nach außen. Ein typischer Gasdurchsatz bei einer 30-1-Kultur beträgt 5,7 l/h (0,2 standard cubic feet/h).

Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens im absatzweisen Betrieb wird das hypertonische Medium einfach zusammen mit den die Ausgangskultur enthaltenden Mikrokapseln in den Kessel K) hinein abgemessen, worauf die Kultur zu maximaler Zelldichte wachsen gelassen wird. Alternativ dazu kann am Anfang ein herkömmliches isotonisches Medium angewandt werden, wobei in die Kultur zusätzliche überschüssige Aminosäuren durch ein- oder mehrmaliges Einspritzen während des Wachstumszyklus eingeführt werden, beispielsweise durch die Einspritzöffnung 3_6. Die beste Durchführungsweise des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht jedoch darin, ein hypertonisches Medium durch Einführung eines kontinuierlichen oder intermittierenden Stroms des Mediums über die Einlaßöffnung 3J[ und Abziehen des Mediums durch das Filterelement £0 durch die Kultur hindurchzuleiten. Das Filterelement £0 kann ein mikroporöses Sieb aus rostfreiem Stahl mit einer Porengröße aufweisen, die kleiner ist als der Durchmesser der Kapseln, beispielsweise 50 bis 100 pm. Das Medium kann über das Ventil 4_2_ abgezogen werden. Der Füllstand des Mediums in der Kultur kann durch das Schaurohr beobachtet werden. Ein typischer Durchsatz des

BAD O«G!NAL

Mediums, das über die Einlaßöffnung 2^8 einströmt und durch das Filterelement £0 abgeführt wird, beträgt 4 bis 12 ml/min. Es ist ferner auch möglich, eine zur Anreicherung dienende Aminosäurelösung nach Bedarf in die Kultur einzuführen, um eine gewünschte Hypertonizitat aufrechtzuerhalten.

Das zur Gewinnung des von den Zellen erzeugten Proteins angewandte Verfahren hängt von der Beziehung zwischen den effektiven Molekülabmessungen des interessierenden Proteins und der Permeabilität der Kapselmembranen ab. Wie aus den oben angeführten US-Patenten hervorgeht, kann die Permeabilität der Kapselmembranen innerhalb weiter Grenzen eingestellt werden. Einzelheiten bezüglich bevorzugter Verfahren zur Kontrolle der Porosität der Kapselmembranen sowie zur Erzielung gleichmäßiger Kapseln sind in der DE-Patentanmeldung (u.Z. ol92-37.253P .DBH-452) angegeben, auf die hier Bezug genommen wird. Wenn das interessierende Protein zu groß ist, um durch die Membran hindurch austreten zu können, sammelt sich das Protein innerhalb der Mikrokapseln an. Wenn es andererseits klein genug ist, um durch die Kapselmembranen hindurchtreten zu können, sammelt es sich entsprechend im extrakapsulären Medium.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Das Beispiel erläutert, daß die Erhöhung der Tonizität des Kulturmediums durch Zusatz einer überschüssigen Menge Aminosäuren die Lebensfähigkeit wie auch die Mitoserate Protein produzierender Zellen nicht verändert, jedoch zu einer erhöhten Proteinproduktion führt. Bei den Versuchen wurden IgG ausscheidende Maus-Maus-Hybridomzellen eingesetzt. Die Hybridomzellen wurden nach einer modifizierten Variante des Verfahrens der US-PS 4 352 883 eingekapselt. Im einzelnen wurde dabei eine Suspension mit einer Zellkonzentration von 10 Zellen/ml in einer 1-%igen (G/V) Lösung von Natriumalginat (NaG-Kelco LV) in Standardmedium in eine Vorrichtung mit Sprühkopf gebracht, der aus einem Gehäuse mit einer oben vorgesehenen Lufteinlaßdüse und einem länglichen Hohlkörper bestand, der unter Gleitreibung in einen Stopfen eingepaßt war. Die Zelldichte der Suspension im Alginatmedium bestimmt die mittlere Anzahl von Zellen pro Kapsel in der Ausgangskultur. Auf das Gehäuse wurde eine mit einer Nadel mit einem Innendurchmesser von 0,25 mm (0,01 inch) mit Tetrafluorethylenbeschichtung versehene Spritze von zB 10 ml Inhalt, die mit einer Schrittpumpe verbunden war, aufgesetzt, wobei die Nadel längs durch das Gehäuse hindurchging. Das Innere des Gehäuses war so ausgelegt, daß die Nadelspitze einem konstanten laminaren Luftstrom ausgesetzt war, der zum Abreißen von aus der Nadel austretenden Tropfen diente. Zur Anwendung wurde die Spritze mit der das einzukapselnde Material enthaltenden Lösung gefüllt und auf das Gehäuse aufgesetzt; durch

Inbetriebnahme der Schrittpumpe wurden schrittweise Tropfen der Lösung aus der Nadelspitze herausgedrückt, die jeweils vom Luftstrom abgerissen wurden und etwa 2,5 bis 3,5 cm tief in eine 1,2-üge (G/V) Calciumchloridlösung fielen, wobei sich gelierte Massen bildeten, die abgesaugt wurden. Die in Gelform übergeführten Massen können zur Expansion des Gels im dreifachen Volumen isotonischer Salzlösung inkubiert werden. Die Expansion in Salzlösung nahm etwa 11 min in Anspruch. Anschließend wurden um die gelierten Massen durch Inkontaktbringen mit einer Lösung von Poly-L-lysin (Sigma Chemical Company, Molmasse 65000) einer Konzentration von 750 mg/1 in isotonischer Salzlösung Membranen erzeugt. Nach einer Reaktionsdauer von 12 min wurden die resultierenden Kapseln 10 min mit einer Lösung von CHES-Puffer (2-Cyclohexylaminoethansulfonsäure, Sigma) einer Konzentration von 1,4 g/l in Salzlösung mit einem Gehalt von 0,2 I (G/V) Calciumchlorid gewaschen. Die Kapseln wurden dann etwa 8 min mit einer 0,3-Sigen (G/V) Lösung von Calciumchlorid in Salzlösung gewaschen, worauf durch 10 min Umsetzung mit einer Lösung von 105 mg/1 Polyvinylamin (Polyscience, Molmasse 50000 bis 150000) in Salzlösung eine zweite Membran um die Kapseln herum erzeugt wurde. Die erhaltenen Kapseln wurden dann wiederum 7 min mit dem doppelten Volumen isotonischer Salzlösung gewaschen und durch 7 min Eintauchen in eine 5 · 10"² !ige (G/V) NaG-Lösung in Salzlösung nachbeschichtet. Die Kapseln wurden anschließend weitere 4 min in Salzlösung gewaschen, worauf das intrakapsuläre Volumen der Kapseln durch zweimaliges Eintauchen in 55 mM Natriumeitrat in

Salzlösung wieder verflüssigt wurde, wobei die erste Behandlung 20 min und die zweite Behandlung 6 min lang vorgenommen wurde. Die Kapseln wurden anschließend zweimal mit Salzlösung und einmal 4 min mit Kulturmedium gewaschen. Wie allgemein in der US-PS 4 409 331 angegeben ist, sammelt sich bei Inkubation der Kapseln im Wachstumsmedium IgG innerhalb der Kapseln an, wobei nur Spurenmengen von IgG im extrakapsulären Medium nachweisbar sind. Nach diesem Verfahren hergestellte Kapseln sind im wesentlichen für IgG undurchlässig, erlauben jedoch den freien Durchtritt der erforderlichen Nährstoffe, wodurch entsprechend ein Zellwachstum und eine Antikörperproduktion innerhalb des intrakapsulären Volumens ermöglicht wird.

In Tabelle 1 sind die Bestandteile eines bekannten Basismediums für Kulturzwecke angegeben; in den Tabellen 2 und 3 sind die in diesem Medium enthaltenen Aminosäuren bzw Vitamine im einzelnen spezifiziert. Die in Tabelle 1 in Klammern angegebenen Konzentrations- bzw Mengenangaben beziehen sich auf Modifizierungen im Eisen- bzw Aminosäuregehalt zur Erzielung eines erfindungsgemäßen hypertonischen Mediums. Aus den in Klammern gesetzten Angaben ist ersichtlich, daß der Eisengehalt um den Faktor 100 und der Aminosäuregehalt verdoppelt wurde,. Nach der Formulierung des Mediums wurden 5 Volum-! Rinderfetalserum zugesetzt. Durch die Zugabe überschüssiger Aminosäuren und von überschüssigem Eisen(III)nitrat wird die Osmolarität des Mediums auf etwa 360 mosm/1 erhöht. Aus den Tabellenwerten ist ersichtlich, daß das normale Medium etwa 4,7 Gew.-S Aminosäuren (Wassergehalt

INSPECTED

nicht mitgerechnet) enthält, während das erfindungsgemäße hypertonische Medium etwa 8,9 I Aminosäuren enthält. Die bevorzugten erfindungsgemäßen Medien enthalten etwa 7,0 bis 12 I Aminosäuren.

Tabelle 1

Herstellung in 40-1-Ansätzen

Chemische Bestandteile Eingesetzte Menge

D-(+)Glucose 80,0 g

NaCl 274,4 g

Na₂HPO₄ (wasserfrei) 4,96 g

KCl 16,0 g

MgSO₄ (wasserfrei) 3,92 g

NaHCO₃ 88,0 g

Stammlösungen

ZnS0„-7H_?0, 8,0 ml

- 6
Konzentration 10 g/ml

CuSO₄-5H₂O, Konzentration 10 g/ml 0,4 ml Fe(NO,).,-9H₂O₇ Konzentration 10~⁶ g/ml 4,0 ml

(10~⁴ g/ml)

MnCl₇-4H₂Oj Konzentration 10~ g/ml 0,4 ml

Aminosäuren^ Konzentration 5OX 800 ml (1600 ml)

Vitamine₇ Konzentration 50 X 800 ml

PIPES 136,96 g

L-Tyrosin 1,40 g

L-Cystin 0,80 g

CaCl₂ 5,88 g

Phenolrot 0,4 g Auffüllen mit destilliertem Wasser auf 40 1.

" J5Ü4715

Tabelle 2 Herstellung in 20-1-Ansätzen

Aminosäure Eingesetzte Menge

L-Alanin	90,0
L-Arginin·HCl	60,0
L-Asparaginsäure	24,0
L-Asparagin-H 0	20,0
L-Cystein-HCl-H₂O	60,0
L-Glutaminsäure	45,0
Glycin	50,0
L-Histidin-HCl-H₂O	20,0
L-Isoleucin	30,0
L-Leucin	7 5,0
L-Lysin-HCl	90,0
L-Methionin	23,0
L-Phenylalanin	25,0
L-Prolin	30,0
L-Serin	10,0
L-Threonin	40,0
L-Tryptophan	10,0
L-Valin	50,0
Auffüllen mit destilliertem Wasser	auf 20 1

\^^c

■·■■■■ 35ϋΛ715

Tabelle 3 Herstellung in 10-1-Ansätzen

_Vitamin Eingesetzte Menge

Ascorbinsäure d-Biotin d-Calciumpantothenat Cholinchlorid d- oC-T ocopherolacetat Ergocalciferol Glutathion Myo-Inosit Menadion-Natriumhydrogensulfit Methyllinoleat Nicotinamid Pyridoxal-HCl Riboflavin Natriumpyruvat Thiamin-HCl Vitamin A Vitamin BI 2

Auffüllen mit destilliertem Wasser auf 10 1.

1,0	g	g	g	g	g	g	g	g
0,3	g	0,046 g	g	g
0,5	g	17 μΐ
0,8	g	0,5
6 μΐ		0,5
0,5	g	0,05
0,55	12,5
1,0	0,52
0,05
0,1

3OT4715

Die eingekapselten Hybridomzellen wurden auf vier Kulturen aufgeteilt, die mit 390, 395, 396 und 397 bezeichnet wurden. Kultur 390, die aus 6 1 Medium bestand und etwa 3 1 abgesetzte Kapseln enthielt, wurde in einer 36-1-Drehflasche kultiviert. Das anfängliche Kulturmedium war das hypertonische Medium, das den doppelten Aminosäuregehalt sowie überschüssiges Eisen enthielt. 3, 5, 7, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 19, 20 und 21 Tage nach Kultivierungsbeginn wurde diese Kultur absatzweise mit 6 bis 8 1 hypertonischem Kulturmedium versetzt, um die Tonizität aufrechtzuerhalten.

Kultur 395, die aus 6 1 eingekapselter Kultur bestand, wurde in einem Behälter aus rostfreiem Stahl kultiviert, wobei während der experimentellen Kultivierungsdauer von 26 Tagen insgesamt 90 1 normales Medium kontinuierlich zugeführt wurden. Die angewandte Aminosäurekonzentration (800 ml) führte zu einem isotonischen Medium.

die

Die Kulturen 396 und 397, /jeweils aus 6 1 eingekapselter Kultur bestanden,wurden in einem Behälter aus rostfreiem Stahl kultiviert, wobei während der experimentellen Kultivierungsdauer von 26 Tagen kontinuierlich 120 1 Medium sowie zusätzliches Eisen zugeführt wurden. Die Kultur 396 erhielt hypertonisches Medium mit doppeltem Aminosäuregehalt, während die Kultur 397 isotonisches Medium erhielt.

Durch sämtliche eingekapselten Kulturen wurde Sauerstoff/CO--Gemisch hindurch barbot iert.

BAD ORiGIHAL

.:..:.. ---.:.- 35 O A 7 1

Fig. I erläutert die Abhängigkeit der Zellkonzentration (Zellen/ml) der abgesetzten Kapseln für die oben genannten vier Kulturen zu verschiedenen Zeitpunkten. Die Zellzählung wurde nach Aufbrechen einer Probe der Kapseln mit einem Hämatocytometer vorgenommen. Wie aus Fig. 1 hervorgeht, führte das hypertonische Medium nicht nur zu keinerlei Behinderung des Wachstums der Hybridomzellen, sondern führte auch zu einer erhöhten Wachstumsrate, was gänzlich unerwartet war.

In Fig. 2 ist die Abhängigkeit der Gesamtmenge lebensfähiger Zellen/ml abgesetzte Kapseln für die vier Kulturen von Fig. 1 dargestellt. Die Lebensfähigkeit der Zellen im hypertonischen Medium ist, wie die Ergebnisse zeigen, mindestens gleich gut und zum Teil sogar besser als in einem isotonischen Medium.

In Fig. 3 ist die Abhängigkeit der Antikörperkonzentration von der Kultivierungsdauer für die oben genannten vier Kulturen dargestellt. Die Ergebnisse zeigen eine Erhöhung der Antikörperproduktion im hypertonischen Medium. Am 14. Tag produzierte die Kultur 397, der kontinuierlich isotonisches Medium zugeführt wurde, etwa 200 μg Antikörper/ml Kapseln, was einer ausgezeichneten Antikörperausbeute aus einer Zellkultur entspricht. Im Gegensatz dazu erzeugten die in hypertonischem Medium wachsenden Kulturen (Kulturen 390 und 396) etwa 800 μg Antikörper/ml Kapseln, was der vierfachen Menge entspricht. Die Antikörperkonzentration wurde durch Aufbrechen der Kapselmembranen

BAD OHiGlNAL

immunologisch durch ELISA-Antikörperassay bestimmt. Im einzelnen wurden hierfür Ratten-Antimaus-Antikörper, die an Alkaliphosphatase gekuppelt waren, mit der intrakapsulären Flüssigkeit umgesetzt. p-Nitrophenylphosphat diente als Substrat für die Alkaliphosphatase nach immunologischer Kupplung an Maus-Antikörper. Die Messung wurde spektrophotometrisch bei 340 nm vorgenommen.

Aus den erhaltenen Ergebnissen geht hervor, daß die Erhöhung der Antikörperkonzentration durch die Hypertonizität des Mediums und nicht durch den zusätzlichen Eisengehalt hervorgerufen wird. Die Kulturen 396 und 397 erhielten beide gleiche Medien mit zusätzlichem Eisengehalt mit dem Unterschied, daß die Kultur 396 die doppelte Aminosäurekonzentration enthielt. In der Kultur 397 lag kein Aminosäuremangel vor, da kontinuierlich isotonisches Medium mit Aminosäuren zugeführt wurde.

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß durch Verwendung eines hypertonischen Mediums, in diesem Fall mit einer Osmolarität von 360 mosm/1, im Gegensatz zu konventionellen isotonischen Medien eine erhöhte Proteinproduktion ohne Beeinträchtigung der Lebensfähigkeit der Zellen induziert werden kann.

Beispiel 2

Die Versuche dienen zur Erläuterung des Befunds, daß, während durch Einkapselung einer Zellkultur und Zusatz überschüssiger Aminosäuren zur Erzielung eines hypertonischen Mediums eine erhebliche SteigevuTijj d(?r An t i köi pcrs vn t hose nunilioh ist . sogar nicht verkapse1te_?Antikörper produzierende Zellen eine

kleine Erhöhung ihrer Antikörperproduktion zeigen, wenn sie in einem Medium kultiviert werden, das durch Zusatz von Natrium hypertonisch gemacht ist.

Bei den Versuchen wurden drei verschiedene Medien eingesetzt: Ein Medium mit einer Osmolarität von 250 mosm/l (hypotonisch), ein zweites Medium mit einer Osmolarität von 325 mosm/l (isotonisch) sowie ein drittes Medium mit einer Osmolarität von 400 mosm/l (hypertonisch). Die Osmolarität der jeweiligen Lösungen wurde über die Gefrierpunktserniedrigung gemessen. Die Osmolarität einer Lösung ist bei diesen Konzentrationen etwa gleich der Osmolalität. Die Medien waren identisch mit dem Grundmedium der Tabellen 1 bis 3 (ohne überschüssiges Eisen bzw Aminosäuren) mit dem Unterschied, daß die Natriumchloridkonzentration zur Änderung der Osmolarität variiert wurde.

In Fig. 4 ist die Abhängigkeit des Zellwachstums (Zellzahl) von der Kultivierungsdauer für die drei obigen Kulturen dargestellt. Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Änderung der Osmolarität der Lösung durch Salzzusatz keinen signifikanten Einfluß auf das Zellwachstum hat.

In Tabelle 4 ist die Antikörperkonzentration für drei verschiedene Kulturen aufgelistet. Die Kulturen A, B und C wurden jeweils unabhängig doppelt getestet (Werte a bzw b in Fig. 4). Die Kulturen waren jeweils Hybridomzellenkulturen, jedoch in nicht verkapselter Form.

	Tabelle 4
ι τ ί t* ö +■	Antikörper
II Λ. LcL U	konzentration
	(Mg/ml)
250a	72,9
250b	74,1
325a	72,3
325b	78,8
400a	79,9
400b	77,7
280a	68,2
250b	66,0
325a	58,6
325b	91,8
400a	52,4
400b	88,9
250a	69,7
250b	65,3
325a	92,5
325b	82,8
400a	79,9
400b	100,8

Antikörper konzentration, Mittelwert (pg/ml)	,8
73	,1
75	,1
78	,6
67	,5
75	,6
70	,3.
67
87
• 90

Wie aus den Ergebnissen von Tabelle 4 ersichtlich ist, führt die Erhöhung der Osmolarität des Wachstumsmediums durch Salzzusatz zu einer Proteinproduktion, die mindestens gleich gut bzw besser ist als die Antikörperproduktion im isotonischen Medium bzw besser ist als die im hypotonischen Medium. Die Daten zeigen ferner, daß der Einfluß allerdings nicht so stark ausgeprägt ist wie bei den Daten von Fig. 3, bei denen Medien verwendet wurden,
die durch Aminosäurezusatz hypertonisch gemacht waren. Gleichwohl ist festzustellen, daß in mit Natriumchlorid modifizierten hypertonischen Medien kultivierte Zellkulturen eine höhere Antikörperproduktion als bei konventionellen Kultivierungs-

BAD OBlGINAL

verfahren aufweisen. Der Vergleich mit Fig. 3 zeigt ferner, daß die Erhöhung der Osmolarität des Kulturmediums durch Aminosäurezusatz zu einer erheblich stärkeren Erhöhung der Proteinproduktion führt.

Für beide Alternativen der Erhöhung der Osmolarität unter Erzielung hypertonischer Systeme durch Zusatz von Aminosäuren wie auch durch Zusatz von

die Steigerung der Proteinproduktion Natriumchlorid lag/angesichts des vorliegenden Fachwissens außerhalb der fachmännischen Erwartung.

Zusätzliche Versuche wurden unter Verwendung Protein erzeugender Zellen wie etwa Human-Human-Hybridomzellen, die IgM produzieren, sowie von Maus-Maus-Hybridomzellen durchgeführt, die IgG synthetisieren. In sämtlichen Fällen führte die Anwendung des hypertonischen Mediums zu höheren Proteinmengen als in isotonischen Medien. Medien, die zusätzliche Aminosäuregehalte aufweisen und eine Osmolarität von etwa 350 bis 360 mosm/1 besitzen, erscheinen hierbei optimal, jedoch kann die Antikörperproduktion bzw die Produktion anderer Proteine auch mit anderen hypertonischen Medien gesteigert werden, die ausreichend Nährstoffe enthalten.

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Claims

Patentanwälte ol92-37.255P 12. Febr. 1985 BEETZ & PARTNER Steinsdorfstr.10,8000 München 22 Ansprüche

1. Verfahren zur Förderung der Proteinproduktion von Protein produzierenden Säugerzellen, gekennzeichnet durch Kultivierung der Protein produzierenden Zellen in einem hypertonischen Medium mit einer Osmolarität von nicht weniger als etwa 340 mosm/1.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Verwendung von Antikörper produzierenden Säugerzellen als Protein produzierende Zellen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet -\ durch Verwendung eines durch Zusatz eines Über- * Schusses an Aminosäuren hypertonisch gemachten Mediums.

4. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch kontinuierliche Zugabe der überschüssigen Aminosäuren zur Aufrechterhaltung der Hypertonizität des Mediums.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch Kultivierung der Zellen in einem hypertonischen Medium mit einer Osmolarität von etwa 340 bis etwa 450 mosm/1.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet durch Verwendung genetisch modifizierter Säugerzellen als Protein produzierende bzw Antikörper produzierende Zellen.

O192-DBH457-SF-Bk -T

7. Verfahren nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch Verwendung von Säuger-Hybridomzellen als Antikörper produzierende Zellen.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet durch Kultivierung der Protein produzierenden bzw Antikörper produzierenden Zellen innerhalb von Kapseln mit permeablen Membranen, die im hypertonischen Medium vorgesehen sind.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch Kultivierung in einem hypertonischen Medium mit einer Osmolarität von etwa 360 mosm/1.

10. Medium zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, gekennzeichnet durch Gehalt an essentiellen Salzen, Nährstoffen, Vitaminen und Aminosäuren, dessen Osmolarität durch entsprechenden Aminosäurezusatz auf etwa 340 bis 450 mosm/1 eingestellt ist.

11. Medium nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch gegenüber der Normalkonzentration etwa doppelte Konzentration an Aminosäuren.

12. Medium nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäurekonzentration etwa 7 bis 12 I der nichtwäßrigen Komponenten beträgt.