CN109153965A - 一种改善藻类生长的方法 - Google Patents

一种改善藻类生长的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109153965A
CN109153965A CN201780024030.8A CN201780024030A CN109153965A CN 109153965 A CN109153965 A CN 109153965A CN 201780024030 A CN201780024030 A CN 201780024030A CN 109153965 A CN109153965 A CN 109153965A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dry
dry cell
dry weight
cell
chlamydomonas
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201780024030.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109153965B (zh
Inventor
罗伯特·麦克布莱德
奥斯卡·冈萨雷斯
斯蒂芬·玛菲尔德
米勒·特朗
王迅
乔恩·汉森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Triton Agea Innovation Co
Original Assignee
Triton Agea Innovation Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Triton Agea Innovation Co filed Critical Triton Agea Innovation Co
Publication of CN109153965A publication Critical patent/CN109153965A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109153965B publication Critical patent/CN109153965B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G33/00—Cultivation of seaweed or algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L17/00—Food-from-the-sea products; Fish products; Fish meal; Fish-egg substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L17/60—Edible seaweed
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • A23L33/12—Fatty acids or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/195—Proteins from microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/18—Lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/18—Lipids
    • A23V2250/186—Fatty acids
    • A23V2250/1872—Linoleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/18—Lipids
    • A23V2250/186—Fatty acids
    • A23V2250/1874—Linolenic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/18—Lipids
    • A23V2250/186—Fatty acids
    • A23V2250/188—Oleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/20—Natural extracts
    • A23V2250/202—Algae extracts
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/90—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in food processing or handling, e.g. food conservation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/10—Process efficiency
    • Y02P20/133—Renewable energy sources, e.g. sunlight

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Information Retrieval, Db Structures And Fs Structures Therefor (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

本文提供了用于生产藻类的高密度培养物的方法以及来自此类培养物的营养补充剂以及这些培养物用于生产治疗性蛋白质的用途。

Description

一种改善藻类生长的方法
背景技术
随着世界人口持续增长，对可食用蛋白质来源的需求不断增加。尽管适合种植传统作物的土地有限，但仍需满足这种需求。藻类是传统农作物的一种替代品。藻类相对陆生作物有几个优势。藻类繁殖速度极快，其世代时间短至10小时。许多藻类品种也富含蛋白质，据报道有些蓝绿藻类品种的70％是蛋白质(Becker,Biotech.Adv.(2007)25:207)。藻类的快速繁殖速度以及高蛋白质含量意味着每英亩藻类产生的蛋白质超过豆类10倍以上。
藻类对人类和非反刍动物的食用蛋白质的生产特别有用，因为除了能够产生大量的蛋白质外，从氨基酸组成方面来看，其蛋白质也是高质量的。藻类的氨基酸组成类似于其他高质量植物来源的氨基酸组成，如大豆，并远优于诸如小麦等的谷物(Fabregas andHerrero,Applied Microbiol.Biotechnol.(1985)23:110)。与诸如蛋和酪蛋白等受人喜爱的动物蛋白质相比，藻类蛋白质具有相对高的生物价值(BECKER，同上)。此外，藻类蛋白是高度可消化的。另外，可从基因上对藻类改造以产生特定营养价值的蛋白质。
除了作为营养蛋白质的来源外，藻类也用于治疗性蛋白质的生产。基于蛋白质的治疗在医学治疗方面越来越重要。近年来，真核生物微藻作为重组蛋白生产的替代方式的兴趣一直在增加。转基因藻类中蛋白质的生产可以具有与转基因植物相同的优势，包括成本、安全性、快速扩展性。表达治疗性蛋白质的微藻可以在本文所述改善的条件下生长。重组蛋白在绿藻莱茵衣藻中叶绿体中的表达已被建立(Mayfield S.P.,等人(2007)CurrOpin Biotechnol 18:126-133)。这些蛋白质包括报告蛋白(Franklin S.,等人Plant J(2002)30:733-744；Mayfield S.P.和Schultz J.Plant J(2004)37:449-458；Muto M.,等人BMC Biotechnol(2009)9:26)、大且复杂的哺乳动物单链抗体(Mayfield S.P.,等人ProcNatl Acad Sci USA(2003)100:438-442)、更多传统的单链抗体(Franklin S.E.和Mayfield S.P.Expert Opin Biol Ther.(2005)5:225-235)、全长单克隆抗体(Tran M.,等人Biotechnol Bioeng.(2009)104(4):663-673)，潜在疫苗抗原(Surzycki R.,等人Biologicals(2009)37:133-138)、多种潜在的治疗性蛋白质(Rasala等人PlantBiotechnol.J.(2010)8:719-733)。从藻类提纯的蛋白质比用标准方法生产的蛋白质有优势，因为它们不含制备中可能存在来自细菌或哺乳动物细胞培养物的毒素和病毒剂。
阻碍藻类作为蛋白质来源和治疗性蛋白质的生产方式而被广泛使用的一个重要因素是高生产成本。用于人类消费或药物用途的藻类必须按照高质量标准生产。在大多数情况下，藻类必须在密闭发酵容器中生长。从采购和安装发酵罐所需的大量资金以及与运行发酵罐相关的高能源成本方面来看，使用密闭发酵容器增加了生产成本。
降低生产成本的一种方式是加快藻类的生长速度。随着更快的生长速度、资金和运营成本平摊于更大量的产品中，从而降低了单位生产成本。本文提供了一种生产藻类的改进方法，该方法带来明显更高的生长速度和改进的营养特征。
发明内容
本文公开的发明构思的若干方面和实施方式包括：用于培养衣藻属物种Chlamydomonas species的高密度培养的有氧、异养的方法，其中，培养物达到50g/L～200g/L干细胞重量的目标密度。在一些实施例中，培养物的目标密度为至少50g/L干细胞重量、至少60g/L干细胞重量、至少70g/L干细胞重量、至少80g/L干细胞重量、至少90g/L干细胞重量、至少100g/L干细胞重量、至少110g/L干细胞重量、至少120g/L干细胞重量、至少130g/L干细胞重量、至少140g/L干细胞重量、至少150g/L干细胞重量、至少160g/L干细胞重量、至少170g/L干细胞重量、至少180g/L干细胞重量、至少190g/L干细胞重量或至少200g/L干细胞重量。在其他实施方式中，目标密度为50g/L～75g/L干细胞重量、75g/L～100g/L干细胞重量、100g/L～125g/L干细胞重量、125g/L～150g/L干细胞重量、150g/L～175g/L干细胞重量或175～200g/L干细胞重量。在一些实施例中，在收获前生产培养物的密度为50g/L干细胞重量、55g/L干细胞重量、65g/L干细胞重量、70g/L干细胞重量、75g/L干细胞重量、80g/L干细胞重量、85g/L干细胞重量、90g/L干细胞重量、95g/L干细胞重量、100g/L干细胞重量、105g/L干细胞重量、110g/L干细胞重量、115g/L干细胞重量、120g/L干细胞重量、125g/L干细胞重量、130g/L干细胞重量、135g/L干细胞重量、140g/L干细胞重量、145g/L干细胞重量、150g/L干细胞重量、155g/L干细胞重量、160g/L干细胞重量、165g/L干细胞重量、170g/L干细胞重量、175g/L干细胞重量、180g/L干细胞重量、185g/L干细胞重量、190g/L干细胞重量、195g/L干细胞重量或200g/L干细胞重量。在一些实施例中，在生产培养物开始后250小时内达到目标密度或浓度。
所用衣藻属物种可以是能够异养或混合营养生长的任何物种，例如莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii、Chlamydomonas dysomos、Chlamydomonas mundane、德巴衣藻Chlamydomonas debaryana、Chlamydomonas moewusii、Chlamydomonas culleus、Chlamydomonas noctigama、Chlamydomonas aulata、Chlamydomonas applanata、Chlamydomonas marvanii或Chlamydomonas proboscigera。在一个实施方式中，所述衣藻属物种是野生型物种，即它不含有异源或外源基因。
所述方法包括获得浓度为0.1g/L～15g/L基本纯的衣藻属物种培养物的接种物。接种物通过将其添加至初始体积的发酵培养基中用于产生生产培养物，其中使用的接种量不超过发酵培养基初始体积的20％。然后，生产培养物在pH为约6.0～10.0，温度为约15℃～约37℃的有氧条件下生长。在一个实施方式中，生产培养物在无光的条件下生长。在一种方法中，通过提供给养培养基(是补充有冰乙酸的发酵培养基浓度的100倍)来给养生产培养物。给养计划由生产培养物的pH变化决定。生产培养物生长直至其达到所需的目标密度，此时从培养物中收获藻类。
在特定实施方式中，当生产培养物的pH增加超过预定的设定点时，对生产培养物供给给养。在一些实施方式中，当pH值超过7.5，开始给养，且当pH值低于6.8时，停止给养。在其他实施方式中，给养用于将生产培养物的pH保持在pH 6.6±0.1、pH 6.8±0.1或pH7.0±0.1。
可以通过本领域已知的任何方法完成收获，包括但不限于过滤、分批离心或连续离心。在一些情况下，生产培养物在培养开始后250小时内达到收获密度。
可以通过喷雾干燥、环干燥、桨式干燥、盘式干燥、太阳能或日晒干燥、真空干燥或冷冻干燥将收获的藻类干燥至水分含量例如不超过15％。
另一方面提供了营养补充剂，所述营养补充剂包含至少90％的至少一种衣藻属物种，其中，所述营养补充剂为水分不超过15％、粗蛋白质至少50％、脂肪含量至少10％、灰分不超过5％。在一些实施方式中，营养补充剂还含有欧米伽3脂肪酸、欧米伽6脂肪酸和欧米伽9脂肪酸。
在一个方面，提供了在生长条件下的一种或多种衣藻属物种的培养物，其中所述培养物的密度以每24小时周期50％～300％、50％～100％、100％～150％、150％～200％、200％～250％或250％～300％的速度增加。
在一个方面，提供了一种在生产条件下的一种或多种衣藻属物种的培养物，其中所述培养物的密度以每24小时周期至少50％、至少75％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少225％、至少250％、至少275％或至少300％的速度增加。
还提供了一种在稳态条件下的一种或多种衣藻属物种的培养物，其中所述培养物具有至少50g/L干细胞重量、至少60g/L干细胞重量、至少70g/L干细胞重量、至少80g/L干细胞重量、至少90g/L干细胞重量、至少100g/L干细胞重量、至少110g/L干细胞重量、至少120g/L干细胞重量、至少130g/L干细胞重量、至少140g/L干细胞重量、至少150g/L干细胞重量、至少160g/L干细胞重量、至少170g/L干细胞重量、至少180g/L干细胞重量、至少190g/L干细胞重量、至少200g/L干细胞重量的藻类密度，且其中，稳态被定义为培养物中的藻类浓度每24小时周期增加约0.1％～约50％的状态。
其他的方面提供了一种由表达至少一种外源治疗性蛋白质的至少一种衣藻属物种的基本纯的培养物生产治疗性蛋白质的方法。所述方法包括用接种物接种生产培养物，所述接种物包括含有约0.1g/L～约15g/L的表达至少一种外源治疗性蛋白质的至少一种衣藻属物种的基本纯的培养物。所用的接种物的量不超过生产培养物初始体积的20％。然后，生产培养物在pH为约6.4～10，温度为约15℃～约37℃的有氧条件下生长。在一个实施方式中，生产培养物在无光的条件下生长。基于生产培养物的pH，使用给养培养基(补充有冰乙酸的生产培养物的培养基浓度的100倍)，按照计划对生产培养物供给给养。生产培养物生长直至藻类达到所需的目标浓度，然后从培养基中收获藻类。可通过过滤、分批离心或连续离心进行收获。
在特定实施方式中，根据生产培养基的pH值的增加确定给养。在特定实施方式中，如果pH大于7.4，对生产培养物供给给养，且当pH达到6.8时停止。在其他实施方式中，设计给养计划以使生产培养基的pH保持在pH 6.6±0.1、pH 6.8±0.1或pH 7.0±0.1。
在一些实施方式中，目标浓度为至少65g/L或至少70g/L。在其他实施方式中，目标浓度为75g/L、80g/L、90g/L、95g/L、100g/L、105g/L、110g/L、115g/L、120g/L、125g/L、130g/L、135g/L、140g/L、145g/L、150g/L、155g/L、160g/L、165g/L、170g/L、175g/L、180g/L、185g/L、190g/L、195g/L或200g/L。
在一些实施方式中，在收获后通过例如喷雾干燥、环干燥、桨式干燥、盘式干燥、太阳能或日晒干燥、真空干燥或冷冻拉伸来干燥所述藻类。在其他实施方式中，所述方法进一步包括从藻类中分离至少一种治疗性蛋白质。
附图说明
结合以下描述、所附的权利要求和所附的附图，将更好地理解要求保护的发明的这些和其他特征、方面和优点，其中：
图1是种子发酵罐中氧饱和百分比和搅拌与批次年龄(batch age)的关系图。
图2是种子发酵罐中pH和温度与批次年龄的关系图。
图3是种子发酵罐中干细胞重量浓度和罐填充百分比与批次年龄的关系图。
图4是生产发酵罐中氧饱和百分比和搅拌与批次年龄的关系图。
图5是生产发酵罐中pH和温度与批次年龄的关系图。
图6是生产发酵罐中干细胞重量浓度和罐填充百分比与批次年龄的关系图。
图7示出了使用通过微波法测定干细胞重量(DCW)的过滤的编号和折叠。
图8是波袋的照片。
图9表示在发酵过程中使用由表4中的成分构成的基础培养基、由表5中的微量元素构成成分和由表6中列出的化合物构成的给养培养基达到的干细胞重量和生长速度。
图10表示在发酵过程中使用由表4中的成分构成的基础培养基、由表5中的成分构成的微量元素和由表6中列出的化合物构成的给养培养基达到的溶解氧(DO)、温度和叶轮的搅拌速度。
图11表示在发酵过程中使用由表4中的成分构成的基础培养基、由表5中的成分构成的微量元素和由表6中列出的化合物构成的给养培养基测得的气流和pH。
图12表示在发酵过程中使用由表4中的成分构成的基础培养基、由表5中的成分构成的微量元素和由表6中列出的化合物构成的给养培养基，由莱茵衣藻培养物消耗的给养培养基。
具体实施方式
提供以下详细描述以帮助本领域技术人员实现所要求保护的发明。然而，该详细描述不应被解释为对所要求保护的发明进行不当限制，因为本领域普通技术人员可以在不脱离本发明的范围的情况下对本文所讨论的实施例进行修改和变化。
本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请、公共数据库、公共数据库条目和其他参考文献整体通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利、专利申请、公共数据库、公共数据库条目或其他参考文献具体地且单独地指明通过引用并入本文一样。
如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数，除非上下文另有明确说明。
对于所提供的数值范围，应当理解，除非上下文明确地另有规定，在所述范围的上下限之间，每个中间值，直至下限的单位值的十分之一，也被特定地公开了。在任何述及的数值或在述及范围的中间值与任何其他述及的数值或该述及范围的任何其他中间值之间的每个较小范围也被包括。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在该范围内或排除在该范围外，并且其中任一端点或两个端点包含在所述较小范围中的或两个端点均不包含在所述较小范围中的每个范围也被包括，以在所述述及范围中排除任何具体的端点。如果述及的范围包括一个或两个端点，则也包括不含所包括的端点之一或两者的范围。除非另有说明，否则培养物密度或浓度基于干细胞重量(DCW)。
本文提供了用于衣藻属的藻类的异养或混合营养、需氧生产的改进方法。如本文所用，术语“异养的”和“异养”是指藻类可利用有机碳源作为能量来源和作为碳源的情况。因此，异养藻类可以在无光的条件下生长。如本文所用，术语“混合营养的”和“混合营养”是指藻类在光(光合作用)和有机碳可用作能源的条件下生长的情况。在混合营养条件下，藻类可以通过使用光作为能量源进行光合作用来生长以固定无机碳(例如二氧化碳、碳酸氢盐和/或碳酸盐)，并通过使用有机碳作为能源进行异养生长。
能够利用有机碳源作为能量源的任何衣藻属物种可以用于实施本文公开的方法。藻类可以是严格异养的，因为它天然地或通过本领域可用的任何手段进行遗传操控而不能进行光合作用。通过遗传操控是指通过人类操纵改变生物的基因构成。如本文所用的遗传操控包括重组DNA技术和传统植物育种技术。如果使用传统植物育种技术，可以通过例如选择和随机诱变使光合藻类严格地异养。如果使用重组DNA技术，可以通过本领域已知的任何技术使藻类无法进行光合作用，例如基因敲除或基因静默技术。本领域技术人员可以容易地想到使藻类无法进行光合作用的各种方法。
或者，藻类可以是天然的或通过使用遗传操控的混合营养。天然混合营养的衣藻物种的实例包括但不限于莱茵衣藻、Chlamydomonas dysomos、Chlamydomonas mundane、德巴衣藻、Chlamydomonas moewusii、Chlamydomonas culleus、Chlamydomonas noctigama、Chlamydomonas aulata、Chlamydomonas applanata、Chlamydomonas marvanii和Chlamydomonas proboscigera。例如，可以通过使用例如选择压力的应用来制备非天然异养的光合藻类。或者，光合藻类可以通过引入必要的代谢途径基因，通过使用本领域已知的重组DNA技术以代谢外源有机碳源。
无论藻类在异养还是在混合营养条件下生长，都要在没有光合作用的情况下提供必需的营养物质使藻类生长。例如，在培养基中(或在其上)生物生长的培养基可补充任何所需的营养物，包括有机碳源、氮源、磷源、维生素、金属、脂类、核酸、微量营养素和/或任何生物特定的需求物。有机碳源包括藻类能够代谢的任何碳源，包括但不限于乙酸盐；简单碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖)；复杂碳水化合物(例如淀粉、糖原)；蛋白质和脂类。在一个实施方式中，碳源是以乙酸形式提供的乙酸盐。
本文所公开的实施方法中使用的藻类可以是衣藻属的单一物种或混合物种。在一个实施方式中，培养物主要含有一种衣藻属物种。如本文所用，当该物种构成超过50％的藻类生物体时，培养物主要是一个种。例如，含有大于50％、大于55％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％的特定衣藻属物种是说该培养物主要包含该物种。在其他实施方式中，就物种或属而言，培养物是无外来污染的。如本文所用，如果培养物没有被刻意的生物污染，则称该培养物对于属或物种是无外来污染的。例如，对于衣藻属的无外来污染的培养物可含有一种或多种衣藻属物种的藻类，但不含任何其他属的生物。同样地，对于莱茵衣藻的无外来污染的培养物不包括除莱茵衣藻以外的、包括其他衣藻属物种的其他生物。用于确定培养物是否是无外来污染的方法，例如被酵母或细菌污染的方法，是本领域技术人员已知的。
在一个实施方式中，通过标准方法测定培养物不含真菌或细菌。在特定实施方式中，通过无菌落形成单位(CFU)确定培养物不含需氧细菌。在另一个实施方式中，通过无菌落形成单位确定培养物不含酵母、霉菌和大肠菌。在其他实施方式中，通过不含菌落形成单位确定培养物不含大肠杆菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和沙门氏菌属Salmonella sp.。
使用本文公开的方法，藻类在生物反应器中异养或混合营养生长。术语生物反应器是指对环境封闭且不与环境直接交换气体和污染物的系统。在藻类是混合营养的情况下，它们可以在光生物反应器中生长。光生物反应器是结合了某种类型的光源以向反应器输入光能的生物反应器。光生物反应器可以描述为封闭的、有照明的培养容器，设计用于光养液体细胞悬浮培养物的受控生物量生产。光生物反应器的实例包括例如玻璃容器、塑料管、透明罐、塑料套管和塑料袋。可用于提供维持光合作用所需能量的光源的实例包括例如日光灯、LED和自然日光。
在特定实施方式中，藻类在无光的条件下异养生长，在这种情况下，可以使用不是光生物反应器的生物反应器。在一个实施方式中，生物反应器由不允许光进入生物反应器的内部的不透明材料例如不锈钢制成。在另一个实施方式中，生物反应器由允许光进入内部的材料制成，例如用于光生物反应器的那些材料，但生物反应器本身放在包围物中，例如房间或小室内，防止光进入生物反应器。在又一个实施方式中，光生物反应器覆盖有不透明材料以防止光进入。
无论光是否被允许进入生物反应器的内部，生物反应器中要具有若干特征。在一个实施方式中，生物反应器由允许在生物反应器内部灭菌的材料构成。可用于灭菌的方法包括加热灭菌、化学灭菌或两者的组合。生物反应器还可选择地具有允许生物反应器的内容物保持在期望的温度范围内的加热和冷却元件。用于控制生物反应器温度的各种方法在本领域中是公知的。
另外，生物反应器可以具有控制生物反应器中包含的培养基的氧含量的方法。可以使用纯氧、环境空气或纯氧与环境空气的组合将氧气引入培养基中。可以通过任何已知方法将氧气引入培养基中。例如，可以通过直接注入、搅拌或直接注入和搅拌的组合来引入氧气。当直接注入时，可以以气态、液态或两者的组合引入氧气。
生物反应器还可具有调节培养基的pH的方法。可以通过添加酸来降低培养基的pH，或者通过添加碱来增加培养基的pH。酸或碱可以以液体形式、气体形式、固体形式或它们的一些组合引入。在控制pH时，可以使用强酸、可以使用弱酸、可以使用强碱、可以使用弱碱或使用其任何组合。可以使用与正在生长的藻类相容的任何酸或碱。在一个实施方式中，通过添加冰乙酸来控制pH。乙酸是有用的，因为它可以转化为乙酸盐，而乙酸盐可以作为藻类的能量和碳的来源。在一个实施方式中，培养基的pH保持在约6.0～约10.0、约6.0～约9.0、约6.0～约8.0或约6.0～约7.0。在其他实施方式中，培养基的pH保持在约6.4～7.2、约6.45～约7.15、约6.5～约7.1、约6.55～约7.05、约6.6～约7.0、约6.65～6.95、约6.7～约6.9或约6.75～约6.85。在一个实施方式中，培养基的pH保持在pH 6.5±0.1、pH 6.8±0.1或pH 7.0±0.1。
在一个实施方式中，藻类可以例如在小规模实验室培养系统中生长。小规模实验室系统是指在小于约6升的体积中的培养。在一个方面，小规模实验室培养可以是1升、2升、3升、4升或5升。在本发明的另一方面，小规模实验室培养可以小于1升。在一个方面，小规模实验室培养可以是100毫升或更少。
对于本领域技术人员显而易见的是，培养的体积将取决于所需藻类生物质的量。所述体积仅受技术人员可用的生物反应器的大小限制。在一个实施方式中，生物反应器的体积可以大于约5升、或大于约10升、或大于约20升。大规模生长也可以是在50升以上、100升以上，200升以上、300升以上、400升以上、500升以上、600升或以上、700升以上、800升以上、900升以上、1000升以上、2000升以上、3000升以上、4000升以上、5000升以上、6000升以上、7000升以上、8000升以上、9000升以上或10000升以上的体积中培养物的生长。
本公开还公开了极大规模的培养系统。在一个方面，培养体积可以是至少20,000升。在另一方面，培养体积可高达40,000升。在另一方面，培养体积可高达80,000升、高达100,000升、高达125,000升、高达150,000升或高达175,000升。在另一方面，培养体积可高达200,000升。在另一方面，培养体积可高达250,000升。在另一方面，培养体积可高达500,000升。在另一方面，培养体积可高达600,000升。在另一方面，培养体积可高达1,000,000升。
同时，对于本领域技术人员而言显而易见的是，当使用较大的培养体积时，可能需要通过几个中间体积使接种物生长。以下是扩大培养的方法的一般性讨论。对本文所讨论的方法进行修改以适应不同大小的初始培养物和不同大小的生产培养物完全在本领域普通技术人员的能力范围内。出于该示例性讨论的目的，初始材料是具有用所需一种或多种藻类植株的划线的TAP平板。使用无菌环将藻类从TAP平板中取出并添加至含有150mL合适培养基的无菌、带挡板的500mL摇瓶中，并在室温(约20℃～28℃)下以150rpm振荡培养约5天。
或者，中间培养物可以在波袋中进行。波袋是一种无菌塑料袋，其带有允许气体交换(与大气或引入的气体)、取样和/或营养补充的一个或多个端口(见图8)。波袋的培养条件(包括搅拌)与摇瓶类似，但可能涉及旋转以外的运动。本领域技术人员将能够设想用于中间培养物的其他合适的容器。
通常，培养在无光的条件下进行，但这不是必需的。在下一次放大之前大约2天，获取无菌样品以检查污染以及藻类的合适形态。培养5天后，摇瓶的干细胞重量(DCW)通常为1.0g/L～3.0g/L。本文提供了用于确定DCW值的方法。然后将500mL摇瓶约20％的内容物(在这种情况下为120mL)添加至含有约1050mL培养基的无菌、带挡板的3L摇瓶中，最终体积为约1200mL或者稀释比为1:10。以与150mL培养物相同的方式培养1200mL培养物，包括形态和污染检查。继续进行摇瓶过程直至获得至少为生产生物反应器中使用体积的10％的培养物。
一旦在摇瓶中生长了足够的藻类，藻类就可以用于接种生物反应器。出于本公开的目的，生物反应器培养与摇瓶培养不同之处在于，在生物反应器培养中，通过添加浓缩培养基来给养培养物。生物反应器接种的培养物体积不超过生物反应器中初始培养基体积的约10％。用于接种生物反应器的藻类浓度应在约0.1g/L～约15g/L干细胞重量(DCW)。在特定实施方式中，转移的藻类浓度为约0.1g/L～约10g/L、约0.1g/L～约5g/L、约0.1g/L～约4g/L、约0.1g/L～约3g/L、约0.1g/L～约2g/L、约0.1g/L～约1g/L、约0.1g/L～约0.9g/L、约0.1g/L～约0.8g/L、约0.1g/L～约0.7g/L、约0.1g/L～约0.6g/L、约0.1g/L～约0.5g/L、约0.1g/L～约0.4g/L、约0.1g/L～约0.3g/L和约0.1g/L～约0.2g/L。在一个实施方式中，使用以下公式计算用于接种生物反应器的藻类浓度：
其中，Cin是接种物的浓度，Vbr是生物反应器中的初始培养基体积，Cbr是刚接种后生物反应器中藻类的初始浓度。
用于在生物反应器中生长藻类的培养基(发酵培养基)可以是适合于在生物反应器中生长的一种或多种藻类植株的异养培养的任何培养基。在一个实施方式中，发酵培养基的组分见表1。
表1发酵培养基A
微量元素溶液的组分见表2。
表2微量元素溶液A
发酵培养基和微量元素溶液是无菌溶液，以使生物反应器中的藻类培养物不受其他生物的污染。发酵培养基可以如表1、表4和表7中给出的形式使用，或者可以以更浓缩的形式使用。在一些实施方式中，发酵培养基以表1、表4和表7中发酵培养基浓度的2倍、3倍、4倍或5倍使用。
生物反应器内培养物的温度保持在约15℃～约26℃或约26℃～约37℃的温度。在另一个实施方式中，温度保持在约26.5℃～约29.5℃。在其他实施方式中，温度保持在约27℃～约29℃或约27.5℃～约28.5℃。在一个具体的实施方式中，生物反应器内容物的温度保持在约28℃。
在生物反应器中发酵期间，培养基中氧饱和百分比保持在约5％～100％。在其他实施方式中，氧饱和百分比保持在约5％～约90％、约5％～约80％、约5％～约70％、约5％～约60％或约5％～约50％。在其他实施方式中，氧饱和百分比保持在约5％～约55％、约10％～约50％、约15％～约45％、约20％～约40％或约25％～约35％。在另一个实施方式中，培养基中氧饱和百分比保持在30％±2.5％。使用本文所述的任何方法或本领域已知的方法保持培养基中氧饱和百分比。
在发酵(培养)期间允许氧饱和百分比变化的范围部分取决于生物反应器的构造，特别是其引入氧的能力。通常，操作员将确定设定点以及相关的上下范围。设定点可以在5％～100％。允许的范围可以在本文提供的任何范围内。
本发明方法的特点在于在发酵过程中给养所述藻类所使用给养培养基的浓度是培养基浓度的50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍或120倍。通常，补充具有碳源的给养培养基以在异养条件下支持高生长速度。因此，在一个实施方式中，给养培养基是本文提供的发酵培养基浓度的100倍，其中补充有冰乙酸作为碳源。表3中给出了一种具体给养培养基的组分。
表3给养培养基A
化学名 化学式 含量 单位
氢氧化铵 NH<sub>4</sub>OH 25 g·L<sup>-1</sup>
磷酸二氢铵 NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 10 g·L<sup>-1</sup>
磷酸二氢钾 KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 1.4 g·L<sup>-1</sup>
氯化钙 CaCl<sub>2</sub> 0.9 g·L<sup>-1</sup>
七水硫酸镁 MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 5.63 g·L<sup>-1</sup>
氢氧化钠 NaOH 4 g·L<sup>-1</sup>
微量元素溶液 混合 40 mL·L<sup>-1</sup>
(冰)乙酸 CH<sub>3</sub>CO<sub>2</sub>H 510 g·L<sup>-1</sup>
培养物的给养由pH的变化触发。由于培养物使用乙酸盐来满足其能量需求，培养基中乙酸量的减少导致培养基的pH的增加。利用pH的增加来触发给养培养基的添加以将pH恢复至所需的设定点。使用该方法允许实现快速生长和获得比先前的培养系统更高的培养密度。由操作者确定pH设定点和开始和停止添加给养培养基的范围来确定给养。当pH超过设定点一定值时开始添加给养培养基，当pH低于设定点选定值时停止供给给养培养基。如本领域技术人员所理解的，确切的设定点和范围将取决于生长的藻类的特定种。在衣藻属物种的例子中，pH范围不应低于pH 5.5或超过pH 10。pH的设定点通常在6.5～7.5的范围内，在±1.0pH单位范围内波动。本领域技术人员将理解，pH范围可以不是对称的，这样可以允许pH升高至比允许降低的程度更大的程度。例如，当pH超过设定点0.5pH单位时可以开始给养，但是当pH降低至设定点以下0.2pH单位时停止给养。
本领域技术人员将理解，一个生物反应器的生产物可用于接种另一个生物反应器。在使用极大的生物反应器的情况下，仅在烧瓶或波袋中生长接种物是不可行的。在这种情况下，较小的生物反应器用于产生接种最终生产生物反应器所需的接种物的量。
在另一个实施方式中，发酵培养基的成分见表4。
表4发酵培养基B
在另一个实施方式中，微量元素的成分见表5。
表5微量元素溶液B
化学名 化学式 含量 单位
EDTA二钠无水合物 Na<sub>2</sub>EDTA·2H<sub>2</sub>O 21.50 g·L<sup>-1</sup>
碳酸钠 Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub> 3.320 g·L<sup>-1</sup>
柠檬酸铁铵 (NH4)<sub>5</sub>Fe(C<sub>6</sub>H<sub>4</sub>O<sub>7</sub>)<sub>2</sub> 7.1 g·L<sup>-1</sup>
一水硫酸锌 ZnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O 0.449 g·L<sup>-1</sup>
四水氯化锰 MnCl·4H<sub>2</sub>O 6.15 g·L<sup>-1</sup>
五水硫酸铜 CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O 0.4995 g·L<sup>-1</sup>
四水钼酸铵 (NH<sub>4</sub>)<sub>6</sub>Mo<sub>7</sub>O<sub>24</sub>·4H<sub>2</sub>O 0.0352 g·L<sup>-1</sup>
硫化硒 SeS<sub>2</sub> 0.014 g·L<sup>-1</sup>
在另一个实施方式中，给养培养基的组分由表6给出。
表6给养培养基B
化学名 化学式 含量 单位
氢氧化铵 NH<sub>4</sub>OH 4.6 g·L<sup>-1</sup>
(冰)乙酸 CH<sub>3</sub>CO<sub>2</sub>H 195.4 g·L<sup>-1</sup>
在另一个实施方式中，发酵培养基的组分由表7给出。
表7发酵培养基C
在另一个实施方式中，微量元素的组分见表8。
表8微量元素溶液C
化学名 化学式 含量 单位
EDTA二钠无水合物 Na<sub>2</sub>EDTA·2H<sub>2</sub>O 21.50 g·L<sup>-1</sup>
碳酸钠 Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub> 3.320 g·L<sup>-1</sup>
柠檬酸铁铵 (NH4)<sub>5</sub>Fe(C<sub>6</sub>H<sub>4</sub>O<sub>7</sub>)<sub>2</sub> 7.1 g·L<sup>-1</sup>
一水硫酸锌 ZnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O 0.449 g·L<sup>-1</sup>
四水氯化锰 MnCl·4H<sub>2</sub>O 6.15 g·L<sup>-1</sup>
五水硫酸铜 CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O 0.4995 g·L<sup>-1</sup>
四水钼酸铵 (NH<sub>4</sub>)<sub>6</sub>Mo<sub>7</sub>O<sub>24</sub>·4H<sub>2</sub>O 0.0352 g·L<sup>-1</sup>
硫化硒 SeS<sub>2</sub> 0.014 g·L<sup>-1</sup>
在另一个实施方式中，给养培养基的组分由表9给出。
表9给养培养基C
化学名 化学式 含量 单位
氢氧化铵 NH<sub>4</sub>OH 4.6 g·L<sup>-1</sup>
(冰)乙酸 CH<sub>3</sub>CO<sub>2</sub>H 195.4 g·L<sup>-1</sup>
磷酸二氢钾 KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 1.25 g·L<sup>-1</sup>
发酵培养基和微量元素溶液是无菌溶液，以使生物反应器中的藻类培养物不受其他生物的污染。发酵培养基可以按照本文表中给出的形式(1倍浓度)使用，或者可以以更浓缩的形式使用。在特定实施方式中，发酵培养基以表中提供的发酵培养基浓度的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍或8倍使用。给养培养基可以按照本文表中给出的形式(1倍浓度)使用，或者以更浓缩的形式使用。在特定实施方式中，给养培养基以表中给养培养基浓度的2倍、3倍、4倍或5倍使用。优选地，具有相同名称的培养基或溶液一起使用，例如发酵培养基A与微量元素溶液A和给养培养基A一起使用。
使用本文描述的方法能生产极高密度的藻类培养物。因此，本公开提供一种藻类培养物，其在稳态条件下具有至少50g/L干细胞重量的藻类浓度。在其他实施方式中，提供了具有至少55g/L干细胞重量、至少60g/L干细胞重量、至少65g/L干细胞重量、至少70g/L干细胞重量、至少75g/L干细胞重量、至少80g/L干细胞重量、至少85g/L干细胞重量、至少90g/L干细胞重量、至少95g/L干细胞重量、至少100g/L干细胞重量、至少105g/L干细胞重量、至少110g/L干细胞重量、至少115g/L干细胞重量、至少120g/L干细胞重量或至少125g/L干细胞重量、至少150g/L干细胞重量、至少175g/L干细胞重量或至少200g/L干细胞重量的稳态浓度的藻类培养物。在特定实施方式中，培养物是衣藻属物种的培养物。在具体的实施方式中，培养物是莱茵衣藻的培养物。如本领域所知，生物的质量或浓度对时间的曲线图通常将形成S形曲线。稳态是在S形生长曲线的拐点之后相对温和增长的时期。出于本公开的目的，当藻类的浓度在24小时内增加约0.1％～约10％时，认为藻类培养物处于稳态状态。在其他实施方式中，稳态是指培养物中藻类的浓度增加约0.1％～50％、约0.1％～25％、约0.1％～7％、约0.1％～约5％、0.1％至3％或0.1％～2％的状态。当培养物浓度降低时，则不认为培养物处于稳定状态。
一旦培养物达到所需浓度，培养物可以繁殖至另外生物反应器中或进行收获或兼具两者。如果繁殖至另外的生物反应器中，接种过程与本文所述的过程相同。另外的生物反应器可以与获得接种物的生物反应器具有相同的尺寸，或者可以更大或更小。对于本领域技术人员显而易见的是，繁殖和/或收获可以是连续的、分批的或半分批的。在分批模式中，整个培养物要么被收获，要么用于繁殖。在连续模式中，连续除去少量培养物用于收获或繁殖，同时添加少量培养基以替换被除去的培养基。半分批处于分批和连续之间。在半分批中，定期除去一部分但不是全部的培养物用于繁殖或收获。与连续模式一样，在半分批中添加相应量的培养基以替换除去的培养基。
在特定实施方式中，可以收获生物反应器中的一部分或全部材料。在一个实施方式中，一旦培养物达到所需的生长阶段，例如生长的对数或稳态阶段，就从生物反应器中收获所有材料。在另一个实施方式中，可以从藻类的生长或稳态培养中进行连续收获。在一个方面，藻类的去除将培养物保持在对数生长阶段。在另一方面，藻类的去除将培养物保持在稳态阶段。生长速度和微藻生长阶段的确定在本领域中是已知的。例如，在Sode等人,J.Biotechnology(1991)21:209-217,Torzillo等人,J.Phycology(1998)34:504-510,Jung和Lee,Biotechnology Progress(2006)22:1443-1450,和Vonshak,A.SpirulinaPlatensis Arthrospira:Physiology,Cell-Biology And Biotechnology.1997.CRCPress，其全部内容通过引用并入本文。
在从生物反应器中除去一部分或全部含培养基的藻类后，理想的是将藻类与培养基分离(脱水)。在一个实施方式中，收获包括从培养基中分离至少90％的微藻以产生除去微藻的液体。在另一个实施方式中，从培养基中除去至少95％的微藻。在另一个实施方式中，从培养基中除去至少97％的微藻。在另一个实施方式中，从培养基中除去至少99％的微藻。在其他实施方式中，除去50％以上的微藻。在另一个实施方式中，从培养基中除去75％以上的微藻。在另一个实施方式中，从培养基中除去80％以上的微藻。在又一个实施方式中，在收获后培养基可以剩余少于30％的微藻。在另一个实施方式中，收获后少于25％的微藻保留在培养基中。在另一个实施方式中，收获后少于5％的微藻保留在培养基中。在另一个实施方式中，收获后少于2.5％的微藻保留在培养基中。在一个实施方式中，收获后少于1％的微藻保留在培养基中。
微藻从液体中的分离可以通过本领域普通技术人员已知的方法完成。在一个实施方式中，可以允许微藻通过重力沉降并除去上覆的液体。在另一个实施方式中，可以通过离心含有微藻的培养物来收获微藻。在一个实施方式中，液体培养物的离心可以使用固定体积离心机以分批模式进行。在一个不同的实施方式中，可以使用连续流动离心完成微藻的批量收获。在另一个实施方式中，可以通过连续流动离心从生长的培养物中连续收获微藻。在其他实施方式中，脱水可以通过过滤完成，例如切向流过滤。可以分批或连续收获模式进行过滤。在其他实施方式中，脱水可以通过电泳技术完成，例如电解凝结和电解絮凝。在其他实施方式中，可以通过絮凝来完成脱水。絮凝可以通过使用合成絮凝剂或天然絮凝剂的化学絮凝或通过自动絮凝来完成。诱导絮凝的方法包括可以是美国专利No.8,969,066和美国专利公开No.US 2015/0284673(申请号No.14/649524)中的方法，这些专利各自通过引用整体并入本文。可以通过重力、离心、溶气浮选(DAF)或本领域技术人员已知的任何其他方法将絮凝物与培养液分离。如果使用化学絮凝，在某些情况下可能需要使用食品级絮凝剂。食品级絮凝剂可从各种来源商购获得。
脱水后，收获的藻类可能仍含有大量液体。为了便于长期储存，理想的是通过干燥除去额外的液体。在一些实施方式中，干燥藻类生物质，使所得材料为至少75％干细胞重量、至少80％干细胞重量、至少85％干细胞重量、至少90％干细胞重量或至少95％干细胞重量。在其他实施方式中，干燥藻类，使所得材料含有小于25％水分、小于20％水分、小于15％水分、小于10％水分或小于5％的水分。藻类生物质的干燥可以通过本领域已知的任何方法完成。示例性的干燥方法包括喷雾干燥、环干燥、桨式干燥、盘式干燥、太阳能或日晒干燥、真空干燥和冷冻干燥。
干燥后，藻类可适合用作人类消费或用作动物饲料的营养补充剂或添加剂。因此，本文所提供的是包含至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的衣藻属物种和约80％±5％或90％±5％干细胞重量的营养补充剂或饲料添加剂，所述营养补充剂或饲料添加剂还具有大于约50％±5％粗蛋白，约10％±5％粗脂肪，并且小于5％灰分。在一些实施方式中，营养补充剂或添加剂还包含至少0.4％(w/w)、至少0.5％(w/w)、至少0.75％(w/w)、至少1.0％(w/w)或至少1.25％(w/w)的欧米伽-3脂肪酸。在其他实施方式中，营养补充剂或添加剂含有至少0.25％(w/w)、至少0.75％、至少1.25％、至少1.5％或至少1.75％的欧米伽-6脂肪酸。在另一个实施方式中，营养补充剂或添加剂包含至少1.25％(w/w)、至少1.75％、至少2.25％或至少2.75％的欧米伽-9脂肪酸。营养补充剂或添加剂的特征还在于无微生物污染，如表10中的标准所确定。
表10
因为本文公开的方法提供了这种高密度培养物，所以该方法可用于生产经过遗传修饰以产生具有治疗价值的蛋白质的藻类。在一些实施方式中，治疗性蛋白质是天然存在的蛋白质。在其他实施方式中，治疗性蛋白质是外源蛋白质。本文所述的外源核酸、核苷酸、多肽或蛋白质定义为与宿主相关。外源核酸、核苷酸、多肽或蛋白质是非天然存在于宿主中或在宿主中不同位置的核酸、核苷酸、多肽或蛋白质。
治疗性蛋白质用于治疗或预防疾病或失调。治疗性蛋白质可以是哺乳动物蛋白质，例如人类蛋白质。治疗性蛋白质可用于兽用护理或用于人类护理。治疗性蛋白质可用于治疗伴侣动物、家养动物、外来动物、野生动物和生产性动物。治疗性蛋白质可以参与例如细胞信号传送和信号转导。
治疗性蛋白质的实例是抗体、跨膜蛋白、生长因子、酶、免疫调节蛋白或结构蛋白。治疗性蛋白质可以是存在于动物或人体中的蛋白质，或者是存在于动物或人体中的蛋白质的衍生物。使用藻类生产治疗性蛋白质的实例可以参见例如in Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2003)100:438-42；Curr.Opin.Plant Biol.(2004)7:159-65；Vaccine(2005)23:1828-32；Curr.Opin.Biotechnol.(2007)18:1-8；Expert Opin.Biol.Ther.(2005)5:225-35；Biotechnol.Lett.(2010)32:1373-83；和国际专利申请公开文本WO 2001/063,284。
编码目标治疗性蛋白质的核苷酸序列可以是天然存在的或野生型序列，或者可以是修饰的序列。修饰的类型包括至少一个核酸的缺失、至少一个核酸的添加或至少一个核酸的替换。本领域技术人员将知道如何对核苷酸序列进行修饰。
可以对核苷酸序列进行的一种特定类型的修饰是密码子优化。如本领域所知，编码多核苷酸的一个或多个密码子可以“偏好”或“优化”以反映宿主的密码子使用。例如，编码多核苷酸的一个或多个密码子可以“偏好”或“优化”以反映叶绿体密码子使用或核密码子使用。大多数氨基酸由两个或多个不同(简并)密码子编码，并且公认的是各种生物利用某些密码子而不是其他密码子。在整个说明书中，“偏好”或密码子“优化”可互换使用。密码子偏好可以在不同植物中有不同的偏向，包括例如与烟草相比，在藻类中有不同偏好。通常，选择的密码子偏好反映了用核酸改造了的生物体(或其中的细胞器)的密码子使用。可以从头合成偏好于特定密码子使用的多核苷酸，或者可以使用常规重组DNA技术进行遗传修饰，例如通过定点突变方法，以改变一个或多个密码子，使得它们偏好于叶绿体密码子使用。在叶绿体中使用的这种优先密码子的使用在本文中称为“叶绿体密码子的使用”。用于莱茵衣藻的叶绿体和核密码子的使用的实例可以在本领域中找到，例如在美国专利申请公开号No.：2004/0014174和国际专利公开号WO2011/063,284。
通过使用表达载体实现治疗性蛋白质在藻类中的表达。表达载体是设计为使得插入特定位点的编码序列将被转录并翻译成蛋白质的载体。表达载体或其线性化部分可包含一种或多种编码目标治疗性蛋白质的外源核苷酸序列。可以转化至宿主的外源核苷酸序列的实例包括编码哺乳动物蛋白质的核酸序列。在一些情况下，外源序列的两侧是与待转化的宿主中所含序列具有同源性的两个序列。
同源序列是例如具有参考氨基酸序列或核苷酸序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性，例如所述参考氨基酸序列或核苷酸序列是在宿主细胞(所述蛋白质是天然来自或衍生自该宿主细胞)中的氨基酸序列或核苷酸序列。同源序列使得外源序列能够重组至待转化的宿主藻类的核或质体基因组中。在一些实施方式中，表达载体包含可操作地与一种或多种控制元件连接的多核苷酸，例如启动子和/或转录终止子。当核酸序列与另一核酸序列处于功能性关系时，核酸序列可操作地连接。例如，如果前序列或分泌前导的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则它可操作地与该多肽的DNA连接；如果启动子影响序列的转录，则它与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则它与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的序列是连续的，并且在分泌前导的情况下，是连续的并且处于阅读阶段。通过在限制酶位点连接来实现连接。如果无法获得合适的限制性位点，则可以使用本领域技术人员已知的合成寡核苷酸衔接子(adaptor)或接头。Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Press,(1989)and Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology,2nd Ed.,John Wiley&Sons(1992)。
如本文使用的术语，调节或控制元件广义上是指调节多核苷酸的转录、翻译或可操作地连接于其上的多肽定位的核苷酸序列。实例包括但不限于RBS、启动子、增强子、转录终止子、发卡结构、RNA酶稳定性元件、起始(启动)密码子、内含子切除的拼接信号和维持正确的阅读框、终止密码子、琥珀密码子或赭石密码子和IRES。调节元件可包括启动子和转录和翻译终止信号。为了引入特定的限制性位点以便控制序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区的连接，可以为提供具有接头的元件。另外，包含细胞区室化信号的序列(即，将多肽靶向细胞质、细胞核、叶绿体膜或细胞膜的序列)可以连接到编码目标蛋白质的多核苷酸上。这种信号在本领域中是众所周知的并且已被广泛报道。
在表达载体中，目标核苷酸序列与宿主细胞识别的启动子可操作地连接以指导mRNA合成。启动子是通常位于结构基因起始密码子上游100至1000个碱基对(bp)的非翻译序列，其调节在其控制下的核酸序列的转录和翻译。启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。诱导型启动子是在其控制下启动增加DNA转录水平的启动子，其响应于环境的某些变化，例如营养素的存在或缺乏或温度的变化。相反，组成型启动子保持相对恒定的转录水平。
许多启动子在藻类中具有活性，包括对被转化的藻类是内源的启动子，以及对转化的藻类不是内源性的启动子(即来自其他藻类的启动子、来自高等植物的启动子以及来自植物病毒或藻类病毒的启动子)。在藻类中有活性的外源和/或内源启动子，以及在藻类中有功能的抗生素抗性基因包括但不限于描述于例如以下文献中的那些：Curr.Microbiol.(1997)35(6):356-62(Chlorella vulgaris)；Marine Biotechnol.(NY).(2002)4(l):63-73(Chlorella ellipsoidea)；MoI.Gen.Genet.(1996)252(5):572-9(Phaeodactylum tricornutum)；Plant MoI.Biol.(1996)31(1):1-12(Volvox carteri)；Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.(1994)91(24):11562-6(Volvox carteri)；Falciatore A,Casotti R,Leblanc C,Abrescia C,Bowler C,PMID:10383998,(1999)1(3):239-251(Laboratory of Molecular Plant Biology,Stazione Zoologica,Villa Comunale,1-80121Naples,Italy)(Phaeodactylum tricornutum and Thalassiosira weissflogii)；Plant Physiol.(2002)129(1):7-12.(Porphyridium sp.)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(2003)100(2):438-42.(Chlamydomonas reinhardtii)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1990)87(3):1228-32.(Chlamydomonas reinhardtii)；Nucleic Acids Res.(1992)20(12):2959-65Marine Biotechnol.(NY).(2002)4(1):63-73(Chlorella)；Biochem.MoI.Biol.Int.(1995)36(5):1025-35(Chlamydomonas reinhardtii)；J.Microbiol.(2005)43(4):361-5(Dunaliella)；Marine Biotechnol.(NY)(1999)1(3):239-251.(Thalassiosira和Phaedactylum)；Appl.Microbiol.Biotechnol.(2002)58(2):123-37(various species)；MoI.Genet.Genomics(2004)271(1):50-9(Thermosynechococcus elongates)；J.Bacteriol.(2000),182,211-215；FEMS Microbiol.Lett.(2003)221(2):155-9；Plant Physiol.(1994)105(2):635-41；Plant MoI.Biol.(1995)29(5):897-907(Synechococcus PCC7942)；Marine Pollut.Bull.(2002)45(1-12):163-7(Anabaena PCC 7120)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1984)81(5):1561-5(Anabaena(various strains))；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(2001)98(7):4243-8(Synechocystis)；MoI.Gen.Genet.(1989)216(1):175-7(various species)；MoI.Microbiol.(2002)44(6):1517-31；Plasmid(1993)30(2):90-105(Fremyella diplosiphon)；Gene(1993)124:75-81(Chlamydomonas reinhardtii)；Current Micro.(1991)22:15-20；Current Genet.(1991)19:317-322(Chlorella)。另外的启动子可以在美国专利6,027,900的表1中找到。
可以使用本领域已知的任何方法将编码治疗性蛋白质的多核苷酸或重组核酸分子引入藻类细胞中。可通过多种方法将多核苷酸引入细胞中，这些方法是本领域熟知的并且部分基于特定宿主细胞选择所述方法。例如，可以使用直接基因转移方法将多核苷酸引入细胞，例如电穿孔或使用粒子枪的微粒介导(生物射弹)转化、“玻璃珠法”或脂质体介导的转化。
微粒介导的转化利用微粒，例如金或钨，其通过用氯化钙、亚精胺或聚乙二醇沉淀而涂覆有所需的多核苷酸。使用诸如BIOLISTIC PD-1000粒子枪(BioRad；Hercules CA)的装置将微粒子粒子高速加速进入细胞。使用生物射弹方法进行转化的方法是本领域熟知的(例如，如Christou,Trends in Plant Science(1996)1:423-431)中所述)。用于转化藻类的示例性方法可以见国际专利申请公开号Nos.WO 2011/034,863、WO 2011/063,284以及Biosci.Biotechnol.Biochem.(2014)78:812-7；J.Biosci.Bioeng.(2013)115:691-4；Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2011)108:21265-9；和Plant Physiol.(2002)129:7-12；Adv.Expl.Med.Biol.(2007)616:1-9；Molec.Biotechnol.(2005)30:185-91；Science(1988)240:1534-38；Folia Microbiol.(2000)45:496-504；Plant Physiol.(2002)129:7-12；Molec.Gen.Genetics(2000)263:404-10.J.Biosci.Bioeng.(1999)87:307-14；Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:2087-90；Plant Cell(1989)1:123-32；PlantBiotechnol.J.(2007)5:402-12；和J.Biotechnol.(2013)163:61-8。
治疗性蛋白质可以在细胞核或叶绿体中表达。当利用核转化时，可以通过使用植物细胞核转化构建体(其中，目标DNA编码序列与能够促进编码蛋白质转运至植物质体中的任何可用的转运肽序列融合)并通过使用适当的启动子来驱动表达，修饰蛋白质用于质体靶向。通过将编码质体(例如叶绿体、转运肽序列)的DNA融合至编码蛋白质的DNA的5’末端，可以实现蛋白质的靶向。编码转运肽区域的序列可以例如从植物核编码的质体蛋白获得，其中植物核编码的质体蛋白例如核酮糖二磷酸羧化酶的小亚基(SSU)；EPSP合酶；植物脂肪酸生物合成相关基因(包括脂肪酰基-ACP硫酯酶、酰基载体蛋白(ACP)、硬脂酰-ACP去饱和酶，β-酮酰基合酶和酰基-ACP硫酯酶或LHCPII基因等)。质体转运肽序列也可以从编码类胡萝卜素生物合成酶的核酸序列获得，例如GGPP合酶、八氢番茄红素合酶和八氢番茄红素去饱和酶。其他转运肽序列公开在以下文献中：Plant Mol.Biol.Rep.(1991)9:104；J.Biol.Chem.1989 264:17544；Plant Physiol.(1987)84:965；Biochem.Biophys.Res.Commun.(1993)196:1414；和Science(1986)233:478。另一种转运肽序列是来自衣藻属的完整ACCase(genbank EDO96563，氨基酸1-33)的序列。有效转运至质体的转运肽的编码序列可包括特定转运肽的全部或部分编码序列，并且还可含有与特定转运肽相关的成熟蛋白质编码序列的部分。存在许多可用于将靶蛋白递送至质体中的转运肽的实例，并且只要递送至质体中，用于本公开内容的特定转运肽编码序列并不重要。随后质体内的蛋白水解过程产生成熟蛋白质。
一旦表达治疗性蛋白质，就可以将其给药受试者。在一些实施方式中，将治疗性蛋白质给药于消费藻类的受试者。在其他实施方式中，在给药之前从藻类中纯化或分离治疗性蛋白质。有几种方法可用于纯化或分离蛋白质，这些方法是本领域技术人员已知的。这些方法包括通过例如硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱、凝集色谱、高效液相色谱(HPLC)、天然或变性条件的电泳、等电聚焦和免疫沉淀。
如本领域技术人员所理解的，确切的给药途径将根据诸如所用的具体治疗性蛋白质、待治疗的病症和待治疗的受试者等因素而变化。示例性给药方法包括但不限于口服、肠内、粘膜、经皮或肠胃外。给药方法的实例包括口服、鼻内、气管内、静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、动脉内、胸骨内、病灶内、局部、透皮、吸入和离子电渗疗法。基于通常已知的因素，例如本文所述的那些因素，本领域普通技术人员可以容易地确定最合适的给药途径。
实施例
以下实施例旨在提供本发明的应用的示例。以下实施例不用于完全限定或限制本发明要求保护的范围。
实施例1培养基和给养的准备
除非另有说明，否则所有培养基和培养材料都是无菌的。出于以下实施例的目的，无菌定义为嗜热脂肪土芽孢杆菌孢子的至少log16的减少。除非另有说明，否则所有使用的材料都适合人类食用(食品级)。
微量元素(TE)溶液将TE溶液制备成两种单独的溶液，称为TEA(表11)和TEB(表12)，然后将它们以相等的比例混合。TEA是一种澄清橙色溶液，而TEB是一种澄清蓝色溶液。当混合时，所得溶液(TE)是澄清绿色的。通过将固体试剂添加至无菌去离子水中来制备所有溶液。应按表11和表12中列出的顺序将试剂添加至溶液中。
表11TEA
化学名 化学式 含量 单位
EDTA二钠二水合物 Na<sub>2</sub>EDTA·2H<sub>2</sub>O 23.00 g·L<sup>-1</sup>
碳酸钠 Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub> 4.64 g·L<sup>-1</sup>
柠檬酸铁铵 (NH<sub>4</sub>)<sub>5</sub>Fe(C<sub>6</sub>H<sub>4</sub>O<sub>7</sub>)<sub>2</sub> 10.47 g·L<sup>-1</sup>
表12TEB
化学名 化学式 含量 单位
EDTA二钠二水合物 Na<sub>2</sub>EDTA·2H<sub>2</sub>O 20 g·L<sup>-1</sup>
一水硫酸锌 ZnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O 0.899 g·L<sup>-1</sup>
四水氯化锰 MnCl·4H<sub>2</sub>O 2.376 g·L<sup>-1</sup>
五水硫酸铜 CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O 0.999 g·L<sup>-1</sup>
碳酸钠 Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub> 2.00 g·L<sup>-1</sup>
四水钼酸铵 (NH<sub>4</sub>)<sub>6</sub>Mo<sub>7</sub>O<sub>24</sub>·4H<sub>2</sub>O 0.070 g·L<sup>-1</sup>
亚硒酸钠 Na<sub>2</sub>SeO<sub>3</sub> 0.034 g·L<sup>-1</sup>
为了制备最终的TE溶液，将等体积的TEA和TEB溶液混合在一起。为了减少整个过程的生物负荷，将所得溶液通过0.22μm孔径的膜无菌过滤。TE溶液的最终组分见表2。将任何未使用的TE溶液储存在2～8℃的不透明容器中。
培养基制备用于两个烧瓶阶段的培养基、种子发酵和生产发酵(发酵培养基)是添加了微量元素的溶液(表2)的盐的简单配方。使用98％冰乙酸的储备溶液将pH培养基调节至约pH＝6.0。添加乙酸之前培养基的pH约为10.5。通过高压灭菌法对培养基进行灭菌。在该实施例中，培养基的成分见表1。F111-GF AntiFoam是一种可选成分，对于烧瓶生长使用时通常不添加至培养基中。
种子和生产发酵的给养(给养培养基)是表1的发酵培养基的浓缩形式(100倍)，其中，添加了大量的乙酸作为主要碳源。通过孔径为0.22μm的膜过滤器过滤灭菌而不通过高压灭菌以减轻乙酸的蒸发损失。给养的组分见表3。
实施例2烧瓶细胞量繁殖
以下步骤详述了1个阶段I烧瓶的制作，其总有效体积为150mL，这得到总有效体积为1,200mL的1个阶段II烧瓶。可根据需要制备更多的烧瓶以满足种子发酵罐接种要求。烧瓶要求的一般准则是在种子发酵罐中每9升培养基体积中有1升阶段II烧瓶液体培养基。最初的烧瓶接种物可以来自划线的TAP平板，或来自1mL低温小瓶(低温小球)。
阶段I为了启动阶段I烧瓶细胞量的繁殖，在生物安全柜中将150mL无菌发酵培养基添加至具有通气的封闭物的无菌带挡板的500mL摇瓶中。为了从平板上接种，获得用所需的莱茵衣藻菌株划线的合适的TAP平板，并在生物安全柜中使用无菌环取4cm划线，并随后用于接种制备的阶段I烧瓶。
如果使用低温小球，这通常使阶段I繁殖时间增加192小时～240小时。从-80℃冰箱中取出所需的小球粒数，并立即置于环境温度下的500mL烧杯的水中解冻。通常每50mL发酵培养基使用2个低温小球。将含有低温小球的烧杯快速置于约35℃的水浴中以解冻低温小球中的材料。一旦低温小球中的材料解冻，轻轻摇动低温小球以确保所有材料都已液化。解冻后，用70％乙醇对低温小球进行喷雾和/或擦拭，并将小球的内容物转移至含有150mL无菌发酵培养基的无菌带挡板的500mL摇瓶中。将低温小球的内容物转移至摇瓶后，在1小时内保持摇瓶不受干扰。1小时的等待时间过后，用材料(例如)包裹摇瓶以减少曝光，并且并将摇瓶在环境温度(约25℃)和150RPM，约100～约500微爱因斯坦的合适光源下转移至轨道振荡器上。在振动台上4天后，除去限制曝光的材料，并且使烧瓶孵育直至观察到绿色，这通常在过程开始10天后。
然后将接种的阶段I烧瓶用铝箔或一些其它不透明材料从盖子自上至下包裹，并置于设定为150RPM的轨道振荡器上，振荡值为1.9cm，且在环境温度(通常约25℃)下进行。接种的阶段I烧瓶保持在轨道振荡器上约120小时。如果阶段I烧瓶是从低温小球开始的，则总振荡器时间约为312小时～360小时(120小时加上额外的192小时～240小时)。
对于污染检查，在接种阶段II烧瓶前48小时，使用无菌移液管在生物安全柜中从阶段I烧瓶中无菌取出样品，通过显微镜进行目视检查并对LB平板划线(Luria-Bertaniplate,参见“Molecular Cloning,A Laboratory Manual,”Sambrook and Russell,2001)。LB平板应以1mL的体积划线，并应在37℃下孵育24小时。经过120小时的阶段I的繁殖后，使用无菌移液管在生物安全柜中从阶段I烧瓶中无菌移除1mL样品，用于在750nm处对光密度以及对干细胞重量浓度(DCW)进行定量。本文提供了测定DCW值的方法。通常阶段I烧瓶的最终DCW值为1.8g·L-1～2.5g·L-1，但浓度达3.2g·L-1是可接受的。
阶段II通过在生物安全柜中将1,050mL无菌发酵培养基添加至无菌、带挡板、具有通气口的3,000mL摇瓶中以制备阶段II烧瓶。添加阶段I接种物后，阶段II烧瓶的初始有效体积为1,200mL。最终阶段I液体培养基的体积，等于所需初始阶段II有效体积的10％(在这种情况下为150mL)，用于在生物安全柜中接种制备的阶段II烧瓶。
阶段II烧瓶的孵育以与阶段I烧瓶类似的方式进行。然后将接种的阶段II烧瓶用铝箔或其它不透明材料从盖子自上而下包裹，并置于设定为150RPM的轨道振荡器上，振荡量为1.9cm，且在环境温度(通常约25℃)下进行。接种的阶段I烧瓶保持在轨道振荡器上约120小时。
作为污染检查，在接种种子发酵罐之前48小时，使用无菌移液管在生物安全柜中从阶段II烧瓶中无菌取出样品，用于通过显微镜目视检查并划线LB平板。LB平板应以1mL的体积划线，并应在37℃下孵育24小时。通常阶段II烧瓶的最终DCW值为1.8g·L-1～2.5g·L-1，但浓度高达3.2g·L-1也是可接受的。
实施例3种子发酵
种子发酵用于产生比在简单摇瓶中更高DCW浓度的更大量的细胞，以将较大的生产发酵罐接种至所需的初始DCW浓度。种子发酵的目的是在144h～182h内产生至少30～40gDCW·L-1，且没有可检测到的污染物。
在无菌发酵容器中制备无菌发酵培养基。制备的培养基体积应等于种子发酵罐的所需初始体积的90％，以允许添加10％(体积)的接种物。在阶段II烧瓶繁殖120小时并证实没有发生污染之后，在生物安全柜中用无菌移液管无菌移除来自II期烧瓶的样品，并用于OD750和DCW的定量。如前所述，通常阶段II烧瓶的最终DCW为2.5±0.7g·L-1。一旦证实阶段II烧瓶的DCW在所需范围内，就可以进行种子发酵罐的接种。
种子发酵罐的所需接种体积等于初始种子发酵罐有效体积的10％，因此初始干细胞重量浓度为0.25±0.07g/L。在生物安全柜中将种子接种物从烧瓶无菌转移至无菌种子接种容器中，然后转移至种子发酵罐中。接种物的添加通常导致pH值增加至高于pH 6.8的设定点。如果pH控制器没有适当调整，在此期间可能会向发酵罐中添加过量的酸性给养，导致pH严重下降。pH值低于5.5可能会对发酵性能产生不利影响，应当避免。为了防止这种情况，可以在接种前暂时禁用pH控制。如果禁用pH控制，则在接种后直接将pH值手动调节至设定点并重新启用pH控制。在成功接种和激活pH控制后，应观察到pH值的增加，这表明代谢活跃，更具体地说，是乙酸盐的消耗。
种子发酵在有氧条件下进行，工艺参数和控制策略列于表13中。在该实施例中，种子发酵在没有光的情况下进行，这意味着在发酵过程中任何观察口被覆盖。
表13示例性种子发酵的参数
参数 控制策略 设定点 ±偏差 单位
总发酵时间(TFT) n/a 168 24 H
温度 设定点 28 0.5 ℃
pH 设定点 6.8 0.2 pH
气流 设定点 1 0.1 Vvm
pO<sub>2</sub> 设定点 30 3 ％空气状态
压力 设定点 0 0.01 巴(barg)
给养速度 反馈(pH值) 变量 n/a g给养/升/小时
搅拌 反馈(pO<sub>2</sub>) 变量 n/a RPM
在该实施例中，给养流是浓缩培养基和冰乙酸的混合物(见表3)，其使用0.22μm孔过滤器过滤灭菌。给养流通过蠕动泵送料至发酵罐。酸性给养流用于调节pH，并且当pH增加超过其设定点(单侧“pH-状态”)时由pH控制器自动给出剂量。通过调节搅拌速率将溶解氧(DO)控制在30％空气饱和度(在大气压下)的设定点。如果单独搅拌不足以保持DO设定点，则也可以调节喷射速度。在形成显著泡沫的情况下，可将等于每升发酵液0.06mL FOAMF111-GF消泡剂的无菌消泡剂团添加至发酵罐中。出于该实施例的目的，“显著的泡沫”定义为足以“阻滞(hold up)”从发酵罐顶部添加的酸的泡沫量。如果累加器/质量流量计指示正在给养酸，但未观察到pH的降低，则可能形成“显著的泡沫”。在这种情况下，“显著的泡沫”的存在应通过窥镜(其暂时未被覆盖)进行目视检查来验证。如果让泡沫形成太长时间，则破裂泡沫可能会将过量的“阻滞”的酸倒入液体培养基中，导致培养物死亡。因此，泡沫形成应尽快进行解决。
对于OD750和DCW，在0小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时和168小时的总发酵时间(TFT)下对种子发酵罐进行取样。对于测量的各种参数获得的示例性结果见图1-3。
在接种生产发酵罐之前48小时，通过无菌取样口从种子发酵罐中无菌取出样品，用于通过显微镜目视检查并在LB平板上划线(在37℃下孵育24小时)，进一步检查污染情况。种子发酵的收获标准是DCW为30g·L-1～40g·L-1，但浓度高达50.0g·L-1是可以接受的。
实施例4生产发酵
生产发酵与种子发酵类似地操作；两个过程之间的主要差异是细胞量的初始浓度，以及对于生产发酵，接种物可能来自另一个发酵罐而不是来自摇瓶。生产发酵的目的是通常在90h～110h内产生至少60g DCW·L-1，没有可检测到的污染物。
可以在发酵容器中制备无菌发酵培养基。或者，可以在发酵容器外部产生无菌发酵培养基，然后将其引入无菌发酵容器中。培养基的体积应等于种子发酵罐的所需初始体积的90％，以允许添加10％(体积)的接种物。
在完成种子发酵并证实没有发生污染之后，通过无菌取样口无菌取出最终样品以定量OD750和DCW。通常种子发酵的最终DCW为30.0g/L～40.0g/L，但浓度高达50.0g/L是可接受的。一旦证实种子发酵罐的DCW在所需范围内并且没有发生污染，就接种生产发酵罐。
生产发酵罐的所需接种体积是生产发酵罐初始体积的10％，因此初始DCW浓度为3.0g/L～4.0g/L。特别是对于生产发酵罐的接种，优选种子接种物暴露于低氧条件下不超过15分钟。在接种物转移期间，种子发酵罐中应保持过程控制(例如，搅拌和喷射)，并且应尽可能地最小化接种转移管线中的停留时间。如果生物体在接种前经历氧饥饿，则会显著降低处理性能。
接种物的添加通常导致pH值增加至高于设定点。如果pH控制器没有适当调整，在此期间可能会向发酵罐中添加过量的酸性料，导致pH严重下降。pH值低于5.5可能会对发酵性能产生不利影响，应进行避免。因此，可以在接种前暂时禁用pH控制。接种后，应在重新启用pH控制之前将pH值手动调节至设定点。在成功接种和激活pH控制后，应观察到pH值的增加，这表明代谢活跃，具体地说，是乙酸盐的消耗。生产发酵在有氧条件下进行，工艺参数和控制策略列于表14中。生产发酵通常在没有光的情况下进行，在发酵过程中覆盖所有观察口。
表14生产发酵罐工艺参数
参数 控制策略 设定点 ±误差 单位
总发酵时间 n/a 100 10 h
温度 设定点 28 0.5 ℃
pH 设定点 6.65 0.2 pH
气流 设定点 1 0.1 vvm
pO<sub>2</sub> 设定点 30 3 ％空气状态
压力 设定点 0 0.01 巴(barg)
给养速度 反馈(pH值) 变量 n/a g给养/升/小时
搅动 反馈(pO<sub>2</sub>) 变量 n/a RPM
给养流(给养培养基A，表3)是浓缩培养基和冰乙酸的混合物，其在0.22μm过滤灭菌并通过蠕动泵给养至发酵罐中。酸性给养流用于调节pH，并且当pH增加超过其设定点(单侧“pH-状态”)时由pH控制器自动给药。通过调节搅拌速率将溶解氧的百分比饱和度(此处缩写为DO)控制在30％空气饱和度(在大气压下)的设定点。如果单独搅拌不足以保持DO设定点，则也可以调节喷射速度。
在形成显著泡沫的情况下，可将等于每升发酵液0.06mL FOAMF111-GF消泡剂的无菌消泡剂团添加至发酵罐中。出于本公开的目的，“显著的泡沫”定义为足以“阻滞”从发酵罐顶部添加酸的泡沫量。如果累加器/质量流量计指示正在给养酸，但未观察到pH的降低，则可能形成“显著的泡沫”。在这种情况下，应通过观察口目视检查并采取适当的措施来验证“显著的泡沫”的存在。如果让泡沫形成太长时间，则破裂泡沫可能会将过量的“阻滞”的酸倒入液体培养基中，导致培养物死亡。因此，泡沫形成应尽快解决。
在TFT＝0小时、24小时、48小时、72小时、96小时和100小时对生产发酵罐进行取样，以测定OD750和DCW。通常0.5L生产发酵的数据和趋势如图4-6所示。在图4中看到的约100小时后，pO2降低至设定点以下是无法提高液体培养基通气速率的结果，因为搅拌和喷射都在实验室规模的发酵罐中达到其最大值。通过在搅拌达到其最大值(级联控制)后增加喷射速率，理想地，过程控制将在整个发酵过程中将DO的值保持在其设定点。
与种子发酵一样，生产发酵作为单侧(酸)“pH-状态”进行操作。作为这种操作模式的结果，通常在整个发酵过程中观察到pH值相对于设定点的波动(参见图5)。随着培养物密度的增加，总乙酸盐消耗速率增加，并且pH“包”的大小减小至约0.05pH单位的最小值。为了保持发酵性能，优选pH的偏差应不超过0.5pH单位，特别是在发酵早期。如果可能，应调整pH控制回路以尽可能减少pH偏差。
发出生产发酵结束的信号没有硬性目标。然而，生产发酵的总体目标是在给定时间/设备限制的情况下尽可能多地生产符合规格的藻类细胞质。至少为60g/L的微波干细胞重量(DCW)浓度被用作收获生产发酵罐的主要标准。
实施例5收获和下游加工
在完成生产发酵后，将液体发酵液从发酵罐中转移出来用于下游处理单元操作。最终的液体培养基不应通过加热来灭活。首先在环境温度(通常约25℃)下通过离心(约3000g)将藻类细胞团与液体分离，然后将所得细胞团以约20±5％的固体浓度转移用于喷雾干燥。喷雾干燥的精确条件因使用的干燥器和材料的状况而异。本领域技术人员将能够容易地确定喷雾干燥的最佳条件。根据说明书评估喷雾干燥的细胞团，如果认为是可接受的，则包装在塑料衬里的桶中。表15中详述了最终喷雾干燥的藻类细胞团产物的目标标准。
表15
视觉 目标 偏差(±) 单位
外表 粉末 n/a n/a
颜色 深绿色 n/a n/a
污染物 目标 偏差(±) 单位
好氧平板计数(APC) &lt;10000 n/a CFU·g<sup>-1</sup>
大肠杆菌(一般型 n.d. 0 CFU·g<sup>-1</sup>
酵母 &lt;10 n/a CFU·g<sup>-1</sup>
总大肠菌群 n.d. 0 CFU·g<sup>-1</sup>
霉菌数量 &lt;30 n/a CFU·g<sup>-1</sup>
金黄色葡萄球菌 n.d. 0 CFU·g<sup>-1</sup>
沙门氏菌 阴性 0 org·(25g)<sup>-1</sup>
成分 目标 偏差(±) 单位
水分 15 5 ％
蛋白质(粗) 50 5 ％
脂肪(粗) 10 5 ％
灰分 &lt;5 n/a ％
氮 10 2 ％
磷(总量) 1 0.5 ％
钠(总量) 0.5 0.3 ％
钾(总量) 0.15 0.1 ％
镁(总量) 0.15 0.1 ％
钙(总量) 0.15 0.1 ％
硫(总量) 0.035 0.01 ％
铁(总量) 0.015 0.01 ％
锰(总量) 0.0035 0.001 ％
铜(总量) 0.003 0.001 ％
锌(总量) 0.002 0.001 ％
实施例6干细胞重量(DCW)的测定
使用永久性标记在下方靠近边缘处标记玻璃微纤维过滤膜。然后将标记的过滤膜在分析天平上称重，并以克(质量初始,g)记录重量。然后将预先称重的过滤膜置于过滤装置中并施加真空。使用2g/L碳酸氢铵溶液从过滤膜边缘开始并移动润湿整个过滤膜。使用移液管将已知体积的含有藻类的培养基(体积已过滤,ml)添加至过滤膜中。选择的体积不应太大，以免过滤膜堵塞或培养基从过滤膜边缘流出。然后用2g/L碳酸氢铵冲洗移液管并将冲洗液添加至过滤膜中。然后用2g/L碳酸氢铵冲洗过滤膜，其量等于体积已过滤,ml的3倍。小心地将过滤膜从过滤装置上取下并折叠，使数字位于7点钟位置(见图7)。接下来将过滤膜折叠成四部分，并将两个角向下弯曲以形成腿。然后将过滤膜置于微波炉上并通过微波以70％的功率干燥10分钟。使过滤膜冷却，然后在用于质量初始,g的相同天平上称重，获得质量最终,g。干细胞重量(DCW)计算如下：
实施例6使用发酵培养基B进行种子发酵
在无菌发酵容器中制备无菌高浓度发酵培养基B(表4)。制备的培养基体积应等于种子发酵罐的所需初始体积的90％，以允许添加10％(体积)的接种物。在阶段II烧瓶繁殖120小时并验证没有发生污染之后，在生物安全柜中用无菌移液管无菌移除来自阶段II烧瓶的样品，并用于OD750和DCW的定量。通常阶段II烧瓶最终DCW为2.5±0.7g/L。一旦确认阶段II烧瓶的DCW在所需范围内，就可以进行种子发酵罐的接种。
种子发酵罐的所需接种体积等于初始种子发酵罐有效体积的10％，因此初始干细胞重量浓度为0.25±0.07g/L。将种子接种物在生物安全柜中从烧瓶无菌转移到无菌种子接种容器中，然后转移至种子发酵罐中。接种物的添加通常导致pH值增加至高于pH 6.8的设定点。如果pH控制器没有适当调整，在此期间可能会向发酵罐中添加过量的酸性给养，导致pH严重下降。pH值低于5.5可能会对发酵性能产生不利影响，应避免使用。为了防止这种情况，可以在接种前暂时禁用pH控制。如果禁用pH控制，则在接种后直接将pH值手动调节至设定点并重新启用pH控制。在成功接种和激活pH控制后，应观察到pH值的增加，这表明代谢活跃，更具体地说，是乙酸盐的消耗。
种子发酵在有氧条件下进行，工艺参数和控制策略列于表13中。在该实施例中，种子发酵在没有光的情况下进行，意味着任何观察口在发酵过程中被覆盖。
给养流是冰乙酸和氨的混合物(给养培养基B，表6)，其使用0.22μm微孔过滤器过滤灭菌。给养流通过蠕动泵给养至发酵罐。酸性给养流用于调节pH，并且当pH增加超过其设定点(单侧“pH-状态”)时由pH控制器自动供给剂量。通过调节搅拌速率将溶解氧(DO)控制在30％空气饱和度(在大气压下)的设定点。如果单独搅拌不足以保持DO设定点，也可以调节喷射速度。
在形成显著泡沫的情况下，可将等于0.06mL FOAM F111-GF每升发酵液的消泡剂的无菌消泡剂团添加至发酵罐中。出于该实施例的目的，“显著的泡沫”定义为足以“阻滞”从发酵罐顶部添加酸的泡沫量。如果累加器/质量流量计指示正在给养酸，但未观察到pH的降低，则可能形成“显著的泡沫”。在这种情况下，“显著的泡沫”的存在应通过窥镜(暂时未被覆盖)用目视检查来验证。如果让泡沫形成太长时间，则破裂泡沫可能会将过量的“滞留”的酸倒入液体培养基中，导致培养物死亡。因此，应尽快解决泡沫形成问题。对于OD750和DCW，在0小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时和168小时的总发酵时间(TFT)下对种子发酵罐进行取样。
在接种生产发酵罐之前48小时，通过无菌取样口从种子发酵罐中无菌取出样品，用于通过显微镜目视检查并在LB平板上划线(在37℃下孵育24小时)，进一步检查污染情况。种子发酵的收获标准是40g/L～60g/L的DCW，但浓度高达80.0g/L是可接受的。
实施例7利用发酵培养基B进行种子发酵
使用高浓度发酵培养基B的生产发酵与种子发酵类似地操作；两个过程之间的主要差异是发酵培养基、微量元素和给养培养基的组分。使用高浓度发酵培养基B的生产发酵的目的是产生至少60g DCW/L，通常在90h～140h内，且没有可检测到的污染物。
可以使用表4中详述的配方在发酵容器中制备无菌发酵培养基B。或者，可以在发酵容器外部产生无菌发酵培养基，然后将其引入无菌发酵容器中。制备的培养基体积应等于种子发酵罐的所需初始体积的90％，以允许添加10％(体积)的接种物。
在使用高浓度发酵培养基完成种子发酵并且确认没有发生污染之后，通过无菌取样口无菌地移除最终样品以对OD750和DCW定量。通常种子发酵的最终DCW为40.0g/L～60.0g/L，但浓度高达80g/L是可接受的。一旦证实种子发酵罐的DCW在所需范围内并且没有发生污染，就接种生产发酵罐。
生产发酵罐所需的接种体积是生产发酵罐初始体积的10％，因此初始DCW浓度为4g/L～6g/L。特别是对于生产发酵罐的接种，优选种子接种物暴露于低氧条件不超过15分钟。在接种物转移期间，种子发酵罐中应保持过程控制(例如，搅拌和喷射)，并且应尽可能地最小化接种转移管线中的停留时间。如果生物在接种前经历氧饥饿，则会显著降低处理性能。
接种物的添加通常导致pH值增加至高于设定点。如果pH控制器没有适当调整，在此期间可能会向发酵罐中添加过量的酸性给养，导致pH严重下降。pH值低于5.5可能会对发酵性能产生不利影响，应避免使用。因此，可以在接种前暂时禁用pH控制。接种后，应在重新启用pH控制之前将pH值手动调节至设定点。在成功接种和激活pH控制后，应观察到pH值的增加，这表明代谢活跃，具体地说，消耗了乙酸盐。生产发酵在有氧条件下进行，工艺参数和控制策略列于表14中。生产发酵通常在没有光的情况下进行，在发酵过程中覆盖所有观察口。
给养流(给养培养基B，表6)是冰乙酸和氨的混合物，其在0.22μm过滤灭菌并通过蠕动泵给养至发酵罐中。酸性给养流用于调节pH，并且当pH增加超过其设定点(单侧“pH-状态”)时由pH控制器自动给药。通过调节搅拌速率将溶解氧的百分比饱和度(DO)控制在30％空气饱和度(在大气压下)的设定点。如果单独搅拌不足以保持DO设定点，则也可以调节喷射速度。
在形成显著泡沫的情况下，可将0.06mL FOAMF111-GF每升液体培养基的消泡剂的无菌消泡剂团添加至发酵罐中。出于本公开的目的，“显著的泡沫”定义为足以“阻滞”从发酵罐顶部添加酸的泡沫量。如果累加器/质量流量计指示正在给养酸，但未观察到pH的降低，则可能形成“显著的泡沫”。在这种情况下，应通过观察口目视检查并采取适当的措施来验证“显著的泡沫”的存在。如果让泡沫形成太长时间，则破裂泡沫可能会将过量的“阻滞”的酸倒入液体培养基中，导致培养物死亡。因此，应尽快解决泡沫形成问题。
在TFT＝0小时、20小时、43小时、68小时、96小时、116小时和140小时对生产发酵罐进行取样，以测定OD750和DCW。通常0.5L生产发酵的数据和趋势如图9-12所示。在图10中可见约80小时后，pO2降低到设定点以下是无法提高液体培养基通气速率的结果，因为搅拌和喷射都在实验室规模的发酵罐中达到其最大值。通过在搅拌达到其最大值(级联控制)后增加喷射速率，理想的过程控制将在整个发酵过程中将DO的值保持在其设定点。
与种子发酵一样，生产发酵作为单侧(酸)“|pH-状态”进行操作。作为这种操作模式的结果，通常在整个发酵过程中观察到pH值相对于设定点的波动(参见图11)。随着培养物密度的增加，乙酸盐总消耗率增加(图12)。发出生产发酵结束的信号没有硬性指标。然而，生产发酵的总体目标是在给定时间/设备限制的情况下尽可能多地生产符合规格的藻类细胞团。如图9所示，微波干细胞重量(DCW)浓度超过80.0g/L。
应当理解，已经通过说明和示例的方式详细描述了要求保护的发明，以使本领域的其他技术人员熟悉要求保护的发明、其原理和实际应用。要求保护的发明的具体制剂和方法不限于所呈现的具体实施方式的描述，而是应当根据所附权利要求及其等同物来看待描述和实施例。虽然上述一些示例和描述包括关于所要求保护的发明可以起作用的方式的一些结论，但是发明人不打算受那些结论和功能的约束，而是仅将它们作为可能的解释来提出。
应进一步理解，上述具体实施方式并非旨在穷举或限制要求保护的发明，并且鉴于前述示例和详细描述，许多替换、修改和变化对本领域普通技术人员是显而易见的。因此，要求保护的发明旨在涵盖落入以下权利要求范围内的所有这些替代形式、修改形式和变化形式。

Claims (45)

1.一种用于有氧、异养培养衣藻属物种Chlamydomonas sp.的高密度培养物的方法，该方法包括，
获得基本纯的浓度为0.1g/L～15g/L的衣藻属物种培养物的接种物；
通过对发酵培养基初始体积接种来产生生产培养物，其中，接种体积不超过发酵培养基初始体积的20％；
将生产培养物保持在pH值为6.0～10.0，温度为15℃～37℃的有氧条件下；
通过向生产培养物提供由生产培养物的pH变化确定的量和计划的给养培养基来给养生产培养物；
在无菌条件下培养生产培养物，直至达到至少60g/L干细胞重量的目标密度；和
从生产培养物收获所述衣藻属物种；
其中，所述衣藻属物种不含异源基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生产培养物保持在在无光的情况下。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，通过pH的增加确定给养。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，向所述生产培养物提供给养培养基以将所述生产培养基的pH保持在pH 6.8±0.5。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述生产培养物的pH超过培养设定点的任何时间向所述生产培养物提供给养培养基，并且在所述生产培养物的pH低于pH设定点的任何时间停止提供给养培养基。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述pH设定点为6.0。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述pH设定点为6.2。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述pH设定点为6.5。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述pH设定点为6.8。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述pH设定点为7.0。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标密度为至少50g/L干重、至少55g/L干重、至少60g/L干重、至少65g/L干重、至少70g/L干重、至少75g/L干重、至少80g/L干重、至少85g/L干重、至少90g/L干重、至少95g/L干重、至少100g/L干重、至少105g/L干重、至少110g/L干重、至少115g/L干重、至少120g/L干重、至少125g/L干重、至少130g/L干重、至少135g/L干重、至少140g/L干重、至少145g/L干重、至少150g/L干重、至少155g/L干重、至少160g/L干重、至少165g/L干重、至少170g/L干重、至少175g/L干重、至少180g/L干重、至少185g/L干重、至少190g/L干重、至少195g/L干重或至少200g/L干重。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标密度为50g/L～75g/L干细胞重量、75g/L～100g/L干细胞重量、100g/L～125g/L干细胞重量、125g/L～150g/L干细胞重量、150g/L～175g/L干细胞重量或175g/L～200g/L干细胞重量。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标密度为50g/L干细胞重量、55g/L干细胞重量、65g/L干细胞重量、70g/L干细胞重量、75g/L干细胞重量、80g/L干细胞重量、90g/L干细胞重量、95g/L干细胞重量、100g/L干细胞重量、105g/L干细胞重量、110g/L干细胞重量、115g/L干细胞重量、120g/L干细胞重量、125g/L干细胞重量、130g/L干细胞重量、135g/L干细胞重量、140g/L干细胞重量、145g/L干细胞重量、150g/L干细胞重量、155g/L干细胞重量、160g/L干细胞重量、165g/L干细胞重量、170g/L干细胞重量、175g/L干细胞重量、180g/L干细胞重量、185g/L干细胞重量、190g/L干细胞重量、195g/L干细胞重量或200g/L干细胞重量。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，在接种所述生产培养物后250小时内达到目标密度。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，通过过滤或离心收获所述衣藻属物种。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，通过分批离心收获所述衣藻属物种。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，通过连续离心收获所述衣藻属物种。
18.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括干燥收获的衣藻属物种。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述干燥是通过喷雾干燥、环干燥、桨式干燥、盘式干燥、太阳能或日晒干燥、真空干燥或冷冻干燥来进行。
20.根据权利要求18所述的方法，所述方法还包括干燥所述衣藻属物种至水分含量低于15％。
21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述衣藻属物种是莱茵衣藻Chlamydomonasreinhardtii、Chlamydomonas dysomos、Chlamydomonas mundane、德巴衣藻Chlamydomonasdebaryana、Chlamydomonas moewussi、Chlamydomonas culleus、Chlamydomonasnoctigama、Chlamydomonas aulata、Chlamydomonas applanata、Chlamydomonas marvanii和Chlamydomonas proboscigera中的一种或多种。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述衣藻属物种是莱茵衣藻。
23.一种营养补充剂，所述营养补充剂包括通过权利要求1所述的方法制备的大于90％或至少一种衣藻属物种，所述营养补充剂包含：
成分 含量 偏差(+/-) 水分 20％ 1 蛋白质(粗) 70％ 1 脂肪(粗) 20％ 1 灰分 &lt;5％ n/a 氮 20％ 1 磷(总量) 5％ 0.001 钠(总量) 2％ 0.001 钾(总量) 1％ 0.001 镁(总量) 1％ 0.001 钙(总量) 1％ 0.001 硫(总量) 1％ 0.001 铁(总量) 1％ 0.001 锰(总量) 1％ 0.001 铜(总量) 1％ 0.001 锌(总量) 1％ 0.001
24.根据权利要求23所述的营养补充剂，其中，所述补充剂进一步包含欧米伽3脂肪酸、欧米伽6脂肪酸和欧米伽9脂肪酸。
25.一种藻类培养物，包括一种或多种在生长条件下的衣藻属藻类，其中，所述培养物包含浓度为至少50g/L干细胞重量的所述藻类，并且，其中，在所述生长条件下，所述培养物的密度以每24小时周期50％～300％的速率增加。
26.根据权利要求19所述的藻类培养物，其中，在稳态条件下，培养物的密度以每24小时周期0.1％～50％的速率增加。
27.一种生产治疗性蛋白质的方法，所述方法包括：
获得基本上纯的浓度为0.1g/L～15g/L的衣藻属物种的培养物的接种物，所述衣藻属物种表达至少一种外源治疗性蛋白质；
通过对发酵培养基初始体积接种来产生生产培养物，其中，接种体积不超过发酵培养基初始体积的20％；
将生产培养物保持在pH值为6.0～10.0，温度为15℃～37℃的有氧条件下；
通过向生产培养物提供由生产培养物的pH变化确定的量和计划的给养培养基来给养生产培养物；
在无菌条件下培养生产培养物，直至达到至少50g/L干细胞重量的目标密度；和
从生产培养物收获所述衣藻属物种。
28.根据权利要求26所述的方法，其中，所述生产培养物保持在无光的情况下。
29.根据权利要求26所述的方法，其中，通过pH的增加确定给养。
30.根据权利要求26所述的方法，其中，向所述生产培养物提供给养培养基以将所述生产培养基的pH保持在pH 6.8±0.5。
31.根据权利要求26所述的方法，其中，在所述生产培养物的pH超过培养设定点的任何时间向所述生产培养物提供给养培养基，并且在所述生产培养物的pH低于所述pH设定点的任何时间停止提供给养培养基。
32.根据权利要求26所述的方法，其中，所述pH设定点为6.0。
33.根据权利要求26所述的方法，其中，所述pH设定点为6.2。
34.根据权利要求26所述的方法，其中，所述pH设定点为6.5。
35.根据权利要求26所述的方法，其中，所述pH设定点为6.8。
36.根据权利要求26所述的方法，其中，所述pH设定点为7.0。
37.根据权利要求26所述的方法，其中，所述目标密度为至少50g/L干重、至少55g/L干重、至少60g/L干重、至少65g/L干重、至少70g/L干重、至少75g/L干重、至少80g/L干重、至少85g/L干重、至少90g/L干重、至少95g/L干重、至少100g/L干重、至少105g/L干重、至少110g/L干重、至少115g/L干重、至少120g/L干重、至少125g/L干重、至少130g/L干重、至少135g/L干重、至少140g/L干重、至少145g/L干重、至少150g/L干重、至少155g/L干重、至少160g/L干重、至少165g/L干重、至少170g/L干重、至少175g/L干重、至少180g/L干重、至少185g/L干重、至少190g/L干重、至少195g/L干重或至少200g/L干重。
38.根据权利要求26所述的方法，其中，所述目标密度为50g/L～75g/L干细胞重量、75g/L～100g/L干细胞重量、100g/L～125g/L干细胞重量、125g/L～150g/L干细胞重量、150g/L～175g/L干细胞重量或175g/L～200g/L干细胞重量。
39.根据权利要求26所述的方法，其中，所述目标密度为50g/L干细胞重量、55g/L干细胞重量、65g/L干细胞重量、70g/L干细胞重量、75g/L干细胞重量、80g/L干细胞重量、90g/L干细胞重量、95g/L干细胞重量、100g/L干细胞重量、105g/L干细胞重量、110g/L干细胞重量、115g/L干细胞重量、120g/L干细胞重量、125g/L干细胞重量、130g/L干细胞重量、135g/L干细胞重量、140g/L干细胞重量、145g/L干细胞重量、150g/L干细胞重量、155g/L干细胞重量、160g/L干细胞重量、165g/L干细胞重量、170g/L干细胞重量、175g/L干细胞重量、180g/L干细胞重量、185g/L干细胞重量、190g/L干细胞重量、195g/L干细胞重量或200g/L干细胞重量。
40.根据权利要求26所述的方法，其中，在接种所述生产培养物后250小时内达到所述目标密度。
41.根据权利要求26所述的方法，其中，通过过滤或离心收获所述衣藻属物种。
42.根据权利要求40所述的方法，其中，通过连续离心收获所述衣藻属物种。
43.根据权利要求26所述的方法，所述方法还包括干燥收获的衣藻属物种。
44.根据权利要求42所述的方法，其中，所述干燥是通过喷雾干燥、环干燥、桨式干燥、盘式干燥、太阳能或日晒干燥、真空干燥或冷冻干燥来进行。
45.根据权利要求26所述的方法，所述方法还包括从衣藻属物种中分离至少一种治疗性蛋白质。
CN201780024030.8A 2016-08-25 2017-08-14 一种改善藻类生长的方法 Active CN109153965B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662379358P 2016-08-25 2016-08-25
US62/379,358 2016-08-25
PCT/US2017/046831 WO2018038960A1 (en) 2016-08-25 2017-08-14 Improved method for growing algae

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109153965A true CN109153965A (zh) 2019-01-04
CN109153965B CN109153965B (zh) 2023-02-03

Family

ID=61246260

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780024030.8A Active CN109153965B (zh) 2016-08-25 2017-08-14 一种改善藻类生长的方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US11549095B2 (zh)
EP (1) EP3504317A4 (zh)
JP (1) JP7012723B2 (zh)
KR (1) KR102435373B1 (zh)
CN (1) CN109153965B (zh)
CA (1) CA3035040A1 (zh)
MX (1) MX2019002223A (zh)
SG (1) SG11201901598XA (zh)
WO (1) WO2018038960A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113277889A (zh) * 2021-06-23 2021-08-20 河西学院 一种藻菌复合营养液及其制备方法与应用
US11549095B2 (en) 2016-08-25 2023-01-10 Triton Algae Innovations, Inc. Method for growing algae

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11311584B2 (en) 2017-04-30 2022-04-26 Triton Algae Innovations Method of treating alimentary canal conditions
CN110072998A (zh) * 2017-11-17 2019-07-30 特里同阿盖亚创新公司 用于使藻类生长的高生产率方法
CN116179356B (zh) * 2022-11-22 2024-01-02 德默特生物科技(珠海)有限公司 高密度异养培养莱茵衣藻的方法及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1827769A (zh) * 2006-01-26 2006-09-06 深圳大学 一种转基因莱茵衣藻生物反应器的构建方法
US20100297296A1 (en) * 2008-10-14 2010-11-25 Solazyme, Inc. Healthier Baked Goods Containing Microalgae
CN101979498A (zh) * 2010-12-01 2011-02-23 华东理工大学 一种微藻高产率异养培养的方法
WO2011063284A1 (en) * 2009-11-19 2011-05-26 Sapphire Energy, Inc. Production of therapeutic proteins in photosynthetic organisms
US20150315538A1 (en) * 2014-05-02 2015-11-05 John Whitman Methods of microalgae cultivation for increased resource production

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS52105276A (en) * 1976-02-25 1977-09-03 Chiyuuji Tatsumi Cultivation of fine algae
JP2000152778A (ja) 1998-11-19 2000-06-06 Yakult Honsha Co Ltd リコペン含有藻類の製造方法及び該製造方法により得られるリコペン含有藻類
ATE373098T1 (de) 2000-04-21 2007-09-15 Martek Biosciences Corp Trophische umwandlung von obligat phototropischen algen durch metabolische manipulation
MY173319A (en) 2011-12-29 2020-01-15 Tet Shin Ho A method and a system for mass-cultivating microalgae with enhanced photosynthetic efficiency
JP2016502409A (ja) 2012-12-03 2016-01-28 ザルツマン，アディ 原核細胞の経路を模倣することによる植物自己窒素固定
US10047371B2 (en) 2014-02-19 2018-08-14 The Regents Of The University Of California Colostrum/milk protein compositions
US11549095B2 (en) 2016-08-25 2023-01-10 Triton Algae Innovations, Inc. Method for growing algae
CN110072998A (zh) 2017-11-17 2019-07-30 特里同阿盖亚创新公司 用于使藻类生长的高生产率方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1827769A (zh) * 2006-01-26 2006-09-06 深圳大学 一种转基因莱茵衣藻生物反应器的构建方法
US20100297296A1 (en) * 2008-10-14 2010-11-25 Solazyme, Inc. Healthier Baked Goods Containing Microalgae
WO2011063284A1 (en) * 2009-11-19 2011-05-26 Sapphire Energy, Inc. Production of therapeutic proteins in photosynthetic organisms
CN101979498A (zh) * 2010-12-01 2011-02-23 华东理工大学 一种微藻高产率异养培养的方法
US20150315538A1 (en) * 2014-05-02 2015-11-05 John Whitman Methods of microalgae cultivation for increased resource production

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BETH A. RASALA ET AL.: "The microalga Chlamydomonas reinhardtii as a platform for the production of human protein therapeutics", 《BIOENGINEERED BUGS》 *
BETH A. RASALA: "Production of therapeutic proteins in algae, analysis of expression of seven human proteins in the chloroplast of Chlamydomonas reinhardtii", 《PLANT BIOTECHNOLOGY JOURNAL》 *
FABIAN BUMBAK ET AL.: "Best practices in heterotrophic high-cell-density microalgal processes: achievements, potential and possible limitations", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
FENG CHEN ET AL.: "Heterotrophic Growth of Chlamydomonas reinhardtii on Acetate in Chemostat Culture", 《PROCESSBIOCHEMISTRY》 *
GLENN A. MARTIN ET AL.: "A Method for the Regulation of Microbial Population Density during Continuous Culture at High Growth Rates", 《ARCH.MICROBIOL.》 *
贺国强等: "高油脂产率微藻的筛选及发酵条件的优化", 《农业生物技术学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11549095B2 (en) 2016-08-25 2023-01-10 Triton Algae Innovations, Inc. Method for growing algae
CN113277889A (zh) * 2021-06-23 2021-08-20 河西学院 一种藻菌复合营养液及其制备方法与应用
CN113277889B (zh) * 2021-06-23 2022-11-25 河西学院 一种藻菌复合营养液及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
US11549095B2 (en) 2023-01-10
MX2019002223A (es) 2019-06-20
CN109153965B (zh) 2023-02-03
SG11201901598XA (en) 2019-03-28
CA3035040A1 (en) 2018-03-01
KR102435373B1 (ko) 2022-08-23
JP7012723B2 (ja) 2022-02-14
EP3504317A4 (en) 2020-04-08
JP2019526282A (ja) 2019-09-19
US20190183161A1 (en) 2019-06-20
WO2018038960A1 (en) 2018-03-01
EP3504317A1 (en) 2019-07-03
KR20190039804A (ko) 2019-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109153965A (zh) 一种改善藻类生长的方法
Iwamoto Industrial Production of Microalgal Cell‐Mass and Secondary Products‐Major Industrial Species: Chlorella
ES2291312T3 (es) Conversion trofica de algas fototroficas estrictas mediante ingenieria metabolica.
US20150252391A1 (en) Method using microalgae for high-efficiency production of astaxanthin
US8173391B2 (en) Golden yellow algae and method of producing the same
CN106190853B (zh) 一种高产藻蓝蛋白的红藻培养方法
US10480002B2 (en) Algal based edible vaccines
Sarmidi et al. Biotechnology for wellness industry: Concepts and biofactories
JPWO2010089864A1 (ja) 動物プランクトン餌料用セレン含有単細胞微細藻類とそれを使用したセレン含有動物プランクトンの培養方法
CN107474142A (zh) 促进目的蛋白分泌的多肽及其相关生物材料与应用
KR100736150B1 (ko) 소포자 배양 기술을 이용한 고추의 정상 배 생산 방법
CN109609444A (zh) 一种bhk21细胞无血清培养基
Borowitzka Algae as food
CN109053867A (zh) 一种高密度发酵表达重组轮状病毒δvp8*抗原的培养方法
CN111925943A (zh) 天津拟甲小球藻及其培养方法与应用
CN107841465B (zh) 一种雨生红球藻高效海水养殖方法
CN107828660A (zh) 一种高效高密度培养生物饵料的方法
KR20200132835A (ko) 조류를 생육하기 위한 고 생산성 방법
Benavente-Valdés et al. Microbial Technology: Microalgae
CN108587984A (zh) 一种富硒螺旋藻培养物、其培养方法及应用
CN108841902A (zh) 一种发育调节蛋白的制备方法和应用
CN108771028A (zh) 一种动物饲料添加剂及其制备方法与应用
CN102649969A (zh) 一种生物锌制剂及其制备方法
CN107736281A (zh) 一种利用益生菌发酵酱油渣防治池塘养殖鳜鱼寄生虫的方法
CN110468052A (zh) 一种利用螺旋藻培养液残夜养殖小球藻的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40002710

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant