NO850533L - Fremgangsmaate og medium for aa fremkalle antistoffproduksjon - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrører en metode for å forbedre proteinproduksjon, spesielt antistoffproduksjonen, i dyrecellekulturer. Sagt i korthet, brukes hypertone heller enn isotone medier til å ernære og opprettholde cellene. Dette har den virkning at det øker mengden av protein produsert pr. celle, mens cellenes levedyktighet opprettholdes. Slike hypertone medier er spesielt vel egnet til å dyrke antistoffproduserende celler slik som hybridomer siden slike celler produserer mye mer antistoff uten betydningsfull modifisering av deres levedyktighet eller veksthastighet.

Konvensjonelle medier for dyrkning av pattedyrceller er utformet i henhold til Eagle's to seminalartikler om virkningen av ionekonsentrasjon på cellevekstcykler, se Science, 122: 501-4(1955 og Arch. Biochem. & Biophys., 61: 356 - 366 (1956). Eagle bestemte at medier som inneholdt 85 - 115 mM natrium

og 1 - 10 mM kalium var optimale for vekst for både HeLa-celler og musefibroblaster. Utformingen av Eagle's basalmedium, som danner basis for nesten alle dyrecellevekstmedier anvendt i dag, er basert på disse resultater.

Eagle's arbeid ble fulgt av Stubblefield og Mueller, se Cancer Res. 20: 1646 - 1655 (1960), som utforsket virkningene

av natriumkloridkonsentrasjon på vekst, biokjemisk sammenset-ning, og metabolisme av HeLa-celler. Stubblefield oppdaget at høyere konsentrasjoner av natriumklorid i vekstmedium forhindret cellereplikasjon, førte til en økning i antall celler,

mens det fremmet RNA og proteinsyntese i cellene som overlever. Stubblefield gjorde en teori om at forandringen i saltinnhold forhindret DNA-replisering, og derved forhindret mitose og tillot cellene som overlevde å vokse seg større enn de ellers ville. Tilsetningen av natriumklorid forandret osmolariteten av mediet, men Stubblefield forsøkte ikke å differensiere mellom osmotiske og ioniske effekter.

12 år senere dyrket Schachtschabel og Foley (se Exp. Cell Res. 70: 317 - 324, 1972) Ehrlich asciter tumorceller i et medium gjort hypertonisk ved tilsetning av natriumklorid for å bestemme virkningen av medier med høy tonisitet på vekstcyklus av denne type celler. Schactschabel fant ut at en salttole-rant populasjon som fulgte en normal livssyklus, utviklet seg etter betydningsfulle tap av antall celler i kulturen. Imidler tid hadde disse salttolerante cellene en noe forskjellig morfo-logi fra konvensjonelle celler, dvs. de viste seg mere lik fibroblaster enn epiteliale celler. Generasjonen eller fordob-lingstiden for disse cellene økte dramatisk, og antallet over-levende celler minket når tonisiteten av mediene ble økt.

Antistoffproduserende kulturer, f.eks. miltceller og hybridomer, blir normalt dyrket i medier slik som Eagle's modifiserte medier som inneholder serum. Vekstsyklus for de anti-stof f produserende celler i disse medier og mengden utskilt antistoff er innen det forventede område sammenlignet med andre proteinutskillende celler dyrket i disse medier. Imidlertid har den økte bruk av antistoffer som biologiske midler, spesielt gjennom teknikker for dannelse av hybridomer og monoklonalt antistoff, ført til et behov for økt antistoffproduksjon fra spesifikke cellekulturer.

Myelomer blir også dyrket normalt i isotone medier. Siden disse celler produserer protein og kan bli genetisk modifisert, ville et medium som kunne øke proteinproduksjonsnivået uten tap av cellenes levedyktighet være fordelaktig.

Følgelig er et mål for oppfinnelsen å gi en metode for dyrking av proteinproduserende celler for å forbedre proteinproduksjonen. Et annet mål er å fremme høy antistoffproduksjon fra antistoffproduserende celler mens man utvikler en levedyk-tig, voksen kultur. Et videre mål er å fremme hybridomvekst, og monoklonal antistoffproduksjon uten å tilsette ernæringscel-ler til kulturen. Et enda videre mål for oppfinnelsen er å gi en metode for å oppnå høyt proteinutbytte fra kulturer med store volumer, som inneholder høy celletetthet. Et annet mål for oppfinnelsen er å fremme proteinproduksjon fra celler, f.eks. myelomer, mens man opprettholder cellenes levedyktighet. Disse og andre mål og momenter for oppfinnelsen vil komme

frem gjennom sammendraget, tegningen og beskrivelsen som følger.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGEN

Fig. 1 illustrerer virkningen på cellepopulasjon av medier gjort hypertoniske ved aminosyretilsetning for en kultur av antistoffproduserende celler;Fig..2 - illustrerer levedyktigheten av celler dyrket i mediene av fig. 1 ; Fig. 3 illustrerer antistoffproduksjonen fra kulturer dyr ket i mediene av fig. 1; Fig. 4 illustrerer at natriumklorid kan anvendes til å

gjøre mediet hypertont uten tap av cellenes levedyktighet; og

Fig. 5 illustrerer et apparat anvendbart i produsering

av protein i henhold til oppfinnelsen.

SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN

Oppfinnelsen vedrører en metode for å fremme proteinproduksjonen, spesielt antistoffproduksjonen, i dyrecellekulturer. I korte trekk er det blitt oppdaget at konvensjonelle medier anvendt til dyrking av proteinproduserende celler, kan bli modifisert til å fremskaffe betydelig høyere proteinutbytter med høyere spesifikk aktivitet enn det som tidligere har vært mulig. Oppfinnelsen vedrører også et forbedret vekstmedium som fremmer proteinproduksjonen.

Oppfinnelsen gir en metode til å fremme proteinproduksjonen ved å dyrke en proteinproduserende celle i et hypertont medium, dvs. et medium som har en osmolaritet på minst 340 milliosmol, idet det fortrinnsvis har en osmolaritet innen området 340 til 450 milliosmol, og mest foretrukket omtrent 360 milliosmol. Foretrukne medier er konvensjonelle vekst-medier, f.eks. Eagle's medier, gjort hypertoniske ved tilsetning av økte mengder aminosyrer, fortrinnsvis 2 ganger det normale aminosyreinnhold. Disse aminosyrer kan bli tilsatt periodevis eller på kontinuerlig basis. Konvensjonelt medium kan bli periodisk tilført overskudd av aminosyrer for å produ-sere aminosyrekonsentrasjoner større enn de som normalt anvendes. Alternativt kan man la et tidligere fremstilt hypertont medium passere kontinuerlig eller intermitterende gjennom kulturen. Forbedring i proteinproduksjon blir også oppnådd i en porsjonskultur som bruker hypertont medium. En hvilken som helst proteinproduserende celle kan dra fordel av oppfinnelsen, men genetisk modifiserte celler er foretrukne.

Mens oppfinnelsens metode er generelt anvendbar til økning av proteinproduksjon fra konvensjonelle proteinproduserende cellekulturer, er den spesielt anvendbar når de proteinproduserende celler er innkapslet i en mengde kapsler som har en permeabel membran som avgrenser et intrakapsulært volum. Kapselmem branen kan inkludere en polymer som inneholder en mengde primære amingrupper saltbundet til et surt polysakkarid. Det foretrukne sure polysakkarid er alginat, mens den foretrukne polymer som inneholder en mengde primære amingrupper er poly-peptid, fortrinnsvis polylysin eller polyornitin.

Oppfinnelsen inkluderer et forbedret vekstmedium til å fremme proteinproduksjonen. Dette mediet inneholder essensielle salter, næringsstoffer og aminosyrer nødvendige for cellevekst og mitose som også slike medier som Eagle<1>s modifiserte medier gjør, men blir modifisert ved tilsetning av overskudd av aminosyrer tilstrekkelig til å øke osmolariteten av mediet til minst omtrent 340 milliosmol, fortrinnsvis mellom omtrent 340 og 450 milliosmol, og mest foretrukket omtrent 360 milliosmol. Medier som representerer oppfinnelsen, fremmer øket proteinproduksjon uten på skadelig måte å affisere levedyktigheten av cellene eller deres veksthastighet.

BESKRIVELSE

Metoden og mediet for oppfinnelsen er basert på oppdagelsen at hypertoniske medier i kontrast til vanlig oppfatning, kan fremme proteinproduksjonen, spesielt antistoff, uten å skade cellenes levedyktighet. Eksepsjonelle antistoffutbytter, som har høyere spesifikk aktivitet eller renhet enn tidligere hadde vært mulig, oppnås når man følger utredningen i oppfinnelsen,

i kulturer med enten små eller store volumer, høy celletetthet, kulturer av industriell størrelse.

Tidligere forsøk angående virkningen av natriumkloridkonsentrasjon på HeLa og musefibroblastceller førte til den kon-klusjon at 290 til 330 milliosmol var optimums tonisitetsområ-det for vekst av dyrecellekultur. Imidlertid, hvis man bruker oppfinnelsens metode, kan man oppnå antistoffutbytter på 50% utskilt protein, og utbytter på opptil 62% er mulig. På grunn av den høye antistoffkonsentrasjonen i det utskilte protein forenkles rensingen av antistoffet, og letter derved mange av problemene assosiert med antistoffrensing og reduserer om-kostningene av slik rensing. Hypertoniske medier er spesielt anvendbare til dyrking av hybridomer, myelomer og andre kontinuerlig pattedyrcelleproteinproduserende kulturer, som gir høyere proteinproduksjon eller sekresjonsnivåer enn det er mulig med konvensjonelle medier. Myelomer kan bli genetisk modifisert til å fremme produksjon av spesifikke proteiner.

Proteinproduserende celler for anvendelse i oppfinnelsen kan bli dyrket i store kulturer som har celletettheter i stør-relsesorden på 10 8 celler/ml i henhold til fremgangsmåotene beskrevet i US 4 352 883, US 4 409 331, og den samtidig inngitte ansøkning nr. 85.0534 hvis innhold det

refereres til her. I korte trekk beskriver patentene '883 og '331 metoder for innkapsling av friske, levende celler og metoder for innhøsting av stoffer produsert av cellene. Ansøkning nr. 85.0534 beskriver at ekstraor-

dinært høye celletettheter kan oppnås i innkapslede kulturer ved å bruke konvensjonelle medier hvis oksygen og karbondioksyd-kravene blir møtt ved å sprøyte gass ved et bestemt oksygen-

og karbondioksydinnhold direkte gjennom en innkapslet kultur. Ved å anvende disse teknikker har man produsert kulturer som har et volum i størrelsesorden på 30 liter og en celletetthet på 10 celler pr. milliliter. Ved å bruke fremgangsmåten av denne oppfinnelsen har slike kulturer produsert mengder i stør-relsesorden av 3- 6 gram av monoklonalt antistoff.

Fig. 5 illustrerer skjematisk et apparat for celledyrking

1 henhold til denne oppfinnelsen. Den består av et 50 liters kar 10 i 316L rustfritt stål, elektropolert, tilpasset med

et lokk 12. En motor 14 driver omdreiningsaksel 16 til å ro-tere propellene 18 og 20 som er plassert i kultur 22. Kultur 22 innbefatter det hypertone medium, f.eks. som desimert her-etter, og en mengde suspenderte kapsler som har membraner som er permeable for aminosyrene, gassene, vitaminene, ionene etc. inneholdt i mediet. Det vanlige foretrukne hypertone medium er modifisert i Eagle's medium som inneholder 2 ganger den normale konsentrasjon av aminosyrer og tilsatt 5% i volum serum, f.eks. bovin-serum. Typisk er kapslene sfæriske eller sfero-idale og har en diameter i størrelsesorden på mindre enn omtrent 2 mm. Kapsler som har en gjennomsnittsdiameter i størrelsesor-den på 0,8 mm virker godt. Cellenes gasskrav blir møtt ved å la en oksygen- og karbondioksyd-inneholdende gass passere gjennom sterilt filter 24, luftrør 26 og gjennomsprøytingshode 28. Gjennomsprøytingshodet 28 kan innbefatte et 2,5 um porøst porselenfilter. Gassen kan bestå av 95% luft og 5%

CC^(i volum). Gassbobler passerer fra gjennomsprøytingshodet 28 opp gjennom mediet blant kapselene. Gjennomstrømningshatig-heten bør være tilstrekkelig til å opprettholde partialtrykket av oksygen i mediet likt med partialtrykket av oksygen i gassen. Partialtrykket av oksygen i mediet kan derved settes på et

nivå eller svakt over det som cellene trenger for optimal vekt. På grunn av serumkomponentene i mediet forårsaker gjennomsprøy-tingen at skum samler seg i overrom 30 av kar 10. Imidlertid

beskytter kapslene cellene mot dehydratisering hvis de midlertidig skulle bli transportert inn i skummet, og beskytter også cellene fra mekanisk skade. Således kan gassprøyting gjennom en innkapslet kultur tilfredsstille den økende cellepopulasjonens behov for oksygen, og derved gjøre det mulig å oppnå ekstremt høye celletettheter. Gass som går ut av kulturen passerer gjennom utgangsåpning 32 og filter 34. En typisk gasstrømshastighet for en 30 liters kultur er 0,2 standard kubikkfot pr. time.

Når man praktiserer oppfinnelsen på porsjonstilførselsmåten, blir det hypertone medium ganske enkelt ført ned i kar 10 sammen med mikrokapsler som inneholder utsædskulturen, og kulturen blir dyrket til maksimum tetthet. Alternativt kan et isotont, konvensjonelt medium anvendes i begynnelsen, og i tillegg kan overskudd av aminosyrer tilsettes til kulturen ved injeksjon én eller flere ganger i løpet av vekstcyklus, f.eks. gjennom injeksjonsåpning 36. Imidlertid er kanskje den beste måte å praktisere oppfinnelsen på, å la hypertont medium passere gjennom kulturen ved å tilføre en kontinuerlig eller periodevis strøm av medium inn i inngangsåpning 38, og drenere bort medium gjennom filterelement 40. Filterelement 40 kan inneholde et rustfritt, mikroporøst nett som har porer mindre enn diameteren av kapslene, f.eks. 50 - 100 um. Medium kan bli trukket med gjennom ventil 42. Nivå av mediet i kulturen kan observeres i det gjennomsiktige rør 44. En typisk hastighet av mediumstrøm-men inn i inngangsåpning 38 og ut gjennom filter 40 er 4 ml til 12 ml pr. minutt. Det er også overveiet at en berikende aminosyreløsning kan bli injisert inn i kulturen ettersom det trengs for å opprettholde en ønsket hypertonisitet.

Metoden anvendt i innhøstning av protein produsert av cellene vil avhenge av forholdet mellom de effektive molekyl-størrelser av proteinet av interesse og permeabiliteten av kapselmembranene. Som beskrevet i de ovenfor refererte paten-ter kan permeabiliteten av kapselmembranene kontrolleres innen grenser. Detaljer av den vanlig foretrukne metoden for å kon-trollere kapselmembranporøsitet og for å lave uniforme kapsler,

er beskrevet i den samtidige ansøkning nr.

85.0535 hvis innhold det er referert til her.

Hvis proteinet av interesse er for stort til å gå gjennom mem-branen, samler proteinene seg i mikrokapslene; hvis det er lite nok til å gå gjennom membranene vil det samle seg i det ekstrakapsulaere medium.

De følgende ikkebegrensende eksempler vil videre illustre-re oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Dette eksperiment illustrerer at en økning av tonisiteten av kulturmediet ved tilsetning av overskudd av aminosyrer ikke påvirker levedyktigheten eller hastigheten av cellemitose i proteinproduserende celler, men forårsaker forøket proteinproduksjon. Cellene anvendt i dette forsøk var et mus-mus-hybridom-utskillende IgG. Hybridomene ble innkapslet ved en modifisering av fremgangsmåten fremsatt i US-Patent nr. 4 352 883. Mer spesielt ble en suspensjon som inneholdt omtrent 10 celler pr. milliliter i 1% (volum)vekt) natriumalginat (NaG-Kelco LV) i standardmedium overført til et jethodeapparat som består av en beholder som har en øvre luftinntaksdyse og en forlenget hul del som er friksjonstilpasset inn i en stopper. Celletett-heten av alginat-mediumsuspensjonen bestemmer gjennomsnittsan-tallet av celler pr. kapsel i utsædskulturen. En sprøyte,

f.eks. 10 ml sprøyte utstyrt med en trinnvis pumpe ble montert på toppen av beholderen med en nål, f.eks. en 0,01 inch I.D. Teflondekket nål, som passerer gjennom lengden av beholderen.

Det indre av beholderen ble utformet slik at toppen av nålen

er utsatt for en konstant laminær luftstrøm som virker som en luftkniv. I anvendelse, er sprøyten full av løsning som inneholder materiale som skal innkapsles,montert på toppen av beholderen, og den trinnvise pumpen blir aktivert til trinnvis å tvinge dråper av løsningen til toppen av nålen. Hver dråpe blir "kuttet av" av luftstrømmen og faller omtrent 2,5

til 3,5 cm ned i en 1,2% (volum/vekt) kalsiumkloridløsning,

og danner gelmasser som blir oppsamlet ved aspirasjon. Gelmas-sene kan inkuberes i tre kompletterte volumer av isotont saltvann for gelekspansjon. Totalt tar saltvannsekspansjonen omtrent 11 minutter. Deretter blir en membran dannet rundt gel-massene ved kontakt med et 750 mg/l poly-L-lysin (Sigma Chemi-cal Company, 65 000 dalton molekylvekt i isoton saltløsning Etter 12 minutters reaksjon blir de resulterende kapslene vasket i 10 minutter med 1,4 g/l løsning av CHES (2-cykloheyl-aminoetan-sulfansyre) buffer (Sigma) som inneholder 0,2% (volum/ vekt) kalsiumklorid i saltvann. Kapslene blir vasket i omtrent 8 minutter med 0,3% (vekt/volum) kalsiumklorid i saltvann,

og en membran nr. 2 blir dannet rundt kapslene ved en 10 minutters reaksjon med 105 mg/l polyvinylamin (Polyscience, 50 000 - 150 000 dalton molekylvekt) i saltvann. Kapslene ble vasket igjen med 2 volumer isotont saltvann i 7 minutter, og sluttdek-_2

ket med en 7 minutters neddykking i 5 x 10 % (vekt/volum) NaG-løsning i saltvann. Kapslene ble vasket i enda 4 minutter

i saltvann, så ble de intrakapsulære volumer igjen væskedannet ved 2 neddykkinger i 55 mMol natriumcitrat i saltløsning, den første i 20 minutter og den andre i 6 minutter. Kapslene ble vasket 2 ganger i saltvann og 1 gang i 4 minutter i medium.

Som beskrevet generelt i US-patent nr. 4 409 331 når kapslene blir inkubert i vekstmediet, samler IgG seg inne i kapslene med bare spormengder som er påvisbare i det ekstrakapsulære medium. Kapslene fremstilt i henhold til denne fremgangsmåten, er inpermeable for IgG, men tillater fri gjennomgang av nødven-dige næringsstoffer og tillater derved cellevekst og antistoffproduksjon i det intrakapsulære volum.

Tabell 1 gir en oversikt over ingrediensene i et kjent grunnkulturmedium, mens tabell 2 og 3 spesifiserer aminosyrene og vitaminbestanddelene av dette medium. Konsentrasjonene i parantes i tabell 1 representerer modifikasjonene som er gjort i jern og aminosyreinnhold, for å danne et hypertont medium av oppfinnelsen. I korte trekk ble jern økt med en faktor på 100 og aminosyreinnholdet ble fordoblet. Etter ut-forming av mediet, ble 5% i volum av fetalt bovinserum tilsatt. Tilsetningen av overskuddet av aminosyrer og jernnitrat øker osmolariteten av mediet til omtrent 360 milliosmol. Som det vil vise seg fra en betraktning av bestanddelen av mediet, består omtrent 4,7% i vekt (ikke inkludert vann) av aminosyrer i det normale medium, mens det hypertone medium inneholder omtrent 8,9% aminosyrer. De foretrukne medier av oppfinnelsen inneholder mellom omtrent 7,0% og 12% aminosyrer.

De innkapslede hybridomer ble delt i 4 kulturer betegnet 390, 395, 396 og 397. Kultur 390 som besto av 6 liter medium (innbefattet omtrent 3 liter bunnfelte kapsler), ble dyrket i en 36 liters roterende kolbe. Utgangskulturmediet var det hypertone medium som inneholdt 2 ganger aminosyreinnholdet og overskudd av jern. Denne kulturen ble porsjonstilført 6 - 8 liter med hypertont kulturmedium på dagene 3, 5, 7, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 19, 20 og 21 for å opprettholde tonisiteten.

Kultur 395 som inneholdt 6 liter innkapslet kultur i et rustfritt stålkar, ble kontinuerlig tilført en total mengde på 90 liter normalt medium over den 26 dagers perioden av for-søket. Den anvendte aminosyrekonsentrasjon (800 ml) resulterte i et isotont medium.

Kulturene 396 og 397 som hver inneholdt 6 liter innkapslet kultur i et rustfritt stålkar, ble kontinuerlig tilført 120 1 medium og tilsatt jern over den 26 dagers perioden. Kultur 396 mottok det hypertone medium med 2 ganger aminosyrene, mens 397 mottok isotont medium. Oksygen/CC^ble sprøytet gjennom alle de innkapslede kulturene. Fig. 1 illustrerer antall celler/ml av bunnfelte kapsler ved forskjellige tider for de fire kulturer. Celletallene fikk man ved å bruke et hematocytometer etter å ha ødelagt en prøve av kapslene. Som det fremkommer, var det ikke bare slik at det hypertone medium ikke hindret hybridomet, det kan faktisk ha økt veksthastigheten, et helt uventet resultat. Fig. 2 illustrerer summen av levende celler/ml av bunnfelte kapsler for kulturene på fig. 1. Levedyktigheten av cellene i det hypertone medium er i det minste så god som, hvis ikke bedre enn den er isotont medium. Fig. 3 illustrerer økningen i antistoffproduksjon ved anvendelse av det hypertone medium. På dag 14 produserte kultur 397 som ble tilført isotont medium på en kontinuerlig måte, omtrent 200 mikrogram antistoff pr. milliliter kapsler, et utmerket antistoffutbytte fra en cellekultur. I sammenligning produserte cellene dyrket i det hypertone medium (390 og 396) omtrent 800 mikrogram antistoff pr. milliliter kapsler, en 4 gangers økning. Antistoffkonsentrasjonen ble målt ved å ødelegge kapselmembranen og bruke en ELISA-antistoffbestemmelse. Spesifikt man et rotte-antimus antistoff koblet til alkalinsk fosfatase, til å reagere med den intrakapsulære væske. P-nit-rofenylfosfat ble anvendt som substrat for alkalinfosfatet immunologisk koblet til museantistoffet, og absorbansen ved 340 nm ble målt.

Disse forsøk viser at økningen i antistoffinnhold er en virkning av hypertonisiteten av mediet, ikke av det tilsatte jern. Begge kulturer 396 og 397 mottok identiske medier som hadde jerntilsetning, men 396 mottok det dobbelte av aminosyre. Det var ingen mangel på aminosyrer i kultur 397 siden den ble kontinuerlig tilført isotont medium med aminosyre. Som det fremkommer fra data, ved å anvende et hypertont medium, i dette tilfelle 360 milliosmol, heller enn det konvensjonelle isotone medium, kan man indusere økt proteinproduksjon uten å nedsette cellenes levedyktighet.

EKSEMPEL 2

Dette eksempel illustrerer at mens innkapsling av en cellekultur og tilsetning av et overskudd av aminosyrer for å gjøre mediet hypertont, sterkt øker antistoffsyntesen, kan man ved å gjøre et medium hypertont ved tilsetning av natrium få en lit en økning i antistoffproduksjon selv for uinnkapslede antistoffproduserende celler.

Tre forskjellige medier ble anvendt i dette forsøk: ett som hadde en osmolaritet på 250 milliosmol (hypotont), ett annet som hadde en osmolaritet på 325 milliosmol (isotont),

og et tredje som hadde en osmolaritet på 400 milliosmol (hypertont). Osmolariteten av hver løsning ble målt ved frysepunkt-depresjon. Osmolariteten av en løsning er omtrentlig lik osmolariteten av disse konsentrasjoner. Mediene var identiske med basismediet fremsatt i tabell 1 til tabell 3 (uten overskuddet av jern eller aminosyrer) med unntak av at natriumkloridkonsen-trasjonen ble variert for å forandre osmolariteten.

Fig. 4 illustrerer celleveksten for de tre kulturer.

Som det fremgår av figuren, hadde forandring av osmolariteten av løsningen ved tilsetning av saltvann ingen signifikant virkning på celleveksten.

Tabell 4 viser forskjellen i antistoffproduksjon forårsaket av modifisering av osmolariteten av løsningen. Tre sett av kulturer (A-C), hver kjørt i duplikat (a, b), er illustrert i tabell 4. Alle kulturene var den samme hybridomkultur, men var i den uinnkapslede form.

Som det blir illustrert av dataene, resulterer en økning av osmolariteten av vektmediet ved tilsetning av saltvann i proteinproduksjon som er god som eller bedre enn antistoffproduksjonen fra det isotone medium og bedre enn det hypotone medium. Som det og så fremgår fra data er ikke virkningene så dramatiske som illustrert i fig. 3 med medier gjort hypertone med_aminosyretilsetning. Kulturer dyrket i natriumklorid modifiserte hypertone medier er såledeskarakterisert vedbedre antistoffproduksjon enn konvensjonelle cellekulturer. Imidlertid resulterer dyrkningen av indusering av en forøkning i osmolariteten ved tilsetning av aminosyrer i en dramatisk og uventet forbedring.

Man har utført tilleggsforsøk hvor man har brukt proteinproduserende celler slik som human-humanhybridomer som danner IgM og også andre mus-mushybridomer som produserer IgG. I

alle tilfelle produserer det hypertone medium større mengder protein enn det isotone medium. Medier som inneholder tilleggs-

aminosyrer som har en osmolaritet på omtrent 350 - 360 milliosmol, viser optimum, men andre hypertone medier som tilfører tilstrekkelig næringsmidler fremmer også antistoff og andre proteiners produksjon.

Fagmannen på området kan bestemme andre modifikasjoner eller variasjoner av fremgangsmåtene og produktene beskrevet her. Slike andre modifikasjoner og variasjoner er inkludert i de følgende krav.

Claims (11)

1. Fremgangsmåte for å fremkalle antistoffproduksjon fra en antistoffproduserende celle av pattedyropprinnelse,karakterisert vedet trinn som består i å dyrke nevnte antistoffproduserende celle i et hypertont medium som har en osmolaritet som ikke er mindre enn omtrent 340 milliosmol.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat nevnte hypertone medium innbefatter et medium gjort hypertont ved tilsetning av et overskudd av aminosyrer.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2,karakterisert vedat nevnte overskudd av aminosyrer blir tilsatt kontinuerlig for å opprettholde hypertonisiteten av nevnte medium.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat det osmotiske trykk av nevnte hypertone medium er mellom omtrent 340 og 450 milliosmol.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat nevnte antistoffproduserende pattedyrcelle innbefatter en genetisk modifisert celle.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5,karakterisert vedat nevnte antistoffproduserende pattedyrecelle innbefatter et hybridom.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat nevnte antistoffproduserende celle blir dyrket innenfor en permeabel kapselmembran plassert i nevnte hypertone medium.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat det osmotiske trykk av nevnte hypertone medium er omtrent 360 milliosmol.

9. Medium for å fremkalle proteinproduksjon fra proteinproduserende celler, idet nevnte medium inneholder essensielle salter, næringsstoffer, vitaminer, og aminosyrer,karakterisert ved tilsetning til nevnte medium av aminosyrer tilstrekkelig til å øke osmolariteten av dette til mellom omtrent 340 og 450 milliosmol.

10. Medium som angitt i krav 9, karakterisert vedat nevnte medium inneholder omtrent 2 ganger den normale konsentrasjon av aminosyrer.

11. Medium som angitt i krav 9, karakterisert vedat aminosyrene i mediet utgjør mellom omtrent 7% og 12% av de ikke-vandige komponenter.