NL8500350A - Verbeterde proteineproductie onder gebruikmaking van hypertonische media. - Google Patents

Description

I32662-Kp/cs .‘ ' *·«* *-'*»·**«* - - - ^^e22% rat em^iiaaesen 'ί%·ί&\. H9> i®Sêft^swSs-aft9jft. α·Λ'4-··ΐν·: Λ ......

·:-- — ^ . _. · 'w ««^J^eias^/woor " -~ - ,rr · - v·*': . · “ * ·'“ V 'r V.* ,.i*iff*dtoÉfc«nêagfraWMMaton-er‘In - 'πΙλλ*» «Mn . t«ow^h0 m*di& . *&B^SÜk&k6„ B^i3& gebruikt . ·»ίδ?Ρ«ΜΛΡ 5fW ' -...... , „ \ \ c^tp^^§ffit>; cPer- - :.^^i^k ^e^te&e^^^^rs^ --zs^MS*.J -r: ££4i&3^i^$^ esdUteW&rtl&iïer.-· soek hebben^ yerrjLcht- tffl-ar de invloed. van.u^e^tl^iJflSSsr^^PSSöSeifen-2^t- y^g^^pBviasahe- -a^me^^^fcafe.esi·- metabodisiriéi i<^^E^da^Q^>d^^^s5se^e%ewssaa^ w^ara.! ver-- ri>:.

bad ^!iWIWaiÏliftrïlM-BiTOrT-dlii nitfligrijiWflr^ irmi^:Tnti1rrf^ ΐτττ-τιττίτίΡ·ifiif- tm^fr! g&S$r ££β£&&^^^ aa%déï»;vhet:.

35 geval zou Zijn; geweest., De toevoeging:; van natriumchloride . * - 2 - ! έϋ * v' ! veranderder de ^dsmo larlt ë it1 Van 'iïét -médium f wéEarËrij ^dhstet Stubblefield geen poging ondernam tot -difrdrenti^reii ^tdsseri osmotische en ionogene effecten.

Twaalf jaar later hebben schachtschabel ën Foley 5^' ' (zfüé’^Kp. · *Cëllf Rés 2%r^fS 1$$·-Ethliieh sascites tumor’- : cëllën -gekweekt" in~ëë'n médium, dat hy^rtöhi^eiiÊ 'wató^^eflÉéiakt door toèVoegiiïg van: hatriumcftloride, ^teneinde 'de invloed · van media met«Hoge tènie.itëife:';-ti^ de<·· groeÏo^citiS Van dit type cellen vêst-të-stelleii.-^chacMtsel^bël'Ifeëf^gëvdttdënfdati'aiöh'.een^ 10 "''zöut~tëïë^a]r€ë- popülëtië> dSeiéen ^^»^0%Bch-4&óé»É!ïè' levens- i “ ^’Qsycldë^Vö-IgdéV?· · ^Üa ëighièiöaiStV^ër^iëseh^ -ïëiï'lïr Sde-ktféek. - ©ntVrikkeldè ..' •iöü^^.tdiëag'atftlÈ# 2‘öé!l*ien *eëri ietwat··'·versch^ Hadden «ÖIÊh· ‘i^iiveh** -^'••-“':Ïtiö^eië'^cëll:ên r dat •"wil^zeggen dat ^lJ>m^è®iMbr<^aQi€te<:^ièkeii' 15: -.···: dan Op· é^ltheeicellën. fre-generatie ö# <'verdubbel Mig^tigd· voëif deze cellen nam dramatisch toe en hëti.-aantal overlevende cel- len>nami af ^naarmate dë tohi^itelt van de .media ^toenam .* 3v^A. jöati li^h'aéün-pröducëtëndë céllen,"Hl jv©örfeêeG?d .milt -ceUëh g^iwëeict- dü medi1a> 20_;‘ zoaïë fëa<g lè ’ s ·gemodificeerde.-j^dl#cinet fsëruiti 'erin. -Groeie-ycli c' “Vöor -de deze mediamande * .. . i ... · .::.· . S.

hoe^eelhëid^fg'ëaoheid^antiii^arosnÏ liegen idsiruïe^ -het tver- * * .&'£··&* -- ^aöhtë^taieOt^»igélëkën'-mèt^a^ere sprdfee^w^üitëchëidende ceMén , tlSLe^ ihf détte media gtoëiën * <*Öf schooit de stijgende >toe- .·* j*·1*^*· 25 f-passirig van afttdlichamen als’ biologische -gereedschapr dn het i bijzonder tengevolge -Vah ^de ivöoruitgang dh hybaridomaan mono-' klonaal ar^ilibhaam-fermentatietèchnieken fS ’hééft- geleid tot - .wiieön, b«^ioe#te· aah-ί ètijgéndë; antilicba^^rö^aötie- utta^pe^·-·· • #·.* ΐ· >*&p$ 3-0-¾.; r^eldina ^"*sëadeh'ioöfc- getetoeekt^i^-i^ —if cmedia .¾ isahgez ie#Kdëfce? oeiien f-peótëï'né^rodufcfë'rën^a^^^^^ kunnèn ^tdèn^gemodificéerd'', < jiên'&ëö^ftmèdiunï>r datedn^ataafc' zou verhogen aöKidejrWd^ilLee^ ^aanv;-celle^nsvatbaiarhéld/;-weneel^k-ï&"&.' 35: - i :av i.r:v .<.v DiefttengeVoigé- is^^ëën> doëi ·Van·nafe Ultyinding'' het' veifl" ^eclïëf f vêws^éai ^erkwl j^ïieo'o^r··'^hèt>löwrékén^ · vanv dë^ulfevinding.'ia'hetveiischaffen - -i van - èeii' h?oge:i'afttlll<^aam^röd^tiC-:ult aritil iöha’ém^pTtódateërën- *ίϊ;·ϊ.:ΗνΙ*?&:. Ύ^Βττ^· ii*QS rt- β C Λ Λ » - - -Μ- . ' V - ! r£d©rn£©lUieüi;n tërwi;jklx eten ^levensvatbare ^expanderende kwtetek rwordt (kitwifcköid:.- Een jander-aSiqeh>^axi adte nit^n^lng fis ibebit^vorderen V=va»chybridSGSmagroeifreEri‘ mdfiïoklimaiiecaw^i^GhiÉai^-prQduQti!tr«QLnder . : toé^Wëgiwg van ^vaedercellen aan ü© ^waek erSeuj- 'andersdpelivan 5^d© U'itviitdiMg is- i-het avérschasffgir^ao etenr.werkwi j.ze. ί-voör .-bet ~ ~ ^Verkïijgterf ^an hoge«spróte^ecopirrengsjt. uit tgcobe „volume cul--‘iöftiutfö-tffi mets c^j$^hóg©£di<^tlie±d<aacBf.peJ3lën:v.iEen. ander doel van a r<j®:;Ui tvinding cisnteefc -bevorderen’svan-prsteJ^e^roxiuctie uit ne#ll®i», 3&ijvcrorbééld ^myeloma, ..ténwi j Z sde. reel lefceitsvatbaar he id 10 W0£d£'!bdh<»fde«£ Daze'en andere doelen “enf£acdtta®avan de uit-~?·.;ΙφΐΉό3^^1ζη£1©η££αΜ©1± jk wórden ^ib3d©^hi©sE»© vólgendet-be-soJ^l^ing.-telceniaag^n;/ η&;·.^··ν·:.ν >ioc ;· ?·Ίον s.;. souLo··.·-· -vïo'scr-er_“ sr vFigv'iÏ iUust-reért /de Pisvloed sopr&e ice^populatiie vaftmedia, .diefbypertonisch-zijn gemaakt -door ^toevoeging -^van 15 aminozuur r?bij een . cultuur vaniantilieiiaam-prod«icerende,';€?elf -J! *· len; nf ·:.?: 1.1:rUv.-·:·ι.. *b . 1®«: 3c··· ci-oriz-ïzi sh rcor.Ti 30 -D^bo-q- 3πΙΐ.; :Fig g-t2 riliustreertr-de - levensvatbaarheid ivanspellen, sdie Hjto~dé :mé&±a sfraas bigbot .werden cg^kwéekt t 3nevnoo : 3 ^ ; i ;--enl33cacjFig. i3=9itlu'stréért s$e rantilich'aamrproduebi^^aitbcul--2¾.dCUHWfif,·Üite&innd· media svan^igi 1 .worden sdékweekfej; ïsouacsSt 0Γ.

-ςsost.tri· rrspi$$b4 ^laatazdBenfSd'atrrnatriumcblaridéi'featBowóbdeil ge-^ÈnfiCijdt>qvöor net teypertonischunakenivanrbêt -..mediumozonder: ver-liés-'Taa&ir^llevensvatbaarheid^rterwijlf'T:i~g -iztr.y.z rei cc-n.

·= ::i'j£ :*£·£>£.?.qlFigi’ '5 seen inrichtingstoont-ï welke-geaebikt is^voor 25 de "^ródiffCtde ofcaa -'proteïne welgens de 'uitvinding r z z. xi^Zn zz Z i - ·.>·.’.-q ; 1 c:^De'>v\iiC^i2iAirrg£hr©é£t betrekkingcopueenniweEkWi jZe evoor het bevördeirê»-,van==decproteïnesepróductie;.fiinvliet bijzonder ~-dftti&iéfSéD^^pro&aetie'? sin ndier lijke ycèlcuituresC Kort samen-gevst' fsivólgendi de iUitvinding-ontdekt? dat conventionele ή 3 0 i§é&£g, ,d£© --gebruik t sworden bvoor rfaèt okweken ^van Mprefcé Ine -prodü -?éArende ad«££efty t zodanig-ikunnen , wórdénrigemodif ioéerd ?Ldatoeen ' 9 o bs ifn ifidaftt sfcegèrêcprpteïne-Qplsreegst, metshogèreespecifieke w^ikih’g ké?n -wordennverkregen sdan evoorheen rnmogel i jk wasbsfc·.' -ζΐ'.άη Oï-S ©d«uitvinding .cevfcfe.nvdexltefteeni^drbefe®dog«&e£rv 35 medÊum^£<ia«fsdé-i.pretéÏRe*pröddctiseebevoréertC'V r.id , i; ai erase ?.t -sin. eb scstlBST uitvinding .veisChaftleencwefkwijzé voor^hètibe-vórdeiéfi^aft^Seiprötelnefiprodiigtié cdeórnhetbk weken, panreen BA9^@föiMM©»prddU£iaroedoveelvin eénchypertoni seh-i Medium> c-fiat;;wi 1 zeggen een medium met een osmolaritëifedtfanfcienminstë 3403o λλ m<iHneTTirtioe . *ί t7<~ir>T*V<=>iir* τηΛ+- Αβη fjstnolariteit-in het txaiect , * —C4— ' . · -‘-•atSÉöi ‘·3&4Φ*450·- ’Mefsfe hdy.wBifi-O* mil-iioeitiQiles.

o* ;:^-iitedi^nrsmedia -adi.Jaiigeöruöcet^jké i'gÊoedïiitediaL/.vibiJ^QOi^e®!^ '., .-:&.TEéglé! sp;media?ι*άί&I“h^e3^oii±seK :iz±jn\ gemaaktcdoot j&eü.teevee-~.r ging-van .-verhaagde >feaavieelhe<ien rsva’xi i-amino^uren y bij:^i>rkeur 5 -’twéé keer -he:*»- '«cseinale amino zdiirgéhad-te ^ dfceze amittozursea k&n-f.

*· nén -cha.rgegew±is :OÊ; o^ ecsntin^-oËaaie: ^o>3pden .^oegerVqegd1.?,-^iet gebruikelijke Kfödium-kan periodiek. worden ringeepoteni n*e>fe ^overmaat aminozuren rxuscter teweegbrengen „van '-amino zuurconcentraties groter fidan 4die Inormaa! gorden ,g«bafuiktAit emarfcieif kah. iëen 10 tevoren ^bereid "fcypertonxseh medium continu. of,£i«an tijd -tot .; r tbjd?do££ider kweek rwerdenigelèid. Verbetering -vda 3de.*p5CQteeIne-· productie wordt ook verkregen bij -een -ober gegewi jze: .kweek ?, öridef ^toepassing .van Jiypertohiscb rmediura . Elkeproteïne-produ- öëréiidë&Céb: heef tibaate tri j dg.uitvinding,- waarbij echter* &v 15 gënëtisch^gémodif ieeerdé. cellen de voorkeur verdienen w;.; · «n-

Ofschoon de methode volgens de uitvinding in het al--. Agéntéen ^geschikt Ais ivoor, -hét ehevorderem ^van rde ^.proteïne-productie uit conventianele>protelne~?produaèrende -ceicuitures ^ :is - i - odé imethode^xn ::het iibij zónder ^geschikt -wannéér .de "protelne-20 producerende «reilen worden i^rgekapseld bin een laantal ,versehil:-• · > lende^capsuleé .rmétceeh ipermeabel membraaii, ?dat iéen intracap- * . -Sulair volumescreëerti'^Het>capsulémembtaa-h kan eesupolyiQeor met een aantal primaire aminegroepen zcmb-gebonden ~,aan ^een ;'zuur polysaccharide· bevatten.. :De voorkeurszuurpolysaccharide 25 is alginaat,'terwijl het voorkeur spölymeer,. dat- teea-aantal· iC·; .primaire'am±öegroepen^hevat>i pölypeptide ..is*. .waarbij poly-lysine :of jtelyornifehinebdeqmeesteovqor&ettr veedieht-v.^d ί?.n - r~oX Defuitvindingr ómvatt-èënnverbeterid ..groeimediW rVQor het^bevorderen van de Xprotelne-productie S> ©it: medium bevat -•30 . in-hoofdtaak .‘ZOuten?>voedingsmiddeien,en -.-aminozuren·, ,n,Q&ig; : t vvod» ;*de tceigraèboea-mitosis, .-evenals j; deimedtae?aais ;.>5agie -ss gemodif ioeerdeorriedia, ernaar Téirj - zijn jgemodifobceerd ftdoer.x.de.c-toe-voeding vanJ©yeam^afe «aminozuren#;,voldoenden voor -de toename van; de . osmolaril^it*waB ?het ·-medium tot1: tenminste 340 milli-35 osmoles, bij voórfeeurvfeussèöo34;0 ;en;,-450 :miiliOsmoles>v.ehv r c< *·? liefst' oav 36QimiïliosmolëSjcriMedia, pvérkrege» volgens de uit-vind±ng,£be‘ve3éderën’ïdebstijgihgxvas.:de;'ipJSOtejtne^prodÏ3;gt4ev J BAfèfiö^$MiA!deligei invlaedxöpcde levensvatbaarheid-vancde ?ceilen of Dop hunngcaeisnelhéids 1 I o&zc ::&* -t>r· muï&n eet sswoss 5. &> .* ÊLi ^ £.<*£[ .CL? < >··*** .* "+-A 11 ΠΟιΛ *♦«»»«· *·>·>»%*» r * n’ i- ; » . i . I » !'>.

ëb «sriSDe, wérkwi-j ze 'ars hét- medium ·νοΐφ0ηΦ de uitvinding **ίϊ&Μ$£&&Ρ&€βίΧΒβ!&χά . op-de ibntdekkihg, dat ~iiï·' tegenstelling tëöt de ê-fftfi' ^M^tseB^r *ópvatt±Hig> hypettdhiscHé mëdia de"’>proteïnë^a3Ddüctie, «Üta? IfcÉÉtiJii^^ttder ^^td,€^öhaëiftpïc^üdÏd.ekürihéh bevorderen Zónder- beschadiging van ' dé' 1 evensvafcba ar hë iki van de Cellen.

»iÈköëptiöi^iéP * specif ieke ac- söihlsrtÖiVërKeid·dan-tötrnu: toe mogeMjk- worden ver-*fs§£ teWÉjfëh Vö&gehs- d#,lfeTe'3r‘-4^utf-;d€r-.~ttiiiviiiaiiig^ 3iff:3fëfczij kleine £>^^^^Maroeieul3baresi,^^hètiiiJ gröte^ völum;eöultüree mét - hoge cel- 1 êié adsaithfcfcau-3- : Oü -W' .^-. r-r. ~ :·:.:·.. = ·.· *£ §v 85 ζ £y- J* Vroegere êkperiMelitëh Op de invloed Van natrium* i^i3Löï^ëCöncëïitratlë op. jièliar-4^n^ muisfibroblastcellen -hebben x% gëiëidr tot-' dè: conclusie', dat 290-330 milliosmoles hetëpti-~maleitoniciteitstra;ject wae voor de - groei Van dierlijke cel-15 , cultures. Echter wanneer men de wèrktoig zé volgens de urtvin-*¥,§ iding? toepast* ΐkunnen' hhtilichaamOpbrengsteh worden verkregen •V«S 50% uitgëscheiden proteïne; terwijl* opbrengsten töt 62% ft$&S tóeêfca&gel ijk zi jTengevolge^ van- de ^ hoge ahtillchaamconeen-&#lkftWWk»£ ih? deï Uit^scheiden-proteïneV wórdt'; de zuivéring van 2 0 v bdetkaiii&ehaitöhèvérgë&akkëiijkt, mët als- gévolg- het Verge- * -¾ -ëë^midfcfceli^kfendVaft vele§ vliil^ dë^próblëiMèft ^die? gepaèrd géan-met i %?é dötaöiveringsvaa'7 antilichamèn, terwij 1-' boVëhdièh- der kóstén §->&aflpéèhidergêil jké Zuivering, verlaagd'- vrardéns- 'flypërtbnische ^e^meai&ëïigh&ia-hefe-bi3iönder; geschikt Voor-het-kwèkên5van ' 25 hyhêldem&ie? ayëlóma’S- ën^andere cóhtihüe-&aiama.iiècèiprötelhè-*--tpröduëerëlidés cii 11 uf e i, ? ©ndër- óplevèrihg: Van*ëeh* hogërè pto-*iteïaeprödüctié^óf^üitschëidingsnivëaQS dShs Vêïk-ri jgbaar^&et ÖOSVêöt£Ohëie^-ftediëV5M^ëlöma’s-Rünhen-gênëtiSeh ^ördèfi^témo-fs.l difideegd^Véöè^ïhdtfbêVêrdêreni'vah idi préductië vëè spëöi’-2 30-as#iei^epr'ö^aInêü5·© -*eft v.zzh λ#? L·* ? es §<« mV* rtê^iölPr§téiÉë“produöérèildé èèï$ën^^diêsgèferüi'kt^kuMén - bi&rdéö?vóigé8# dè’^iitVièdMgfVRdnnën<ifêkwêekt ~4WordëS% ïs-'grote ?^d«löifëÉ^et^é'é3?dMhthédéë%>:ifi^aê^öMé®vahi#rèdttë van W* cel-im2tgé&&-ië+epM&qeê&êèêf. «®IRe®zljn BèécRtëvêfc-i'J&^e 35 &.3PM&£teaa®£fe %4&&&iS£ëc1i2mÈi&ti 9f£$2 sft3 p4S9ö9 ν33*$ é£*dê*s> , #ë®èÊfdê Λ- v,‘- 4 /% r λ λ «r «- — — ---— . alsmede methoden voor nhet: pogs.ten.gvan.. -stoffen .die door de .cellen zijn geproduceerdpe. hiermee \samenhangendfe"#W«ttd3caan-: se octrooiaanvrage .Novj 5.79v„4j^.3%:heschrijft:/- :dafccbijmoh&ei£· hoge celdiqhtheden kunnen.^xden irorkre^en in -ingekapaèJbde'i cul·*· 5. tures onder gehrua^akdng-;iva3ï gebruikenjkeb media* tnadienv dgfc. zuurstof- en kooldioxids^hoef tesii.wprden: bevredigd:· door;·,·£η-borrelen van een gas met een: bepaald zuurstof» en; kooldioxide-r gehalte, rechtstreeks in. eeh ingekapselde culture. :Onderi toe-* passing, van..deze, tqqhn-ie-ken zijn? rer .culturess ^inet: _een.;^Qlnme 10 in de orde van grootte van 30 1 en een celdichth.ed.it· vanirlO^; * cellen/ml verkregen. Onder toepassing, -yan:· de weirkwi j ze volgens de urtyindi-ng: hebben; rdergelijke cultures manpikiOhaie -: anti lichamen^ geprpjtuceerd iji ^ order, van grootte yata* g, < ; - * < ··: - e ï-ig-..,.\5 is; een'schematische: afbeelding van-., .een; in-* 15 richting, voor: het., kweken, van cellen;· volgens de uitvinding. r De inrichting is voorzien van een 3<16L roestvrijstalen, elek-_ trogepolijst/. 50^ 1: vat. 1Ό yporzien van een deksel <12.; fen .motor-j4r drijft derroerdsrasr,j 6c aan, s waar bi-j de.: r.oerdesrbladen f j cl-β enr 2 0V in-, de^ culture 22, ronddraaien.,; Culture: 22i omvat5* Jiet 20 * J^per toni scha medium,:: bijvoorbeeld·, als hierna^gedefinieebd, V: 5,an een aantal·, gesuspendeerde.·-capsules·-. ?net membranen./ ~ dieNper*-; meabel^zijnj y©pr>_ der; aminozuren,L gassenvitaminen* ionen> etc r i fiin* het-_, medium. aanw£ zig. Het ge.woonl ijk vpprke^r^ verdienende hypertonische*medium is een gemodificeerdeEagle '.s mediüm met ... 25- daarin twee keer ,de.· normale concentratie van aminozuren/.; J.» . welk-medium, voorts, is aangevuld;.met, 5-ypl.% serum, „bijvoor*!* / ybee^djrunderserufa* Gewponlijk zijnt-de icapsuiesciOnd^QfiSbdl*· -: Ώyorraig-. en hebben, een. diameter.· ini de>vorde£ vant; grootte *van ? minder dan Sapsu-les- met^eeu; gemiddeldejidiameter in 30 de orde van grootte van 0,8 mm doen het goed>ï&an^de>,gasbek j .hpefte; van-ide-.cfl|en;-;wordt voldaaniidQor^hetgdOO^leiden van ,, t v; §u]irstp|^:ven-kof l-dipxide-ïbevattend .r gas LVia een;; 4beriel jf il** - ter 24 ^ ind^tbuis . 26-ven borrelkop/:28 ;!?;^rrelkop ?^8 fkan.izijn yporzien . van^e.nn 2>5Amicr§o poreus^porsêleinfi^ter. jSét gas 35 kan3,9¾¾ luchtjeni5%if§2.ïiE>eE yolume) ^beyatten. ^asbeli^fcjes /? .uit 2¾¾ doofst omen>:he%> medi^m^:aj^;id^vexvtde: clangs .:d^^§gsules:t ^abör^ol'SnAmoat *4odanig. zijn t „ £dSiöj^l^ttiële druk .haafd-.praktisch/qp^..4iq parti#le i&cuk: xa%idevZEUurstpf o r η n 'z c λ .-:7...- .

-cc'ï iff· te.b gas. De zuur stof druk in het medium kan daarbij worden :&eh<^den· PP een niveau bij of enigszins boven het niveau, dat -pelten.nodig hebben voor optimale groei. Tengevolge van decSejgumcpmponenten in het medium brengt het doorborrelen rihv SQhuimvorming met zich mee, waarbij het schuim in de bovenste - — lEuinste j3O_^van .het vat 10 wordt verzameld. Ofschoon de cap-... i§ule%r<i%cpellpn iegen dehydratatie beschermen, dienen zij .csoitvanvtijd:t©t.-naar het schuim te worden getransporteerd, - . welke ^capsules, bovendien de cellen behoeden voor mechanische 10 ^beschadiging. Dientengevolge kan het: doorborrelen van gas in reeff-iingecapsuleerde culture voldoen aan de zuurstofbehoefte ï.tyanijide..toegenomen celpopulatie, met het gevolg, dat extreem -arx-nhoge^ celdichtheden kunnen worden gerealiseerd. Gas, dat de -culture verlaat, passeert via uitlaatpoort 32. en filter.34.

15 Een typische gas stroomsnelheid voor een 30 1 culture :is.r: * :, 0,0056 m3/h. x;

Onder toepassing van de uitvinding volgens de v chargegewijze methode wordt gewoonweg een hypertonisch medium gedoseerd in vat 10 tezamen met microcapsules met daarin de 20 kiemculture. * -waarbij de culture wordt gekweekt tot maximale -•^ovcJiii^theid.^cAtternatief kan aanvankelijk een isotonischt-con-r r.i lyeationeelLmedium worden gebruikt, waarbij bovendien jeep, -^ s'pvermaafe aminozuren kan worden toegevoegd aan d.e culture, door iiij.ect5te\en;iwel· een of meen.keer tijdens de groeicyclus^ bij-25 r: 3voorbeeld -via fnj eet iepoort 36. Ofschoon misschien-de cb.este -manier vanlin-: prakt ijk brengen van de^uitvinding. is het:.door-c v Vosresi van he.b-hypertonische medium door -de -culture, door in--itnoduefeie. .vanseen ^oontinue of intermitterende atnogm-medium dittifitob toevoerptoort x.38 jc gevolgd xdoor -de afvoer vany^et-.medium 30 o^i-a:-£^terselemen%n4iQ; rEiilterelement rkan zijnevoe^zien van - ri" .«wi gcoestVEi je micropormze : zeef: met igpriën deinen .dan .ide c ε -«iiametetuvan Edeujeapsuiess, -bijvoorbeeld::50- t®t xl-00,vmierons.

• ^medium -kanciviatafsluiter lonttrokkeu> .Hete a -- jifveauj^asidiPt emediwbia.rde:cPuiture^andwprdejn waargenomen 35 εIviacide ifemnsptctranteiZïijbuiSz4AitypisefeersnelheidsYan , .^defcmediimstrQomiinctQevPe3^9ortq3,8:en uit ^filter .:4.0 sds-4 ml:r csfebtiil2idttbc^ericmii5ie^BdcattsOoH.aminozuuroplos-f^Pl^lS^iiforden cgdliaöeeteiqrd finsdse aoulturp tindien zulks noodzake-erüjfekta voor .het>dnaodhav©^nvarn,-een:ge«en.ste -hypertonlciteit.

A - .* M. JA .*s fv «i. η.- ^ ? rrfiFilV· ?\ "ς jZ: ~ 'r-~- ^ ‘

w > » ^ I

-8-

De toegepaste werkwijze voor het oogsten van- cié door de cellen geproduceerde proteïne is afhankelijk Van Mie Affectieve moleculaire afmetingen van de beoogde protéfeïe^en^de permeabiliteit van de capsulemembraneni'Zoals in Hië £bovénge-5 noemde octrooischriften beschreven kan de 'pet-raé^j^i-te&tË van de capsulemembranen binnen grenzen worden beheerst «^Bij-ZOn-derheden van de hedendaagse voorkeursméthódé-vbor hét> ^beheersen van de capsulemembraanporeusheid én Voor -hét -Vervaardigen van uniforme capsules zijn beschreven in dé -hiérmée Aaanêh-10 hangende Amerikaanse Octrooiaanvrage No. -579 ::494.,--Tii-dé^be-* > oogde proteïne te groot is om door het membraan té-kdiirtén ‘ passeren, wordt de proteïne in de microcapsulee verzameld; wanneer de proteïne klein:genoeg is om de membranen té -kunnen passeren dan zal deze zich ophopen in het extracapsulaïre 15 medium. -1'

De volgende niet-beperkende voorbeelden dienen ter verduidelijking van de uitvinding.

ΠΤ‘ . .....; · j

- VOORBEELD I

. - Dit voorbeeld illustreert, dat' opvoering Vdri'de- OC

20 ' toniciteit van het cultüurmedium door dé -töévoecjïngi 3Véiï Overmaat aminozuren geen wijziging in de 1even svatbaarheidAf in <·,. <3é snelheid van celmitosis van de proteïne-pröducérehdé^'cel-’ len teweegbrengt, wel gaat dit gepaard met een verhoogde proteïneprodüctie. De in deze proef gebruikte -cellen ïwaasen -v r> “25 ; een*muis-muis-hybridoma uitscheidende IgG-oellen. D^ ihytori-domd's werdén-ïngékapséid via een modificatie1 van' déd^r-het 'Amè-rikaanse -dOtroöischriff No. =4.352.8833^beschreveh ipaS3cie--dUrér^iléér in-hét bij Zonder ;weidAen- suspensie met daarin r*·-v' T0-5cëireri/ml7 frï >·1 % (giéw^/volvl -natriumaXg^inaat ^(NaG-Kelco CE 30 - · LV)^ih -standaardftéd'iUm overgebraeht .in 'een vetraal^kopincrdch--'tihg/J'Vó,ófziéiS van 'een? huis :met éeri 'bovenste ~Xuchtdaïlaét>-spfoeikop en -één langgerekte "liölle <1 ichaamsfrïctïe ,^ΌηχΙβ^β-'^^ΟΙνί: :~>±n een ébop * >De - céldichthéid van "de alg inaa t^anedium-- sUspenSié-bepaalt (1hét ^émiddeldéiaan'taii 'cellen·· spér ^capsule . a 35-- in ade-kiémdui-ëufé » Een öspUit?p2bijVööïbeél<$ce®3f c40 . ccfr'SspuaLt, '------ vèórzién “van 3êéW téö&ë&rpünlp werd -^aangebrachbφάν&ή Tin chet " - BABiQiSGftltftL'éen --riaaid /bijvoorbeeld i(yp&Z5>sgmuI-iD r iDefion-beklede - ' naald/-diede ?ïén^béivah^ét bui® ideorlbopt. ^Hetr inwendige van het huis werd zodanig ontworpen, dat de top van de naald

„ _ -g _ -- v “ J

i: t ~wórdt onderworpen aan een constante laminaire luchtstroming, •(die als een luchtmes dient. Bij toepassing wordt de spuit, • gevuld met de oplossing met daarin het in te kapselen materiaal bovenop het huis aangebracht en de doseerpomp wordt ge--*5activeerd voor het incrementeel forceren van druppels van de *u-oplossing naar de top van de naald. Elke druppel wordt "afge-: sneden" door de luchtstroom en valt ca. 2,5-3,5 cm in een 1,2% (gew./vol.) calciumchlorideoplossing, onder vorming van gegeleerde massa's, die door afzuigen worden verzameld. De 10 gegeleerde massa's kunnen worden geïncubeerd in drie aange-*C! vulde volumina isotonische zoutoplossing voor gelexpansie.

In totaal neemt de zoutoplossingexpansie ca. 11 min in be-. h\ ' slag. Vervolgens wordt een membraan gevormd rondom de ge-“jv.geleerde massa's door contact met een 750 mg/1 pöly-L-lysine 15 (Sigma Chemical Company, 65.000 dalton molecuulgewicht) in een isotonische zoutoplossing. Na 12 min reactie werden de : verkregen capsules gewassen gedurende 10 min met 1,4 g/1 op-. lossing van CHES (2-cyclohexylaminoethaansulfonzuur) buffer (Sigma) met 0,2% (gew./vol.) calciumchloride in zoutoplossing.

20 - De capsules werden gedurende ca. 8 min gewassen met 0,3% (gew./vol.) calciumchloride in zoutoplossing, waarna een tweede membraan werd gevormd rond de capsules via een 10 min reactie met 105 mg/1 polyvinylamine (Polyscience, 50.000- 150.000 dalton molecuulgewicht) in zoutoplossing. De capsules 25 werden wederom gewassen met twee volumina isotonische zoutoplossing gedurende 7 min en vervolgens bekleed met een 7 min immersie in 5 x 10”2% (gew./vol.) NaCl oplossing in een zoutoplossing. De capsules werden nog eens 4 min gewassen in een zoutoplossing, waarna de intracapsulaire volumina opnieuw 30 vloeibaar werden gemaakt door twee immersies in 55 mM natrium-citraat in zoutoplossing, waarna de eerste immersie plaatsvond gedurende 20 min en de tweede immersie gedurende 6 min.

De capsules werden twee keer gewassen in zoutoplossing en een keer gedurende 4 min in het medium. Zoals in algemene be-35 woordingen in het Amerikaanse octrooischrift 4.409.331 beschreven, vindt er na incuberen van de capsules in het groei-raedium ophoping van IgG plaats in de capsules, waarbij in BAD ÖffiGIWAltracapsulaire medium slechts sporenhoeveelheden kunnen worden gedetecteerd. De volgens deze procedure bereide cap- - 1C - ! sules zijn praktisch impermeabel voor IgG, terwijl zij vrije doorgang waarborgen voor de vereiste voedingsstoffen om zodoende de celgroei en antilichaamproductie in het intracap-sulaire volume mogelijk te maken.

5 In tabel A zijn de bestanddelen van een basis-, be kend cultuurmedium opgesomd, terwijl tabellen B en C de aminozuur- en vitaminebestanddelen van dit medium illustreren. De concentraties tussen haken in tabel A slaan op de modificaties ten aanzien van het ijzer- en aminozuurgehalte onder 10 vorming van een hypertonisch medium volgens de uitvinding. "Γ Kort samengevat werd het ijzer verhoogd met een factor van 100 en het aminozuurgehalte werd verdubbeld. Na het verkrijgen van het medium werd er 5 vol.% foetaal runderserum toegevoegd.

Door de toevoeging van de overmaat aminozuren en ferrinitraat 15 nam de osmolariteit van het medium toe tot ca. 360 millios- ? moles. Zoals uit een overzicht van de bestanddelen van het medium duidelijk naar voren komt, maakt ca. 4.7 gew.% (water buiten beschouwing gelaten) van het normale medium aminozuur uit, terwijl het hypertonische medium ca. 8,9 gew.% amino-20 zuren bevat. De voorkeursmedia volgens de uitvinding bevatten ca. 7,0-12 gew.% aminozuren.

C ? .

, - f / r* ... . /"·'

BAD ORIGINAL

8500350 - 11 - ' * ·'

TABEL A

Bereid in porties van 40 1

Chemische component Toegepaste hoeveelheid D (+) glucose 80,0 g 5 NaCl 274,4 g

Na2HP04 (watervrij) 4,96 g KC1 16,0 g

MgSO^ (watervrij) 3,92 g

NaHC03 88,0 g 10 Voorraadsoplossingen

ZnS04.7H20 8,0 ml conc: lO^Gg/ml

CuS04.5H20 0,4 ml cone:. 10“5 g/ml 15 Fe(N03)3-9H20 4,0 ml conc: 10g/ml (10"^ g/ml)

MnCl2.4H20 0,4 ml conc: 10”5 g/ml

Aminozuren 800 ml (1600 ml) 20 conc: 50x

Vitaminen 800 ml conc: 50x PIPES 136,96 g L-Tyrosine 1,40 g 25 L-Cystine 0,80 g

CaCl2 5,88 g

Fenol Rood 0,4 g Q.S. tot 40 1 met gedestilleerd water.

BAD ORIGINAL

85 0 0 3 5 0

> * v I

- 12 -

TABEL B

Bereid in porties van 20 1

Aminozuur Toegepaste hoeveelheid L-alanine 90,0 g 5 L-arginine HC1 60,0 g L-aspartinezuur 24,0 g L-aspargine H20 20,0 g L-cysteïne HC1*H20 60,0 g L-glytaminezuur 45,0 g 10 Glycine 50,0 g L-histidine HC1.H20 20,0 g L-isoleucine 30,0 g L-leucine 75,0 g L-lysine HCl 90,0 g 15 L-methionine 23,0 g L-fenylalanine 25,0 g L-proline 30,0 g L-serine 10,0 g L-threonine 40,0 g 20 L-tryptofaan 10,0 g L-valine 50,0 g Q.S. tot 20 1 met gedestilleerd water.

bad original 8500350 - 13 - 1 · ! *

TABEL C

Γ ' ' '

Bereid in porties van 10 1

Vitamine Toegepaste hoeveelheid

Ascorbinezuur 1,0 g 5 d-Biotine 0,3 g d-Calciumpantothenaat 0,5 g

Cholinechloride 0,8 g ~ d-Alfatocoferolacetaat 6 μΐ " Ergocalciferol 0,5 g 10 Glutathion 0,55 g

Myo-Inositol 1,0 g

Menadionnatriumbisulfiet 0,046 g

Methyllinoleaat 17 μΐ

Nicotinamide 0,5 g 15 Pyridoxal-HCl 0,5 g

Riboflavine 0,05 g " Natriumpyruvaat 12,5 g "Thiamine HC1 0,52 g vitamine A 0,05 g 20 Vitamine B12 0,1 g 'Q.S. tot 10 1 met gedestilleerd water.

De ingekapselde hybridoma's werden gesplitst in v & % ' . * . - vier cultures, aangegeven als 390, 395, 396 en 397. Culture * ï?* 390, bestaande uit 6 1 medium (met daarin ca. 3 1 bezonken 25 capsules), werd gekweekt in een 36 1 draaikolf. Het aanvankelijke cultuurmedium was het hypertonische medium, dat twee keer het aminozuurgehalte en overmaat ijzer bevatte. Deze culture werd chargegewijze gevoed met 6 tot 8 1 hypertonisch cultuurmedium op de dagen 3, 5, 7, 10, 11, 12, 16, 17, 18,, 19, 3t) 20 en 21 onder handhaving van de toniciteit.

Culture 395, bestaande uit 6 1 ingekapselde culture in een roestvrijstalen vat, werd continu gevoed met een totaal „ _van 90 1 normaal medium gedurende de periode van 26 dagen van ί . ..." ..

het experiment. De gebruikte aminozuurconcentratie (800 ml) 35 resulteerde in een isotonisch medium.

B4P,ORIGINAL Cultures 396 en 397, elk bestaande uit 6 1 ingekapselde culture in een roestvrijstalen vat, werden continu gevoed met 120 1 medium en bovendien ijzer gedurende de periode - 14 - ..1 van 26 dagen. Culture 396 ontving het hypertonische medium met twee keer de aminozuren, terwijl culture 397 het isoto-nische medium ontving. Door alle ingekapselde cultures werd zuurstof/CC^ ingeborreld.

5 Fig. 1 illustreert het aantal cellen/ml bezonken capsules bij diverse tijden voor de vier cultures. De cel-tellingen werden verricht met behulp van een hematocytometer na verbreking van een monster van de capsules. Het is evident, dat het hypertonische medium de hybridomagroei niet heeft be-10 lemmerd en in tegendeel in feite de groeisnelheid heeft be-r r vorderd, een geheel onverwacht resultaat.

Fig. 2 illustreert de som van de levenvatbare cellen/ml van de bezonken capsules voor de cultures uit fig. 1.

De levensvatbaarheid van de cellen in het hypertonische medium 15 is tenminste even goed, zo niet beter dan in het isotonische medium.

Fig. 3 illustreert de toename in antilichaamproduc- i tie onder gebruikmaking van het hypertonische medium. Op dag 14 produceerde culture 397, die werd gevoed met het isotonische 20 medium op een continue basis, ca. 200 microgram antilichaam . ^ per milliliter capsules, een uitstekende antilichaamopbrengst uit een celculture. Vergeleken hiermee produceerden de cultures, die gekweekt werden in het hypertonische medium (390 en 396) ca. 800 microgram antilichamen per milliliter capsules, 25 een viervoudige toename. Antilichaamconcentratie werd gemeten door het verbreken van het capsulemembraan en onder gebruikmaking van een ELISA-antilichaamproef. Specifiek werd een rat-antimuis-antilichaam, gekoppeld aan alkalifosfatase, tot reactie gebracht met de intracapsulaire vloeistof. P-nitro-30 fenylfosfaat werd gebruikt als substraat voor het alkalifos-faat, immunologisch gekoppeld aan het muisantilichaam, waarbij een absorptie van 340 nm werd gemeten.

Deze proeven laten zien, dat de toename in anti-lichaamgehalte een effect is van de hypertoniciteit van het 35 medium en niet van het extra ijzer. Beide cultures 396 en 397 ontvingen de identieke média met extra ijzer, waarbij echter .

396 twee maal de aminozuren ontving.’ Er was geen gebrék' aan

Lin culture 397, aangezien deze continu werd gevoed met een isotonisch medium met aminozuren.' Uit de gegevens fi’R (U) 7 R Λ

- 15 - v I

volgt duidelijk, dat onder gebruikmaking van een hypertonisch medium, in dit geval 360 milliosmoles, in plaats van het conventionele isotonische medium, een verhoogde proteïneproductie kan worden geïnduceerd zonder aantasting van de levensvatbaar-5 heid van de cel.

VOORBEELD II

Dit voorbeeld toont dat door incapsuleren van een celculture en toevoeging van een overmaat aminozuren, teneinde het medium hypertonisch te maken, de antilichaamsynthese sterk 10 toeneemt, terwijl door een medium hypertonisch te maken door toevoeging van natrium, een geringe toename in de antilichaam-productie teweeggebracht wordt zelfs bij niet-ingekapselde antilichaam-producerende cellen.

In deze proef werden drie verschillende media ge-15 bruikti een met een osmolariteit van 250 milliosmoles (hypo-tonisch), een tweede met een osmolariteit van 325 milliosmoles (isotonisch), en een derde met een osmolariteit van 400 milliosmoles (hypertonisch). De osmolariteit van elke oplossing werd gemeten aan de hand van de vriespuntsdaling. Os-20 molariteit van de oplossing is ongeveer gelijk aan de osmolariteit bij deze concentraties. De media waren identiek aan het basismedium, zoals uiteengezet in tabellen A-C (zonder de overmaat ijzer en aminozuur), behalve dat natriumchloridecon-centratie werd gevarieerd teneinde de osmolariteit te wijzi-25 gen.

Fig. 4 toont de celgroei voor de drie cultures. Uit de fig. blijkt duidelijk, dat door verandering van de osmolariteit van de oplossing door toevoeging van een zoutoplossing geen significante invloed op de celgroei wordt uitgeoefend.

30 Tabel D toont het verschil in antilichaamproductie, veroorzaakt door modificatie van de osmolariteit van de oplossing. Drie sets cultures (A-C), elke proef werd in duplo (a,b) , . uitgevoerd, zijn weergegeven in tabel D. Alle deze cultures waren dezelfde hybridomaculture, doch in de niet-ingecapsu-35 leerde vorm.

BAD ORIGINAL

.8500350

^ v I

- 16 -

TABEL D

Osmolariteit Ab (ug/ml) Gemiddeld yg/ml 250a 72,9 73 250b 74,1 5 A 325a 72,3 75 325b 78,8 400a 79,9 78,8 400b 77,7 280a 68,2 67,1 10 250b 66,0 325a 58,6 75,1 B 325b 91,8 400a 52,4 70,6 400b 88,9 15 250a 69,7 67,5 250b 65,3 C 325a 92,5 87,6 325b . 82,8 400a 79,9 90,3 20 400b 100,8

Zoals uit de gegevens duidelijk blijkt, resulteert de toename van de osmolariteit van het groeimedium door de toevoeging van een zoutoplossing in een protexneproductie, die even goed of beter is dan de antilichaamproductie uit het 25 isotonische medium, en beter dan uit het hypotonische medium.

Uit de gegevens volgt bovendien duidelijk, dat de invloed niet zo dramatisch is als bij fig. 3 met media, die hypertonisch werden gemaakt door toevoeging van aminozuur. Cultures, gekweekt in natriumchloride gemodificeerde hypertonische media 30 worden derhalve gekenmerkt door betere antilichaamproductie dan gebruikelijke celcultures. De invloed van het teweegbrengen van de toename in osmolariteit door de toevoeging van aminozuren resulteert echter in een dramatische en verrassende verbetering.

35 BAD ORIGINAlPr werden andere proeven uitgevoerd onder gebruikmaking van proteïne-producerende cellen, zoals mens-mens-hybridoma's, die IgM vormen alsmede andere muis-muishybridoma's, - 17 - ' ' v ‘' 'j die IgG produceren. In alle gevallen produceert het hyper-tonische medium grotere hoeveelheden proteïne dan het iso-tonische medium. Media met daarin extra aminozuren met een osmolariteit van 350-360 milliosmoles blijken optimaal te 5 zijn, doch andere hypertonische media, die voldoende voedingsmiddelen leveren, blijken de antilichaam- en andere proteïne-productie te bevorderen.

Deskundigen op dit gebied kunnen andere modificaties of varianten van de procedures en producten, zoals hierboven 10 beschreven, bedenken. Zulke andere modificaties en varianten worden mede omvat door de volgende conclusies.

i i

BAD ORIGINAL

8500350

Claims (9)

1. Werkwijze voor het bevorderen van de antilichaam-productie uit een antilichaam-producerende cel van mammalia origine, met het kenmerk, dat de antilichaam-producerende cel wordt gekweekt in een hypertonisch medium 5 met een osmolariteit van niet minder dan ca. 340 milliosmoles.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het hypertonische medium een medium is, dat hypertonisch wordt gemaakt door de toevoeging van een overmaat aminozuren.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het ken merk, dat de overmaat aminozuren continu worden toegevoegd teneinde de hypertoniciteit van het medium te handhaven.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken merk, dat de osmotische druk van het hypertonische medium 15 ligt tussen 340 en 450 milliosmoles.

5. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken merk, dat de antilichaam-producerende mammaliacel een genetisch gemodificeerde cel is.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het ken- 20. e r k, dat de antilichaam-producerende mammaliacel een hybridoma is.

7. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken merk, dat de antilichaam-producerende cel wordt gekweekt in een permeabel capsulemembraan, beschikbaar in het hyper-25 tonische medium.

8. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken merk, dat de osmotische druk van het hypertonische medium ca. 360 milliosmoles is.

9. Een medium voor het bevorderen van de protelneproduc-30 tie uit proteïne-producerende cellen, welk medium essentiële zouten, voedingsstoffen, vitaminen en aminozuren bevat, met het kenmerk, dat aan het medium voldoende aminozuren zijn toegevoegd voor het verhogen van de osmolariteit ervan tot een waarde, die ligt tussen 340 en 450 milli-35 osmoles. ÜRIGINALMedium vol?ens conclusie 9, met het kenmerk, dat het medium ca. twee keer de normale concentratie aminozuren bevat. > - 19 - ' ; ' - ! T1. Medium volgens conclusie 9, met het ken merk/ dat de aminozuren in het medium 7-12 gew.% van de niet-waterige componenten uitmaken. BAD ORIGINAL 8500350