CN112342180A - 一种葛仙米混养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种葛仙米混养方法，包括葛仙米藻种混养驯化、配制混养培养基、接种以及发酵罐混养等步骤。本发明采用Review生物活性水是一种全新的农业用水，具有营养丰富，抑菌杀菌效果，在混养中不仅可为葛仙米提供营养，还可起到预防杂菌污染效果。所用EOW(酸性氧化电位水)为光谱杀菌，且对葛仙米无毒害，对葛仙米伤害小，有效保护葛仙米藻细胞的活性，且对人体有益，不会带来食品安全风险。通过紫外线和有机碳源结合驯化培养，选育获得混养适应性强的葛仙米藻种。通过溶氧量指标作为警报信号，有效实现光暗交替培养调控，有效地避免溶氧量对混养葛仙米的毒害。异养碳源为水解酶解淀粉，增加异养对碳源存在形式的多样性。混养模式下，葛仙米光合自养生长，异养生长，异养全过程是相对无菌状态，受外界影响较小。
Description
技术领域
本发明涉及葛仙米的培植技术领域，具体为一种葛仙米混养方法。
背景技术
葛仙米是念珠藻属(Nostoc Vauch)中球状念珠藻(Nostoc sphaeoides Kützing)的俗称，它属于蓝藻门(Cyanophyta)，蓝藻纲(Cyanophyceae)，念珠藻目(Nostocales)，念珠藻科(Nostocaceae)。葛仙米又称绿色燕窝，弥足珍贵，是食药两用的佳品。其干物质总蛋白含量为28.38％～52％，总糖为24.19％。含18种氨基酸，包括人体必需的8种氨基酸；富含VC、VE和B族维生素，及多种矿质元素，特别是含钙量高的食用藻类。
微藻的培养模式有三种方式：自养、异养、混养。目前，葛仙米培养主要采用悬浮培养、跑道池搅拌培养、静置气相培养或浅层培养。综合以上培养模式，葛仙米的培养方式均属于开放式光合自养。光合自养的缺点是培养密度低、培养周期长，生长慢、开放式培养受外界环境因素影响大，且易于污染杂藻和微生物，因此，需要消耗大量人力物理进行清洗筛选，同时为了保证食用微生物风险，需采取灭菌方式。近年来，混养技术在其它微藻(如小球藻、裸藻、栅藻等)方面的应用，获得显著的效果，目前混养培养微藻数量极少，且无有关葛仙米混养的报道。因此，为规避葛仙米现有技术存在的不足，开发一种葛仙米混养方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种葛仙米混养方法，解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种葛仙米混养方法，具体步骤如下：
步骤1)葛仙米藻种混养驯化：
(1)、驯化筛选混养藻种：选取球体圆润的葛仙米球体，在无菌操作台上，采用EOW(酸性氧化电位水)水浸泡处理20-30秒，洗净，制成藻浆，涂布于添加有0.5g/L的葡萄糖的BG-110固体培养基表面，在40W紫外灯下，距灯距离5cm处照射，24小时后，在2000lux，光暗比例8h/16h下，温度30℃下生化培养箱内培养出肉眼可见的小藻体；挑选小藻体，接于添加有葡萄糖0.5g/L的BG-110液体培养基中，通气培养，每7-10天更新一次培养基，在2000lux，光暗比例8h：16h下，温度30℃下生化培养箱内培养，获得可存活的且粒径达2mm以上的藻体，并保存；
(2)、混养藻种扩繁：挑选2mm以上的藻体，采用EOW(酸性氧化电位水)水浸泡处理20-30秒，制成藻浆，接于扩添加有葡萄糖0.5g/L的BG-110液体培养基中，在2000lux，光暗比例8h：16h下，温度30℃下生化培养箱内通气培养出现小藻体后，每7-10天更新一次培养基分密度培养，扩繁获得小藻体，作为混养发酵罐培养的藻种；
步骤2)配制混养培养基：
(1)培养基组分
Review生物活性水50-100份，淀粉20-30份、淀粉酶3-6份、生物素0.01-0.05份、维生素B120.01-0.08份、维生素B10.05-0.1份、氯化钠1.0-2.0份、氯化钾2-4份、硝酸钾10-15份，碳酸氢钠4-8份，消泡剂0.01-0.05份、抑菌剂1.0-2.0份，土壤浸出液20ml-40ml/L，去离子水1000-20000份；
(2)培养基配制
(2.1)稀释：采用去离子水，将Review生物活性水稀释200-300倍；
(2.2)配制：在1.1中中添加，淀粉、淀粉酶、消泡剂；
(2.3)酶解：通入过滤空气，将光合发酵罐温度设置110℃，处理10-20min，冷却至60℃，添加生物素、维生素B12、维生素B1、氯化钠、氯化钾、硝酸钾10-15份，碳酸氢钠、抑菌剂，土壤浸出液；
(2.4)灭酶灭菌：通入过滤空气，将发酵罐温度设置为121℃灭菌30min，灭酶杀菌，冷却即得；
步骤3)、接种：
将步骤1中藻种按5-10g/L，接于步骤2中装有培养基的光合发酵罐中，通入经过滤的空气，搅拌。
步骤4)、发酵罐混养：
(1)光合适应培养：打开光合发酵罐外周，补充8000lux的光强，初期培养5-7天，让葛仙米适应，光合发酵的培养液；
(2)暗适应培养：从第6天开始，光合适应和暗适应结束后，调节光照在8000lux，光暗比例8h：16h，培养5天；
(3)光暗交替培养：在光合发酵罐中光暗交替培养；
根据光合发酵罐内溶氧量，当溶氧量超过15-25mg/L时，停止供光，进行暗培养，当溶氧量超过2-5mg/L时，打开补光灯，进行光合培养，暗培养温度为30℃，光合培养温度为25℃；
根据背光面侧的透光率，调节光合培养时的光照强度，当透光率500-600lux，8000lux，透过光率为300-500lux时，光强调至15000lux，透过光率为100-200lux，光强调至20000lux，当光透过率为50-100lux，采取分罐培养，或采收获得大量葛仙米藻种。
优选地，所述消泡剂为植物油。
本发明中所述Review生物活性水为日本KUMAMOTO SUIKEN公司采购设备，制备而得。
本发明中所述土壤浸出液按现有技术制备而得。
本发明中所述EOW(酸性氧化电位水)为市售或购买设备制备而得。
本发明中所述光合发酵罐为市售。
本发明中所述BG-110固体培养基和BG-110液体培养基按照现有技术配制而成。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、采用Review生物活性水是一种全新的农业用水，具有营养丰富，抑菌杀菌效果，在混养中不仅可为葛仙米提供营养，还可起到预防杂菌污染效果。
2、所用EOW(酸性氧化电位水)为光谱杀菌，且对葛仙米无毒害，对葛仙米伤害小，有效保护葛仙米藻细胞的活性，且对人体有益，不会带来食品安全风险。
3、通过紫外线和有机碳源结合驯化培养，选育获得混养适应性强的葛仙米藻种。
4、通过溶氧量指标作为警报信号，有效实现光暗交替培养调控，有效地避免溶氧量对混养葛仙米的毒害。
5、异养碳源为水解酶解淀粉，增加异养对碳源存在形式的多样性。
6、混养模式下，葛仙米光合自养生长，异养生长，异养全过程是相对无菌状态，受外界影响较小。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
对照实施例1：
步骤1：制备藻种：选取球体圆润的葛仙米球体，在无菌操作台上，采用EOW(酸性氧化电位水)水浸泡处理20-30秒，洗净，制成藻浆，涂布于BG-110固体培养基表面，在2000lux，光暗比例8h/16h下，温度30℃下生化培养箱内培养出肉眼可见的小藻体。挑选小藻体，接于BG-110液体培养基中，通气培养，每7天更新一次培养基，在2000lux，光暗比例8h：16h下，温度30℃下生化培养箱内培养获得藻体，并保存。
步骤2：培养：按现有技术配制BG-110液体培养基，装入于光合发酵罐同体积的玻璃瓶中，按照8g/L接种步骤1中获得的藻种，在8000lux下，25℃下培养，每7天更换一次培养液并分密度培养，直至试验例培养结束为止，过滤统计葛仙米总重量，测算葛仙米干物质得率，生长速率，检测蛋白质、粗多糖含量。
试验实施例2：
步骤1、葛仙米藻种混养驯化
1、驯化筛选混养藻种：选取球体圆润的葛仙米球体，在无菌操作台上，采用EOW(酸性氧化电位水)水浸泡处理20-30秒，洗净，制成藻浆，涂布于添加有0.5g/L的葡萄糖的BG-110固体培养基表面，在40W紫外灯下，距灯距离5cm处照射，24小时后，在2000lux，光暗比例8h/16h下，温度30℃下生化培养箱内培养出肉眼可见的小藻体。挑选小藻体，接于添加有葡萄糖0.5g/L的BG-110液体培养基中，通气培养，每7-10天更新一次培养基，在2000lux，光暗比例8h：16h下，温度30℃下生化培养箱内培养，获得可存活的且粒径达2mm以上的藻体，并保存。
2、混养藻种扩繁：挑选2mm以上的藻体，采用EOW(酸性氧化电位水)水浸泡处理20-30秒，制成藻浆，接于扩添加有葡萄糖0.5g/L的BG-110液体培养基中，在2000lux，光暗比例8h：16h下，温度30℃下生化培养箱内通气培养出现小藻体后，每7-10天更新一次培养基分密度培养，扩繁获得小藻体，作为混养发酵罐培养的藻种。
步骤2、配制混养培养基
1.1培养基组分
Review生物活性水100份，淀粉25份、淀粉酶5份、生物素0.03份、维生素B120.06份、维生素B10.07份、氯化钠1.5份、氯化钾3份、硝酸钾12.5份，碳酸氢钠6份，消泡剂0.02份、抑菌剂1.5份，土壤浸出液30ml/L，去离子水20000份。
1.2培养基配制
1.2.1稀释：采用去离子水，将Review生物活性水稀释200倍。
1.2.2配制：在1.1中中添加，淀粉、淀粉酶、消泡剂。
1.2.3酶解：通入过滤空气，将光合发酵罐温度设置110℃，处理15min，冷却至60℃，添加生物素、维生素B12、维生素B1、氯化钠、氯化钾、硝酸钾，碳酸氢钠、抑菌剂，土壤浸出液。
1.2.4灭酶灭菌：通入过滤空气，将发酵罐温度设置为121℃灭菌30min，灭酶杀菌，冷却即得。
步骤3、接种：将步骤1中藻种按8g/L，接于步骤2中装有培养基的光合发酵罐中，通入经过滤的空气，搅拌。
步骤4、发酵罐混养：
1光合适应培养：打开光合发酵罐外周，补充8000lux的光强，初期培养7天，让葛仙米适应，光合发酵的培养液。
2暗适应培养：从第6天开始，光合适应和暗适应结束后，调节光照在8000lux，光暗比例8h：16h，培养5天。
3光暗交替培养：在光合发酵罐中光暗交替培养。
根据光合发酵罐内溶氧量，当溶氧量超过20mg/L时，停止供光，进行暗培养，当溶氧量超过3mg/L时，打开补光灯，进行光合培养，暗培养温度为30℃，光合培养温度为25℃。
根据背光面侧的透光率，调节光合培养时的光照强度，当透光率500-600lux，8000lux，透过光率为300-500lux时，光强调至15000lux，透过光率为100-200lux，光强调至20000lux，当光透过率为50-100lux时，采收获得大量葛仙米藻种。过滤统计葛仙米总重量，测算葛仙米干物质得率，生长速率，检测蛋白质、粗多糖含量。
实施例3：蛋白质、粗多糖含量检测
蛋白含量依据GB5009.5-2016中的凯氏定氮法测定
粗多糖含量依据NYT1676-2008中的硫酸-苯酚法测定
实施例4：干物质得率和湿重增长速率
干品得率(R)，选取150g葛仙米鲜品，用吸水纸吸干表面水分，称100g，于55℃下烘干48小时，而后收集干品，并称重即得干品得率。
湿重增长速率：记录初始接种量(m)培养结束时，用分样筛收集所有葛仙米，在分样筛中沥水15min后，称取总重量(M)，按照如下公式计算，湿重增长速率。
S：湿重增长速率(g/100g.day)；M：采收时葛仙米鲜品总重量(g或kg)；
m：葛仙米初始接种总重量(g或kg)；T：培养周期(day)。
表1试验结果
由表1的结果显示，混养能加快葛仙米的日平均生长速率，蛋白质含量、干物质得率低于对照，粗多糖含量高于对照。虽然，光合自养和混养各由优势，对比结果均存在优劣，但本试验结果可以证实，采用葛仙米混养模式具有可行性。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其它实施方式。
Claims (2)
1.一种葛仙米混养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)葛仙米藻种混养驯化：
(1)、驯化筛选混养藻种：选取球体圆润的葛仙米球体，在无菌操作台上，采用EOW(酸性氧化电位水)水浸泡处理20-30秒，洗净，制成藻浆，涂布于添加有0.5g/L的葡萄糖的BG-110固体培养基表面，在40W紫外灯下，距灯距离5cm处照射，24小时后，在2000lux，光暗比例8h/16h下，温度30℃下生化培养箱内培养出肉眼可见的小藻体；挑选小藻体，接于添加有葡萄糖0.5g/L的BG-110液体培养基中，通气培养，每7-10天更新一次培养基，在2000lux，光暗比例8h：16h下，温度30℃下生化培养箱内培养，获得可存活的且粒径达2mm以上的藻体，并保存；
(2)、混养藻种扩繁：挑选2mm以上的藻体，采用EOW(酸性氧化电位水)水浸泡处理20-30秒，制成藻浆，接于扩添加有葡萄糖0.5g/L的BG-110液体培养基中，在2000lux，光暗比例8h：16h下，温度30℃下生化培养箱内通气培养出现小藻体后，每7-10天更新一次培养基分密度培养，扩繁获得小藻体，作为混养发酵罐培养的藻种；
步骤2)配制混养培养基：
(1)培养基组分
Review生物活性水50-100份，淀粉20-30份、淀粉酶3-6份、生物素0.01-0.05份、维生素B120.01-0.08份、维生素B10.05-0.1份、氯化钠1.0-2.0份、氯化钾2-4份、硝酸钾10-15份，碳酸氢钠4-8份，消泡剂0.01-0.05份、抑菌剂1.0-2.0份，土壤浸出液20ml-40ml/L，去离子水1000-20000份；
(2)培养基配制
(2.1)稀释：采用去离子水，将Review生物活性水稀释200-300倍；
(2.2)配制：在1.1中中添加，淀粉、淀粉酶、消泡剂；
(2.3)酶解：通入过滤空气，将光合发酵罐温度设置110℃，处理10-20min，冷却至60℃，添加生物素、维生素B12、维生素B1、氯化钠、氯化钾、硝酸钾10-15份，碳酸氢钠、抑菌剂，土壤浸出液；
(2.4)灭酶灭菌：通入过滤空气，将发酵罐温度设置为121℃灭菌30min，灭酶杀菌，冷却即得；
步骤3)、接种：
将步骤1中藻种按5-10g/L，接于步骤2中装有培养基的光合发酵罐中，通入经过滤的空气，搅拌；
步骤4)、发酵罐混养：
(1)光合适应培养：打开光合发酵罐外周，补充8000lux的光强，初期培养5-7天，让葛仙米适应，光合发酵的培养液；
(2)暗适应培养：从第6天开始，光合适应和暗适应结束后，调节光照在8000lux，光暗比例8h：16h，培养5天；
(3)光暗交替培养：在光合发酵罐中光暗交替培养；
根据光合发酵罐内溶氧量，当溶氧量超过15-25mg/L时，停止供光，进行暗培养，当溶氧量超过2-5mg/L时，打开补光灯，进行光合培养，暗培养温度为30℃，光合培养温度为25℃；
根据背光面侧的透光率，调节光合培养时的光照强度，当透光率500-600lux，8000lux，透过光率为300-500lux时，光强调至15000lux，透过光率为100-200lux，光强调至20000lux，当光透过率为50-100lux，采取分罐培养，或采收获得大量葛仙米藻种。
2.根据权利要求1所述的一种葛仙米混养方法，其特征在于，所述消泡剂为植物油。
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