CN115449485B - 一种养殖海水小球藻的方法 - Google Patents

一种养殖海水小球藻的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及藻类生物养殖技术领域，尤其是一种养殖海水小球藻的方法，包括在实验室中进行保种、育种；将小球藻藻种接种至一级扩种工序球形瓶中培养；再将一级扩种工序球形瓶中的藻液接种至管道式光生物反应器中培养；最后将管道式光生物反应器中的藻液接种至跑道池中培养。本发明通过在不同工序和不同条件进行养殖小球藻，可缩短养殖周期，增加养殖密度，保证细胞活性，使藻液一直处于细胞生长周期中的对数生长期，细胞活性好，易分裂，提高了小球藻的培养产率。

Description

一种养殖海水小球藻的方法
技术领域
本发明涉及藻类生物养殖技术领域，尤其涉及一种养殖海水小球藻的方法。
背景技术
小球藻是一种普生性单细胞绿藻，属于绿藻门。小球藻呈球形或椭圆形，直径2-5µm，有薄而坚固的细胞壁，种类繁多，生态类型多样，在淡水和海水中均有分布，在人工培养基中也能够良好生长。小球藻蛋白质含量高，营养丰富，易于规模化培养，海水小球藻含有不饱和脂肪酸EPA，近年来也备受相关研究单位及企业重视，而被广泛开发利用。
小球藻的主要培养方式有自养、异养和混养。目前规模化养殖多采用自养方式，但该方式培养密度低、生长周期长、生产效率低、占地面积大，且采收困难。
因此，设计一种养殖海水小球藻的方法成为了本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种养殖海水小球藻的方法。
本发明是通过以下技术方案予以实现：一种养殖海水小球藻的方法，包括以下步骤：
S1：在实验室光照培养箱中进行保种、育种；
具体包括：将小球藻藻种置于实验室光照培养箱中进行保种、育种，保种温度为5-8℃，光照强度为1000-1500lx，光暗比为12h：12h；育种温度为22-26℃，光照强度为2000-5000lx，光暗比为12h：12h；
S2：将S1中完成育种的小球藻藻种接种至一级扩种工序球形瓶形成藻液，进行培养；
具体包括：一级扩种工序球形瓶内的培养温度为20-24℃，光照强度为4000-6000lx，光暗比为14h：10h，通入二氧化碳和空气的混合气体，通气时间比为14h：10h；
S3：将S2中完成培养的藻液接种至管道式光生物反应器中培养；
具体包括：管道式光生物反应器内的培养温度为20-30℃，通入二氧化碳和空气的混合气体，通气时间比为14h：10h；
S4：将S3中完成培养的藻液接种至跑道池中培养。
根据上述技术方案，优选地，S1的实验室光照培养箱中设有第一液体培养基，第一液体培养基配方包括：盐度为3-5%的卤水，尿素0.2-0.3 g/L，KH2PO40.03-0.05 g/L，FeCl33-4 mg/L，Na2EDTA4-5 mg/L，NaHCO31-1.5g/L。
根据上述技术方案，优选地，S2的一级扩种工序球形瓶中设有第二液体培养基，第二液体培养基配方包括：盐度为3-5%的卤水，尿素0.2-0.3 g/L，KH2PO40.03-0.05 g/L，FeCl33-4 mg/L，Na2EDTA4-5 mg/L。
根据上述技术方案，优选地，在121℃条件下，分别对第一液体培养基中的卤水和第二液体培养基中的卤水灭菌设定杀菌时间，再分别冷却至室温。
根据上述技术方案，优选地，杀菌时间为20 min。
根据上述技术方案，优选地，管道式光生物反应器和跑道池中均设有第三液体培养基，第三液体培养基配方包括：盐度为3%的卤水，尿素0.2-0.3g/L，KH2PO40.03-0.05g/L，FeCl33-4 mg/L，Na2EDTA4-5mg/L。
根据上述技术方案，优选地，第三液体培养基的卤水均使用NaClO消毒爆气，24小时后用大苏打中和消杀后的卤水，保证余氯残留小于等于0.05ppm，并结合每日蒸发量实时检测盐度变化，从配水养水池向养殖池内加入消毒后的新水，并调整卤水盐度为3-5%。
根据上述技术方案，优选地，S1的实验室光照培养箱中还包括用于保种的固体培养基；固体培养基的保种过程具体为：盐度为3%的卤水，加入20%琼脂粉，溶解后灭菌，配制平板固体培养基，冷却凝固后使用三区划线法对小球藻细胞进行保种。
根据上述技术方案，优选地，S2中小球藻藻种与液体培养基的接种比例为1：3，S3中藻液与液体培养基的接种比例为1：10，S4中藻液与液体培养基的接种比例为1：20。
本发明的有益效果是：本发明通过在不同工序和不同条件进行养殖小球藻，可缩短养殖周期，增加养殖密度，保证细胞活性，使藻液一直处于细胞生长周期中的对数生长期，细胞活性好，易分裂，提高了小球藻的培养产率。
附图说明
图1示出了本发明的一种养殖海水小球藻的方法的流程框式示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。
如图1所示，本发明提供了一种养殖海水小球藻的方法，包括以下步骤：
S1：在实验室光照培养箱中进行保种、育种；
具体包括：将小球藻藻种置于实验室光照培养箱中进行保种、育种，保种温度为5-8℃，光照强度为1000-1500lx，光暗比为12h：12h；育种温度为22-26℃，光照强度为2000-5000lx，光暗比为12h：12h；
S2：将S1中完成育种的小球藻藻种接种至一级扩种工序球形瓶形成藻液，进行培养；
具体包括：一级扩种工序球形瓶内的培养温度为20-24℃，光照强度为4000-6000lx，光暗比为14h：10h，通入二氧化碳和空气的混合气体，通气时间比为14h：10h；
S3：将S2中完成培养的藻液接种至管道式光生物反应器中培养；
具体包括：管道式光生物反应器内的培养温度为20-30℃，通入二氧化碳和空气的混合气体，通气时间比为14h：10h；
S4：将S3中完成培养的藻液接种至跑道池中培养。
S2-S3中二氧化碳的浓度为1000ppm，通入时间与光照时间相对应。
根据上述实施例，优选地，S1的实验室光照培养箱中设有第一液体培养基，第一液体培养基配方包括：盐度为3-5%的卤水，尿素0.2-0.3 g/L，KH2PO40.03-0.05 g/L，FeCl33-4 mg/L，Na2EDTA4-5 mg/L，NaHCO31-1.5g/L，VB1和VB12溶液，VB1和VB12溶液的加入量与藻液的比均为3000:1。
根据上述实施例，优选地，S2的一级扩种工序球形瓶中设有第二液体培养基，第二液体培养基配方包括：盐度为3-5%的卤水，尿素0.2-0.3 g/L，KH2PO40.03-0.05 g/L，FeCl33-4 mg/L，Na2EDTA4-5 mg/L，VB1和VB12溶液，VB1和VB12溶液的加入量与藻液的比均为3000:1。
根据上述实施例，优选地，在121℃条件下，分别对第一液体培养基中的卤水和第二液体培养基中的卤水灭菌设定杀菌时间，再分别冷却至室温。
根据上述实施例，优选地，杀菌时间为20 min。
根据上述实施例，优选地，管道式光生物反应器和跑道池中均设有第三液体培养基，第三液体培养基配方包括：盐度为3%的卤水，尿素0.2-0.3g/L，KH2PO40.03-0.05g/L，FeCl33-4 mg/L，Na2EDTA4-5mg/L。
根据上述实施例，优选地，第三液体培养基的卤水均使用NaClO消毒爆气，24小时后用大苏打中和消杀后的卤水，保证余氯残留小于等于0.05ppm，并结合每日蒸发量实时检测盐度变化，从配水养水池向养殖池内加入消毒后的新水，并调整卤水盐度为3-5%。
根据上述实施例，优选地，S1的实验室光照培养箱中还包括用于保种的固体培养基；固体培养基的保种过程具体为：盐度为3%的卤水，加入20%琼脂粉，溶解后灭菌，配制平板固体培养基，冷却凝固后使用三区划线法对小球藻细胞进行保种。
根据上述实施例，优选地，S2中小球藻藻种与液体培养基的接种比例为1：3，S3中藻液与液体培养基的接种比例为1：10，S4中藻液与液体培养基的接种比例为1：20。
实施例1：
使用盐度为3%的卤水，加入20%琼脂粉，溶解后灭菌，配制平板固体培养基，冷却凝固后使用三区划线法对小球藻细胞进行保种，保种温度为5℃，光照强度为1000lx，光暗比为12h：12h；使用盐度为3%的卤水，121℃灭菌20 min后冷却至室温，加入灭菌后的尿素0.2g/L、KH2PO40.03g/L、FeCl33mg/L、NaHCO30.5g/L、Na2EDTA4mg/L，VB1以及VB12溶液，在500mL锥形瓶中按照体积比40%接入保存的小球藻，使得锥形瓶中小球藻初始OD680nm为0.4，将锥形瓶置于恒温光照培养箱中，温度设置为22℃，光照强度为2000lx，光暗比为12h：12h，每日摇瓶一次，养殖周期为2周，在一级扩种工序球形瓶培养时，将盐度为3%的卤水，121℃灭菌20 min后冷却至室温，经过洁净风淋后进入一级扩种工序，加入灭菌后的尿素0.2 g/L，KH2PO40.03g/L，FeCl33mg/L，Na2EDTA 4mg/L，VB1和VB12溶液，按照1：3的接种比例接入藻种，养殖过程中通入CO2和空气的混合气体，通气时间比为14h：10h，养殖周期约为2周，在管道式光生物反应器培养时，使用盐度为3%的卤水，并用NaClO进行消毒，水体中余氯低于0.05 ppm后，加入灭菌后的第三液体培养基组分，按照接种比例1：10接入藻种，养殖过程中定期通入CO2和空气的混合气体，通气时间比为14h：10h，养殖周期约为1周，上述养殖过程中减少NaHCO3的加入量和CO2气体浓度（CO2的浓度为500ppm）,测定管道式光生物反应器初始OD680nm为0.432，养殖3天后测定OD680nm为0.860，恢复CO2气体浓度为1000 ppm后养殖3天，测定OD680nm为1.454。在大鹏跑道池进行培养时，使用盐度为3%的卤水，并用NaClO进行消毒，水体中余氯低于0.05 ppm后，加入灭菌后的第三培养基组分，按照接种比例为1：20将管道式光生物反应器中藻液通过管道排至跑道池中，养殖周期约为2周。测定大棚跑道池初始OD680nm为0.367，养殖2周后测定OD680nm为1.762。
实施例2：
使用盐度为3%的卤水，加入20%琼脂粉，溶解后灭菌，配制平板固体培养基，冷却凝固后使用三区划线法对小球藻细胞进行保种，保种温度为6℃，光照强度为1250lx，光暗比为12h：12h；使用盐度为3%的卤水，121℃灭菌20 min后冷却至室温，加入灭菌后的尿素0.25g/L、KH2PO40.02g/L、FeCl33.5mg/L、NaHCO31.25g/L、Na2EDTA4.5mg/L，VB1以及VB12溶液，在500mL锥形瓶中按照体积比40%接入保存的小球藻，使得锥形瓶中小球藻初始OD680nm为0.4，将锥形瓶置于恒温光照培养箱中，温度设置为24℃，光照强度为3500lx，光暗比为12h：12h，每日摇瓶一次，养殖周期为2周，在一级扩种工序球形瓶培养时，将盐度为3%的卤水，121℃灭菌20 min后冷却至室温，经过洁净风淋后进入一级扩种工序，加入灭菌后的尿素0.25g/L，KH2PO40.02g/L，FeCl33.5mg/L，Na2EDTA4mg/L，VB1和VB12溶液，按照1：3的接种比例接入藻种，养殖过程中通入CO2和空气的混合气体，通气时间比为14h：10h（CO2气体浓度为1000 ppm），养殖周期约为2周，在管道式光生物反应器培养时，使用盐度为3%的卤水，并用NaClO进行消毒，水体中余氯低于0.05 ppm后，加入灭菌后的第三液体培养基组分，按照接种比例1：10接入藻种，养殖过程中定期通入CO2和空气的混合气体，通气时间比为14h：10h（CO2气体浓度为1000 ppm），养殖周期约为1周，上述养殖过程中减少KH2PO4的加入量,测定管道式光生物反应器初始OD680nm为0.397，养殖3天后测定OD680nm为0.832，恢复KH2PO4至0.04g/L后养殖3天，测定OD680nm为1.593。在大鹏跑道池进行培养时，使用盐度为3%的卤水，并用NaClO进行消毒，水体中余氯低于0.05 ppm后，加入灭菌后的第三液体培养基组分，按照接种比例为1：20将管道式光生物反应器中藻液通过管道排至跑道池中，养殖周期约为2周。测定大棚跑道池初始OD680nm为0.545，养殖2周后测定OD680nm为1.894。
实施例3：
使用盐度为3%的卤水，加入20%琼脂粉，溶解后灭菌，配制平板固体培养基，冷却凝固后使用三区划线法对小球藻细胞进行保种，保种温度为8℃，光照强度为1500lx，光暗比为12h：12h；使用盐度为3%的卤水，121℃灭菌20 min后冷却至室温，加入灭菌后的尿素0.15g/L、KH2PO40.05g/L、FeCl34mg/L、NaHCO31.5g/L、Na2EDTA5mg/L，VB1以及VB12溶液的培养基母液，在500mL锥形瓶中按照体积比40%接入保存的小球藻，使得锥形瓶中小球藻初始OD680nm为0.4，将锥形瓶置于恒温光照培养箱中，温度设置为26℃，光照强度为5000lx，光暗比为12h：12h，每日摇瓶一次，养殖周期为2周，在一级扩种工序球形瓶培养时，将盐度为3%的卤水，121℃灭菌20 min后冷却至室温，经过洁净风淋后进入一级扩种工序，加入灭菌后的尿素0.15g/L，KH2PO40.05g/L，FeCl34mg/L，Na2EDTA 5mg/L，VB1和VB12溶液，按照1：3的接种比例接入藻种，养殖过程中通入CO2和空气的混合气体，通气时间比为14h：10h，（CO2气体浓度为1000 ppm），养殖周期约为2周，在管道式光生物反应器培养时，使用盐度为3%的卤水，并用NaClO进行消毒，水体中余氯低于0.05 ppm后，加入灭菌后的第三培养基母液，按照接种比例1：10接入藻种，养殖过程中定期通入CO2和空气的混合气体，通气时间比为14h：10h（CO2气体浓度为1000 ppm），养殖周期约为1周，上述养殖过程中减少尿素的加入量,测定管道式光生物反应器初始OD680nm为0.362，养殖3天后测定OD680nm为0.745，恢复尿素至0.3g/L后养殖3天，测定OD680nm为1.498。在大鹏跑道池进行培养时，使用盐度为3%的卤水，并用NaClO进行消毒，水体中余氯低于0.05 ppm后，加入灭菌后的第三液体培养基母液，按照接种比例1：20将管道式光生物反应器中藻液通过管道排至跑道池中，养殖周期约为2周。测定大棚跑道池初始OD680nm为0.462，养殖2周后测定OD680nm为1.928。
对比例：使用盐度为3%的卤水，加入20%琼脂粉，溶解后灭菌，配制平板固体培养基，冷却凝固后使用三区划线法对小球藻细胞进行保种，保种温度为6℃，光照强度为1250lx，光暗比为12h：12h；使用盐度为3%的卤水，121℃灭菌20 min后冷却至室温，加入灭菌后的尿素0.25g/L、KH2PO40.04g/L、FeCl33.5mg/L、NaHCO31.25g/L、Na2EDTA4.5mg/L，VB1以及VB12溶液，在500mL锥形瓶中按照体积比40%接入保存的小球藻，使得锥形瓶中小球藻初始OD680nm为0.4，将锥形瓶置于恒温光照培养箱中，温度设置为24℃，光照强度为3500lx，光暗比为12h：12h，每日摇瓶一次，养殖周期为2周，在一级扩种工序球形瓶培养时，将盐度为3%的卤水，121℃灭菌20 min后冷却至室温，经过洁净风淋后进入一级扩种工序，加入灭菌后的尿素0.25g/L，KH2PO40.04g/L，FeCl33.5mg/L，Na2EDTA4mg/L，VB1和VB12溶液，按照1：3的接种比例接入藻种，养殖过程中通入CO2和空气的混合气体，通气时间比为14h：10h（CO2气体浓度为1000 ppm），养殖周期约为2周，在管道式光生物反应器培养时，使用盐度为3%的卤水，并用NaClO进行消毒，水体中余氯低于0.05 ppm后，加入灭菌后的第三液体培养基组分，按照接种比例1：10接入藻种，养殖过程中定期通入CO2和空气的混合气体，通气时间比为14h：10h（CO2气体浓度为1000 ppm），养殖周期约为1周，测定管道式光生物反应器初始OD680nm为0.415，养殖3天后测定OD680nm为0.935，再养殖3天后，测定OD680nm为1.732。在大鹏跑道池进行培养时，使用盐度为3%的卤水，并用NaClO进行消毒，水体中余氯低于0.05 ppm后，加入灭菌后的第三液体培养基组分，按照接种比例为1：20将管道式光生物反应器中藻液通过管道排至跑道池中，养殖周期约为2周。测定大棚跑道池初始OD680nm为0.485，养殖2周后测定OD680nm为1.946。
本申请中细胞密度测定方法为:使用紫外-可见分光光度计，预热结束后，将检测波长调至680 nm，使用空白培养基或蒸馏水作为参比液校正空白后，将摇匀的藻液置于10mm比色皿中，测定OD680nm。
本申请中余氯浓度测定方法为：使用比色法进行测定。使用滤菌器过滤掉藻液中细胞至水体无色，将余氯检测试剂1-2滴于10 mL过滤后的藻液中，据藻液颜色变化，对照色别表，即可读得相应藻液中余氯数值。加入检测试剂立即判定为游离氯数值，放置10分钟后判定为总余氯数值。
下表为实施例1-3以及对比例的小球藻生长数据表：
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从上表的实施例1-3中可以看出，在培养过程中减少药量的摄入，会影响后期小球藻的OD680nm（即680nm波长处的光密度），对比例则体现出，若完全按照本发明的培养条件对小球藻进行培养，则会使小球藻的OD680nm（即680nm波长处的光密度）在短时间内有明显的增长，提高了小球藻的培养产率。
本发明的有益效果是：本发明通过在不同工序和不同条件进行养殖小球藻，可缩短养殖周期，增加养殖密度，保证细胞活性，使藻液一直处于细胞生长周期中的对数生长期，细胞活性好，易分裂，提高了小球藻的培养产率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种养殖海水小球藻的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：对小球藻藻种进行保种、育种作业；
具体包括：将小球藻藻种置于固体培养基中进行保种、置于锥形瓶中进行育种；保种温度为5-8℃，光照强度为1000-1500lx，光暗比为12h：12h；育种温度为22-26℃，光照强度为2000-5000lx，光暗比为12h：12h；
固体培养基的保种过程具体为：盐度为3%的卤水，加入20%琼脂粉，溶解后灭菌，配制平板固体培养基，冷却凝固后使用三区划线法对小球藻细胞进行保种；
锥形瓶中设有第一液体培养基，第一液体培养基配方为：盐度为3-5%的卤水，尿素0.2-0.3 g/L，KH2PO40.03-0.05 g/L，FeCl33-4mg/L，Na2EDTA4-5 mg/L，NaHCO31-1.5g/L，VB1和VB12溶液，VB1和VB12溶液的加入量与藻液的比均为3000:1；
S2：将S1中完成育种的小球藻藻种接种至一级扩种工序球形瓶形成藻液，进行培养；
具体包括：一级扩种工序球形瓶内的培养温度为20-24℃，光照强度为4000-6000lx，光暗比为14h：10h，通入二氧化碳和空气的混合气体，通气时间比为14h：10h，二氧化碳的气体浓度为1000ppm；
一级扩种工序球形瓶中设有第二液体培养基，第二液体培养基配方为：盐度为3-5%的卤水，尿素0.2-0.3 g/L，KH2PO40.03-0.05 g/L，FeCl33-4mg/L，Na2EDTA4-5 mg/L，VB1和VB12溶液，VB1和VB12溶液的加入量与藻液的比均为3000:1；
S3：将S2中完成培养的藻液接种至管道式光生物反应器中培养；
具体包括：管道式光生物反应器内的培养温度为20-30℃，通入二氧化碳和空气的混合气体，通气时间比为14h：10h，二氧化碳的气体浓度为1000 ppm；
S4：将S3中完成培养的藻液接种至跑道池中培养；
管道式光生物反应器和跑道池中均设有第三液体培养基，第三液体培养基配方为：盐度为3%的卤水，尿素0.2-0.3g/L，KH2PO40.03-0.05g/L，FeCl33-4 mg/L，Na2EDTA4-5mg/L；
S2中小球藻藻种与液体培养基的接种比例为1：3，S3中藻液与液体培养基的接种比例为1：10，S4中藻液与液体培养基的接种比例为1：20。
2.根据权利要求1所述的一种养殖海水小球藻的方法，其特征在于，在121℃条件下，分别对第一液体培养基中的卤水和第二液体培养基中的卤水灭菌设定杀菌时间，再分别冷却至室温。
3.根据权利要求2所述的一种养殖海水小球藻的方法，其特征在于，所述杀菌时间为20min。
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